JP3630689B2 - 抗ポリマー抗体の検出方法およびシリコーン関連疾患（ｓｒｄ）の診断を援助するのに有用な診断試験キット - Google Patents

Description

本発明は、抗ポリマー抗体を検出する方法とキットに関し、更に詳細には、シリコーン関連疾患（SRD）、線維筋痛症および慢性疲労症候群（CFS）を診断する方法に関する。
非常に感受性がありかつ特異的であることが既知である自己免疫応答を確認するのに典型的に用いられる様々な免疫分析法を用いてシリコーン関連疾患と診断された試験個体の50％以上および線維筋痛症および慢性疲労症候群と診断された試験個体の80％以上に抗ポリマー抗体が確認された。抗ポリマー抗体の検出は、シリコーン乳房移植が診断的に試験可能な免疫応答を生じることができる最初の明確な証明となりかつ線維筋痛症および慢性疲労症候群に対する免疫応答が客観的方法によって試験される最初の証明となる。
ヒト抗体を検出するために当業者に通常既知の免疫分析技術と方法は、Antibodies:A Laboratory Manual,Ed Harlow ＆ David Lane（1988）Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,ニューヨークに記載されており、一般的には均一系と不均一系の分析形態が含まれる。現在、抗ポリマー抗原またSRD、線維筋痛症またはCFSに応答して免疫学的に生じる血清抗体を検出する既知の方法はない。
シリコーンポリマーは、最近まで生物学的におよび免疫学的に不活性であると考えられ、そのためヒトに外科的に移植するほとんどの医療用具の成分上の外部コーティングとして含まれている。シリコーン含有部材の例としては、人口股間接、カテーテル、義歯および乳房移植片が挙げられる。合衆国では200万人を超える女性ががん手術後の増強、乳房成形および女房再建のシリコーン移植片の受容者であったと推定される。
シリコーン乳房移植片のような部材が広く用いられるようになってきたので、シリコーンが生物学的にあるいは免疫学的に不活性なものでないという関係が増えてきた。シリコーンは、有機基が炭素結合を介してシリコン原子に直接結合した反復Si−Ｏ骨格を含む完全に合成のポリマーである。シリコーンは、直鎖、分枝鎖および架橋サブユニットの程度に基づいて液体、ゲルまたは固体に作られる。架橋度は、得られたシリコーンの粘稠度を規定し、透明なゲルから白色の不透明なエラストマーまで変化しうる。架橋ポリマーは、残りのシリコーン液を保持するゆるくからみ合うマトリックスを形成する。その複合体の化学多能性の欠除が、マトリックスから徐々にシリコーン液の“ゲルブリード”を可能にするのではないかと思われる。使用した精製法の厳格さによっては触媒、短い線状ポリマーおよび小さな環状化合物のような不純物が残ることがある。
シリコーンポリマーを含む医療用具を移植している患者の約10％は、炎症、重い筋肉痛または明白なリウマチ性（自己免疫）疾患を含む合併症を経験している。最近、特に移植片が破裂した患者において、シリコーン移植片が多発性硬化症様症状に結びついた。シリコーンゲル充填乳房移植片を移植した合衆国内の約200万人の女性の一部は、感染症、嚢収縮、縫合不全および破裂のような合併症がある（Touchette 1992）。更に、乳房移植片の受容者は線維筋痛症、乾燥症候群、リンパ腺症、痙縮、強皮指、脱毛症、浮腫、毛細血管拡張症、色素沈着の変化、回帰熱、皮疹および慢性疲労を含む症状を特徴とする症状を経験している（Brozenaら,1988;Seleznickら,1991;Vaseyら,1991;Copelandら,1993;Spiera ＆ Kerr,1993;Spieraら,1994）。
シリコーンを含む種々の部材を外科的に移植した個体は、全身性硬化症（強皮症）またはシェーグレン症候群のような類似自己免疫疾患を示す関節炎と皮膚病の症状を生じることがある（Brozenaら,1988;Vaseyら,1991;Spieraら,1994）。しかしながら、シリコーン含有医療用具と自己免疫疾患に関係があるとする研究はかなり懐疑的な問題に直面した（Gabrielら,1994）。
シリコーン乳房移植片に曝露すると以前に認識または限定されたリウマチ疾患と集団的に等しくなく適切な診断試験でユニークに同定可能である症状や合併症の発現が生じることがある。しかし、疾患の全身性の種類や相対的に非特異的な症状、特に区別されないリウマチ疾患とSRDはしばしば疾患を臨床的に診断することを困難にしかつ区別することを困難にする。臨床医が区別されないリウマチ疾患とSRDを区別および識別することを可能にする分析法が非常に望まれているが今のところ存在しない。
外科移植は、寿命の延長から美容向上までにわたって利点がある。移植は危険をも伴い、利点が危険を上回るとしても人々にはその既知の危険が移植に先行する動機となる。同様に、既存の移植片の除去は、費用、痛み、キズ、障害および死亡を伴うものである。彼女／彼の移植の利点と危険のバランスを移植志願者に援助する診断試験が非常に求められているが現在は存在しない。
線維筋痛症および慢性疲労症候群の診断は、現在、患者の症状を線維筋痛症については米国リウマチ学会および慢性疲労症候群については疾患管理予防センターによって系統的に記述された症状と比較した主観的臨床所見に基づいている。現在、線維筋痛症または慢性疲労症候群を同定する既知の客観的な検査試験は存在しない。
本発明の主目的は、抗ポリマー抗体を検出する信頼できる方法を提供することである。また、本発明の主目的は、シリコーン関連疾患、線維筋痛症および慢性疲労症候群を診断する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、試験血清中の抗ポリマー抗体の検出によってシリコーン関連疾患、線維筋痛症および慢性疲労症候群を同定する主観的試験を提供することである。
本発明の具体的な実施態様は、ａ）抗ポリマー抗体に関し試験すべき試料を供給する工程、およびｂ）ポリアクリルアミド（特に部分的に重合したポリアクリルアミド）、シリコーンおよびコラーゲンからなる群より選ばれたポリマーと前記試料とを抗ポリマー抗体が前記ポリマーと反応するのに十分な時間混合して複合体を形成する工程を含む抗ポリマー抗体を検出する方法において上記目的の１以上を達成する。前記試料中の抗ポリマー抗体の有無を示すために工程ｂ）から得られた物質に指示薬が加えられる。
好適な方法においては、前記ポリマーを固相に結合する工程が更に含まれる。好適な方法においては、該固相はニトロセルロース膜、ポリビニリデンジフルオリド（PEDF）およびナイロンを含む群より選ばれる。
好適な方法においては、該指示薬は、ヒト抗体に特異的であり検出可能な標識に結合した結合部材であり、前記試料とポリマーと前記固体支持体上に標識三元複合体を形成するのに十分な条件下でしばらく混合される。
好適な方法においては、前記試料中の前記抗ポリマー抗体の有無を示す標識三元複合体の有無を検出する工程が更に含まれる。
本発明の１つの観点によれば、上記目的は、シリコーン関連患者の診断方法であって、ａ）抗ポリマー抗体に関し試験すべき試料を供給する工程;b）ポリアクリルアミド、シリコーンおよびコラーゲンからなる群より選ばれたポリマー抗原と前記試料とを抗ポリマー抗体が前記ポリマー抗原と反応するのに十分な時間混合して複合体を形成する工程；およびｃ）指示薬と工程ｂ）から得られた物質とを反応させて前記試料中の抗ポリマー抗体の有無を示す工程を含む方法において行われる。工程ｃ）から得られた物質中の反応した指示薬の有無を同定することにより反応した指示薬の存在がSRDの臨床診断と共に前記試料を供給する個体におけるシリコーン関連疾患を同定する。
本発明の１つの観点によれば、上記の目的は、線維筋痛症の診断方法であって、ａ）抗ポリマー抗体に関し試験すべき試料を供給する工程;b）ポリアクリルアミド、シリコーンおよびコラーゲンからなる群より選ばれたポリマー抗原と前記試料とを抗ポリマー抗体が前記ポリマー抗原と反応するのに十分な時間混合して複合体を形成する工程；およびｃ）指示薬と工程ｂ）から得られた物質とを反応させて前記試料中の抗ポリマー抗体の有無を示す工程を含む方法において行われる。工程ｃ）から得られた物質中の反応した指示薬の有無を同定することにより反応した指示薬の存在が線維筋痛症の臨床診断と共に前記試料を供給する個体における線維筋痛症を同定する。
本発明の１つの観点によれば、上記の目的は、慢性疲労症候群の診断方法であって、ａ）抗ポリマー抗体に関し試験すべき試料を供給する工程;b）ポリアクリルアミド、シリコーンおよびコラーゲンからなる群より選ばれたポリマー抗原と前記試料とを抗ポリマー抗体が前記ポリマー抗原と反応するのに十分な時間混合して複合体を形成する工程；およびｃ）指示薬と工程ｂ）から得られた物質とを反応させて前記試料中の抗ポリマー抗体の有無を示す工程を含む方法において行われる。工程ｃ）から得られた物質中の反応した指示薬の有無を同定することにより反応した指示薬の存在が慢性疲労症候群の臨床診断と共に前記試料を供給する個体における慢性疲労症候群を同定する。
他の目的および利点は、添付の表および図面に関して理解される下記の明細書から明らかになるであろう。
本発明の目的は、ポリマー抗原および／または抗ポリマー抗体（APA）の検出または測定を可能にする種々の結合分析の形態や形式によって達成される。本発明の現在好適な実施態様が本明細書に詳述されるが、本開示は本発明の原理の例示としてみなされるべきであり記載された実施態様に本発明を限定するものでないことは理解されるべきである。
抗ポリマー抗体の検出方法としては、体液の試験試料を供給する工程、ポリアクリルアミド（特に部分的に重合したポリアクリルアミド）、シリコーンまたはコラーゲンを含む群より選ばれたポリマーと該試料とを抗ポリマー抗体とポリマー複合体を形成するのに十分な時間混合する工程、および指示薬と、該試料とポリマーとを混合して前記試料中の抗ポリマー抗体の存在を検出する工程が含まれる。本方法は、シリコーン関連疾患（SRD）、線維筋痛症および慢性疲労症候群（CFS）に罹った患者を診断するのに診断手段として用いられ、その３疾患を診断する検査（客観的）試験は現在存在しない。
ポリアクリルアミドゲルは、アクリルアミドモノマー相互のおよび固体ゲルマトリックスを形成するビスアクリルアミドのような架橋剤へのフリーラジカルによる触媒重合の結果として形成される。架橋剤に対するアクリルアミドの割合を変えることによりゲルマトリックスの多孔性または剛さが影響される。フリーラジカル捕捉剤として作用する化合物は、重合手順を妨害する。空中に存在する酸素（O₂）がそのような化合物であり、完全な重合を妨げる。このため、通常は重合前にアクリルアミド／架橋剤溶液を脱ガスして固体ゲルマトリックスの製造を最大にする。通気により酸素を添加するとまたはゲル／空気界面のサイズを増すことにより、ここでは部分重合アクリルアミド（PPA）と呼ばれるアクリルアミド／架橋剤の擬似または“部分的”重合サブユニットの製造が容易になる。PPAは重合ゲルマトリックスに共有結合で架橋しないあるいはできない様々なサイズの線状および／または環状小分子の不均一混合物から構成されると考えられる。
PPAは、最適には、2.5mlの37.5:1のアクリルアミド／ビスアクリルアミド溶液（Acryl:Bis）と、8.5ml滅菌水と3.5mlの1.5Mのトリスバッファー（pH8.0）とを混合することにより調製され、次に、0.1mlの0.01％過硫酸アンモニウム溶液と0.020mlのN,N,N′,N′−テトラメチルエチレンジアミン（TEMED）を加えることにより重合される。重合は、60mlビーカー中で10分間行われる。PPAは、約1ml量のわずかに粘性の液体として固体ゲルの上方に残る。
この処方は多量の免疫学的に反応性のPPAを生じるが、種々の程度の免疫反応性を有するPPAを製造するために他の架橋化合物がアクリルアミドと共に用いられる。その架橋化合物としては、ジアリルタータルジアミド、メチレンビスアクリルアミド、エチレンビスアクリルアミド、ドデカメチレンビス（マレアン酸）およびジアクリロイルピペラジンが挙げられるがこれらに限定されない。また、ポリマー抗原としてPPAの代わりに線状シロキサン、環状シロキサン、大環状シリコーンおよびコラーゲンのような他の化合物も用いられる。
抗ポリマー抗体を検出する代表的な方法は、抗ポリマー抗体（APA）ラインブロット分析が好ましく下記に詳述される。また、抗ポリマー抗体、およびSRD、線維筋痛症およびCFSを診断する方法は、一般的には主に２つの種類、即ち、均一系と不均一系分析に分類される他の結合分析によって検出される。
均一系分析形態は、指示薬または結合複合体を検出する前に試験溶液と指示薬の分離を必要としない。その広範囲の分類としては、凝集および沈降分析のような多くの形式および抗体と抗原の検出について当業者に既知の他の形式が含まれる。
本発明の方法は、また、試験試料中の抗ポリマー抗体の存在または量を検出するために固相サンドイッチ分析（不均一系分析）を用いて行われる。典型的にはポリマー抗原またはその個々のサブユニットのような特異的結合部材を含む捕捉試薬が固相材料に付着する。試験試料は、該試験試料中の抗ポリマー抗体とポリマー抗原間の特異的複合体の形式に十分な条件下でしばらく捕捉試薬とインキュベートされる。次に、非結合試験試料を除去することが慣用的に知られているバッファーを含むバッファー溶液で固相材料が洗浄される。次に、得られた複合体が第２標識ポリマー抗原のような指示薬と三元複合体の形成に十分な時間および条件下でインキュベートされる。未反応指示薬は、固相をバッファー溶液で洗浄することにより除去される。次に、固相に結合した指示薬量が指示薬の標識成分と適合しうる手法によって測定される。定量される場合には固相に結合した指示薬量が固相に結合した試験試料の抗ポリマー抗体量に比例する。本方法の試薬は、同時に混合されるかまたは単独であるいは組合わせて順次加えられる。
本発明においては、固相材料は、特異的結合部材を固定化するために用いられる適切な吸収性、多孔性または毛細管クロマトグラフィー物質または当業者に周知の他の慣用の固体物質が含まれる。詳しくは、固相材料は、１種以上の分析試薬を含む１以上の層を有する分析部材による流れに有用なガラス繊維、セルロースまたはナイロンパッド；浸漬と読み取り分析用ディップスティック；試薬の１種または全種が固相材料の単一片の分離帯に含まれるクロマトグラフィー（即ち、ペーパーまたはガラス繊維）または薄層クロマトグラフィー（即ち、ニトロセルロース）用試験片；または当業者に周知の吸収材料が含まれる。この固相材料としては、ポリアクリルアミドビーズ、ポリスチレンビーズまたはチューブ、磁気ビーズ、マイクロタイタープレートまたはガラスもしくはプラスチックテストチューブも含まれるがこれらに限定されない。
固相材料として天然物質、合成物質または合成的に変性された天然に存在する物質も用いられ、多糖、即ち、紙のようなセルロースおよびジアゾベンジルオキシメチルセルロース、ニトロセルロース、２−アミノフェニルチオエチルセルロースおよび酢酸セルロースのようなセルロース誘導体；シリカ；シリコン粒子；不活性化アルミナのような無機物質または塩化ビニルのようなポリマー、塩化ビニル−プロピレンポリマーおよび塩化ビニル−酢酸ビニルポリマーと共に多孔性ポリマーマトリックスに一様に分散した他の微細無機物質；天然（即ち、木綿）および合成（即ち、ナイロン）双方の布；シリカゲル、アガロース、デキストランおよびゼラチンのような多孔性ゲル；ポリアクリレートのような高分子膜；タンパク質結合膜等が含まれる。固相材料は、かなりの強度または支持体によって供給される強度がなければならず、検出可能なシグナルの発生を妨害してはならない。
捕捉試薬は、典型的には、固相材料に結合した特異的結合部材を含む。特異的結合部材は、抗体、抗原または指示薬を直接または間接に結合し、いかなる手段によっても試験試料および他の分析試薬から捕捉結合部材が分離されるように固相に結合するかまたは結合することができるかまたは沈殿することができる。本発明の捕捉試薬は、不溶性固相材料に結合する捕捉結合部材に限定されない。凝集分析においては、捕捉試薬の捕捉結合部材はウシ血清アルブミンのような可溶性担体に結合し得る。
特異的結合部材は、特異的結合対、即ち、異なる２分子の一部であり化学的または物理的手段によって分子の一方が第２分子に特異的に結合する（非特異的結合とは反対に）。抗原と抗体のほかに、どちらか一方が固定化され試験試料に結合する特異的結合対としては、ビオチンとアビジン；炭水化物とレクチン；相補的ヌクレオチド配列；相補的ペプチド配列；エフェクターとレセプター分子；酵素補助因子と酵素；酵素インヒビターと酵素；ペプチド配列と該配列または全タンパク質に特異的な抗体；高分子酸と塩基；色素とタンパク質結合剤；プロテインＡと抗体；プロテインＧと抗体等が含まれる。
更に、特異的結合対としては、原特異的結合部材の類縁体である部材、例えば、被検体類縁体が含まれる。被検体は、ポリマー抗原あるいは抗ポリマー抗体として定義される。特異的結合部材が免疫反応体である場合には抗体、抗原、ハプテンまたはその複合体とすることができる。更に、抗体はモノクロナール抗体またはポリクロナール抗体、組換えタンパク質または組換え抗体、その混合物または断片、および抗体と他の特異的結合部材の混合物とすることができる。そのような抗体の調製の詳細および特異的結合部材として使用するための適合性は当業者に周知である。
指示薬は、抗体または抗原の有無または量を示すために抗体または抗原に直接または間接に結合することができる特異的結合部材に直接または間接に結合した検出可能な標識を含んでいる。標識あるいは特異的結合部材を変えることにより様々な指示薬が作られる。通常は抗体あるいは抗原または相補的特異的結合部材と複合体を形成した後に指示薬が検出されるが非結合指示薬も検出される。
標識は、特異的結合部材に結合しかつ肉眼または機器手段によって検出可能なシグナルを生じることができる物質を意味することができる。本発明に有用な種々の適切な標識としては、色素原；触媒；蛍光化合物；化学発光化合物；放射性標識；コロイド金属および非金属粒子、色素粒子、酵素または基質、または有機ポリマーラテックス粒子を含む直接肉視標識；シグナル発生物質を含むリポソームまたは他の小胞（他の分析試薬、抗体または抗原と反応して肉眼または機器手段によって検出可能なシグナルを生じることができる）等が含まれる。
本発明の方法は、また、競合分析形式を用いて行われる。固相競合分析においては、捕捉試薬は、典型的には固相材料に付着しておりかつ試験試料と指示薬双方と接触する特異的結合部材を含む。しかしながら、指示薬は、標識と結合した被検体または被検体類縁体から形成される。結合反応が起こり、（１）固定化捕捉薬／被検体複合体および（２）固定化捕捉薬／指示薬複合体の複合体の形成が生じる。また、固定化特異的結合部材は、試薬試料被検体が指示薬に結合するために競合する被検体または被検体類縁体とすることができる。競合分析においては、固相上の標識量は試料中の被検体量に逆比例する。従って、陽性試験試料は通常シグナルが低下する。
抗ポリマー抗体を検出する好適な方法は、抗ポリマー抗体ラインブロット分析を含んでいる。部分重合アクリルアミド抗原がニトロセルロース支持体に加えられ、試験片に切断される。該試験片は、試験試料と１時間インキュベートされ、次に、指示薬が該試験片に加えられて抗ポリマー抗体を可視化させる。
（APA）ラインブロット分析は、他の免疫分析より特異性および感受性を増大して試験血清中の抗ポリマー抗体を検出する。抗ポリマー抗体は、複合体ポリマーPPAに特異的に応答すると考えられ、（APA）ラインブロット分析を用いる他の非特異的抗シリコーン抗体より同定される。
更に、試験血清中の抗ポリマー抗体の検出は、何らかの意味で関連があると考えられる３種の疾患、SRD、線維筋痛症およびCFSと相関することがわかった。その（APA）ラインブロット分析は、SRD線維筋痛症およびCFS患者からの免疫応答を客観的に検出するために用いられ、それらの患者を健康な血液提供者と周知の自己免疫疾患にかかった他の病気の患者から同定する。
本発明においては、試験試料は抗ポリマー抗体またはポリマー抗原を含む疑いがある天然に存在するまたは人工的に生成された液体試験媒体から得られる。試験試料は、通常は、抗ポリマー抗体またはポリマー抗原が検出される生物液体またはその希釈液であり、血清；全血；血漿；体液；唾液；羊水および脳脊髄液等が含まれる。
本発明においては、ポリマー抗原はアクリルアミド、部分重合アクリルアミド、シリコーンまたはコラーゲンから構成される。
ニトロセルロース支持体のほかに、ポリビニリデンジフルオリド（PVDF）およびナイロンが代替的膜原とすることができる。（APA）ラインブロット分析は、また、標準96ウェルポリスチレン酵素結合免疫吸着分析（ELISA）形式にも適応することができる。APAラインブロットは、ラテックス凝集、抗体捕捉分析、放射性免疫沈降分析（RIPA）、ポリスチレンビーズによる酵素免疫分析（EIA）および粒子濃度蛍光免疫分析（PCFIA）を含む他の免疫分析に適応するように処理することができなければならない。
抗ポリマー抗体ラインブロット分析は、典型的には、数種の異なる試薬の添加およびインキュベーションを必要とする。試薬を安定化するためにおよび過剰の試薬または試験試料を反応物から除去するために種々の異なるバッファーと洗液が用いられる。当業者に周知であるように、バッファーと洗液、および反応回数の変更が行われる。
分析試薬は、キット中に供給される。抗ポリマー抗体を検出する試験キットは、典型的には、ポリマー抗原が固定化される支持物質を含み、場合によっては、適切な指示薬、バッファー溶液および適切な指示薬の適切な供給物が含まれ、検出可能な標識に結合したヒト抗体に特異的な結合部材を含み、酵素標識の存在下に比色または化学蛍光シグナルが含まれる。
ポリマー抗原を検出する試験キットは、典型的には、抗ポリマー抗体が固定化されるかまたは試験試料の成分が固定化される（即ち、固相上に抗原を直接固定化する）固相材料を含み、場合によっては、適切な指示薬、バッファーおよび洗液の適量が含まれる。安定剤および保存剤のような他の成分もキットおよび／または試薬中に存在させることができる。
抗ポリマー抗体（APA）の存在を検出するためにPPAを用いる診断用“ラインブロット”キットは、下記の成分を含むことが望ましい。
１）PPA希釈液に含浸したニトロセルロース膜片。
２）前記PPA被覆ニトロセルロース片のインキュベーションに適合する大きさに適したプラスチックまたはポリスチレン製ディスポーザブルトレー。
３）免疫学的分析におけるヒト免疫グロブリンの適切な検出用の下記の基質または下記の基質と試薬の組合わせ；ビオチニル化ヤギ抗ヒトIgG、アビジン結合ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、30％過酸化水素および４−クロロ−１−ナフトール。
４）陽性APA対照血清。
５）弱／陽性APA対照血清。
６）陰性APA対照血清。
７）100mlの20×洗浄バッファー。
８）25mlの10×ブロッティングバッファー。
９）30gのブロッティングバッファー末。
代替的に供給される分析キットの感受性と特異性に影響する成分としては、抗ヒトIgへのHRPの直接結合、代替的結合用酵素としてのアルカリホスファターゼ、および3,3′−ジアミノベンジジン（DAB）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（AEC）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（BCIP/NBT）およびファーストレッドRCorのような他の熱量基質が含まれる。
ニトロセルロースのほかに、ポリビニリデンジフルオリド（PVDF）およびナイロンがAPAラインブロット分析および／または標準96ウェルポリスチレン酵素結合免疫吸着分析（ELISA）形式に適合される分析において代替的膜源として用いられる。APAラインブロット形式が本特許の要求に詳細に記載され最も有効であることがわかったが、PPAはラテックス凝集、抗体捕捉分析、放射性免疫沈降分析（RIPA）、ポリスチレンビーズによる酵素免疫分析（EIA）および粒子濃度蛍光免疫分析（PCFIA）を含む他の免疫学的分析に適合するように処理することができなければならない。
診断検査においては、多数の試料を容易に適応させることができるのでELISAが行うのにより望ましいものである。ほとんどの診断検査室はELISA用機器を既に備えている。対照的に、ラインブロット免疫分析は、特に多数の試料を処理する特殊な器具（反応トレー、ウォシャ等）を必要とする。
免疫学的技術の当業者に一般に既知の方法は、Antibo dies:A laboratory Manual,Ed Harlow ＆ David Lane,（1988）,Cold Spring Harbor,chap.12 ＆ 14に記載されており、この文献の記載は本願明細書に含まれるものとする。
下記の実施例は、例示のために示すものであり、限定を目的とするものではない。
実施例1:抗ポリマー抗体の検出
試料の採取
各被検者または対照からの血清を採取し、翌日配達キャリヤで氷上輸送するまで−20℃で貯蔵し、試験時間まで−20〜４℃で貯蔵した。
抗ポリマー抗体ラインブロット分析
2.5mlのAcryl:Bis（37.5:1）、8.5mlのH₂Oおよび3.5mlの1.5Mトリスを混合することにより部分重合アクリルアミドを調製した。この５％アクリルアミド溶液を100μｌの0.01％過硫酸アンモニウムおよび20μｌのTEMEDで架橋し、60mlビーカー中で15分間固化した。PPAはわずかに粘稠な液体として上方に残る。
ポリマー（PPA）の分割量を５、25、125、625および3,125倍に順次希釈し、ニトロセルロース膜に加え、風乾した。次に、ニトロセルロース膜を試験片に切断し、ウェスタンブロット阻止バッファーで1:400に希釈した盲検試験血清と１時間インキュベートした。ビオチニル化ヤギ抗ヒトIgGまたは抗ヒトIgMアビジン結合ホースラディッシュペルオキシダーゼおよび酵素基質ペルオキシドと４−クロロ−１−ナフトールを用いる一連の反応によって結合IgGまたはIgMを可視化した。
各APA試験片ロット（28試験片）に陰性、弱陽性および強陽性対照を流した。弱陽性対照は、分析物の酵素展開部分を標準化するために働いた。対照血清の反応性に基づいて試験片ロットを標準化し、続いてそれを用いて試験血清の反応レベルを評価した。
実施例2:手順と結果の比較
（APA）ライン免疫ブロッティングによって検出したシ リコーン乳房移植片の受容者からの盲検でない試料にお ける抗ポリマー抗体の頻度
シリコーン乳房移植片に曝露すると以前に認識または限定されたリウマチ疾患と集団的に等しくなく適切な診断試験でユニークに同定可能である症状や合併症の発現が生じることがある。APAラインブロット法の組合わせを用いてシリコーン乳房移植後に合併症を報告する人の約50％（363/667）がAPA血清抗体を生じることが求められた。これは、健康な血液提供者に見られる７％（7/100）より著しく多い（ｐ＜0.0005）（表１）。他の自己免疫合併症（SLE、RA、若年性関節リウマチまたは汎発性強皮症）を経験している患者からの血清は、症例の10％未満にAPA抗体を示した。従って、抗ポリマー抗体は自己免疫性の一般マーカーでないと思われる。しかしながら、強皮症のCREST型に罹った患者は、試験症例の50％（10/20）に検出可能なAPAを示した。このことは、皮膚の緊張、強皮指、脱毛症、浮腫、毛細血管拡張、皮疹および色素沈着の変化を含む強皮症様症候群がシリコーン乳房移植とよく関連があることから興味深い（Brozenaら,1988;Vaseyら,1991;Spieraら,1994）。
乳房移植片からのシリコーンへの曝露と関連がある合併症をもつ患者は、健康な血液提供者よりおそらく17倍検出可能なAPAを生じた（95％の信頼限界7.55〜46.69）。この％は、現在治療を探究しているシリコーン乳房移植受容者全員が実際にはシリコーン曝露から直接生じる合併症を経験していないことから乳房移植片からの合併症に非常に適切である。
SRDに罹った69人の患者の盲検でない試料中の抗ポリマ ー抗体の頻度
抗ポリマー抗体分析を特定の臨床症状の出現と相関させるために、シリコーン疾患に罹った69人の患者をMP、PIPについての関節の痛み、感覚異常、知覚異常、後頭、上歯頸、上顎、腰、膝、および足首を含む多発性痛点、圧倒的な疲労、全身の倦怠および調べた広範な疼痛によって限定した。
69人の患者のうち、原発性シェーグレン症候群の患者が２人、CRESTの患者が１人、血清陽性慢性関節リウマチの患者が１人およびACR基準を満たす狼瘡の患者が１人を含む５人の患者は米国リウマチ学会の基準によって周知のリウマチ疾患があった。持続性慢性肝炎の患者が１人あった。４人の患者のリウマチ様因子は陽性であり、７人の患者は抗甲状腺抗体を有した。
58人の患者はSRDであり、11人の患者は疾患がなかった。
22人の患者は抗ポリマー抗体とSRDがあり、13人の患者はおそらく抗ポリマー抗体とSRDがあり、合計35人の患者が抗ポリマー抗体の存在があった。
SRDに罹った患者の60％が抗ポリマー抗体があった。
シリコーン疾患のない患者は11人あり、４人の患者のみ抗ポリマー抗体の存在を示した。この抗体は、SRD患者の60％が抗体を有したのでSRDの極めて良好なプレディクターである。
SRDに罹ったおよび罹っていない患者の盲検でない試料 中の抗核抗体（既知の自己抗原）の頻度
抗核抗体試験は、強皮症を検出するためにリウマチ専門医によって通常行われている。抗核抗体は、SRDに罹った58人のうちの20の患者（34％）に低力価で存在した。抗核抗体は、SRDに罹っていないが筋膜痛のある11人の患者のうち５人に存在した。抗核抗体とSRD間の相関は証明されず、抗核抗体試験をシリコーン疾患の良好なプレディクターとしなかった。
抗ポリマー抗体が陽性であることが既知の試料によるEL ISA方式におけるAPAの検出
下記の表（表２、３＆４）は、ELISA方式における抗ポリマー抗体の検出を示すものである。各表の第１欄に示されるように部分重合ポリアクリルアミド抗原の希釈比をポリスチレン96ウェルプレートの各ウェルに結合した。代表的な患者試料の血清希釈量（1/50、1/100等）を各欄の上の第１例に示す。血清を抗原を含むウェル中でインキュベートし、次に、ヤギ抗ヒトアルカリホスファターゼ標識二次抗体と反応させた。この標識二次抗体と基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドールホスフィート（BCIP）ホスフェートとの反応からのシグナル発生系から光学濃度としてデータを示した。ブランクを示した欄におけるPPAあるいは血清を含まないウェルは、他のウェルに相対して０に設定する。本試験から、ELISA方式を用いる抗ポリマー抗体を試験する能力が示された。

実施例3:抗ポリマー抗体の検出からのシリコーン関連疾患の診断
本実験におけるAPAの検出は、シリコーンまたは乳房移植片に見られる他の成分に対向する免疫交差反応性を表すものである。また、シリコーンはアジュバントとして機能および／またはコラーゲンのような周囲結合組織に存在する細胞成分と物理的に相互作用することができる。このことにより、シリコーンまたは細胞成分の構造上の変化が生じ部分重合アクリルアミド（PPA）に抗原的に似てくる。シリコーン、コラーゲンおよびPPAは全て架橋ポリマーである。これらの物質間の抗原の関係は、架橋の種類および程度に起因し、ポリマーの化学組成に起因しない。
シリコーン移植片への曝露がAPA発生に必要でないと考えられる所見は、この後の仮説と一致している。健康な集団の約７％がPPAと交差反応する抗体を生じると考えられる。シリコーン含有部材が医薬、商業、工業に広く用いられることからこのことは適格でなければならず、正常な血液提供者がシリコーンに知らないで曝露していたことは起こりうることである。また、前から存在するAPAを有する個体はシリコーン移植後の合併症に罹りやすくするものであるがまだ確立していない。
PPAおよびPPB（部分重合ビスアクリルアミド−抗体が実際に存在することを示すために用いられる）との所見に基づいて、APAがシリコーン移植ポリマー成分に抗原的に似ているアクリルアミド／ビスアクリルアミドから構成される異種ポリマー構造（おそらく環状コンホメーション）と反応すると思われる。推測であるが、環状構造は相対的に単純なポリマー構造に抗原性を伝達するのに必要な複雑さのレベルを与えることができる。更に、環状ポリマーの複合体は、重合に耐性があり、おそらくはアクリルアミドゲルの部分重合成分として存在する。
SRDに罹った患者を同定するAPA試験の能力を示すために、盲検試験を設計した。
個体からの血清試料をリウマチ専門医から入手した。試料の分類をコード化し、試料の分類に対して盲検にした。次に、APA抗体試験（ラインブロット形式）を用いて試料を分析し、抗ポリマー抗体の有無について結果を採点した。下記のグループからの試料を含めた（表５および図１を参照されたい）。
１）性および年齢の合った健康な個体；シリコーン移植なし（23試料）
２）古典的リウマチ疾患；シリコーン移植なし（19試料）
３）無症候個体：シリコーン移植あり（15試料）
４）非定型結合組織病／非特異的自己免疫合併症（ACTD/NSAIC）軽度および中等度／重度；シリコーン移植あり（18軽度および18中等度／重度試料）
５）非定型リウマチ症候群（ARS）；シリコーン移植あり（43試料）
６）古典的リウマチ疾患；シリコーン移植あり（18試料）
血清試料の分類基準：
１）全身性エリテマトーデス−全身性エリテマトーデスの診断は、Tan EM,Cohen AS,Fries JFら,1982年改訂全身性エリテマトーデス（SLE）の分類基準,Arthritis Rheum 25:1271−1277,1982に準じて行った。
２）進行性全身性硬化症−進行性全身性硬化症の診断は、Masi AT,Rodnan GP,Medsger TA Jrら：全身性硬化症（強皮症）の予備的基準,Arthritis Rheum 23:581−590,1980に準じて行った。
３）混合結合組織病／重複症候群−混合結合組織病の診断はRNPの存在と陰性SMを必要とし、その疾患の臨床上の説明によった。重複症候群は、臨床症状と２種類以上のリウマチ疾患の特徴、特に進行性全身性硬化症、全身性狼瘡、筋炎および慢性関節リウマチを必要とする。
４）多発性筋炎または皮膚筋炎−多発性筋炎または皮膚炎の診断は、Bohan A,Peter JP,Bowman RLら：多発性筋炎または皮膚筋炎に罹った患者153人のコンピュータ分析,Medicine（ボルティモア）56:255−286,1977による基準によった。
５）シェーグレン症候群−シェーグレン症候群の診断は、Fox RI,Robinson CA,Curd JCら：シェーグレン症候群に関する第１回国際シンポジウム：分類基準の提言,Scand,J.Rheumatol,562:28,1986に基づいて行った。
６）非定型結合組織病／非特異的自己免疫症状−ACTD/NSAICに罹った患者は、自己抗体試験の陽性および下記の少なくとも４種の存在を有した（ACTDの診断はANA結果の陽性を必要とした）。
a.レイノー現象：患者は少なくとも２種の色調変化、肉眼による痙攣または指頭潰瘍の病歴を示す。
b.多発性筋肉炎:3ヵ所以上の関節の滑膜の浸潤と筋痛が６週間より長く続くものとして定義され、医師によって認められる。
c.関節痛、３ヵ所以上の関節。
d.眼球乾燥症および口内乾燥症の主観的感覚。
e.筋痛症；医師の試験で客観的筋痛によって決定される。
f.点状出血、毛細血管拡張、網状皮斑または紅斑血管発疹を含む皮疹。
g.胸膜炎または心膜炎。
h.記憶喪失または精神病試験で集中することが難しい。
ｉ 末梢神経障害。
j.少なくとも６ヵ月続く疲労。
k.リンパ腺症。
l.光感受性：太陽に曝露した際の皮疹の発生として限定される。
m.嚥下困難。
n.脱毛症。
o.運動失調。
p.睡眠障害。
q.易傷性または出血性疾患
r.慢性膀胱炎または刺激性膀胱。
s.刺激性腸症候群または大腸炎。
t.寝汗。
u.粘膜潰瘍。
v.乳房痛または被包化の徴候／症状。
７）自己抗体：
A. ANAおよびRF陽性（401U区分による比濁法で）。
B. 抗DNA、SSA、SSB、RNP、SM、scl−70、セントロメア、Jo−１、PM−sclまたはdsDNAのような他の自己抗体。
C. 甲状腺抗体、抗ミクロソームまたは抗カルジオリピン。
D. 他の血清学的異常：
1. 免疫グロブリンの上昇（IgG,IgA、IgM）：または
2. ESR、CRP上昇のような炎症の血清学的徴候。
８）非定型リウマチ症候群−非定型リウマチ症候群の診断は、上記症状および／または知見の５つが陽性の自己抗体結果に付随しなかった場合に行われる。
９）重度−重度のACTD/ARSまたはNSAICは、乳房の硬化または被包化、または病理試験と皮疹に対するシリコーン肉芽腫（即ち、毛細血管拡張、溢血点）と共に少なくとも乳房痛を必要とする。職業、副業およびセルフケアのわずかな仕事だけ行う能力と一致した機能上の能力の低下がある。
10）中等度−中等度のACTD/ARSは、中等度の疼痛または患者が日常生活の仕事を多少行うことができる機能上の能力がある。
11）軽度−軽度のACTD/ARSは、日常生活に必要な仕事の大部分を行うことができる。
表５および図１に示されるように、APA試験はACTD/NSAIC分類（SRD）からの患者の血清をユニークに同定することができた。表示された約８％のベースラインは、盲検でない実験に見られた健康な血液提供者の平均APA血清反応性である。縦軸は、APA血清反応％として仕切られている。ｐ値は、標準として性の合った対照を用いて対でないスチューデントのｔ検定分析によって求める。

実施例4:抗ポリマー抗体の検出からの線維筋痛症の診断
線維筋痛症の診断は、現在、米国リウマチ学会によって系統的に記述された臨床所見に基づいている。1990年に米国リウマチ学会によって分類されたように、線維筋痛症は炎症または筋肉／骨格異常のない広範囲にわたる慢性疼痛および触診時の18のうち11の圧痛点の疼痛を特徴とする症候群である。疼痛は、次の症状に付随することがよくある：慢性疲労、睡眠障害、頭痛および刺激性腸症候群。（REF:Goldenberg,D.L.1995.Fibromyalgia:why such controversy.Annals Rheumat.Dis.54:3−５）
圧痛点の指頭触診時の疼痛以外は物理的知見はほとんどなく、線維筋痛症の診断である既知の検査（客観的）試験もない。CFSおよび線維筋痛症は、同一症状のことがあり、少なくとも相当な重なりもあり、一方の症状をもう一方の症状に誤診することになることが示されている。（REF:Buchwald,D.＆ Garrity,D.1994.Comparison of patients with chronic fatigue syndrome,fibromyalgia,and multiple chemical sensitivities.Arch.Intern.Med.154:2049−2053）
線維筋痛症に罹った患者を同定する能力を示すために、下記の盲検実験を行った。
患者と健康な個体からの試料をユニークなNo.に割り当て分析に従った。試料中の抗ポリマー抗体の存在を予め試料分類の知識をもたずにAPAラインブロットを用いて分析した。分析およびデータの表作成後、試料分類と試料No.を相関させるコードを得、結果と試料分類とを相関させるために用いた。APA試験が線維筋痛症を診断することを示す結果を表６に示す。

血清希釈度1:400でわかるように、健康な対照の読みが10％陽性よりも小さく低下する場合、抗ポリマー抗体は線維筋痛症に罹った患者の71％になお出現した。
実施例5:抗ポリマー抗体の検出からの慢性疲労症候群の診断
CFSの診断は、現在、疾患管理予防センターによって系統的に記述された徴候および症状の最低数の臨床所見に基づいている。慢性疲労症候群（CFS）は、６ヵ月以上持続する疲労（１日の平均活動が50％低下する）を特徴とする。典型的には次のことに付随している：軽い熱；咽喉痛；説明されていない筋肉の衰弱；リンパ腺痛；筋痛；頭痛；過度の感応性を含む神経生理学的症状；錯乱；忘れっぽい；抑うつ；睡眠障害；およびこれらの症状の急性または亜急性罹患（ref:Calabrese,L.Danao,T.Camara,E.Wilke,W.1992 Chronic Fatigue Syndrome.Amer.Fam.Phys.45:1205−1213）。試験時に物理的知見はほとんど存在せず、CFSを診断する既知の検査（客観的）がない（ref:Buchwald,D.＆ Garrity,D.1994.Comparison of patients with chronic fatigue syndrome,fibromyalgia,and multiple chemical sensitivities.Arch.Intern.Med.154:2049−2053）。
慢性疲労症候群に罹った患者を同定する能力を示すために、下記の盲検実験を行った。
患者と健康な個体からの試料をユニークなNo.に割り当て分析に従った。試料中の抗ポリマー抗体の存在を予め試料分類の知識をもたずにAPAラインブロットを用いて分析した。分析およびデータの表作成後、試料分類と試料No.を相関させるコードを得、結果と試料分類とを相関させるために用いた。APA試験がCFSを診断することを示す結果は上記表６に示されている。
血清希釈度1:400でわかるように、健康な対照の読みが10％陽性よりも小さく低下する場合、抗ポリマー抗体はCFSに罹った（55％）1/2を超える患者になお出現した。倍の血清濃度では精度がわずかに落ちるが試験したCFSに罹った患者の82％が抗ポリマー抗体に陽性であった。

Claims (6)

1. 線維筋痛症の診断方法であって、
   ａ）抗ポリマー抗体に関して試験すべき試料を供給する工程；
   ｂ）ポリアクリルアミドおよび部分重合アクリルアミドからなる群より選ばれたポリマー抗原と前記試料とを、抗ポリマー抗体が前記ポリマー抗原と反応するのに十分な時間混合して、複合体を形成する工程；
   ｃ）指示薬と前記工程ｂ）から得られた物質とを反応させて前記試料中の抗ポリマー抗体の有無を示す工程；及び
   ｄ）工程ｃ）から得られた物質中の反応した指示薬の有無を同定する工程
   を含み、よって反応した指示薬の存在により、線維筋痛症の臨床診断と共に前記試料を供給する個体における線維筋痛症を同定する、前記方法。
2. 慢性疲労症候群（CFS）の診断方法であって、
   ａ）抗ポリマー抗体に関して試験すべき試料を供給する工程；
   ｂ）ポリアクリルアミドおよび部分重合アクリルアミドからなる群より選ばれたポリマー抗原と前記試料とを、抗ポリマー抗体が前記ポリマー抗原と反応するのに十分な時間混合して、複合体を形成する工程；
   ｃ）指示薬と前記工程ｂ）から得られた物質とを反応させて前記試料中の抗ポリマー抗体の有無を示す工程；及び
   ｄ）工程ｃ）から得られた物質中の反応した指示薬の有無を同定する工程
   を含み、よって反応した指示薬の存在により、慢性疲労の臨床診断と共に前記試料を供給する個体におけるCFSを同定する、前記方法。
3. 線維筋痛症の診断を援助するのに有用な診断キットであって、
   支持物質に結合したポリアクリルアミドまたは部分重合アクリルアミドを含む抗原；及び
   前記抗原に結合した抗体の有無を示すことができる指示薬：
   を含む、前記診断キット。
4. 慢性疲労症候群（CFS）の診断を援助するのに有用な診断キットであって、
   支持物質に結合したポリアクリルアミドまたは部分重合アクリルアミドを含む抗原；及び
   前記抗原に結合した抗体の有無を示すことができる指示薬：
   を含む、前記診断キット。
5. 複合体を形成しない物質を抗ポリマー抗体とポリマー抗原の複合体から分離する洗浄組成物を更に含む、請求項３または４に記載の診断用キット。
6. 該指示薬が酵素標識の存在下の比色または化学発光シグナルである、請求項３〜５のいずれか１項に記載の診断用キット。

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