JPH11500529A

JPH11500529A - 甲状腺自己免疫疾患の臨床診断薬としてのポリクローナルヒト抗−ｈＴｇ自己抗体の使用及び患者血清中での抗−ｈＴｇ自己抗体の検出用添加薬

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Publication number: JPH11500529A
Application number: JP8524633A
Authority: JP
Inventors: アンドレアスベルクマン，
Original assignee: ベーエルアーハーエムエスディアグノスティカゲーエムベーハー
Priority date: 1995-02-16
Filing date: 1996-02-07
Publication date: 1999-01-12
Anticipated expiration: 2016-02-07
Also published as: EP0809805B1; DE59602091D1; ATE180894T1; US5919632A; DE19505266C1; EP0809805A1; JP3558645B2; WO1996025668A1; EP0809805B2

Abstract

(57)【要約】患者の血清中でのチログロブリンに対する自己抗体（抗−ｈＴｇ自己抗体）の臨床的検出用の免疫学的アッセイにおける、特に特異的結合試薬として使用される測定しようとするサンプル中に存在する抗−ｈＴｇ自己抗体およびポリクローナルヒト抗−ｈＴｇ自己抗体がアッセイの別の試薬として使用されるヒトチログロブリン（ｈＴｇ）の結合部位に関して競合的であり、上記の試薬の一方が各場合とも標識が付けられており、各場合とも他方の成分が固体相に結合されており、そしてここで測定しようとするサンプル中に存在する抗−ｈＴｇ自己抗体の存在が固体相に対する標識が付いた試薬の結合の減少に基づき検出されるような競合アッセイにおける、特異的結合試薬としての、特に親和性−精製されたＩｇＧ画分の形態でのチログロブリン（抗−ｈＴｇ自己抗体）に対するポリクローナルヒト自己抗体の使用。

Description

【発明の詳細な説明】甲状腺自己免疫疾患の臨床診断薬としてのポリクローナルヒト抗−ｈＴｇ自己抗体の使用及び患者血清中での抗−ｈＴｇ自己抗体の検出用添加薬本発明は診断薬の製造業者により工業規模で製造されそして販売されている試薬キットによって実施される免疫アッセイによる生物学的流体中の抗体の検出に関する。特に、本発明は自己抗体、特に甲状腺の自己抗原に対する自己抗体の検出に関し、そこではヒトの血清または血漿中のチログロブリン（ｈＴｇ）に対するヒトの自己抗体の測定が本発明に関して主として重要性がある。チログロブリンは甲状腺自己抗原の１種であり、そして各々約３３０ｋＤの分子量を有する２種の同じグリコシル化された副単位からなる高分子量蛋白質である（例えば J．Furmaniak and B．Rees Smith in: Autoimmunity，1990，Vol．7 ,63-80頁参照）。チログロブリンは甲状腺コロイドの主要成分でありそして甲状腺ホルモン類であるトリヨードチロニン（Ｔ₃）およびチロキシン（Ｔ₄）の前駆体である。上記の甲状腺ホルモン類の合成の予備段階として、未結合の循環しているヨウ素およびヨウ化物がチロイドペルオキシダーゼ酵素（ＴＰＯ）の触媒作用の下でＴｇのチロシル基またはヨードチロシン基の中に導入される。甲状腺ホルモン類Ｔ₃およびＴ₄が次にヨウ素化されたチログロブリンから遊離され、これは血液中のＴ₃またはＴ₄の含有量に応答するホルモン調節機構により影響を受ける。甲状腺自己免疫疾患の場合には、特に甲状腺機能低下症をもたらす破壊的な橋本甲状腺炎の場合には、チロイドペルオキシダーゼに対する自己抗体の他にかなりの量のチログロブリンに対する自己抗体も患者の血液中で検出される（そのような抗体を以下では常に「抗−ｈＴｇ自己抗体」と称する）。従ってそのような抗−ｈＴｇ自己抗体の検出および定量的測定は甲状腺疾患の臨床診断においてかなり重要である。患者の血清中の抗−ｈＴｇ抗体の測定は免疫学的アッセイを含む種々の技術により可能である。このタイプの商業的に利用できるアッセイ（ヘニング試験(HEN NINGtest^R)抗−Ｔｇ）では、予め希釈した血清サンプルを試験管の中で標識されたＴｇ（トレーサーとして）および蛋白質Ａ懸濁液と共に同時に培養する。抗− ｈＴｇ自己抗体がサンプル中に存在する場合には、それらはトレーサーとして加えられた抗原ｈＴｇと反応する。同時に、懸濁した固体相の粒子の形態で存在する蛋白質Ａは抗体のＦｃ副単位と非特異的に結合し、そしてサンドイッチ複合体が生成する。それに対して結合された全ての分子を含む固体相懸濁液の粒子は遠心により副単位に転化され、そして未結合のトレーサーを含有する上澄み液は除去される。サンプル中の自己抗体の量が多くなればなるほど、結合されるトレーサーの量は多くなる。それ故、抗−ｈＴｇ自己抗体の濃度は沈澱中で検出可能なトレーサーの量、例えば放射標識付けの場合には沈澱中で測定可能な放射能、に正比例する。全種類のＩｇＧ抗体を区別なく結合しうる非特異的結合相手であるプロテインＡを使用することにより、そしてトレーサーとしての標識の付いたチログロブリンの同時使用により、全ての抗−ｈＴｇ自己抗体が上記のアッセイにおいて検出される。患者の血清は臨床的に現れる甲状腺自己免疫疾患に直接的に関連しない抗−ｈＴｇ自己抗体を含有しているかもしれないことが知られているため、直接的に結合されており且つ例えば橋本甲状腺炎の如き臨床的に現れる甲状腺疾患の原因であるそのような抗−ｈＴｇ自己抗体に選択的に応答するアッセイもそれ自体は利点があるであろう。さらに、上記の既知の方法が遠心段階を必要とすることは該方法のある種の欠点であるとみなされるであろう。しかしながら、競合アッセイおよびコーテイング管方法として作用する他の方法は遠心段階なしで操作され（ＤＹＮＯｔｅｓｔ^R抗−ＴＰＯ、この方法の原則に関してはＤＥ４１２０４１２Ｃ１を参照のこと）、抗−ｈＴｇ自己抗体の測定と平行して非常に頻繁に行われている抗−ＴＰＯ自己抗体の測定用に利用可能である。しかしながら、異なる取り扱い段階を含む２種のアッセイの同時実施は臨床研究のための実施においては欠点となることが証明されている。従ってコーテイング管技術に従い操作され且つ競合アッセイでありそして試験血清サンプル中で測定しようとする抗体の存在が試験管の壁に対する標識付き試薬（トレーサー）の結合の減少として現れるようなアッセイにより抗−ｈＴｇ自己抗体の測定を行うこともそれ自体望ましいであろう。抗原ｈＴＰＯのエピトープは本質的には抗−ＴＰＯ自己抗体の測定の場合には既知でありそして競合測定用に適する１組のモノクローナル抗体を見いだすことが可能であるが（Jean Ruf，Marie-Elisabeth Toubert，Barbara Czarnocka，Jo see-Martine Durand-Gorde，Mireille Ferrand and Pierre Carayon，in: Endoc rinology，Vol．125，No．3，pages 1211-1218，1989 参照）、現在では抗原が非常に大きくおよび／または免疫反応に含まれるそれらのエピトープに関する同定が不十分であるか或いは該エピトープが未知である場合には匹敵する競合アッセイの開発は基本的問題に直面するはずである。そのような症例は非常に多数あり、そしてグルタメートデカルボキシラーゼ（Ｉ型糖尿病）、アセチルコリン受容体（重症筋無力症）、いわゆる「ミエリン塩基性蛋白質」（多発性硬化症）、ＴＳＨ受容体および特にチログロブリン（ｈＴｇ）がそのような抗原の例として挙げられる。抗−ｈＴＧ自己抗体の測定に関して、抗−ＴＰＯ自己抗体の測定に関して上に記載されている方法に対応する競合アッセイを開発する試みがなさる場合には、チログロブリンに対して製造される抗原または抗体集団として作用するチログロブリンの特性に関する難点に遭遇する。最初に述べたように、ヒトチログロブリン（ｈＴｇ）は非常に多数の潜在的抗原決定因子（エピトープ）を有する非常に大きい蛋白質抗原であり、それは動物の直接的な免疫化により異種抗体を製造するためのヒトチログロブリンを使用してヒトチログロブリンの多数の異なるエピトープに対して指向されることが見いだされているポリクローナル抗体の集団が得られる。しかしながら、最近数年間の研究は自己免疫疾患中に生成する抗−ｈＴｇ自己抗体は明らかにチログロブリン表面上の限られた数のエピトープに対してのみ製造されることを示している（J．Furmaniak and B．Rees Smith，in: Au toimmunity，1990，Vol．7，pages 63-80; J．Ruf，Mireille Henry，Catherine De Micco，P．Carayon，in: Thyroglobulin and Thyroglobulin Antibodies in ners，C.，Editors)，pages 21-31，1987，G.T．Verlag Stuttgart，New York; C.T.J．Chan，P.G.H．Byfield，R.L．Himsworth and P．Shepherd，in: Clin．e xp．Immunol.（1987）70，pages 516-523; S.M．McLachlan，U．Feldt-Rasmusse n，E.T．Young，S.L．Middleton，M．Blichert-Toft，K．Siersboek-Nielsen，J . 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41-49）。問題の複雑さのために、完全なエピトープのマップ作製は現在までｈＴｇに関しては成功しておらず、その状況は自己免疫疾患中に生成した自己抗体が明らかにコンホメーション抗体の中にあることが見いだされたという事実によりさらに困難となり、それにより動物源のモノクローナル抗−ｈＴｇ抗体を使用するエピトープのマップ作製時の試みをさらに困難にしそして組み換え逐次抗体を使用する関連エピトープのマップ作製を妨げている（Q．Dong，M．Ludgat e and G．Vassart，in: Journal of Endocrinology（1989）122，pages 169-176 ）。それ故、動物の血清中でのｈＴｇの助けによる免疫化により得られるポリクローナル異種ＩｇＧ集団は自己免疫疾患において生ずる抗−ｈＴｇ自己抗体集団には対応せず、従って競合免疫学的アッセイにおける使用にはあまり適してはいないかまたは不適切であるのは明らかである。他方では、抗−ｈＴｇ自己抗体を測定するための競合アッセイにおいてモノクローナル抗−ｈＴｇ抗体を使用する試みが希望する結果、すなわち自己免疫疾患の病理学的過程に実際に関連する抗−ｈＴｇ自己抗体の割合を測定するアッセイの開発をもたらさないことが見いだされている。モノクローナル抗−ｈＴｇ抗体を使用する場合に不満足な結果となる理由は、抗−ｈＴｇ自己抗体生成に含まれる個別のエピトープが非常に大きいｈＴｇ分子上で互いに少ない程度で影響するため患者の血清中に実際に存在するポリクローナル抗−ｈＴｇ自己抗体の分画だけがモノクローナル抗−ｈＴｇ抗体を使用する競合アッセイで検出されるということ、並びにこれらの分画が全体的な病理学的過程を適切には示さないということである。動物源のモノクローナル抗−ｈＴｇ抗体の代わりにモノクローナルまたは組み換えヒト抗−ｈＴｇ抗体を使用する試み（ＧＢ−Ａ−２２６５７１３）は原則的にこの問題を改善するものではない。従って、既存の競合アッセイに基づく抗−ｈＴｇ自己抗体の測定は信頼性がなく、十分な感度で実施することができないということが知られている。従って本発明の目的は、そのような自己抗体が多数の関連エピトープを有する抗原に対して製造されそしてポリクローナル抗体の集団として存在する時でもそのような自己抗体を高い精度および信頼性をもって測定できるような方法で、抗体の競合アッセイ、特に抗−ｈＴｇ自己抗体測定用の競合アッセイを設定することである。この目的は、請求の範囲第１項に従う特異的結合試薬としてのチログロブリンに対するポリクローナルヒト自己抗体、特に甲状腺自己免疫疾患に罹っているヒト患者の血清からのチログロブリンに対する親和性−精製されたポリクローナルヒトＩｇＧ自己抗体の使用による患者の血清中の抗−ｈＴｇ自己抗体の測定において達成される。ポリクローナル抗−ｈＴｇ自己抗体の本発明に従う特に有利な使用方法は従属請求の範囲第２項〜第７項に記載されている。本発明はさらに請求の範囲第８項記載の患者の血清中の抗−ｈＴｇ自己抗体の免疫学的測定用試薬キットにも関し、それは本質的にそのような試薬キットの一般的成分の他に親和性−精製された抗−ｈＴｇ自己抗体（親和性−精製された抗 −ｈＴｇＩｇＧ調合物）を含有することにより特徴づけられている。請求の範囲第９項に記載されている非常にさらに一般的な態様に従うと、本発明は、一般的にはそのような抗体の発生により特徴づけられる疾患の臨床診断用のポリクローナルヒト抗体の使用にも関し、その理由としては、さらに以下でより詳細に説明されているように、抗−ｈＴｇ自己抗体の決定から生ずる原則を他の用途にも適用することができ、そして患者の血清から得られるポリクローナルヒト抗体（ｈＩｇＧ）は免疫学的アッセイを実施するための商業用試薬キット中で特異的結合試薬としてすでに使用されていることを確認することが不可能であるからである。本出願ではチログロブリンに対するポリクローナルヒト自己抗体が「特異的結合試薬」として使用されると述べられているが、これはそれらが抗原と１つもしくは複数の抗体との間の特異的免疫学的反応を使用する免疫学的アッセイにおいて反応物として使用されることを意味する。「特異的結合試薬」は「分析物用の結合剤」の意味で使用されるものではなく、その理由は測定しようとする抗体を「分析物」とみなす必要がないであろうし、本発明に従い使用されるチログロブリンに対するポリクローナルヒト自己抗体が抗原チログロブリンの結合部位のための競合剤として競合するからである。本発明は、現在免疫学的アッセイ用の試薬キットの工業的製造分野において一般的な動物源の抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル抗−ｈＴｇ抗体）を使用する代わりに、検出しようとする甲状腺自己免疫疾患に罹っていることが示されている患者の血清から直接得られるポリクローナルヒト自己抗体を使用する場合、患者の血清中で抗−ｈＴｇ自己抗体を非常に高い信頼性でもって検出できるという知見に基づいている。本発明では、検出しようとする甲状腺自己免疫疾患の典型的な症状を有する一人の患者の血清の形態でそのようなポリクローナルヒト自己抗体を使用することが一般的に可能であるが、使用される出発血清が検出しようとする疾患に関連する人間において生成されるかもしれないできるだけ完全な全ての自己抗体の集団を確実に含有するようにするためには複数のそのような患者の一緒にした（「プールされた」）血清をポリクローナルヒト自己抗体源として使用することが好ましい。さらに、抗−ｈＴｇ自己抗体の測定の場合には、ポリクローナルヒト自己抗体は好適にはそのような血清中に存在する全てのｈＴｇ自己抗体が使用されるような方法では用いられず、その代わりに、ポリクローナルヒト自己抗体を、ｈＴｇ親和マトリックスを使用する親和性精製後に、特異的結合試薬として使用される免疫グロブリン画分が本質的に抗−ｈＴｇ自己抗体だけからなるような方法で好適に用いられる。本出願が親和性精製目的のためのまたは免疫学的アッセイにおける試薬としてのチログロブリンまたはヒトチログロブリンの使用に関する場合には、それが主として意味するものは例えば英国の会社であるサイパックの如き種々の製造業者から商業的に入手できる一般的なヒトチログロブリンである。しかしながら、非常に特異的なチログロブリン画分が甲状腺自己免疫疾患の自己抗体の生成中に平均を越える程度まで含まれるかもしれないことが最近示されている（Ali H．Sab oori，Noel R．Rose，Rudolf C．Kuppers, Wayne G．Butscher, Herbert S．Bre sler and C．Lynne Burek，in: Clinical Immunology and Immunopathology，Vo l．72，No.1，pages 121-128，1994; A．Gardas，in: Autoimmunity，1991，pag es 331-336）ため、本発明は親和性精製のため、およびアッセイにおける試薬としての両方のため完全チログロブリン調合物でなはく自己免疫疾患に関して特に重要であるヒトチログロブリン画分だけ、例えば上記の文献中で蛋白質ピーク１として表示されておりそして大きく減少したヨウ素化度を有するチログロブリンに対応する蛋白質画分、または健康な人間と比べて橋本甲状腺炎に罹っている人間において大きな割合で発生することが示されているｈＴｇの他の画分だけを特に使用する。そのようなチログロブリン画分を完全チログロブリン調合物の代わりに使用することにより、アッセイの選択性および／または感度並びに特異性に関して別の利点を得ることもさらに可能となる。本発明に従うヒト抗−ｈＴｇ自己抗体の測定は２つの図面および２つの測定曲線並びに２つの使用例に関して以下でさらに詳細に説明される。図面において、図１は標識が付けられた形態で使用されるｈＴｇ用の固定化された特異的結合剤として作用する親和性−精製されたポリクローナルヒトＩｇＧ画分を使用する抗 −ｈＴｇ自己抗体測定の第一の変法における方法の原理を示しており、図２は固定化された形態で使用されるｈＴｇ用の特異的結合剤として標識が付けられた形態で使用される親和性−精製されたポリクローナルヒトＩｇＧ画分を使用する抗−ｈＴｇ自己抗体測定の第二の変法における方法の原理を示しており、図３は実施例１に従うアッセイにおける抗−ｈＴｇ自己抗体の測定に関する測定値の表で共に典型的な測定曲線を示しており、そして図４は実施例２に従うアッセイにおける抗−ｈＴｇ自己抗体の測定に関する測定値の表で典型的な測定曲線を示している。特異的結合試薬としてのポリクローナルヒト抗−ｈＴｇの使用により、特異的結合試薬として加えられるポリクローナルヒト自己抗体が患者のサンプル中で検出しようとする自己抗体と競合するような競合免疫学的アッセイを実現することが可能である。特に、一つの変法によると特に親和性−精製された抗−ｈＴｇ−ＩｇＧ調合物の形態のポリクローナルヒト抗−ｈＴｇ抗体が固体担体相と、特に試験管の壁と、結合しそして標識の付いたヒトチログロブリン、例えば放射性ヨウ素処理されたヒトチログロブリンが別の試薬として使用されるような方法でこのアッセイを実施することができる。抗−ｈＴｇ自己抗体の不存在下では、特に検出しようとする甲状腺疾患の原因であるｈＴｇ自己抗体の不存在下では、標識されたチログロブリンは完全にまたは空白試験の百分率特性値まで結合される。検出しようとするタイプの抗−ｈＴｇ自己抗体が患者のサンプル中に存在する場合には、この方法で特異的結合試薬として使用される抗体と患者の血清中の抗体との間の競合が生じ、後者は固体相に対する標識の付いたチログロブリンの結合減少で現れ、それは固体／液体分離後に固体相上で見られる標識の減少をもたらす。原理的にそれ自体既知である方法の別の原理では（図２）、抗原すなわちヒトチログロブリン（またはその画分、上記参照）を固体相の上で固定化しそして標識の付いたポリクローナルヒト抗−ｈＴｇ自己抗体画分の形態のトレーサーを使用するような工程を行うこともできる。この場合にも、患者のサンプル中で測定しようとする自己抗体の存在が固体相に対する標識の結合減少をもたらす。ヨウ素放射性同位体が本発明の実施例においてトレーサー分子用のマーカーまたは標識として常に使用されるとしても、使用する標識の性質は厳密なものではなく他の適当な標識をトレーサー調合物用に選択および使用できることは当技術の専門家には明らかである。固体相はそれ自体は既知である微量滴定板の壁または他の粗い分散性もしくは微細な分散性の固体相であってもよく、そして適当な固体相は主として特定用途に関する実際の考察を基にして選択することができる。以下の試験が示すように、特異的結合試薬としてポリクローナルヒト抗−ｈＴｇ自己抗体を使用する競合アッセイによりヒトの血清中の抗−ｈＴｇ自己抗体の信頼性のある測定が可能になるということが驚くべきことに見いだされた。特異的結合試薬としてのポリクローナルヒト抗−ｈＴｇ自己抗体の使用は多分、抗−ｈＴｇ自己抗体の病原性成長に関連するできるだけ全てのエピトープ用の結合相手がそのようなポリクローナル特異的結合試薬のｈＴｇ分子上に存在するという利点を有するであろう。しかしながら、このことは患者の血清中のそのような抗−ｈＴｇ自己抗体の発生を検出可能な効果となるまで生じさせることを保証しており、この効果はもちろん患者の血清中の個別の自己抗体タイプの量および／または数につれて増加する。実際に特異的結合試薬としてのモノクローナル抗体を用いるとモノクローナル抗体と抗原との間の特異的結合は患者の血清からのある種のタイプの自己抗体により妨害されず且つそのような自己抗体はこのようにして検出されないということは本発明に従う方法では予期されない。ある種の疾患に関する典型的なセットであり且つ抗体集団としてある種の病理学的症状と関連するフィンガープリント分布の性質を表す自己抗体を有する患者の血清を使用することにより、そのようなフィンガープリントパターンに関するありうる最適な特異性も得られ、そして非特異的な副作用は適する標準化により排除することができる。ポリクローナルヒト抗−ｈＴｇ自己抗体が使用される時には、これらの抗体または関連抗原の固定化または標識付けをしてもｈＴｇの全ての関連エピトープを全ての関連する自己抗体タイプとの結合用に利用するのに十分な可能性があるため、集団の各々の個別の抗体タイプが全体的な測定結果に対して寄与し、その臨床的関連性は増加する。しかしながら、本発明の予備条件は現在まで使用されてきた動物の免疫化により得られた抗体を用いるかまたは対応するモノクローナル抗体を用いる代わりに疾患に罹っているヒトドナーの血清から得られる抗体を用いて操作する際の重大問題が実際に存在しないという驚異的な発見である。例えば、抗−ｈＴｇ自己抗体が相対的に少量のドナー血清で大量のコーテイング試験管の調合物用の条件に合致するのに十分であるような量で橋本甲状腺炎患者の血清中に、存在するということが驚異的なことに見いだされた。それ故、約２５０００回の個別測定用に十分な量である５ｍｇの親和−精製された抗−ｈＴｇ自己抗体は例えば１０００Ｕ／ｍｌの抗−Ｔｇ含有量（出願人のヘニング試験抗−Ｔｇで測定された）を有する１０ｍｌの患者の血清を使用して得られる。さらに、相対的に少数の疾患に罹っている十分で異なる人間のプールされた血清が使用される時には、実質的に同一の結合性質を有する非常に適切なポリクローナルヒト自己抗体が意図する使用のために得られ、そしてバッチ毎に観察されるかもしれない相対的な変動を一般的な予想目盛り付け工程により容易に考慮することができる。従って適切な入手性および／または再現性に関する条件並びに特異的結合試薬の品質の安定性はポリクローナルヒト抗体を使用するアッセイでは証明されていない。先入観にも等しいそのような条件は現在商業用アッセイにおいて特異的結合相手として何故ヒトＩｇＧ画分が使用されないかの理由並びに患者の血清中の抗体測定用の免疫学的アッセイのための商業的試薬キット製造用の特異的結合相手としてのポリクローナルヒトＩｇＧキット画分の使用に関する提案を文献中で見付けられないかの理由を説明できるであろう。特に疾患に特異的な抗体集団の「フィンガープリントパターン」を検出可能であり特別に論じられている検出法に関する上記の事項から、本発明が基づく原理は抗−ｈＴｇ自己抗体の測定用だけでなく一般的に臨床的診断における抗体測定用、および特に外部抗原に対する抗体の測定用にも適していることは明らかである。このタイプの可能な用途は、例えば、疾患に罹っている一人の患者から得たＩｇＧ画分を患者の血液中を循環する抗体の減少に基づいてこの特異的患者の症状における改良を監視するために使用するアッセイ用の特異的結合相手として使用することである。そのような症例では、医師は患者から得たＩｇＧ画分で医師自身によってコーテイングされる試験管以外の全ての必要な試薬を含有している試薬キットを準備することができる。医師がそのような患者に対して特異的な試験管のある種の原料を準備したら、彼はその後に患者における抗体濃度の変化およびおそらく元の抗体の消失を監視することができる。同様に、プールされておりそして必要に応じて親和性精製により濃縮されている患者の血清からのある種の抗原に対するヒト抗体を使用して試験システムを製造することもでき、それにより一般的であるが臨床的にみて信頼性の高い方法でこの抗原により惹起される疾患に罹っている疑いのある患者の免疫状態を測定することが可能となる。適する抗原は自己抗原だけでなく細菌もしくはウイルス源の病原性抗原またはアレルゲンとして作用する抗原も挙げられる。そのような試験システムは抗原およびこれらの抗原に対して製造される抗体のタイプに関して非常にわずかしかわからない時にも準備することができ、その理由はこれが適切な抗体生成で免疫系の反応を反映するという条件においては、この試験システムはある程度まで対応する病理学的症状の存在または不存在を直接的に示すからである。本発明を図面に示されている抗−ｈＴｇ自己抗体に対する２つのアッセイタイプに関する２つの実施例を参照しながら以下でさらに詳細に説明する。しかしながら、本発明の原則は抗−ｈＴＰＯ自己抗体の測定の場合のようにモノクローナル抗体を使用する競合免疫学的アッセイが大多数の症例において本質的に正確な結果を与えるような他の症例においてもその価値を有するという点に注意を払うべきである。ＩｇＧ画分の形態のポリクローナルヒト抗体を使用すると、これまでのような親和精製なしでも匹敵する正確な結果をこの場合には得ることができ、さらに血清が正確に測定されずに抗体を含まないとされる非常に希な場合でも正確な結果が得られ、その血清が検出しようとする自己抗体を実際には含有していたことを示した。実施例物質全ての実施例において固体相として使用される管はスターインサートを有する７５×１２ｍｍのヌンク製のマクシソープ品質の管である。記載されている緩衝溶液は、緩衝液Ａ：燐酸塩で緩衝された食塩水溶液（ＰＢＳ）、０．１％ツィーン２０緩衝液Ｂ：１０ｍＭＴＲＩＳＨＣｌ、１０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７.８緩衝液Ｃ：２０ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐＨ７.０緩衝液Ｄ：２５ｍＭクエン酸緩衝液Ｅ：０.５Ｍ燐酸ナトリウム、ｐＨ８.０緩衝液Ｆ：２０ｍＭ燐酸ナトリウム、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマ）、３％の結晶化が抑制されたソルビトールシロップ（カリオンＦＰ、メルク）、ｐＨ７.５血清サンプル：橋本甲状腺炎、自己免疫甲状腺炎およびグレーヴズ病を示す患者からの血清サンプルをドイツの種々な病院から得た。それらを試薬の調合用または試験血清として使用した。対照サンプルとして使用する血清サンプルは感染症、自己免疫疾患またはアレルギー疾患の症状のなかった人間からの血清である。比較方法として使用されたヘニング試験抗−Ｔｇに従うアッセイは商業用アッセイでありそしてベルリンのブラームス・ダイアグノスチカＧｍｂＨからの操作指示付きの試薬キットの形態で入手できる。ヨウ素¹²⁵−標識付きヒトチログロブリンは上記の商業用のヘニング試験抗 −Ｔｇから採取された。試薬の製造用の橋本甲状腺炎のある患者の血清からの抗−ｈＴｇ自己抗体の親和性精製ａ）親和マトリックスの製造２０ｍｇのヒトチログロブリン（サイパック、英国）を７ｍｌの緩衝液Ｃの中に溶解させ、そして１００ｍｌの過ヨウ素酸ナトリウム（フルカ）を加える。１５分間にわたる培養後に、溶液をＮＡＰ２５カラム（ファーマシア）により脱塩しそして次に１０ｍｌのカルボリンク物質（ピアース、米国）と混合する。４℃ における２０時間にわたる培養後に、この物質を１０ｍｌガラスカラム（バイオラド）の中に入れそして緩衝液Ｃで洗浄する。ｂ）橋本患者の血清からのヒト抗−Ｔｇ自己抗体の親和精製１０人の橋本甲状腺炎患者の各々から得られた１ｍｌの血清を混合し（出願人のＨＥＮＮＩＮＧｔｅｓｔ^R抗−Ｔｇを用いる測定に相当する最終的な抗−ｈＴｇ含有量：５０００Ｕ／ｍｌ）そして１２０分間にわたり親和マトリックス上で蠕動ポンプを使用して１ｍｌ／分の流速で循環させる。カラム流出流の吸収を２８０ｎｍにおいて連続的に測定する。カラムを次に５０ｍｌの緩衝液Ｃで洗浄する。カラムを緩衝液Ｄで洗浄することによりヒト抗−ｈＴｇ自己抗体を溶離する。ヒト抗−ｈＴｇ自己抗体（溶離後の量：４ｍｌ）を４ｍｌの緩衝液Ｅと混合しそしてその後の使用のために必要となるまで４℃において貯蔵する。実施例１：放射性ヨウ素で処理したチログロブリンをトレーサーとして使用する抗−ｈＴｇ自己抗体の測定（方法ＨＤ−Ｒ）ａ）橋本甲状腺炎の患者からのヒト抗体を用いる試験管の製造（「ＨＤ−Ｒ管」）ヒト抗体を結合するために抗−ヒト−ＩｇＧでコーテイングされた管を最初に製造した。この目的のためには、ヤギ−抗−ヒト−ＩｇＧ（注文番号３ＡＧ４７４、等級２、スカンチボディーズ、米国）を緩衝液Ｂの中で６.７μｇ／ｍｌの最終濃度になるまで希釈した。３００μｌのこの溶液をピペットで試験管（ヌンクからのマキシソープ管）に入れそして室温において２０時間にわたり培養した。管の内容物を次に傾斜させ、そして管に緩衝液Ｆを完全に充填した。２時間にわたる培養後に、管の内容物を傾斜させそして管を真空中で乾燥した。製造された管（「ＡＨＩ管」）を４℃において貯蔵した。上記の如き親和−精製されたヒト抗−ｈＴｇ自己抗体を緩衝液Ａで２μｇ／ｍｌの蛋白質濃度になるまで希釈し、そして１００μｌのこの溶液を抗−ヒト−ＩｇＧでコーテイングされた管（ＡＨＩ管）の各々にピペットで入れそして２時間にわたり室温において振りながら（３２０回転／分）培養した。緩衝液Ａの中に１ｍｇ／ｍｌのヒトＩｇＧを含有する溶液を次に遊離している抗−ヒト−ＩｇＧ結合部位を飽和させるためにピペットで入れそして培養をさらに２時間にわたり振りながら続ける。管を次に各回毎に２ｍｌのＰＢＳで２回洗浄しそしてその後の使用のために必要となるまで４℃で貯蔵する。ｂ）測定の実施工程は下記の培養方式に基づく：１.サンプルの製造のために、対照群、並びに患者および標準者のヒト血清を緩衝液Ａで１＋２０（１部の血清、２０部の緩衝液）の比で希釈する。２.１００μｌのサンプルを橋本甲状腺炎患者の抗体でコーテイングされた管（ＨＤ−Ｒ管）にピペットで入れる。３.１００μｌの放射性ヨウ素処理されたヒトＴｇ（市販のＨＥＮＮＩＮＧｔｅｓｔ^R抗−Ｔｇアッセイの成分）をピペットで入れる。４.２時間にわたり室温で振りながら培養する。５.液体相を除去しそして各回毎に２ｍｌのＰＢＳで２回洗浄する。６.管に残っている放射能を測定する。ｃ）結果上記の条件下においてサンプル中の抗−チログロブリン自己抗体の不存在下では、放射性ヨウ素処理されたチログロブリントレーサーは橋本甲状腺炎患者からのＩｇＧでコーテイングされている管に７３％の程度まで結合される。サンプル中の抗−Ｔｇ自己抗体の量の増加により、標識の付いたチログロブリンの結合は減少する。標準者の代表的測定値および代表的な測定曲線が図３に示されている。予測された通り、ブラームス・ダイアゴノスチカからの比較方法であるヘニング試験抗−Ｔｇ中と全く同様に、４１個の対照サンプルは上記の方法で陰性であると見いだされている（表１参照）。橋本甲状腺炎、グレーヴズ病または免疫甲状腺炎の患者からの８５個の血清を本発明に従う方法および比較方法であるヘニング試験抗−Ｔｇで測定した。潜在的に抗−ｈＴｇ−陽性である測定サンプルの中で、本発明に従う方法で３５個のサンプルがそして比較方法では３２個が陽性であると見いだされた。２８個のサンプルは両方の方法で陽性であると見いだされた。測定結果は表２に示されている。これらの結果は患者の血清中のチログロブリンに対する自己抗体の測定に関してポリクローナルヒト抗−ｈＴｇ自己抗体の使用が適することを示している。実施例２：患者の血清からの標識の付いた親和−精製されたヒト抗−ｈＴｇ自己抗体を使用する抗−ｈＴｇ自己抗体の測定（方法Ｔｇ−Ｒ）ａ）ヒト抗−ｈＴｇ自己抗体の放射性ヨウ素処理上記の通りにして親和−精製されそして橋本病に罹っている患者の血清５０μ ｌの量のから得られたヒト抗−ｈＴｇ自己抗体１０μｇを５０μｌのｐＨ７.４の５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液および２μｌの１５０μＣｉＮａ¹²⁵Ｉと混合し、そして標識付け反応を古典的なクロルアミンＴ方法により行いそして５μｌのＨ₂ Ｏ中の２.５μｇのクロルアミンＴの添加により開始した。６０秒間の反応時間後に、サンプルを３００μｌのｐＨ７.４の５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液で希釈しそして上記の一般的な方法でＮＡＰ−１０−カラム（ファーマシア）により脱塩する。得られた標識の付いた抗体を５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、０．１％ツィーン２０、０.２％ＢＳＡ、ｐＨ７.４で４００,０００ｃｐｍ／ｍｌの最終希釈度となるまで希釈する。この物質を４℃において貯蔵する。ｂ）工程測定に関しては、工程は下記の培養処方に基づいている：１.サンプル製造に関しては、対照群、患者および較正からのヒト血清を緩衝液Ａで１＋２０に希釈する。２.１００μｌのサンプルをチログロブリンでコーテイングされている試験管にピペットで入れる。３.以上の通りにして製造された１００μｌの放射性ヨウ素処理されたヒト抗− ｈＴｇ抗体をピペットで入れる。４.２時間にわたり室温で振りながら培養する。５.液体相を分離しそしてこれらの管を各回毎に２ｍｌのＰＢＳで２回洗浄する。６.管に残っている放射能を測定する。ｃ）結果上記の条件下においてサンプル中の抗−ｈＴｇチログロブリン自己抗体の不存在下では、放射性ヨウ素処理されたヒト抗−ｈＴｇ抗体はヒトチログロブリンでコーテイングされている管（Ｔｇ−Ｒ）に３２％の程度まで結合される。サンプル中の抗−ｈＴｇ抗体量の増加により、標識の付いたヒト抗−ｈＴｇ抗体の結合は減少する（代表的な測定曲線は図４に示されている）。予測された通り、ブラームス・ダイアゴノスチカからの比較方法であるヘニング試験抗−Ｔｇ中と同様に、１０個の対照サンプルは上記の方法で陰性であると見いだされている（表１参照）。橋本甲状腺炎、グレーヴズ病または免疫甲状腺炎の８５人の患者からの血清の測定においては、１６個のサンプルが本発明の方法により陽性であると測定された。比較方法であるヘニング試験抗−Ｔｇでは、１７個のサンプルが陽性であると測定された。この検定変法の１４個のサンプルは比較方法であるヘニング試験抗−Ｔｇと一致した（表２参照）。患者の血清から得られそして患者の血清中のチログロブリンに対する対応する自己抗体の測定のための標識の付いた形態で存在するヒト抗−ｈＴｇ抗体を使用することも可能であることこのようにして見いだされた。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年１１月２７日【補正内容】請求の範囲１．チログロブリンに対するポリクローナルヒト自己抗体（抗−ｈＴｇ自己抗体）の、患者の生物学的流体のサンプル中でのチログロブリンに対する自己抗体（抗−ｈＴｇ自己抗体）の臨床検出用免疫学的アッセイにおける特異的結合試薬としての使用。２．ポリクローナルヒト抗−ｈＴｇ自己抗体を患者の血清中の抗−ｈＴｇ自己抗体の発生に関連する甲状腺自己免疫疾患に罹っている一人の患者または数人の患者からの血清調合物の形態でまたは親和性精製によりそれから得られた抗−ｈＴｇ−ＩｇＧ画分の形態で使用することを特徴とする請求の範囲第１項記載の使用。３．免疫学的アッセイが競合アッセイであり、測定しようとするサンプル中に存在する抗−ｈＴｇ自己抗体および特異的結合試薬として使用されるポリクローナルヒト抗−ｈＴｇ自己抗体が、アッセイの別の試薬として使用されるヒトチログロブリン（ｈＴｇ）の結合部位に関して競合的であり、各場合とも上記の試薬の一方が標識され、他方が固体相に結合され、測定しようとするサンプル中に存在する抗−ｈＴｇ自己抗体の存在が、固体相に対する標識された試薬の結合の減少に基づいて検出されることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項記載の使用。４．ポリクローナルヒト抗−ｈＴｇ自己抗体が、固体担体層と結合されている親和性−精製された抗−ｈＴｇ−ＩｇＧ調合物の形態で使用されること、並びに試験する患者のサンプル中の抗−ｈＴｇ自己抗体の存在がそれ自体固体担体層に対する加えられた標識されたヒトチログロブリンの結合の減少として現れることを特徴とする請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載の使用。５．試験管の壁が固体担体層として使用され、親和性−精製された抗−ｈＴｇ− ＩｇＧ調合物が、試験管の壁にヒトＩｇＧに対する非特異的結合剤によって結合されることを特徴とする請求の範囲第４項記載の使用。６．ヒトチログロブリンでコーテイングされた固体担体相が別の試薬として使用されるようなアッセイにおいて、ポリクローナルヒト抗−ｈＴｇ自己抗体が標識でマークされている親和性−精製された抗−ｈＴｇ−ＩｇＧ調合物の形態で使用されることを特徴とする請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載の使用。７．ポリクローナルヒト抗−ｈＴｇ自己抗体が、測定しようとする自己抗体の発生が典型的である甲状腺自己免疫疾患に罹っている異なるドナー患者の血清を組み合わせるて親和性−精製された抗−ｈＴｇ−ＩｇＧ画分の形態で得られ、親和性−精製された抗−ｈＴｇ−ＩｇＧ調合物は、ｈＴｇ親和マトリックスＲに結合し、その後に適切な緩衝液で溶離することで得られることを特徴とする請求の範囲第１項から第６項のいずれかに記載の使用。８．希溶液および／または緩衝溶液、抗−Ｔｇ標準および抗−Ｔｇ０標準並びに場合により対照血清を含む一般的成分の他に、それがヒトチログロブリンおよび親和性−精製された抗−ｈＴｇ−ＩｇＧ調合物を２種の別の成分として含有しており、ヒトチログロブリンまたは抗−ｈＴｇ−ＩｇＧ調合物のいずれかが標識の付いた形態で存在しており、そして上記２種の成分の他方の成分が各場合とも試験管の内表面上のコーテイングとして存在していることを特徴とする患者の血清中での抗−ｈＴｇ自己抗体の免疫学的測定のための臨床診断用の試薬キット。９．（削除）

Claims

【特許請求の範囲】１．チログロブリンに対するポリクローナルヒト自己抗体（抗−ｈＴｇ自己抗体）の、患者の生物学的流体のサンプル中でのチログロブリンに対する自己抗体（抗−ｈＴｇ自己抗体）の臨床検出用免疫学的アッセイにおける特異的結合試薬としての使用。２．ポリクローナルヒト抗−ｈＴｇ自己抗体を患者の血清中の抗−ｈＴｇ自己抗体の発生に関連する甲状腺自己免疫疾患に罹っている一人の患者または数人の患者からの血清調合物の形態でまたは親和性精製によりそれから得られた抗−ｈＴｇ−ＩｇＧ画分の形態で使用することを特徴とする請求の範囲第１項記載の使用。３．免疫学的アッセイが競合アッセイであり、測定しようとするサンプル中に存在する抗−ｈＴｇ自己抗体および特異的結合試薬として使用されるポリクローナルヒト抗−ｈＴｇ自己抗体が、アッセイの別の試薬として使用されるヒトチログロブリン（ｈＴｇ）の結合部位に関して競合的であり、各場合とも上記の試薬の一方が標識され、他方が固体相に結合され、測定しようとするサンプル中に存在する抗−ｈＴｇ自己抗体の存在が、固体相に対する標識された試薬の結合の減少に基づいて検出されることを特徴とする請求の範囲第１項または第２項記載の使用。４．ポリクローナルヒト抗−ｈＴｇ自己抗体が、固体担体層と結合されている親和性−精製された抗−ｈＴｇ−ＩｇＧ調合物の形態で使用されること、並びに試験する患者のサンプル中の抗−ｈＴｇ自己抗体の存在がそれ自体固体担体層に対する加えられた標識されたヒトチログロブリンの結合の減少として現れることを特徴とする請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載の使用。５．試験管の壁が固体担体層として使用され、親和性−精製された抗−ｈＴｇ− ＩｇＧ調合物が、試験管の壁にヒトＩｇＧに対する非特異的結合剤によって結合されることを特徴とする請求の範囲第４項記載の使用。６．ヒトチログロブリンでコーテイングされた固体担体相が別の試薬として使用されるようなアッセイにおいて、ポリクローナルヒト抗−ｈＴｇ自己抗体が標識でマークされている親和性−精製された抗−ｈＴｇ−ＩｇＧ調合物の形態で使用されることを特徴とする請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載の使用。７．ポリクローナルヒト抗−ｈＴｇ自己抗体が、測定しようとする自己抗体の発生が典型的である甲状腺自己免疫疾患に罹っている異なるドナー患者の血清を組み合わせるて親和性−精製された抗−ｈＴｇ−ＩｇＧ画分の形態で得られ、親和性−精製された抗−ｈＴｇ−ＩｇＧ調合物は、ｈＴｇ親和マトリックスＲに結合し、その後に適切な緩衝液で溶離することで得られることを特徴とする請求の範囲第１項から第６項のいずれかに記載の使用。８．希溶液および／または緩衝溶液、抗−Ｔｇ標準および抗−Ｔｇ０標準並びに場合により対照血清を含む一般的成分の他に、それがヒトチログロブリンおよび親和性−精製された抗−ｈＴｇ−ＩｇＧ調合物を２種の別の成分として含有しており、ヒトチログロブリンまたは抗−ｈＴｇ−ＩｇＧ調合物のいずれかが標識の付いた形態で存在しており、そして上記２種の成分の他方の成分が各場合とも試験管の内表面上のコーテイングとして存在していることを特徴とする患者の血清中での抗−ｈＴｇ自己抗体の免疫学的測定のための臨床診断用の試薬キット。９．ヒト血清またはある疾患に罹っている数人のドナー患者のポリクローナル免疫グロブリン断片の使用であって、検出されるべき他の患者及び／または行われるべきドナー患者または他の患者の流体において、前記疾患の特徴である抗体の免疫学的検出による臨床診断のための試薬キット用の特異的結合試薬としての使用。