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Verfahren zur Herstellung eines sterilen Kollagenproduktes mit filz-
bzw. vliesartiger Faserstruktur Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung
eines sterilen Kollagenproduktes mit filz- bzw. vliesartiger Faserstruktur. Dieses
Kollagenprodukt ist in der Medizin als Wundabdeckungs- bzw. tiiündverklebungsmaterial
und zum Ausfüllen von pathologischen Knochenhohiräumen verwendbar.
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Es ist an sich bekannt, aus tierischen Geweben hergestellte Kollagenprodukte
zur Wundabdeckung und Wundverklebung zu verwenden. Im brit. Patent Nr. 1.147.072
ist ein Wundabdeckupgsmaterial beschrieben, das aus einem durch Schäumen eines Kollagensols
erzeugten Kollagenschwamm und einer mit letzterem verklebten Kollagenfolie zusammengesetzt
ist. Im südafrikanischen Patent Nr.
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6705.871 ist ein
Kollagenprodukt beschrieben, das
aus mikrokristallinem kolloidalem Kollagen besteht und dazu bestimmt ist, als Mischkomponente
mit anderen Wirksubstanzen in kosmetischen und pharmazeutischen Präparaten verwendet
zu werden. Auf dem Markt ist ferner ein Kollagenpräparat in Form eines leichten
flockigen Pulvers erhältlich, das zwar eine -hämostatische Wirkung ausübt, aber
schwer in die Tiefe einer Wunde einzuführen ist und bei stärkeren diffusen Blutungen
weggespült wird.
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Um bei der Wundheilung mittels Kollagen optimale Resultate zu erzielen,
müsste man über ein Kollagenprodukt verfügen, das gleichzeitig die folgenden Eigenschaften
in sich vereinigen sollte: 1. eine hämostatische Wirkung ausüben; 2. gegenüber Körperflüssigkeiten
ein gutes Absorptionsvermögen aufweisen; 3. eine die Neubildung von Geweben, insbesondere
Knochengewebe, fördernde Wirkung ausüben; 4. eine gute Resorbierbarkeit aufweisen;
5. eine möglichst geringe Antigenwirkung ausüben, und 6. für das Aufbringen auf
bzw. Einführen in Wunden oder pathologische Knochenhöhlen optimale mechanische Eigenschaften
besitzen.
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Die in der Literatur beschriebenen oder im Handel erhältlichen Kollagenprodukte
besitzen die eine oder andere dieser Eigenschaften, jedoch nicht alle zusammen.
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Es wurde nun gefunden, dass man durch eine neuarige Kombination von
chemischen und physikalischen Behandlungen von kollagenhaltigen Geweben von Schlachttieren
ein Kollagenprodukt erhalten kann, das eine filz- bzw. vliesartige Struktur aufweist
und die oben definierten Forderungen voll erfüllt.
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Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines
sterilen Kollagenproduktes mit filz- bzw.
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vliesartiger Faserstruktur durch Entfettung vonlollagenhaltigem Gewebe
von Schlachttieren, Extraktion des entfetteten Gewebes mit Elektrolytlösungen zur
Entfernung von nichtkollagenen löslichen Ballaststoffen, Behandlung des erhaltenen
Gewebes mit einem proteolytischen, die Grundstruktur des Kollagens nicht angreifenden
Enzym zwecks Entfernung von nicht-kollagenen proteinartigen Begleitsubstanzen und
Telopeptiden, Reinigung des erhaltenen Rohkollagens durch Umfällung, Entsalzung
des gereinigten Kollagens, Lösen des gereinigten und entsalzten Kollagens in Wasser,
Gefriertrocknen des Kollagens und Sterilisation des getrockneten Kollagens.
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Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass
man das kollagenhaltige Gewebe-bei 400C nicht übersteigenden Temperaturen sehr fein
zerkleinert und
die Entfettung und die Entfernung der unerwunschten
wasserlöslichen Ballaststoffe gleichzeitig durchführt, indem man den Gewebebrei
mit dem 5-fachen Volumen 5-l5%iger wässriger NaCl-Lösung, die 0,2-1°/oo Natriumazid
als Konservierungsmittel und ein fettdispergierendes Netzmittel enthält, mehrmals
extrahiert.
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Als Ausgangsmaterial zur Durchführung des er-'-indungsgemässen Verfahrens
kann man z.B. Häute, Sehnen oder Knochen von Schlachttieren, z.B. Schweinen oder
Rindern, verwenden.
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Das erfindungsgemässe Verfahren kann im einzelnen wie folgt durchgeführt
werden: Das kollagenhaltige Gewebematerial, z.B. Schweinehaut6 wird bei 40°C nicht
übersteigenden Temperaturen fein zereinert. Vorzugsweise wird das Gewebematerial
vor dem Zerkleinen zur -10 bis -20°C abgekühlt. Der Gewebebrei wird dann mit etwa
5-fachen Volumrnenge 5-15%iger, vorzugsweise lO%oiger wässrige NaCl-Lösung, die
0,1-1°/oo Natriumazid als Konservierungsmitte-und 0,5-2 Ges.% eines nicht-ionischen
fettdispergierenden Netz mittels enthält, extrahiert. Durch diese Extraktion werden
dem Gewebe unerwünschte wasserlösliche Ballaststoffe und das Fett entzogen. Als
Netzmittel können z.B. die für Haushaltzwecke bestimmten Wasch- und Reinigungsmittel
verwendet werden. Das als Konservierungsmittel verwendete Natriumazid hat gegenüber
den
bisher verwendeten organischen Konservierungsmitteln den Vorteil, dass es in Wasser
leicht löslich und deshalb leicht auswaschbar ist. Diese Extraktion wird mehrmals,
z.B. zweimal, wiederholt.
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Der so entfettete fasrige Gewebebrei wird zur pH-Umstellung mit Wasser
oder mit 0,1- bis 5%iger Ameisen-, Essig- oder Zitronensäure oder einer anderen.
ähnlich wirkenden organischen aliphatischen Säure, vorzugsweise mit 3%iger Essigsäure
gewaschen und anschliessend im 5-fachen Volumen 0,1-5°,bizer, vorzugsweise'3%iger
Essigsäure, der 1 Gew. °/oo, bezogen auf das Gewicht des eingesetzten Gewebematerials,
eines prcteolytischen Enzyms, vorzugsweise Pepsin, und 1°/oo Chloroform as Konservierungsmittel
zugesetzt worden sind, bei pH 2,5-3,5 verdaut. Dabei werden nicht-lcollagene proteinartige
i3 0 Begleibstarzen und die sogenannten Telopeptide die weitgehend für die Antigenität
des Kollagens verantwort1'h sind, abgebaut, ohne dass die eigentlichen Kollagenfadenmoleküle
in kleine Peptide aufgespalten werden. Nach 8-48 Stunden Reaktionszeit wird die
homogene stark viskoses Kollagensustiension durch eine G l-Glassinternutsche oder
durch ein entsprechen feines rostfreles Drahtsieb filtriert. Aus dem viskosen Filtrat
wird das Kollagen durch Zugabe von gesättigter NaCl-Lösung bis zur Erzielung einer
Konzentration von etwa 3-5 NaC1 ausgefällt. Zur Inaktivierung des im Reaktionsgemisch
verbleibenen Pepsin wird der pH-Wert des erhaltenen Kollagenbreies zur Zugabe von
Alkalihydroxydlösangen, vorzugsweise Natron-«ugeS auf pH 8,6-88 eingestellt.
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Nach 1/2-1 Stunde wird das erhaltene Rohkollagen zentrifugiert. Das
Rohkollagen wird durch Lösen in 0,05-5%iger Lösung einer der zuvor genannt organischen
Säuren, vorzugsweise in 3siger Essigsäure und Fällung mittels NaCl oder KCl-gereinigt
Das ausgefällte Kollagen wird durch Zentrifugation abgetrennt.
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Diese Reinigung wird zweckmässigerweise wiederholt. Das so erhaltene
gereinigte Kollagen wird zur Entfernung des von der Fällung herrührenden Salzes
so lange mit 60-75, vorzugsweise 70 volumenprozentigem wässrigem Aethylalkohol gewaschen,
nis der Salz-Gehalt des Kollagens zwischen 0 und 0,9d01liegt, bezogen auf das Gewicht
des Trockenrückstandes des Kollagenreises. Das entsalzte Reinkollagen wird durch
Zentrifugieren cder Abnutschen von überschüssigem Alkohol befreit. Kleine Bestmengen
von Alkohol beeinträchtigen die weitere Verarbeitung nicht. Die Entsalzung des Kollagens
kann auch durch Ultrafiltration oder Dialyse durchgeführt werden.
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Das gereinigte und entsalzte Kollagen wird in entmineraMsiertem oder
destilliertem Wasser, gegebenenfalls unter Zusatz von bis zu 3% Essig- oder Ameisensäre
in einer Konzentration gelöst, welche einem Trockenrückstand von 0,5 bis 2 Gew.%
entspricht. Das wässrige Kollagen wird dann der Gefriertrocknung unterworfen. Das
entwässerte Kollagen kann in Beutel aus Kunststoff-Folien, z.B. Polyäthylen, verpackt
werden, die durch Verschweissen verschlossen werden können. Das Kollagenprodukt
wird in der Verpackung durch Bestrahlung mit einer Dosis von 2-3,5 Mrad Y-Strahlen
sterilisiert.
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Je nach der Form des Gefässes, in welchem die Gefriertrocknung des
Kollagens durchgeführt wird, kann das Kollagenprodukt z.B. in Form von Scheiben
oder quadratischen bzw. rechteckigen Platten erhalten werden.
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Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte Kollagenprodukt
weist eine filz- bzw. vliesartige Faserstruktur auf, in welcher die Zwischenräume
oder Hohlräume zwischen den Fasern kommunizierend sind, was zur Folge hat, dass
das Kollagenmaterial eine grosse Saugfähigkeit für Körperflüssigkeiten besitzt.
Das erfindungsgemäss hergestellte Kollagenprodukt ist biegsam und lässt sich leicht
in Stücke der gewünschten Grösse und Form schneiden und somit bequem auf Wunden
aufbringen, in Wunden einsetzen oder mittels chirurgischen Klebern an Wunden aufkleben.
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Das Kollagenprodukt weist ausserdem eine hohe hämostatische Aktivität
auf und ist sehr leicht resorbierbar. Es besitzt ferner die Eigenschaft, die Neubildung
der Gewebe, insbesondere der Knochengewebe, stark zu fördern, was in der chirurgischen
Orthopädie von besonderer Wichtigkeit ist.
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Nach den bisherigen Erfahrungen übt das erfindungsgemäss hergestellte
Kollagenprodukt praktisch keine antigene Wirkung aus.
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Das vorliegende Kollagenprodukt eignet'sich ganz allgemein zur oberflächlichen
Wundabdeckung zwecks Beschleunigung der Wundheilung und gewährt Schutz gegen Infektionen
und Dehydratation. Es eignet sich ferner als Hämostypticum bei
parenchymatösen
Blutungen und als Trägermaterial für chirurgische Kleber zur Gewebeverkiebung sowie
als Füllmaterial für pathologische Knochenhohlräume und ersetzt dadurch die Spongiosa
plastik in der chirurgischen Orthopädie. Vergleichsweise sind die in der Literatur
beschriebenen und im Handel erhältlichen Kollagenprodukte für diesen Zweck völlig
unbrauchbar. Die Verwendung des erfindungsgemäss hergestellten Kollagenmaterials
ist in folgenden Fällen angezeigt: Behandlung von Ulcera, Behandlung von Verbrennungswunden,
Hämostase in der Thoraxchirurgie, Hämostase bei Leber- und Milzverletzungen, Hämostase
bei Prostatektomien, Verklebung von Gefässnähten oder von Rupturen parenchymer Gewebe,
die sich nur schwer vernähen lassen.
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Das erfindungsgemäss hergestellte Kollagenprodukt kann vor der Applikation
mit physiologisch wirksamen Stoffen z.B. Antibiotika, Desinfektionsmitteln, Blutplasma,
physiologischer Kochsalzlösung, Lokalanästhetikaa etc.> getränkt bzw. beladen
werden.
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Beispiel 1 1 kg Schweinehaut wurde bei -10 bis -20°C eingefroren
und während 10-20 Minuten mit einem Messerhomogenisator hoher Tourenzahl sehr fein
zerkleinert. Die Temperatur des Mahlgutes wurde durch Zugabe von Eisstückchen unter
+400C gialten.
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Der erhaltene zähe fasrige Gewebebrei wurde in 5 Liter 10%iger NaCl-Lösung,
die 2,5 g Natriumazid und 50 ml einer 10%eigen wässrigen Lösung des nicht-ionischen
Netzmittels NP 55/52 (Polyoxyäthylennonylphenyläther) enthielt, unter kräftigem
Rühren suspendiert. Die Suspension wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur weitergerührt
und anschliessend zentrifugiert. Der grau bis bräunlich gefärbte trübe Ueberstand,
der Fett und unerwünschte wasserlösliche Ballaststoffe enthielt, wurde verworfen.
Der zurückbleibende weisse Hautfaserbrei wurde noch zweimal in der gleichen Weise
extrahiert, wobei der Extraktionsflüssigkeit pro Liter 0,1 Mol Dinatriumhydrogenphosphat
zugesetzt wurde Der zurückbleibende Hautfaserbrei wurde in 3 Liter 3%iger Essigsäure
aufgerührt und zentrifugiert. Das feste Zentrifugat wurde in 5 Liter 3%iger Essigsäure,
die ig Pepsin und 5 ml Chloroform enthielt, suspendiert. Man liess die Suspension
über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Die proteolysierte viskose farblose bis schwach
milchige Kollagensuspension wurde durch ein feines rostfreies Drahtnetz am Vakuum
abgenutscht.
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Dem viskose Filtrat wurde unter Rühren langsam gesättigte NaCl-Lösung
(etwa 36d,oig) zugegeben, bis der NaCl-Gehalt des Gemisches etwa 5% betrug. Dabei
fiel das Kollagen als fasrig-flockiger weisser Niederschlag aus. Die restlichen
Spuren von Pepsin wurden durch Behandlung des Niederschlages mit 500 ml 30%igem
wässrigem NaOH während 2 Stunden inaktiviert.
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Das Kollagen wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, in 5 Liter 3%iger
Essigsäure bei pH 3-4 gelöst, durch Zugabe von gesättigter wässriger NaCl-Lösung
gefällt und zentrifugiert. Diese Operation wurde noch zweimal wiederholt.
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Der NaCl-haltige Kollagenrückstand wurde mit etwa 70%igem Aethylalkohol
1/2 Stunde lang aufgerührt. Das alkoholhalEge Gemisch wurde zentrifugiert. Diese
Operationen wurden wiederholt, bis das abgeschiedene Kollagen einen NaCl-Gehalt
von 0,006, bezogen auf das Gewicht des Trockenrückstands, aufwies.
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Das gereinigte und entsalzte Kollagen wurde in 3 Volumen 10%Der Essigsäure
gelöst und mit destilliertem Wasser (etwa 2,5 bis 5-fache Volummenge) soweit verdünnt,
dass die Kollagenkonzentration einen Trockenrückstand von 1% entsprach. Die viskose
Kollagenl8sung wurde durch eine G 1-Glassinternutsche filtriert, in kreisrunde Glasschalen
abgefüllt und lyophilisiert. Die auf diese Weise erhaltenen scheibenförmigen, etwa
0,5 cm dicken Kollagenplatten wiesen eine filz- bzw. vliesartige Struktur auf. Die
Kollagenplatten
wurden in Beutel aus Polyäthylenfolie ver-packt,
welche durch Verschweissen verschlossen wurden. Die verpackten Kollagenpiatten wurden
durch Bestrahlen. mit einer Dosis von 2,5 Mrad X-Strahlen sterilisiert.
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Beispiel 2 Der nach Beispiel 1 aus 1 kg Rindersehnen erhaltene, entfettete
und extrahierte fasrige Gewebebrei wird in 5 Volumteilen 0,5-molarer Essigsäure
suspendiert. Zu der Suspension wird 1 g technisches Pepsin, gelöst in 100 ml 0,01-n
HCl gegeben, worauf das pH mit HCl auf 2,9 eingestellt wird. Unter wiederholtem
Umrühren wird die Suspension 48 Stunden lang bei Raumtemperatur verdaut. Die erhaltene
viskose Kollagensuspension wird durch eine Gl-Glasnutsche filtriert und so von unverdauten
Rückständen befreit. Das Kollagen wird aus der Suspension zur Zugabe von 309einem
wässrigem NaOH gefällt und durch Zentrifugieren abgetrennt. Danach wird das Kollagen
gereinigt, indem es in 0,5-molarer Essigsäure gelöst und durch langsame Zugabe von
3% NaCl wieder gefällt wird. Das gereinigte Kollagen wird in 0,5-molarer Essigsäure
gelöst, mit Wasser verdünnt, worauf in einer Ultrafilterapparatur das im Kollagen
noch enthaltene NaCl ausgewaschen wird. Die Ultrafiltration wird so lange durchgeführt,
bis im Eluat mit Silbernitrat keine Chloridionen mehr nachweisbar sind und die Kollazenkonzentration
0,5mg beträgt.
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Die Kollagen lösung wird wie im Beispiel 1 feinfiltriert, lyophilisiert,
verpackt und sterilisiert. Ausbeute: 102 g fasriges Kollagenvlies.