ITFI980099A1 - Metodo diagnostico per patologie algiche - Google Patents

Description

Domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo:

Campo dell'invenzione

La presente invenzione riguarda la possibilità di diagnosticare alcune malatie algiche mediante rilevazione della ipofunzionalità o diminuzione dei livelli delle proteine G-inibitorie (qui di seguito indicate come Gi/o).

Stato dell'arte

Una grave cefalea disabilitante si manifesta, durante la vita, in circa il 40% della popolazione mondiale.

In Italia 10 milioni di cittadini sono soggetti periodicamente a episodi di cefalea.

Si distinguono essenzialmente due tipi di cefalea, la cefalea primaria che è generalmente un sintomo di una malattia disabilitante ma benigna e la cefalea secondaria che rappresenta invece un sintomoi di patologie molto gravi come per esempio: tumori cerebrali, arteriti a cellule giganti, aneurismi intracranici, emorragie subaracnoidee, meningiti, ecc.. A 'questi due tipi di cefalea si deve poi aggiungere il comune mal di testa che sperimentano quasi tutti almeno una volta nella vita.

Allo stato attuale delle conoscenze la diagnosi delle varie forme di cefalee è effettuabile esclusivamente su base clinica esaminando cioè solamente le caratteristiche con cui l'attacco si manifesta (numero e durata degli attacchi, descrizione della sintomatologia associata, anamnesi familiare, esclusione di patologie espansive endocraniche, di svariati disordini metabolici, di infezioni tanto cefaliche che sistemiche ecc.).

Per quanto riguarda la fibromialgia, essa è caratterizzata da dolori ed iperalgesia diffusi a prevalente localizzazione muscolare, li'epidemiologia si aggira mediamente intórno al 5% della popolazione.

Fino ad oggi, i numerosissimi studi neurofisiologici, ematologia, bioptici e psicologici volti ad individuare la patogenesi della sindrome fibromialgica non hanno portato a risultati obbiettivi ed attendibili in grado di differenziare il paziente fibromialgico dal soggetto sano.

Appare pertanto di grande importanza poter disporrò di un semplice ed affidabile metodo diagnostico capace di discriminare le cefalee primarie sia da quelle secondarie ad altre patologie che dal comune mal di testa e di diagnosticare con sicurezza la fibromialgia.

Le proteine G iriibitorie sono proteine ubiquitarie localizzate sulla parete interna della membrana citoplasmatica. Il loro effetto inibitorio su svariate funzioni cellulari viene attivato a seguito della stimolazione di idonei recettori di membrana a cui le proteine sono collegate. Questo effetto inibitorio si esplica attraverso una riduzione dei livelli di AMP-ciclico, l'apertura di canali del potassio e la chiusura di cariali del calcio. In altre parole le cellule (in particolare quelle nervose) divengono iperpolarizzate e pertanto meno eccitabili. Allo stato attuale delle conoscenze, nessuna patologia umana è mai stata correlata ad una riduzione della funzionalità o dei livelli cellulari delle proteine Gi/o.

Descrizione dettagliata dell'invenzione

La presente invenzione consente di superare i problemi suddetti in quanto rende disponibile un semplice metodo diagnostico di laboratorio capace di identificare rapidamente e con precisione la presenza delle patologie suddette.

E' stato infatti sorprendentemente trovato, ed è oggetto della presente invenzione, che le forme di cefalea primaria e di fibromialgia possono essere messe in relazione con una carenza e/o una ridotta funzionalità delle proteine Gi/o.

La carenza delle proteine Gi/o può essere determinata con gli appropriati metodi analitici noti in letteratura (per es. Western Blot e immunofluorescenza).

La funzionalità delle proteine Gi/o può venire valutata determinando la loro capacità di inibire la produzione di AMP ciclico (cAMP) (in altre parole misurando i livelli basali di cAMP che nei malati risultano più elevati per mancata inibizione) o misurando l'inibizione della produzione stimolata di cAMP o misurando i livelli di mRNA per le proteine Gi/o, anche queste determinazioni sono effettuate con metodi noti in letteratura (per es. Northern Blot, Ibridazione in situ, RT-PCR).

Fra i vantaggi del presente metodo diagnostico è importante considerare che l'ubiquità delle proteine G inibitorie consente di eseguire la determinazione su vari tipi di elementi figurati del sangue e su vari tipi di cellule: muscolari, nervose ecc.

Solo per. evidente comodità la presente descrizione 'si riferisce in particolare alle analisi eseguite su cellule ematiche (leucociti) in quanto queste sono le più facilmente, prelevabili dal paziente. Analisi su altri tipi di cellule o elementi figurati del sangue potranno essere applicate usando le appropriate tecnologie note.

In particolare la ricerca è stata effettuata sui linfociti jottenuti dal sangue venoso periferico poiché dall'esame della letteratura risultano essere I piu idonei per gli studi sulle proteine G inibitorie.

Vengono qui di seguito descritti a titolo di esempi alcuni metodi per la valutazione della funzionalità e dei livelli cellulari delle proteine Gi/o ma è ovvio che altri metodi analitici per la determinazione di proteine G inibitorie, noti in letteratura, possono essere impiegati nel metodo! diagnostico secondo l'invenzione.

Valutazione della funzionalità delle proteine Gi/o

I campioni di sangue (15-20 mi) eparinizzati (500 UI eparina/ 10 mi sangue) sono diluiti 1:1 con soluzione fisiologica. I linfociti sono poi isolati per centrifugazione in. gradiente di densità come descritto daj Bòyum (Scand. J. Clin. Lab. Invest., 21 (Suppl. 97): 77, 1968) e permeabilizzati con digitonina (10 pg/ml) in condizioni tali da mantenere integre le funzioni biologiche (Corey et al, J. Biol. Chem, 264: 14165, 1989).

I linfociti provenienti da soggetti sani vengono poi preincubati con o senza tossina della pertosse (PTX) alla concentrazione di i100 ng/ml a 37° per 90 min. Dopo la preincubazione, i linfociti vengono suddivisi in campioni contenenti 1-2-10® cellule intatte e i vari reagenti vengono aggiunti in quantità tale da ottenere un volume finale di 300 μl.

Per la determinazione del contenuto di cAMP i linfociti vengono risospesi in una miscela di incubazione contenente teofillina 100 μΜ (oppure 3-isobutil-1-metilxantina) per impedire la degradazione di cAMP da parte delle fosfodiestarasi. Per misurare il livello basale di cAMP si aggiunge al campione il veicolo (DMSO). La formazione di cAMP viene invece iniziata aggiungendo forskolina 10-4 M che stimola direttamente l'adenilato iciclasi.

Per ottenere la curva di inibizione della produzione di cAMP si deve aggiungere ai campioni, contenenti forskolina l'analogo non idrolizzarle del GTP Gpp(NH)p (guanilil 5'-imidodifosfato) ne! range di concentrazioni comprese tra 10 nM e 100 μΜ. Dopo un'incubazione di 15 min a 37°C, le cellule vengono lise ed i campioni centrifugati. La determinazioneidei contenuto di cAMP viene poi effettuato nel sovranatante tramite un metodo ELÌSA.

Quantificazione delle proteine Gi/o

La quantificazione delle proteine Gi/o viene effettuata dai linfociti isolati secondo l'analisi Westem-blot oppure con l'uso della tecnica dell'immunofluorescenza.

a) Analisi Westem-blot

Le cellule vengono rotte per sonicazione in Hepes buffer 25 mM e 10% saccarosio. Le cellule vengono quindi centrifugate a 105,000 x g per 60 min. Le membrane cosi' ottenute vengono risospese in Tris-HCI buffer 1mM (pH 7.4) contenente 1 mM EDTA, leupeptina 5 pg/ml, 0.3 mg/ml fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) e 1 mM ditiotreitolo (DTT).

Le proteine di membrana vengono prima separate su gel di acrilammide (10 o 12%), previa diluizione delle stesse 1:3 nel samplé buffer, secondo Laemli (Nature 227: 680-685; 1971). Si preparano gel di 1,5 rnm di spessore e di 8 x 10 cm di dimensione e si sottopongono ad una corrente di 30 o 50 mA (doppia corsa) per circa 45-60 min.

Dopo la separazione elettroforetica le proteine vengono trasferite elettricamente (1 h a 100 V, 400 mA) su nitrocellulosa secondo la tecnica descritta da Towbin et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354; 1979), usando buffer Tris-glicina contenente il 10% di metanolo.

Parte dei filtri contenenti lo standard di riferimento o i pesi molecolari marker vengono colorati con amido black per verificare il trasferimento. I filtri contenenti le proteine linfocitarie vengono lavati per 2 volte con TBS (Tris 50 mM, NaCI 138 mM, MgCI2 2 mM, pH 7.4) quindi incubati nello stesso buffer contenente 3% di albumina serica o gelatina per 2 h a temperatura ambiente. Quindi si lavano per 1 volta con TBS ( 5 min) quindi 1 volta con lo stesso buffer (5 min) contenente 0.05% Tween 20 (TTBS). Dopo questo lavaggio i filtri si incubano per tutta la notte con l’anticorpo primario (anti Già secondo Laemli, rabbit serum) diluito 1:500 in TTBS. L'anticorpo viene quindi rimosso e i filtri lavati con TTBS 2 volte (5 min). Si aggiunge quindi il secondo anticorpo, IgG di capra ànti-coniglio coniugato con la fosfatasi alcalina, diluito T.

3000 e si tiene a contatto con i filtri per 1 h a temperatura ambiente. Dopo questo contatto i filtri vengono lavati abbondantemente con TTBS e quindi per 4 volte con TBS (5 min per lavaggio).

In parallelo alla reazione con siero anti Giα si incubano alcuni filtri con siero di coniglio (preimmune) per verificare la specificità della reazione di immunoriconoscimento cori siero specifico anti Giα.

La reazione si sviluppa mediante aggiunta ai filtri di un substrato cromogeno per. la fosfatasi alcalina e le bande ottenute si visualizzano e si identificano per confronto con la banda della proteina Giα standard.

Tutte le operazioni di lavaggio e incubazione con il siero specifico e l'anticorpo coniugato vengono condotte mettendo i filtri su un agitatore rotante.

b) Immunofluorescenza

La densità di membrana delle Gi/o viene determinata in maniera qualitativa anche su linfociti interi provenienti da campioni di controllo e da pazienti. Le cellule vengono fissate in paraformaldeide e trattate per il riconoscimento anticorpale (IgG anti Già, diluizione 1 : 100), quindi la. coniugazione con IgG FITC (1: 500). La reazione viene visualizzata dopo una serie di lavaggi mediante microscopia a fluorescenza.

Quantificazione dei livelli di mRNA codificante le proteine G-inibitorie

La determinazione dei livelli di messaggio per le proteine G viene eseguita con 2 metodiche fondamentali: l'analisi secondo Northern e la ibridazione in situ.

a) Northern analisi

Si prepara RNA totale secondo le tecniche descritte dai vari produttori di kit . preparativi. L'acido nucleico RNA viene quindi separato su gel di agarosio in condizioni denaturanti, in parallelo ad RNA standard. Il gel viene poi trasferito su nitrocellulosa e preparato per la ibridazione secondo le metodiche classiche. . La ibridazione viene eseguita mediante riconoscimento con sonda di DNA, rappresentata da oligonuclèotidi provenienti dalla sequenza terminale LKDCGLF, LKECGLY o da cDNA per il clone Gi2α e Gi3α.

b) Ibridazione in situ.

Dalle cellule ematiche o da tessuti vengono allestiti preparati di circa 10 pm. I preparati vengono trattati con condizioni stringenti di buffer di ibridazione in modo da abbassare il background di risposta. La ibridazione viene eseguita usando sonde oligonucleotidiche o cDNA.

Dati sperimentali

I risultati ottenuti utilizzando i metodi sopra descritti, hanno dimostrato che i pazienti affetti dalle varie forme di cefalea primaria e da fibromialgia hanno una ridotta funzionalità delle proteine Gi/o. Tale ipofunzionalità appare correlata ad una riduzione dei livelli di proteine Gi/o nei linfociti dei pazienti malati. E’ stato inoltre osservato che, a causa di tale ridotta funzionalità delle proteine Gi/o, i linfociti dei soggetti malati hanno i livelli basali di AMP ciclico superiori ai controlli sani.

I dati sperimentali otténuti sono riassunti nelle Figure 1 - 4; in particolare: La Figura 1 riporta in ordinate i livelli di cAMP basali in linfociti di pazienti cefalalgici e pazienti fibromialgici in confronto a soggetti sani;

La Figura 2 illustra l’effetto del pretrattamento con tossina della pertosse (PTX) sulla capacità di inibizione della produzione di cAMP stimolato in linfociti umani intatti. Come si vede dalia figura l’incubazione di linfociti con forskolina aumenta fortemente i livelli basali di cAMP.

Tale innalzamento viene prevenuto (vedi colonne bianche) dal Gpp(NH)p (attivatore delle Gì) aggiunto in concentrazioni opportune (riportate in ascisse); in caso di pretrattamento dei linfociti con PTX (che inattiva selettivamente le Gì) detta inibizione è assente (colonne nere).

La Figura 3 riporta i dati sull’inibizione della produzione di cAMP stimolato in linfociti di soggetti cefalalgici;

La Figura 4 riporta i dati sull'inibizione della produzione dì cAMP stimolato in linfociti di soggetti fibromialgici.

In base ai suddetti risultati, si può quindi affermare che il presente metodo onsente di diagnosticare le cefalee primarie e. la fibròmialgia misurando uno o più dei parametri sopra indicati.

Il metodo diagnostico secondo l'invenzione permette quindi la diagnosi differenziale su base biochimica tra le cefalee primarie dovute ad una deficienza di proteine G inibitorie e le numerose forme di cefalea secondaria. Tali metodi potranno inoltre essere di estrema utilità per la diagnosi della fibròmialgia. Sulla base dei risultati ottenuti in ratti resi diabetici con allossana e streptazocina in cui è stata dimostrata una diminuzione della funzionalità delle proteine Gi/o (Gawler et al., Nature 327: 229-232, 1987; Bushfield et al., Biochem. J. 271: 365-372, 1990; Lacombe et al., Diabetes Metab. 22: 432-438, 1996; Gando et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 282: 475-484, 1997), è prevedibile che, con l'impiego del metodo (o metodi) diagnostico secondo l'invenzione è possibile identificare nell'uomo il dolore da neuropatia diabetica.

Claims (8)

1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo diagnostico per la determinazione di malattie algiche in cui si misura la carenza e/o l’ipofunzionalità di proteine G inibitorie in elementi figurati del sangue e/o cellule umane.
2. 2. Metodo diagnostico secondo la rivendicazione 1 in cui si misura l'innalzamento dei livelli basali di cAMP.
3. 3. Metodo diagnostico secondo la rivendicazione 1 in cui la carenza di proteine G inibitorie è misurata con analisi Westérn-blot.
4. 4. Metodo diagnostico secondo la rivendicazione 1 injcui la carenza di proteine G inibitorie è misurata per immunofluorescenza.
5. 5. Metodo diagnostico secondo la rivendicazione 1 in cui la carenza è misurata determinando i livelli di mRNA codificante le proteine Gì.
6. 6. Metodo diagnostico secondo la rivendicazione 1 in cui l’ipofunzionaiita e misurata valutando l'inibizione di produzione di AMP-ciclico.
7. 7. Metodo diagnostico secondo una delle rivendicazioni 1 - 6 in cui si utilizzano cellule ematiche.
8. 8. Metodo diagnòstico secondo le rivendicazioni 1 - 7 in cui le maiattie.algìche identificate sono: cefalee primarie e sindrome fibromialgica.