DE60106322T2

DE60106322T2 - Gefriergetrocknete Verbundmaterialien und deren Herstellungsverfahren

Info

Publication number: DE60106322T2
Application number: DE60106322T
Authority: DE
Inventors: Wilson Carlton Harvey; Peter 22397 Duvenstedt Van Leeuwen; Tom Boatbridge Hyland; Wil Aitken
Original assignee: Johnson and Johnson Medical Ltd
Current assignee: Johnson and Johnson Medical Ltd
Priority date: 2000-05-12
Filing date: 2001-05-11
Publication date: 2005-10-27
Anticipated expiration: 2021-05-12
Also published as: GB2362466B; JP4799758B2; US20010045177A1; DE60106322D1; CA2347331A1; AU4380601A; EP1153622B1; GB0107400D0; GB2362466A; US6309454B1; CA2347331C; AU783184B2; JP2002058733A; EP1153622A1

Description

Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft gefriergetrocknete Kissen, die einen bedeutenden Anteil einer Mischung aus Collagen und oxidierter regenerierter Zellulose (ORZ) enthalten, und Verfahren für die Produktion solcher Kissen.
Hintergrund
Die WO98/00180 beschreibt den Einsatz gefriergetrockneter Schwämme, die aus Collagen, das mit oxidierte regenerierte Zellulose (ORZ) vermischt wurde, bestehen, für die Behandlung chronischer Wunden. Solche Schwämme müssen in der Praxis hohe Ansprüche an Reinheit, Sterilität und fehlender Antigenität erfüllen.
Es war bisher nicht möglich Schwämme aus Collagen/ORZ-Mischungen herzustellen, die eine hohe Reproduzierbarkeit und eine hohe Zugfestigkeit im nassen und im trockenen Zustand aufweisen. Im besonderen neigt Collagen zur Denaturierung, wenn es mit Gammabestrahlung sterilisiert wird. Des weiteren tendieren Collagenschwämme dazu sich in Wundflüssigkeit sehr schnell aufzulösen, besonders in der Anwesenheit von Collagenaseenzymen. Während dieses Problem durch chemische Quervernetzung der Collagenschwämme durch quervernetzende Agenzien, wie Glutaraldehyd, umgangen werden kann, können bei Einsatz solcher quervernetzenden Agenzien Probleme der Toxizität und Antigenität auftreten.
Zusammenfassung der Erfindung
Dementsprechend ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung physiologisch annehmbare, sterile Schwammkissen zur Verfügung zu stellen, die auf Collagen/ORZ-Mischungen basieren und die eine hohe Zugfestigkeit aufweisen. Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung physiologisch annehmbare, sterile Schwammkissen zur Verfügung zu stellen, die auf Collagen/ORZ-Mischungen basieren und die eine sehr hohe Reinheit, Sterilität und eine niedrige Gesamtkeimzahl aufweisen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung physiologisch annehmbare, sterile Schwammkissen zur Verfügung zu stellen, die auf Collagen/ORZ-Mischungen basieren und die eine hohe Einheitlichkeit aufweisen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung physiologisch annehmbare, sterile Schwammkissen zur Verfügung zu stellen, die auf Collagen/ORZ-Mischungen basieren und die unter simulierten physiologischen Verhältnissen reduzierte Resorptionsraten aufweisen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung physiologisch annehmbare, sterile Schwammkissen zur Verfügung zu stellen, die auf Collagen/ORZ-Mischungen basieren und die ohne chemische Quervernetzung hohe mechanische Festigkeit und lange Resorptionszeiten aufweisen.
Die vorliegende Erfindung stellt einen sterilen gefriergetrockneten Schwamm zur Verfügung, wobei mindestens 80Gew.% des Schwammes aus einer Mischung aus Collagen und oxidierter regenerierter Zellulose in dem Gewichtsverhältnis 60:40 bis 40:60 bestehen, wobei der Schwamm eine trockene Zugfestigkeit von mehr als 3 N und eine nasse Zugfestigkeit größer als 1 N aufweist und wobei der Schwamm durch einen Prozeß erhältlich ist, in dem der Schwamm durch Gammastrahlung sterilisiert wird.
Vorzugsweise ist das Sterilitätssicherheitsniveau besser als 10^–6.
Der Schwamm beinhaltet mindestens 80Gew.% einer Mischung aus Collagen und ORZ in dem Gewichtsverhältnis 60:40 bis 40:60. Bevorzugt enthält das Gewichtsverhältnis einen kleinen Überschuß an Collagen, in einem Bereich 50:50 bis 40:60 ORZ:Collagen. Vorzugsweise besteht der gefriergetrocknete Schwamm im wesentlichen aus Collagen, ORZ, Wasser und bis zu 5% aus einer oder mehreren therapeutisch aktiven Substanzen, wie Wachstumsfaktoren. Bevorzugt besteht der gefriergetrocknete Schwamm aus nicht mehr als 1Gew.% anderer Inhaltsstoffe als Collagen, ORZ und Wasser.
Der Collagengehalt wird durch Hydrolyse des Collagens in seine einzelnen Aminosäuren und durch die Analyse des Hydroxyprolins, wie unten ausführlich beschrieben, festgestellt. Der Collagengehalt wird so berechnet, daß er das 7,19-fache des Hydroxyprolingehalts darstellt. Der ORZ-Gehalt wird durch dessen Hydrolyse in seine einzelnen Monosaccharide und durch die Analyse der Glucoronsäure, wie sie weiter unten ausführlich beschrieben wird, festgestellt.
Vorzugweise hat der gefriergetrocknete Schwamm einen pH von 2,3 bis 4,0, bevorzugt von 2,5 bis 3,0, der wie hier später beschrieben gemessen wird.
Vorzugsweise haben die erfindungsgemäßen sterilen gefriergetrockneten Schwämme einen Collagendenaturierungsgrad, der wie hier später beschrieben gemessen wird, von weni ger als 15%, vorzugsweise von weniger als 10%, und am meisten bevorzugt von weniger als 5%. Es ist eine besonders vorteilhafte Eigenschaft der erfindungsgemäßen gefriergetrockneten Schwämme, daß das Collagen gegen Denaturierung durch Gammastrahlung, die bei der Sterilisation benutzt wird, stabilisiert ist. Der Denaturierungsgrad des Collagens wird durch Behandlung mit Trypsin, um das denaturierte Collagen aufzulösen (Trypsin löst das native Collagen nicht auf), gefolgt von Filtration und Quantifizierung des Hydroxyprolins in dem Filtrat, wie unten ausführlich beschrieben wird, festgestellt.
Die erfindungsgemäßen sterilen gefriergetrockneten Schwämme haben eine trockene Zugfestigkeit (die maximale Belastung wurde wie nachfolgend beschrieben gemessen), die höher als 3 N ist, bevorzugt höher als 4 N. Bevorzugt ist die trockene Zugbelastung bei 20% Ausdehnung, gemessen wie hier später beschrieben, höher als 2,5 N, bevorzugt höher als 3,5 N. Bevorzugt ist die trockene Bruchausdehnung, wie hier später beschrieben gemessen, von 15 bis 30%, vorzugsweise von 20 bis 25%.
Die Zugstärkemerkmale der Schwämme gemäß der vorliegenden Erfindung werden weiterhin charakterisiert durch Naßstärkemessungen von Proben, die vor dem Test für 15 Minuten in PBS getränkt wurden. Die resultierende Maximalbelastung der Naßstärke ist höher als 1 N, vorzugsweise höher als 1,25 N. Die Naßbelastung bei 20% Ausdehnung ist höher als 0,1 N, vorzugsweise höher als 0,2 N, am besten 0,2 bis 0,3 N. Die Naßbruchausdehnung beträgt bevorzugt 75 bis 100%, vorzugsweise 80 bis 90%.
Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen sterilen gefriergetrockneten Schwämme nicht chemisch quervernetzt. Es kann eine geringe dehydrothermale Quervernetzung als ein Ergebnis des Gefriertrocknungsprozesses auftreten, aber bevorzugt gibt es keine chemische Quervernetzung durch Glutaraldehyd oder ähnlichem. Das reduziert die Antigenität und die Herstellungskosten der Schwämme. Die vorliegende Erfindung erreicht zufriedenstellende physikalische Eigenschaften der Schwämme und ausreichend lange Resorptionszeiten in vivo durch sehr sorgfältige Kontrolle der Zusammensetzung und der Herstellungsbedingungen der Schwämme. Im besonderen beinhalten die Schwämme vorzugsweise ORZ-Fasern, wobei ein Volumenanteil von mindestens 80% der Fasern Längen in dem Bereich von 20 μm bis 1000 μm aufweisen. Solch eine Größenverteilung kann beispielsweise dadurch erreicht werden, daß man ORZ-Gewebe mahlt und das gemahlene Puder im folgenden siebt, um Fasern außerhalb des Größenbereichs zu entfernen. Vorzugsweise liegt der Längendurchschnitt (Volumendurchschnitt) der ORZ-Fasern in einem Bereich von 250 μm bis 450 μm.
Die Auswahl der ORZ-Faserlänge in diesem Bereich führt zu einer einfachen Mischbarkeit des ORZs und Collagens und zu hoch homogenen Produkten. Das ORZ wird sorgfäl tiger mit dem Collagen komplexiert, was zu verbesserten therapeutischen Eigenschaften des Schwammes führt. Des weiteren reduziert das ORZ die Collagendenaturierung durch Gammastrahlen während der Sterilisation effektiver. Überraschenderweise können trotz der kleinen Größe der ORZ-Fasern diese Vorteile erreicht und gleichzeitig die Zugfestigkeit der Schwämme erhalten werden
Die erwünschten physiochemischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen gefriergetrockneten Schwämme werden des weiteren durch den Einsatz von Collagen, das sequentiellen, alkalischen und sauren Behandlungsschritten unterzogen wurde, um das Collagen substantiell zu reinigen ohne Collagenfasern zu denaturieren, erreicht. Vorzugsweise liegt die Gesamtkeimzahl (TVC) des gefriergetrockneten Schwammes gemäß der vorliegenden Erfindung bei weniger als 100 cfu/g, besser bei weniger als 10 cfu/g, und am besten bei weniger als 1 cfu/g.
Die sterilen gefriergetrockneten Schwämme gemäß der vorliegenden Erfindung haben eine hohe und einheitliche Porosität, und eine hohe Flüssigkeitsabsorptionskapazität. Die gemessene Absorption der nicht-kompremierten Kissen in 0,9% Salzlösung ist vorzugsweise höher als 12 g/100 cm², bevorzugter höher als 15 g/100 cm². Vorzugsweise hat der erfindungsgemäße sterile gefriergetrocknete Schwamm unter simulierten physiologischen Bedingungen eine Resorptionszeit, wie sie weiter unten genauer beschrieben wird, von mehr als 48 Stunden.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine Herstellungsmethode für ein gefriergetrocknetes Schwammkissen zur Verfügung, das folgende Schritte beinhaltet:

das Bereitstellen einer angesäuerten Paste aus gereinigten Collagenfasern, wobei das Collagen zu weniger als 10% denaturiert ist;
das Bereitstellen oxidierter regenerierter Zellulosefasern, wobei mindestens 80% der besagten Fasern Längen in dem Bereich von 20 μm bis 1000 μm aufweisen;
die Kombination besagter Collagen- und besagter ORZ-Fasern in einer homogenen, wäßrigen Dispersion bei einem Gewichtsverhältnis von 60:40 bis 40:60 Collagen:ORZ, wobei die wäßrige Dispersion bis zu einem pH im Bereich von 2,8 bis 3,2 angesäuert wird und eine totale Feststoffkonzentration von 0,8 bis 1,2Gew.% aufweist;
das Einfüllen besagter wäßriger Dispersion auf Tabletts mit einer Tiefe von mehr als 1 cm;
das Einfrieren der Dispersion bei einem Temperaturprogramm niedriger als –30°C, gefolgt von einer Temperatur zur Gefriertrocknung und zum dehydrothermalen Quervernetzen bis zu einem Restfeuchtegehalt von 5 bis 15Gew%;
das Aufspalten der gefriergetrockneten Dispersion, um Oberflächenschichten zu entfernen und ein oder mehrere Kissen übrig zu lassen; und
das Sterilisieren des einen oder der mehreren Kissen durch Gammabestrahlung.

Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren im wesentlichen ohne den Einsatz jeglicher chemischer Quervernetzungsagenzien ausgeführt.
Vorzugsweise beinhaltet der Schritt der Collagenbereitstellung die folgenden Schritte:

das Bereitstellen frischer und nicht geschwollener Stücke des Rindercoriums;
die Behandlung der Coriumstücke mit einer Lösung, die Natriumhydroxid und Wasserstoffperoxid enthält, um das Corium anschwellen zu lassen und zu sterilisieren;
dann die Behandlung des Coriums mit einer wäßrigen Alkalilösung bei einem pH höher als 12 und einer Temperatur niedriger als 50°C für eine Zeitdauer von 10 bis 14 Tagen;
dann das Behandeln des Coriums mit einer wäßrigen Säurelösung bei einem pH von 0,8 bis 1,2 und Temperaturen unter 50°C bis der pH der Coriumstücke unter 2,5 fällt;
dann das Waschen des Coriums und Vermischen des Coriums mit ausreichend Wasser, um eine Paste zu formen.

Diese Behandlung führt zu einem Collagen mit außergewöhnlicher Reinheit und Einheitlichkeit ohne eine signifikante Collagendenaturierung. Die Collagenpaste kann in dem gefrorenen Stadium aufbewahrt werden, aber vorzugsweise wird das Collagen zwischen den oben genannten Schritten und dem Schritt der Kombination des Collagens mit dem ORZ nicht gefriergetrocknet.
Vorzugsweise enthält der Schritt zur Bereitstellung oxidierter, regenierter Zellulosefasern das Mahlen eines oxidierten, regenerierten Zellulosegewebes und das Screenen der gemahlenen Partikel, um Partikel zu entfernen, die eine Größe von kleiner als 20 μm oder größer als 1000 μm aufweisen.
Vorzugsweise enthält der Schritt des Vermischens des Collagens und des ORZs die Schritte:

das Hinzufügen einer säuregeschwollenen Collagen-/Wasserpaste zu angesäuertem Wasser;
das Hinzufügen oxidierter, regenerierter Zellulosefasern zu dem angesäuerten Wasser;
und das Homogenisieren der sich daraus ergebenden Mixtur.

Detaillierte Beschreibung
Die Dispersion wird in Tabletten mit einer Tiefe von mindestens 10 mm gefüllt, bevorzugt mindestens 20 mm, und in den Tabletten zu Blöcken gefroren bevor sie gefriergetrocknet werden. Das Einfrieren wird vorzugsweise durchgeführt, indem man die Tabletten, die die wäßrige Masse enthalten, auf vorgekühlte Platten bei –55°C plaziert. Die Tabletten werden dann in einen Gefriertrockner gestellt, und für zwei Stunden bei –50°C gehalten, dann, bevor der Gefriertrocknungszyklus begonnen wird, bei –40°C gehalten. Diese Gefriermethode ergibt einheitliche verteilte Eiskristalle und somit einheitlichere Produkte als einfaches Schockgefrieren der wäßrigen Masse in den Tabletten.
Vorzugsweise wird der Schritt der Gefriertrocknung mit einer dehydrothermaler Quervernetzung ausgeführt, indem ein Temperaturprogramm im Bereich –40°C bis +30°C eingesetzt wird, um Blöcke aus gefriergetrocknetem Material zu erhalten. Die Blöcke werden abgespalten, um die Oberflächenschichten zu entfernen und um ein oder mehrere Kissen bereitzustellen. Das Einfüllen von Collagen- und ORZ-Fasern in Tabletten führt zu der erwünschten Orientierung von Collagen- und ORZ-Fasern in den fertigen Kissen. Des weiteren sichert das Abspalten der fertigen Kissen von einem größeren Block, daß sie eine hohe Homogenität und Oberflächeneinheitlichkeit aufweisen
Der Sterilisationsschritt wird bevorzugt durch Gammastrahlung bei einer Dosis von 18 bis 29 KGy ausgeführt. Es wurde entdeckt, daß überraschend wenig Collagendenaturierung in dem Sterilisationsschritt stattfindet, was vielleicht auf einen stabilisierenden Effekt des ORZs zurückzuführen ist.
In bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens beträgt das Gewichtsverhältnis von Collagen zu oxidierter, regenerierter Zellulose von 50:50 bis 55:45 und der pH der wäßrigen Dispersion ist 2,9 bis 3,1.
Eine spezifische Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens und des Produkts wird jetzt durch Beispiele weiter beschrieben werden.
Beispiel 1
Ein gefriergetrockneter Collagen-/ORZ-Schwamm wird wie folgt hergestellt.
Zuerst wird die Collagenkomponente wie folgt aus Rindercorium hergestellt. Das Rindercorium wird von der Kuhhaut entfernt, abgeschabt und in Natriumhypochloritlösung (0,03% w/v) getaucht, um die mikrobielle Aktivität vor der weiteren Prozessierung zu inhibieren.
Das Corium wird dann mit Wasser gewaschen und mit einer Lösung, die Natriumhydroxid (0,2% w/v) und Wasserstoffperoxid (0,02% w/v) enthält, behandelt, um das Corium bei Umgebungstemperatur schwellen zu lassen und zu sterilisieren.
Die Coriumstücke werden dann einem alkalischen Behandlungsschritt in einer Lösung unterzogen, die Natriumhydroxid, Calciumhydroxid und Natriumbicarbonat (0,4% w/v, 0,6% w/v bzw. 0,05% w.v,) enthält bei einem pH größer als 12,2, Umgebungstemperatur, und für eine Zeitdauer von 10 bis 14 Tagen, mit Rotation, bis ein Amidstickstoffniveau unter 0,24 mmol/g erreicht ist.
Die Coriumstücke werden dann mit 1 % Salzsäure bei Umgebungstemperatur und pH 0,8 bis 1,2 einem Säurebehandlungsschritt unterzogen. Die Behandlung wird unter Rotation fortgesetzt bis die Coriumstücke genügend Säure absorbiert haben, um einen pH unter 2,5 zu erreichen. Die Stücke werden dann mit Wasser gewaschen bis der pH-Wert der Coriumstücke 3,0 bis 3,4 erreicht.
Die Coriumstücke werden dann mit Eis in einem Häcksler zerkleinert, zuerst mit einer groben Zerkleinerungs- und dann mit einer feinen Zerkleinerungseinstellung. Die resultierende Paste, die aus einem Anteil von 650 g Coriumstücke zu 100 g Wasser in Eisform besteht, wird eingefroren und bis zu dem nächsten Prozeßschritt aufbewahrt. Das Collagen wird jedoch nicht gefriergetrocknet, bevor es mit dem ORZ im nächsten Schritt gemischt wird.
Die ORZ-Komponente des gefriergetrockneten Kissens wird wie folgt hergestellt. Ein SURCICEL^®-Gewebe (Johnson & Johnson Medical, Arlington) wird gemahlen, indem man einen Rotationsmesserschneider mit einer Siebplatte einsetzt, während man die Temperatur unter 60°C hält.
Das gemahlenen ORZ-Pulver und das erforderliche Gewicht (in Bezug auf den Feststoffinhalt) der gefrorenen Collagenpaste werden dann zu einer ausreichenden Wassermenge, die mit Acetatsäure angesäuert wurde, gegeben, um einen pH-Wert von 3,0 und einen Gesamtfeststoffgehalt von 1,0% zu erhalten. Die Mischung wird durch einen Fryma^® MZ130D Homogenisierer homogenisiert, indem die Einstellungen fortschreitend erniedrigt wurden, um eine homogene wäßrige Masse herzustellen. Der pH der wäßrigen Masse wird bei 2,9 bis 3,1 gehalten. Die Temperatur der wäßrigen Masse wird unter 20°C gehalten und der Feststoffgehalt wird bei 1% ± 0,07 gehalten.
Die resultierende wäßrige Masse wird zu einem Entgasungsreaktor gepumpt. Es wird für mindestens 30 Minuten Vakuum angelegt, unter gleichzeitigem Rühren, um die wäßrige Masse zu entgasen. Die wäßrige Masse wird dann in Gefriertrocknungstabletts mit einer Tiefe von 25 mm gepumpt. Die Tabletts werden auf Gefrierplatten plaziert, deren Temperatur auf – 40°C voreingestellt wurde. Dann wird das Gefriertrocknungsprogramm gestartet, um das Collagen und das ORZ zu trocknen und dehydrothermal querzuvernetzen, so daß sie dicke Schwammkissen bilden.
Nach Beendigung des Zyklus wird das Vakuum entfernt, die gefriergetrockneten Blocks werden entfernt und werden dann gespalten, um die Ober- und Bodenoberflächenschichten zu entfernen und um den Rest der Blöcke in 3 mm dicke Kissen zu zerteilen. Der Schritt der Spaltung der gefriergetrockneten Blöcke in Kissen wird mit einem Fecken-Kirfel-K1-Schneider ausgeführt.
Letztendlich werden die Kissen mit einer Stanze auf die erwünschte Größe und Form gestanzt, verpackt und mit 18 bis 29 KGy Cobalt 60 Gammabestrahlung sterilisiert. Überraschenderweise verursacht diese Bestrahlung eine signifikante Denaturierung des Collagens, welches durch die Abwesenheit von ORZ stabilisiert zu werden scheint.
Die daraus resultierenden gefriergetrockneten Collagen-ORZ-Kissen haben eine einheitliche, weiße, samtige Erscheinung. Die Dicke der Kissen beträgt 3,2 ± 0,17 mm (N = 8 Chargen). Der Collagengehalt beträgt 54% ± 3,8% (N = 12 Chargen). Der Hydroxyprolingehalt beträgt 7,6 ± 0,5% (N = 12 Chargen). Der Carboxylatgehalt beträgt 10,98 ± 0,81% (N = 12 Chargen). Der Aschegehalt beträgt 0,16 ± 0,1 % (N = 12 Chargen). Der Schwermetall (Belastungs-) gehalt liegt niedriger als 1 ppm. Der pH ist 2,78 ± 0,15. Der Denaturierungslevel ist 4,87 ± 1,54%. Der Endotoxinlevel ist 33,5 ± 0,9 cfu/g. Das Niveau der Gesamtkeimzahl ist 0,2 ± 0,3 cfu/g. Der Feuchtegehalt (Verlust bei der Trocknung) ist 12,0 ± 12,8%.
Verfahren 1
Der Collagengehalt der Materialien gemäß der vorliegenden Erfindung wird wie folgt gemessen:
Kurz gesagt, wird Collagen in seine einzelnen Aminosäuren hydrolysiert. Die Menge der Aminosäure Hydroxyprolin wird festgestellt, indem man sie mit Chloramin-T oxidiert und anschließend mit 4-Dimethylaminobenzaldehyd verbindet, um ein farbiges Produkt herzustellen, dessen Konzentration spectophotometrisch bei 550 Nanometern gemessen wird.
Die Hydrolyse der Proben wird mit 6 molarer Salzsäure bei 105°C ausgeführt bis der Verdau vollständig ist, was mindestens 16 Stunden dauert. Die Lösung wird dann mit 6 molarer NaOH-Lösung auf pH 6 neutralisiert. Die Lösung wird dann verdünnt. Typischerweise benötigt das Verfahren 1 ml 6 molarer HCl für eine 10 mg Probe und das Endvolumen für die Analyse nach der Verdünnung ist 500 ml.
Eine 1 ml Probe der Testlösung wird mit 1,0 ml einer Oxidationslösung behandelt, die durch das Auflösen von 7 gm Chloramin-T in 600 ml Citratpuffer hergestellt wurde. Dem Gemisch wird es erlaubt für 10 Minuten zu stehen, wonach 1,0 ml 20%ige Perchlorsäure hinzugefügt wird, gemischt und bei Raumtemperatur für 5 Minuten stehen gelassen wird.
Die Mischung wird dann mit 1,0 ml eines Farbreagens, das durch die Auflösung von 30 gm 4-Dimethylaminobenzaldehyd in 45 ml Perchlorsäure (60% w/v), gefolgt von Verdünnung in 250 ml Propan-2-ol, hergestellt wurde, behandelt. Die Mischung wurde in einem Wasserbad bei 60°C für 20 Minuten behandelt, für 5 Minuten gekühlt, gefolgt von dem Ablesen der optischen Dichte bei 550 Nanometern. Die optische Dichte wird mit Werten, die bei Kontrollproben aus reinem Collagen bei verschiedenen Konzentrationen, reinem Hydroxyprolin mit verschiedenen Konzentrationen und Negativkontrollproben gemessen wurden, verglichen, um den Hydroxyprolingehalt zu erhalten.
Der Collagengehalt der Proben in Gewichtsprozent wird durch Multiplikation des gemessenen Hydroxyprolingehalts in Gewichtsprozent mit 7,19 erhalten.
Verfahren 2
Die Menge des denaturierten Collagens, das in den Materialien gemäß der vorliegenden Erfindung vorhanden ist, wird wie folgt bestimmt.
Kurz gesagt, wird natives Collagen durch seine trippelhelikale Struktur gegen proteolytische Enzyme geschützt, außer für spezifische Collagenasen. Wenn die helikale Struktur geschädigt ist, ist das sich ergebende denaturierte Collagen für andere Proteasen, wie Typsin, zugänglich und wird zu Peptiden abgebaut. In diesem Prozeß wird das trypsinresistente, native Collagen von dem abgebauten Peptiden durch Salzpräzipitation abgetrennt und das nichtnative Collagen, das in dem Filtrat vorhanden ist, wird durch Hydroxyprolinanalyse quantifiziert.
Eine Probe des erfindungsgemäßen Materials (100 mg) wird in eine 50 ml konische Flasche eingewogen. In die Flasche werden 10 ml Tris-HCl-Pufferlösung zugefügt, die 500 Einheiten Trypsin enthält. Negativexperimente ohne Trypsinenzym werden auch ausgeführt. Die Mischungen werden bei 4°C für 5 Stunden geschüttelt. Dann werden 2,5 ml 25%ige NaCl in 3 molarer Essigsäure zu jedem Behältnis hinzugegeben und sorgfältig gemischt. Die Behältnisse werden dann in einen Kühlschrank bei 4°C für mindestens 16 Stunden gestellt. Der gekühlte Extrakt wird durch Whatman-541-Filterpapier in 50 ml-Bechergläser gefiltert und der Hydroxyprolingehalt einer Probe des Filtrats wird durch die Methode gemäß Verfahren 1 gemessen. Das denaturierte Collagen wird als das 7,19-fache des gemessenen Hydroxyprolinlevels berechnet und der Prozentsatz des denaturierten Collagens wird durch den Vergleich mit dem totalen Collagengehalt, der durch Verfahren 1 gemessen wird, berechnet.
Verfahren 3
Der ORZ-Gehalt der Materialien gemäß der vorliegenden Erfindung wird durch ein Verfahren gemessen, das dem ähnlich ist, das von Bitter und Muir in der Analytical Chemistry, Band 4 (1962), Seiten 300 bis 334 beschrieben wird.
Kurz gesagt, wird das Material in seine einzelnen Komponenten hydrolysiert, indem man Schwefelsäure benutzt. Bei der Hydrolyse zerfällt das ORZ in Glucuronsäure (schätzungsweise 80%) und Glucose (20%). Die Glucuronsäuremoleküle gehen dann mit Carbozol eine Farbreaktion ein, dessen Absorption im Vergleich zu einer Serie von ORZ-Standards gemessen wird, um eine Abschätzung des ORZ-Gehalts abzugeben.
Proben des getesteten Materials (10 mg) werden in Hydrolysierungsröhrchen gegeben. Entionisiertes Wasser (0,5 ml) und konzentrierte Schwefelsäure (3 ml) werden zugefügt und das Gemisch wird auf einem Vortexer für 15 Minuten gemischt und auf die komplette Auflösung der Probe hin überprüft.
Eine Teilmenge (0,1 ml) jedes Probehydrolysats wird zu 2,9 ml Natriumtetraboratlösung (0,025 molar in konzentrierter Schwefelsäure) hinzugefügt und unter Einsatz des Vortexers gemischt. Die Proberöhrchen werden für 10 Minuten in ein kochendes Wasserbad gestellt und dann abgekühlt. Dann wird 0,1 ml Carbozollösung (0,125% in Ethanol) zu jedem Röhrchen hinzugesetzt und sorgfältig mit einem Vortexer gemischt, gefolgt von der Platzierung der Röhrchen für 15 Minuten in einem kochenden Wasserbad und anschließendem Kühlen. Die Absorption der resultierenden Lösungen bei 523 Nanometern wird dann gegen einen Null-ORZ-Konzentrationsstandard gemessen.
Verfahren 4
Die Bakterien-, Pilz- oder Hefeorganismenzahl, die in den erfindungsgemäßen Materialien vorhanden sind, wird wie folgt gemessen.
Eine 2 gm-Probe des Materials wird mit 100 ml steriler Ringers-Lösung, die ein Viertel der Stärke aufweist, extrahiert und eine Teilmenge (5 ml) wird auf eine sterile Filtermembran (Porengröße 0,45 m) zur Sterilfiltration gegeben. Die Filter werden auf ein Nährstoffme dium in einer Petrischale gelegt und unter sterilen Bedingungen für 48 Stunden bei 30°C inkubiert, um das Wachstum von Keimkolonien, die mit dem bloßen Auge oder unter einem Stereomikroskop, falls notwendig, gezählt werden können, zu erlauben. Entsprechende Negativkontrollen werden auch ausgeführt.
Die Höhe der mikrobiologischen Verschmutzung der Proben wird als die totale Lebendzahl (TVC) in koloniebildenden Einheiten pro Gramm (cfu/g) gemäß der folgenden Formel ausgedrückt: TVC = [(N × 100)/(5 × W))wobei N die Anzahl der Kolonien ist, W das Gewicht der Probe in Gramm ist, 100 das Volumen der Extraktionslösung in ml ist und 5 das Volumen der Teilmenge ist (5 ml), gefiltert wurde.
Verfahren 5
Die nasse und trockene Zugfestigkeit des erfindungsgemäßen Materials wird wie folgt gemessen.
Proben werden aus einem 3 mm dicken Kissen des Materials gestanzt. Die Probedimensionen sind 2,5 × 12 cm. Die Proben werden in einen Instron-Spannungstester mit Abmessungen von 50 × 25 ml gegeben. Die trockene Zugfestigkeit wird als die Belastung bei 20% Verlängerung und die Belastung bei Bruch gemessen. Die Ausdehnung bei Bruch wird in Prozent des anfänglichen Backenabstands angegeben. Mindestens 5 Proben wurden getestet.
Die Naßstärkemessungen wurden auf dieselbe Weise mit Proben, die 15 Minuten lang in Phosphatpuffersalzlösung (PBS) getaucht worden waren, durchgeführt.
Verfahren 6
Der pH von festen Materialien gemäß der vorliegenden Erfindung wird durch Aufweichung von 100 gm des Materials in 100 ml entionisiertem Wasser und Messung des pHs der resultierenden wäßrigen Masse mit Glaselektrode erhalten.
Verfahren 7
Die Resorptionsrate der zusammengesetzten Materialien gemäß der Erfindung wird in einem Flußaussimulierten Wundenflüssigkeit wie folgt gemessen.
Ein kreisförmiges Kissen des getesteten Materials mit einer Dicke von 3 mm und einem Durchmesser von 6 cm wird in eine zylindrische Einbuchtung gelegt und mit einer Schicht aus flüssigkeitsundurchlässigen Deckmaterial bedeckt. Der simulierte Wundenfluß (3,45 mg/l Collagenase in Phosphatpuffersalzlösung) wurde kreisförmig mit einer Rate von 2,5 ml, 7,5 ml oder 12 ml/24 Stunden von einer Öffnung unter dem Zentrum der getesteten Scheibe zu sechs kreisförmig, um den Rand der getesteten Scheibe und unter der getesteten Scheibe verteilten Öffnungen, um niedrige, mittlere und hohe Wundenausflußraten zu simulieren. Die Resorptionszeit wurde als die Zeit abgeschätzt, die für die komplette Auflösung des getesteten Kissens notwendig war. Die Zeit betrug mindestens zwei Tage bei der hohen Flußrate, mindestens drei Tage bei der mittleren Flußrate und mindestens sechs Tage bei der niedrigen Flußrate.
Verfahren 8
Die Flüssigkeitsabsorption der erfindungsgemäßen Materialien wurde wie folgt gemessen.
Eine Probe (typischerweise 2,5 cm × 2,5 cm × 0,3 cm) des getesteten Materials wurde trocken gewogen und dann in phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) 15 Minuten lang eingetaucht, mit Pinzetten entfernt und wieder gewogen. Die Flüssigkeitsabsorption wurde dann in Gramm absorbierter Flüssigkeit pro Gramm (Trockengewicht) des Materials berechnet.
Verfahren 9
Die Menge bakterieller Enotoxine in den erfindungsgemäßen Materialien wurde wie folgt festgestellt.
Kurz gesagt, verursachen Endotoxine aus grammnegativen Bakterien die Gelierung von Limulusamebocytlysate (LAL). Der Test wird als ein Grenzwerttest durchgeführt, wobei die Probe als positiv oder negativ in Bezug auf den Test eingestuft wird, wenn sie mit etablierten Endotoxinkonzentrationen verglichen wird. Positiv- und Negativkontrollen sind wesentlich und werden mit jedem Testlauf ausgeführt. Die Wirksamkeit des Standardkontrollendotoxins wurde durch Vergleich mit Standardreferenzendotoxinen (USP EC6) verifiziert. De tails des Verfahrens können in Carl Freudenberg, Method 091,102 (Pyrogeniziät); in USP XXIII (1985); in den FDA Guidelines 1987 und in European Pharmacoepia 2.6.14 (1998) nachgesehen werden.

Claims

Steriler gefriergetrockneter Schwamm, wobei mindestens 80Gew.% des Schwammes aus einem Gemisch von Kollagen und oxidierter regenerierter Zellulose in einem Gewichtsverhältnis von 60:40 bis 40:60 besteht, wobei der Schwamm eine trockene Zugfestigkeit von mehr als 3N aufweist und eine nasse Zugfestigkeit von mehr als 1N aufweist und wobei der Schwamm durch ein Verfahren erhältlich ist, bei dem der Schwamm durch Gamma-Bestrahlung sterilisiert wird.
Steriler gefriergetrockneter Schwamm nach Anspruch 1, wobei der Schwamm im wesentlichen frei von chemischen Kreuzvernetzungen ist.
Steriler gefriergetrockneter Schwamm nach Anspruch 1, wobei das Kollagen ein Ausmaß an Denaturierung von weniger als 20% aufweist.
Steriler gefriergetrockneter Schwamm nach Anspruch 3, wobei das Kollagen ein Ausmaß an Denaturierung von weniger als 10% aufweist.
Steriler gefriergetrockneter Schwamm nach Anspruch 3, worin 80% der oxidierten regenerierten Zellulosefasern pro Volumen zwischen 20 μm und 1000 μm lang sind.
Steriler gefriergetrockneter Schwamm nach Anspruch 5, wobei die mittlere Länge der oxidierten regenerierten Zellulosefasern von 250 bis 450 μm ist.
Steriler gefriergetrockneter Schwamm nach Anspruch 1, wobei die oxidierte regenerierte Zellulose in der Form von Fasern vorliegt und mindestens 90% der Fasern pro Volumen weniger als 1 mm lang sind.
Steriler gefriergetrockneter Schwamm nach Anspruch 1, wobei das Verhältnis von Kollagen zu oxidierter regenerierter Zellulose von 50:50 bis 55:45 ist.
Steriler gefriergetrockneter Schwamm nach Anspruch 1, wobei die Biobelastung (TVC) des Schwamms weniger als 100 cfu/g, bevorzugterweise weniger als 10 cfu/g, weiter bevorzugt weniger als 1 cfu/g ist.
Steriler gefriergetrockneter Schwamm nach Anspruch 1, wobei der Schwamm von 5 bis 15Gew.% Wasser enthält.
Steriler gefriergetrockneter Schwamm nach Anspruch 1, wobei eine Lage des Schwammes mit einer Dicke von 3 mm eine nicht komprimierte Absorptionskapazität von 0,9% Kochsalzlösung von 15 bis 20 g/100 cm² aufweist.
Steriler gefriergetrockneter Schwamm nach Anspruch 1, wobei der Schwamm eine Resorptionszeit unter simulierten physiologischen Bedingungen von mehr als 48 Stunden aufweist.
Verfahren zur Herstellung eines gefriergetrockneten Schwammkissens, umfassend die Schritte von: zur Verfügung stellen einer angesäuerten Paste aus gereinigten Kollagenfasern, wobei das Kollagen weniger als 10% denaturiert ist; zur Verfügung stellen von oxidierten regenerierten Zellulosefasern, wobei mindestens 80% der Fasern Längen im Bereich von 20 μm bis 1000 μm aufweisen; Kombinieren des Kollagens und der ORC-Fasern in einer homogenen wässrigen Dispersion in einem Gewichtsverhältnis von 60:40 bis 40:60 Kollagen:ORC, wobei die wässrige Dispersion auf einen pH im Bereich von 2,8 bis 3,8 angesäuert wird und eine gesamte Feststoffkonzentration von 0,8 bis 1,2Gew.% aufweist; Gießen der wässrigen Dispersion in Tabletts auf eine Tiefe von mehr als 1 cm; Frieren der Dispersion auf eine Temperatur unterhalb von 30°C, gefolgt von einem Temperatur-programmierten Gefriertrocknen und dehydrothermalem Kreuzvernetzen auf einen finalen Feuchtigkeitsgehalt von 5–15Gew.%; Aufteilen der gefriergetrockneten Dispersion, um Oberflächenlagen zu entfernen und ein oder mehrere Kissen zurückzulassen; und Sterilisieren der einen oder mehreren Kissen durch Gamma-Bestrahlung.
Verfahren nach Anspruch 13, das im wesentlichen ohne Verwendung von chemischen kreuzvernetzenden Mitteln durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Schritt von zur Verfügung stellen von Kollagen die folgenden Schritte umfaßt: zur Verfügung stellen von frischen und nicht gequollenen Stücken von Rinderkorium; Behandeln der Stücke mit einer Hypochloridlösung, um eine mikrobielle Aktivität zu inhibieren; Behandeln des Koriums mit einer Lösung, die Natriumhydroxid und Wasserstoffperoxid enthält, um das Korium aufzuquellen und zu sterilisieren; dann Behandeln des Koriums mit einer wässrigen Alkalilösung bei einem pH von größer als 12 und einer Temperatur von niedriger als 50°C für eine Zeitdauer von 10–14 Tagen; dann Behandeln des Koriums mit einer wässrigen sauren Lösung bei einem pH von 0,8-1,2 und einer Temperatur von niedriger als 50°C; dann Waschen des Koriums und Zermahlen des Koriums mit ausreichend Wasser, um eine Paste zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Schritt von zur Verfügung stellen von oxidierter regenerierter Zellulosefasern das Mahlen eines oxidierten regenerierten Zel lulosegewebes und ein Sieben der gemahlenen Partikel umfaßt, um Partikel zu entfernen, die eine Größe von weniger als 20 μm oder größer als 1000 μm aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Schritt von Dispergieren des Kollagens und des ORC die Schritte umfaßt von: Hinzufügen einer Säure-gequollenen Kollagen/Wasser-Paste zu angesäuertem Wasser; Hinzufügen von oxidierten regenerierten Zellulosefasern zu dem angesäuerten Wasser; und Homogenisieren des sich ergebenden Gemisches.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Schritt von Gefrieren durch Plazieren der Tabletts, die die wässrige Dispersion enthalten, auf gekühlte Regale in einem Gefriergerät durchgeführt wird, gefolgt von Halten der Tabletts bei einer Temperatur von unterhalb von –30°C bis zur Vervollständigung des Einfrierens.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Schritt von Gefriertrocknen mit dehydrothermalem Kreuzvernetzen durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Schritt von Sterilisieren durch Gamma-Bestrahlung bei einer Dosis von 18–29 KGy durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Gewichtsverhältnis von Kollagen zu oxidierter regenerierter Zellulose von 50:50 bis 55:45 ist und der pH der wässrigen Dispersion von 2,9 bis 3,1 ist.