KR20090108006A - 혈장-유래된 미세입자로부터 바이오마커를 확인 및 분석하는 방법 - Google Patents

혈장-유래된 미세입자로부터 바이오마커를 확인 및 분석하는 방법 Download PDF

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마이크로파티클 프로테오믹스, 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 혈장 미세입자 프로테옴에서 후보 바이오마커를 확인하는 방법을 제공한다. 또한, 혈장, 특히 혈소판-결핍 혈장으로부터 유래된 미세입자를 단리, 확인 및 분석하는 방법을 제공한다.
미세입자 프로테옴, 바이오마커, 혈장, 혈소판

Description

혈장-유래된 미세입자로부터 바이오마커를 확인 및 분석하는 방법 {METHODS FOR IDENTIFYING AND ANALYZING BIOMARKERS FROM PLASMA-DERIVED MICROPARTICLES}
<관련 출원에 대한 상호 참조>
본 출원은 그의 전문이 참고로 본원에 명시적으로 포함되는 2006년 11월 9일자로 출원된 미국 가출원 제60/857,928호를 우선권으로 주장한다.
혈장은 가장 복잡하고 유용한 인간 프로테옴 중 하나를 함유한다. 현재, 상기 유형의 샘플 내에서 단백질의 검출은 여러 임상 상태의 소인, 존재 및 진행을 평가하기 위한 중요한 도구이다. 그러나, 개개 단백질을 검출 및 측정하는 현재 방법은 단지 그의 최대 잠재력을 피상적으로 다루기 시작한 것이다. 오늘날, 오직 약 120종의 상이한 단백질 분석물에 대한 시험법만이 FDA에 의해 승인되었으며, 새로운 단백질 분석물을 검출하기 위한 시험은 지난 10년에 걸쳐 평균적으로 1년 당 약 하나의 시험법만이 승인되었다. 이는 정상 혈장에 존재하는 40,000종의 상이한 단백질 및 여러 임상 상태 하에 존재할 수 있는 또 다른 500,000종의 단백질 중 극히 소수의 분획물만을 나타낸다. 이는 연구자가 혈장에서 더 많은 단백질을 확인하기 위한 고효율 검출법을 사용하는 방법을 개발하는 것을 시도하도록 하였다. 2D 겔, 액체 크로마토그래피 및/또는 질량 분광법을 기초로 하는 현재 방법은 약 500종의 상이한 혈장 단백질의 검출을 유도하였다. 그러나, 상기 분석 방법의 제 한된 동적 범위로 인해 미분획화된 혈장의 분석에 대한 검출이 제한되는 것으로 보인다. 풍부한 단백질, 예컨대 알부민 (35-45 mg/ml), 피브리노겐 (2-6 mg/ml), 면역글로불린 (12-18 mg/ml) 및 트랜스페린 (2-3 mg/ml)은 1010배까지의 낮은 농도로 존재할 수 있는 단백질의 검출을 방해한다. 10가지의 가장 풍부한 단백질의 제거는 민감도를 10배만 증가시켜, 대부분의 단백질이 여전히 미검출된다. 이는 분석 전에 그의 복잡성을 감소키기기 위한 혈장 샘플의 분획화를 일부 유발한다.
미세입자 (MP)는 특히 활성화되거나 또는 스트레스 하에 있는 경우에 본질적으로 모든 세포 유형에 의해 방출되는 소형 세포하 막성 소포체이다. 이에는 원형질막의 엑토시토시스 (또는 기포형성)로부터 생성되는 엑토좀, 및 세포내 다포성 엔도좀과 세포 표면과의 융합에 의해 방출되는 엑소좀이 포함된다. 혈장에서, MP는 그의 외부 표면에서의 음이온성 인지질의 존재로 인한 응고를 촉진하는 혈액 성분으로서 발견된다. 대부분 포스파티딜세린인 이러한 음이온성 인지질은 형광 표지된 아넥신 V에 대한 그의 친화도를 기초로 한 유세포 분석을 이용하여 혈액 샘플로부터 MP를 검출하는데 현재 널리 사용된다. 미세입자의 세포 공급원은 유세포 분석에 의해 검출되는 세포-특이적 마커에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, CD41 (당단백질 IIb) 발현에 대한 MP는 혈소판에 의해 생성되는 것으로 여겨진다. 상기 방법을 이용하여, 혈소판, 적혈구, 내피 세포, 호중구, 림프구 및 심지어 평활근 세포로부터의 미세입자를 혈장에서 검출하였다. 건강한 개체에서, 이들 MP 중 90％ 넘게 혈소판으로부터 유래하며, 광범위한 병리 상태 하에 미세입자의 총 개수 및 여러 세포 집단으로부터 유래하는 개수가 달라진다.
전통적으로, 혈장에서의 이러한 미세입자의 존재는 세포막의 무작위 기포형성에 의해 생성되는 세포 활성화 및/또는 손상의 신호로 여겨진다. 그러나, MP가 중요한 생물학적 기능을 갖는 고유 단백질 및 염증성 인자 군을 함유한다는 것을 나타내는 충분한 증거가 축적되어 왔다. 예를 들어, THP-1 단핵세포로부터 IL-1β의 빠른 분비를 위한 주요 경로는 엑토좀에서의 MP 방출을 통해 일어나며, 이는 분비 단백질에 대한 통상적인 신호전달 펩티드가 결핍된 분비된 단백질에 대한 일반적인 방출 메카니즘일 수 있다. 연구자들은 혈장, 또는 자극된 세포의 상층액 중 하나로부터 단리된 MP를 사용하여 세포 기능에 대한 광범위한 효과를 입증하였다. 이러한 MP 효과에는 내피 세포 및 단핵세포에서의 부착 분자의 증가된 발현, 사이토카인 방출의 자극, 혈관 반응성의 변경, 혈관형성 유도, 염증성 매개체에 대한 반응의 감소, 및 피브린 기능의 증진이 포함된다. 상기 효과는 미세입자의 세포 공급원, 이들을 생성하기 위한 방법, 및 이환된 세포 (또는 조직)에 따라 변한다. 비록 많은 집단이 다양한 세포에 대한 이들 MP의 효과를 연구하여 왔지만, 혈장 MP의 단백질 조성물은 몇몇 세포-표면 마커의 존재를 제외하고는 거의 알려져 있지 않았다. 최근, 본 발명자들은 혈소판-유래된 미세입자의 프로테옴을 분석하였으며, 578종의 단백질을 확인하였다. 혈장에서의 대수의 미세입자는 혈소판으로부터 유래하되, 유용한 정보는 다른 세포로부터 유래된 혈장 미세입자에도 존재한다고 여겨진다.
이에 따라, 다양한 질환, 장애 및 증상의 진단에 유용할 수 있는 혈장 미세 입자에서 바이오마커를 확인하는 방법을 발견하는 것이 요망된다.
<발명의 개요>
본 발명은 혈장, 특히 혈소판-결핍 혈장으로부터 유래된 미세입자를 단리, 확인 및 분석하는 방법을 제공한다. 추가적으로, 본 발명은 미세입자, 특히 단백질 및 펩티드의 바이오마커 성분을 확인 및 분석하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 펩티드는 보다 큰 단백질의 성분이다. 겔 여과 및 초원심분리를 이용하여 3명의 건강한 공여자의 인간 혈액으로부터 혈장-유래된 미세입자 (MP)를 단리시켰다. ADP와의 인큐베이션, 이어서 겔 여과 및 초원심분리에 의해 인간 혈소판으로부터 혈소판-유래된 MP를 생성하였다. 각 샘플의 분획물을 ICAT 방법으로 표지하였으며 (미국 특허 제6,629,040호), 제조업체 지침 (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems))을 사용하는 겔-기재 프로토콜을 이용하여 처리하였다. 또 다른 분획물을 SDS PAGE 상에서 유출하고, 트립신으로 분해하고, 추출하였다. 샘플 군 모두를 써모피니간 (ThermoFinnigan) LTQ 질량 분광계에서 LC-MS에 의해 분석하였다. 2.0 (+1 전하), 2.2 (+2 전하) 및 3.5 (+3 전하) 초과의 교차 상관 값의 표준 기준의 최초-통과 필터링 (first-pass filtering)을 사용하며, 모든 펩티드가 완전히 트립신 분해성인 것을 요구하는 펩티드 확인을 수행하였다. 스펙트럼 계수 또는 ICAT를 사용하여 샘플을 비교하였다. 혈소판-유래된 MP가 아닌 혈장-유래된 MP에서 나타나는 26종 이상의 단백질을 본원에서 확인하였으며, 3종 이상이 혈장-유래된 MP에서 훨씬 더 풍부하였다.
본 발명은 본원에서 구체적으로 개시된 것 이외에 혈액으로부터의 추가의 바 이오마커를 확인, 측정 및 분석하는데 유용하다. 한 측면에서, 이러한 바이오마커는 대상체에서 질환 상태를 확인하고, 질환 및 장애의 진행을 모니터링하고, 치료에 대한 반응을 모니터링하는데 유용하다. 또한, 본 발명은 상기 질환 또는 장애와 관련된 본 발명의 바이오마커의 검출에 의해 질환 또는 장애에 대한 소인을 확인하는데 유용하다. 또한, 본 발명은 혈액 이외의 정상 및 질환 상태의 조직으로부터 단백질 및 펩티드를 확인 및 비교하는데 유용하다. 또한, 본 발명은 질환에 대해 치료를 받는 환자에 대한 의학적 예후 유용성을 갖는 바이오마커를 확인하여 치료가 얼마나 잘 수행되는지를 측정하는데 유용하다.
정상 인간에서, 90％ 초과의 미세입자는 혈소판으로부터 유래한다. 이에 따라, 혈소판 미세입자는 "배경"을 나타내며, 유용한 정보를 함유할 가능성이 낮다. 이를 위해, 본 발명은 한 측면에서 혈장 미세입자 프로테옴으로부터 혈소판 미세입자 프로테옴을 차감하도록 한다.
A 및 B를 포함한 도 1은 혈장 MP 및 혈소판 MP의 비교 프로테옴 분석의 도식도를 제공한다. 혈장 및 혈소판 MP의 프로테옴을 비교하기 위한 2개 상보적 방법을 도시한다. A) 스펙트럼 계수를 기초로 한 표지되지 않은 단백질의 비교 분석. B) 표지된 펩티드 이온 강도의 수동식 정량에 의한 ICAT-표지된 단백질의 비교 분석.
A 및 B 부분을 포함한 도 2는 2D 겔의 샘플 구역 및 MSight®에 의해 제시되는 것과 같은 데이터의 분석을 예시한다. 질량 분광계에 의해 생성된 파일을 .mzXML 파일로 변환시키고, MSight®로 삽입하였다. A) 810 내지 1020 사이의 M/Z 및 90 내지 145분의 체류 시간에 대한 강도 플롯의 샘플 부분. B) 상대적인 정량 및 동정을 위해 펩티드에 주석을 달았다. 대부분의 점이 동일한 강도의 쌍으로서 나타나지만, 여러 그렇지 않은 점 (6, 9, 29 등)들이 있다.
도 3은 혈장-유래된 MP 및 혈소판 MP로부터의 186개 단백질에 대한 스펙트럼 계수의 그래프 예시를 나타낸다. 혈장 미세입자에서의 스펙트럼 계수의 log 2 값을 186개 표지되지 않은 단백질에 대한 혈소판 미세입자에서의 스펙트럼 계수로 나누었다. 혈장 MP에서만 존재하는 펩티드를 갖는 단백질은 나타내지 않았지만, 표 1에 포함된다. 5종의 차등적으로 발현되는 단백질을 표기한다.
도 4는 ICAT 표지화에 이은 혈장-유래된 MP 및 혈소판 MP로부터의 94개 펩티드에 대한 상대적 이온 강도의 도표도이다. 94개 펩티드에 대한 조절된 이온 강도의 log 2 값을 정규화하였다. 선택된 단백질로부터의 펩티드를 나타낸다.
이에 따라, 한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 대상군으로부터의 하나 이상의 혈액 샘플 및 대조군으로부터의 하나 이상의 혈액 샘플로부터 얻어진 혈액 혈장 미세입자로부터 단백질을 단리하는 단계;
(b) 단백질을 확인하는 단계;
(c) 통계적 시험을 적용하여 확인된 각 단백질의 존재량을 측정하는 단계; 및
(d) 하나 이상의 대상군 혈액 샘플에서 확인된 각 단백질의 존재량을 하나 이상의 대조군 혈액 샘플에서의 동일한 단백질의 존재량과 비교하여 양성 및 음성 바이오마커의 존재를 결정하는 단계
를 포함하는, 혈장 미세입자 서브-프로테옴에서 후보 바이오마커를 확인하는 신규 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 단백질을 단리하는 단계 (a)가
(e) 혈액 샘플로부터 혈장 미세입자-풍부화된 분획물을 단리하는 단계;
(f) 풍부화된 분획물로부터 혈장 미세입자를 정제하는 단계; 및
(g) 정제된 미세입자로부터 단백질을 단리하는 단계
를 더 포함하는 신규 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 혈장 미세입자-풍부화된 분획물을 단리하는 단계 (e)가
(h) 혈액 샘플로부터 혈소판-결핍 혈장 (PPP)를 분리하는 단계; 및
(i) 크기에 의해 분획화하여 혈장 미세입자-풍부화된 분획물을 얻는 단계
를 포함하는 신규 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 혈장 미세입자를 정제하는 단계 (f)가
(j) 혈장 미세입자-풍부화된 분획물을 분획화하여 혈장 미세입자를 얻는 단계
를 포함하는 신규 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 단백질을 단리하는 단계 (g)가
(k) 얻어진 혈장 미세입자를 탈지하여 단백질을 얻는 단계
를 포함하는 신규 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은
(l) 임의로, 얻어진 단백질을 절단하여 펩티드를 얻는 단계
를 더 포함하는 신규 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (h) 혈장 미세입자-풍부화된 분획물을 분리하는 단계를 원심분리에 의해 수행하는 신규 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (i) 크기에 의해 분획화하여 정제하는 단계를 분획화된 혈장 미세입자를 크기 배제 컬럼을 통해 유출함으로써 수행하는 신규 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (j) PPP를 분획화하는 단계를 원심분리에 의해 수행하는 신규 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 원심분리가 혈장-유래된 미세입자를 포함하는 펠렛을 형성하기에 충분한 것인 신규 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (k) 탈지 단계를 혈장 미세입자를 겔 전기영동함으로써 수행하는 신규 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 겔 전기영동이 SDS PAGE인 신규 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (l) 절단 단계를 탈지된 단백질을 적절한 효소로 분해함으로써 수행하는 신규 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 효소가 트립신인 신규 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (b) 확인 단계를 얻어진 단백질 또는 펩티드의 서열 분석에 의해 수행하는 신규 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (b) 확인 단계를 얻어진 펩티드의 서열 분석에 의해 수행하는 신규 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 분석을 질량 분광법에 의해 수행하는 신규 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 분석을 HPLC-MS/MS에 의해 수행하는 신규 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (c) 통계적 시험의 적용 단계를 이온 전류, 스펙트럼 계수 및 커버율 (coverage)로부터 선택되는 방법을 이용함으로써 수행하는 신규 방법을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 사용되는 통계적 방법이 대상군 및 대조군 사이의 스펙트럼 계수를 비교하는 것인 신규 방법을 제공한다.
단백질은 대조군과 비교하여 대상군에서 증가된 존재량을 나타내는 경우에 양성 바이오마커로 고려될 수 있으며, 단백질은 대조군과 비교하여 대상군에서 감소된 존재량을 나타내는 경우에 음성 바이오마커로 고려될 수 있다.
혈장 미세입자를 정제하는 단계는 풍부한 혈장 단백질 (예를 들어, 알부민, 피브리노겐 및 보체 인자)을 억제 (예를 들어, 스펙트럼 분석에서의 부재 또는 낮은 계수로 발견됨)하는 공정이다.
추가적으로, 본 발명의 방법은 대상군 및/또는 대조군으로부터 혈액 샘플을 수집하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 혈액 샘플은 다양한 방법을 통해 신선하게 채취할 수 있으며, 이의 예에는 정맥 천자, 유치 정맥 또는 동맥 카테터, 수술중 샘플, 및 수술 도중 또는 이후의 상처 부위로부터 제거된 혈액이 포함된다. 또한, 혈액은 혈액 은행으로부터 얻을 수 있다. 샘플로부터 즉시 (예를 들어, 24시간 이내) 혈장을 얻고 가공하여 MP를 얻는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 혈장은 혈장 또는 혈청 은행으로부터 얻을 수 있다. 동결된 혈장 또는 혈청으로부터의 MP 단백질의 수율은 통상적으로 신선한 혈장에 비해 낮다. 그러나, 동결된 혈장은 여전히 잠재적 샘플 공급원이다.
대상군은 질환, 증상 또는 장애를 갖는 대상체이다. 대조군은 질환, 증상 또는 장애의 부재가 입증된 대상체이다. 희귀 질환, 장애 및 증상에 대하여, 대조군은 일반 집단으로부터 취하며 알려진 위험 인자에 대해 매칭한다. 상태가 희귀한 경우 (1/100 미만), 질환, 증상 또는 장애가 대조군에 부재한다고 입증되지 않은 경우라도 제안된 방법이 바이오마커를 발견하는데 여전히 유용하다.
본 발명은 정상 조직 샘플, 이환된 조직 샘플, 생검물, 혈액, 타액, 배설물, 정액, 눈물, 뇌척수액, 질 세척액, 기관지 폐포 세척액, ERCP 세척액 및 소변 이외의 임의의 체액을 비롯한 체액에서 바이오마커를 확인하는데 이용할 수 있는 것으로 예상된다.
혈소판 결핍 혈장 (PPP)은 혈장으로부터 혈소판을 제거하여 얻을 수 있다. 이러한 분리를 수행하기 위해 사용되는 한 절차는 원심분리이다. 전형적으로, 혈소판 펠렛이 형성될 때까지 혈액 샘플을 원심분리하며, 상층액은 PPP이다. 다른 형태의 분리 기법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 당업자들은 혈액 샘플로부터 PPP를 분리하기 위해 미국 특허 제6,637,257호의 미세기계화된 여과 장치의 사용을 구상할 수 있다.
미세입자-함유 분획물은 예를 들어 겔 여과에 의해 크기 배제 컬럼으로부터 수집한다. 단백질의 존재에 대해 분획물을 시험하여 미세입자의 존재를 결정한다. 양성 시험은 혈장 미세입자의 존재를 나타낸다. 단백질 함량이 1 밀리리터 당 100 마이크로그램을 초과하는 경우에 분획물을 배제한다. 통상적으로, 피어스 바이오테크놀로지 (Pierce Biotechnology)사의 MicroBCA 단백질 분석 키트를 사용하여 측정하되, 다른 단백질 분석 또한 충분할 것이다.
혈장 미세입자를 포함하는 펠렛을 형성하는데 필요한 원심분리의 수준을 초원심분리로 부른다. 초원심분리는 10,000 g에 접근하는 'g-포스 (g-force)'로도 알려진 침전 가속을 생성하는 원심분리로서 정의되며, 여기서 g는 중력 상수 (9.81 m/s2)이다. 전형적으로, 100,000 g를 사용하여 MP를 침전시킨다.
탈지된 단백질의 확인을 간략화하기 위해 이를 절단하는 것이 유리할 수 있다. 이후, 확인은 분해된 단백질의 펩티드 단편을 MS에 의해 샘플링하고, 이를 MS/MS에 의해 서열 분석함으로써 달성할 수 있다.
인간 (또는 다른 동물) 게놈을 기초로 한 데이터베이스로 측정된 물질과 부합하는 상위 500개 펩티드를 비교하는 통계적 알고리즘을 사용하여 펩티드를 확인한다. 적합한 소프트웨어의 예에는 시퀘스트(Sequest)® 및 MASCOT®가 포함된다.
단백질을 서열 분석하는데 충분히 민감한 임의의 질량 분광계를 사용할 수 있다. 예에는 써모피니간 LTQ-FT 및 써모피니간 LTQ 기기가 포함된다. 비행 시간 질량 분광계, 예컨대 Q-TOF 또한 사용할 수 있다. 전자분무 이온화 (ESI)를 이온 공급원으로서 사용하였으나, MALDI 및 관련된 방법 또한 사용할 수 있다.
대상군 및 대조군에 대한 곡선 하 면적을 적분하고, 비를 형성하여 이온 전류를 비교한다. 통계적 시험은 t-검정이다. t-검정, 이어서 본페로니 교정 (Bonferroni correction)에 의해 스펙트럼 계수를 비교할 수 있다, 스펙트럼 계수가 정규 분포가 아니기 때문에, 비-모수적 검정, 예컨대 윌콕슨 순위합 검정이 바람직하다. 한 실시양태는 R로 불리는 소프트웨어 패키지에 포함된다. 커버율은 단백질 당 고유 펩티드의 수를 의미하며, 전체 서열의 얼마만큼의 백분율이 포함되는지를 의미한다. 일반적으로, 보다 고유한 펩티드 및 보다 높은 커버율은 단백질 검출에서의 신뢰도를 증가시킨다. 일반적으로, 이는 상기 정의된 XCOR 값 이외에 사용된다.
별법으로, 관능기를 형성하는 개별 단백질 또는 단백질 군을 확인하는 개별 펩티드 또는 펩티드 군에 대한 스펙트럼 계수는 분포-무관 방법을 이용하여 대상군 및 대조군 사이의 차이에 대해 시험할 수 있다. 이러한 방법 중 하나는 임의 순열법이다. 오류 발견율을 결정하기 위해, 대상군 및 대조군으로부터 표지를 제거할 수 있으며, 데이타의 임의 순열을 당업계에 공지된 바와 같이 구축할 수 있다. 이어서, 대상군 및 대조군에 대한 표지를 이들 순열에 무작위적으로 부착시키고, 윌콕슨 순위합 검정 또는 당업계에 공지된 다른 검정을 이용하여 유의성에 대해 시험한다. 임의 순열이 대상군을 대조군과 비교한 경우 얻어진 것보다 더 작은 확률 (p) 값을 갖는 결과를 생성하는 경우, 이는 오류 발견을 구성한다. 이어서, 당업계에 공지된 절차와 유사하게 오류 발견율을 결정하였다.
<정의>
본 발명의 명세서 및 특허청구범위에서, 다음과 같은 용어가 아래 열거된 정의에 따라 사용될 것이다.
약어 및 두문자어
AIM은 대식세포에서의 아팝토시스 억제제를 의미한다.
C4BP는 보체 성분 C4 결합 단백질을 의미한다.
ESI는 전자분사 이온화를 의미한다.
FCGBP는 IgG 결합 단백질의 Fc 단편을 의미한다.
ICAT는 동위원소-코딩된 친화도 태그를 의미한다.
LC/MS는 액체 크로마토그래피/질량 분광법을 의미한다.
LC/MS는 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광법을 의미한다.
MALDI는 매트릭스-지원 레이저 이탈/이온화법을 의미한다.
MP는 미세입자를 의미한다.
MS/MS는 탠덤 질량 분광법을 의미한다.
PAGE는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 의미한다.
PBS는 포스페이트 완충 염수를 의미한다.
PPP는 혈소판-결핍 혈장을 의미한다.
PRP는 혈소판-풍부 혈장을 의미한다.
SDS는 소듐 도데실 술페이트를 의미한다.
TOF는 비행 시간을 의미한다.
vWF는 폰 빌리브란트 인자(von Willebrand Factor)를 의미한다.
"하나" 및 "한"은 본원에서 관사의 문법상 대상이 하나 또는 하나 초과 (즉, 하나 이상)임을 나타내는데 사용된다. 예를 들어, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "이환된 세포"는 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체의 세포를 의미하며, 이들 이환된 세포는 질환 또는 장애를 앓고 있지 않은 대상체에 비해 변경된 표현형을 갖는다. 세포 또는 조직은 이들이 질환 또는 장애를 앓고 있지 않은 대상체의 동일한 세포 또는 조직에 비해 변경된 표현형을 갖는 경우 질환 또는 장애에 의해 "이환된다".
본원에서 사용되는 용어 폴리펩티드의 "생물학적으로 활성인 단편" 또는 "생물활성 단편"은 그의 천연 리간드 또는 온전한 단백질에 의해 결합되지 않은 새로운 리간드에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 단백질의 기능을 수행할 수 있는 전장 단백질의 천연 또는 합성 부분을 포함한다.
"바이오마커"는 이를 질환의 진행 또는 치료의 효과를 측정하거나 또는 관심있는 과정을 측정하는데 유용하게 하는 특정한 분자적 특징을 갖는, 체내의 특정한 생화학물질이다.
본원에서 사용되는 "화합물"은 본 발명의 방법에서 사용되거나, 확인되거나 또는 단리되는 폴리펩티드, 단리된 핵산, 화학물질 또는 다른 작용제를 나타낸다.
"대조군" 세포, 조직, 샘플 또는 대상체는 시험 세포, 조직, 샘플 또는 대상체와 동일한 유형의 세포, 조직, 샘플 또는 대상체이다. 예를 들어, 대조군은 시험 세포, 조직, 샘플 또는 대상체를 조사하는 시점과 정확하게 또는 거의 동시에 조사할 수 있다. 또한, 대조군은 예를 들어 시험 세포, 조직, 샘플 또는 대상체를 조사한 시점으로부터 떨어진 시점에 조사할 수 있고, 대조군의 조사 결과를 기록하여 이 기록된 결과를 시험 세포, 조직, 샘플 또는 대상체를 조사하여 얻어진 결과와 비교할 수 있도록 할 수 있다. 또한, 대조군은 시험군 또는 시험 대상체가 아닌 다른 공급원 또는 유사한 공급원으로부터 얻을 수 있으며, 여기서 시험 샘플은 시험을 수행할 질환 또는 장애를 갖는 것으로 의심되는 대상체로부터 얻는다.
"대상군" 세포, 조직, 샘플 또는 대상체는 조사 또는 치료되는 대상이다.
단어 "검출하다" 및 그의 문법상 변형의 사용은 정량화가 수반되지 않는 종류의 측정을 의미하는 반면, 단어 "결정하다" 또는 "측정하다" 및 이들의 문법상 변형의 사용은 정량화를 수반하는 종류의 측정을 의미하는 것으로 이해된다. 용어 "검출하다" 및 "확인하다"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 "검출가능한 마커" 또는 "리포터 분자"는 마커가 없는 유사 화합물의 존재 하에 마커를 포함하는 화합물의 특이적인 검출을 허용하는 원자 또는 분자이다. 검출가능한 마커 또는 리포터 분자로는, 예를 들면 방사성 동위원소, 항원 결정기, 효소, 혼성화에 이용가능한 핵산, 발색단, 형광단, 화학발광 분자, 전기화학적으로 검출가능한 분자, 및 변경된 형광-편광 또는 변경된 광-산란을 제공하는 분자가 포함된다.
"질환"은 동물이 항상성을 유지할 수 없는 동물의 건강 상태로, 여기서 이 질환이 개선되지 않으면 동물의 건강은 계속 악화된다. 한편, 동물에서의 "장애"는 동물이 항상성을 유지할 수 있는 동물의 건강 상태이되, 여기서 동물의 건강 상태는 장애가 없는 경우보다 바람직하지 못하다. 장애는 치료하지 않더라도 반드시 동물의 건강 상태를 더 저하시키지는 않는다.
"단편" 또는 "절편"은 하나 이상의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열의 부분, 또는 하나 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 핵산 서열의 부분이다. 용어 "단편" 및 "절편"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "미세입자"는 직경이 2 ㎛ 미만인 입자를 함유하고, 100,000 달톤이 넘는 분자량을 갖는 임의의 단백질을 나타낸다. 이들은 세포로부터 방출된 다양한 지질단백질 및 막 소포체를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Piccin, A. et. al, Blood Reviews 2007, 21, 157-171] 참조).
본원에서 사용되는 "펩티드"는 2개 이상의 아미노산 잔기의 서열을 포함하며, 여기서 아미노산은 펩티드 결합에 의해 공유 결합된 자연 발생 또는 합성 (비-자연 발생) 아미노산이다. 단백질 서열 또는 펩티드 서열을 포함할 수 있는 아미노산 잔기의 개수에는 제한이 없다. 단백질은 온전한 천연 또는 합성 단백질이다. 펩티드는 단백질의 단편 (예를 들면, 트립신 분해 펩티드)이다. 트립신 분해 펩티드는천연 또는 합성 단백질 상의 프로테아제 트립신의 작용으로부터 생성된 펩티드이다.
"다수"는 둘 이상을 의미한다.
용어 "정제된"은 자연 환경에서 분자 또는 화합물과 통상적으로 관련된 다른 성분에 비해 분자 또는 화합물이 풍부함을 나타낸다. 용어 "정제된"이 특정 분자의 완전한 순도가 반드시 그 과정 동안 달성됨을 나타내는 것은 아니다. 본원에서 사용되는 "고도로 정제된" 화합물은 90％ 초과로 순수한 화합물을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "샘플"은 바람직하게는 정상 조직 샘플, 이환된 조직 샘플, 생검물, 혈액, 타액, 배설물, 정액, 눈물, 뇌척수액, 질 세정액, 폐포 세정액, ERCP 세정액, 및 소변을 제외한 임의의 체액을 비롯한 (이에 제한되지는 않음), 대상체로부터의 생물학적 샘플을 나타낸다. 또한, 샘플은 관심있는 세포, 조직 또는 유액을 함유하는 대상체로부터 수득한 물질의 임의의 다른 공급원일 수 있다. 또한, 샘플은 세포 또는 조직 배양물로부터 수득할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "이차 항체"는 다른 항체 (일차 항체)의 불변 영역에 결합하는 항체를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "고상 지지체"는 다양한 화합물과 결합 (바람직하게는 공유 결합)을 형성할 수 있는 용매 불용성 기질을 나타낸다. 상기 지지체는 생물학적으로 천연 물질 (예컨대, 세포 또는 박테리오파지 입자 등)일 수 있거나, 또는 합성 물질 (예컨대, 아크릴아미드 유도체, 아가로스, 셀룰로스, 나일론, 실리카, 또는 자화 입자 등)일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "표준물"은 비교를 위해 사용되는 것을 나타낸다. 예를 들어, 표준물은 대조군 샘플에 투여 또는 첨가되어 상기 화합물을 시험 샘플에서 측정할 때 결과를 비교하는데 사용되는 공지의 표준 작용제 또는 화합물일 수 있다. 또한, 표준물은 공지된 양으로 샘플에 첨가되어, 관심있는 마커를 측정하기 전에 샘플을 처리하거나 또는 정제 또는 추출 절차를 수행할 때 정제 또는 회수 비율 등을 결정하는데 유용한 작용제 또는 화합물과 같은 "내부 표준물"을 나타낼 수 있다.
분석, 진단 또는 치료의 "대상체"는 동물이다. 이러한 동물에는 포유동물, 바람직하게는 인간이 포함된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 혈소판이 고갈된 혈장으로부터 미세입자를 단리하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 혈장으로부터 단리된 미세입자를 확인 및 분석하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 혈소판-결핍 혈장으로부터 미세입자를 단리하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 미세입자와 연관된 바이오마커를 확인 및 분석하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 바이오마커는 단백질 및 펩티드, 또는 이들의 상동체 또는 단편이다. 한 측면에서, 본 발명의 방법에 의해 확인된 바이오마커의 존재, 또는 정상적인 대조군 수준에 비한 바이오마커 수준의 차이는 질환, 장애 또는 증상의 지표이다. 한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 확인된 바이오마커를 사용하는 질환, 장애 및 증상의 진단적 분석법을 제공한다.
이제 하기 실시예를 참조하여 본 발명을 기재한다. 이들 실시예는 단지 설명의 목적을 위해 제공된 것으로, 본 발명이 이들 실시예로 한정되는 것으로 이해되어서는 안 되며, 오히려 본원에 제공된 교시 내용의 결과로서 명백해지는 임의의 모든 변형을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
재료 및 방법
혈소판 및 혈소판-유래된 MP의 단리. 혈소판 및 혈소판-유래된 MP를 앞서 기재된 바와 같이 단리하였다 (문헌 [Garcia BA, Smalley DM, Cho H, Shabanowitz J, Ley K, Hunt DF. The Platelet Microparticle Proteome. J Proteome Res. 2005; 4: 1516-1521] 참조). 요컨대, 1/10 부피의 산-시트레이트-덱스트로스 (85 mM 트리소듐 시트레이트, 83 mM 덱스트로스, 및 21 mM 시트르산) 용액으로 정맥 천자하여 인간 혈액을 수집하였다. 110×g에서 15분 동안 원심분리하여 혈소판-풍부 혈장 (PRP)을 수득하였다. 710×g에서 15분 동안 원심분리하여 혈소판을 펠렛화시키고, 상층액인 혈소판-결핍 혈장 (PPP)은 혈장 MP의 단리를 위해 남겨 두었다 (하기 참조). 혈소판 펠렛을 3회 세척하고, 타이로드(Tyrode) 완충액 10 mL에 다시 현탁시키고, 110×g에서 1회 더 원심분리하여 남아있는 적혈구 세포 또는 잔해물을 제거하였다. 혈소판-유래된 미세입자를 제조하기 위해, ADP (10 ㎛ 최종 농도)를 10분 동안 혈소판 현탁액에 첨가하였다. 혈소판을 원심분리 (710×g, 15분)에 의해 제거하고, 150,000×g에서 90분 동안 10℃에서 원심분리하여 혈소판-유래된 MP를 펠렛화시켰다.
혈장-유래된 MP의 단리. 혈장-유래된 MP를 겔 여과 크로마토그래피에 이어 초원심분리에 의해 단리하였다. 요컨대, 앞서 생성된 혈소판-결핍 혈장 (PPP)을 710×g 및 25℃에서 15분 동안 2회 더 원심분리하여 잔류 세포 및 세포 잔해물을 제거하였다. 이어서, 이 혈장을 세파크릴(Sephacryl)® S-500 HR (GE 헬쓰케어(GE Healthcare), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재) 겔 여과 컬럼에 적용하고, 150,000×g에서 90분 동안 10℃에서 초원심분리하여 MP-함유 분획을 수집하였다.
표지되지 않은 단백질 분석을 위한 샘플 제조. 혈소판-유래 및 혈장-유래된 미세입자 펠렛을 도 1A에 도시된 바와 같이 처리하였다. MP를 최소 부피의 PBS (포스페이트 완충 염수, pH 7.4)에 다시 현탁시키고, 마이크로 BCA 단백질 분석법 (피어스 바이오테크놀로지, 인크., 미국 일리노이주 락포드 소재)을 이용하는 단백질 분석을 위해 소량의 분취액을 채취하였다. 혈장 미세입자 40 ㎕ 및 등량의 혈소판 MP로부터의 단백질 (PBS를 사용하여 다시 40 ㎕로 현탁시킴)을 5X SDS-PAGE 로딩 완충액 (0.5M Tris, pH 6.8, 10％ SDS, 38％ 글리세롤, 0.1％ 브로모페놀 블루) 10 ㎕와 혼합하였다. 개별 샘플 (각각 50 ㎕)을 5분 동안 95℃로 가열하고, 실온으로 냉각시키고, 2분 동안 14,000 rpm에서 원심분리한 후에 겔에 로딩하였다. 미세입자 단백질을 150 V에서 미니-겔 시스템 (바이오라드(Biorad), 미국 캘리포니아주 허큘레스 소재)을 사용하여 7.5％ 아크릴아미드 SDS-PAGE에 대략 1 cm 전기영동시켰다. 단백질을 함유하는 아크릴아미드 겔 조각을 잘라내어 2시간 동안 고정액 (50％ 메탄올, 12％ 아세트산, 0.05％ 포르말린)에 두었다. 레인의 겔내 트립신 분해 및 펩티드 추출을 앞서 기재된 바와 같이 수행하였다 (문헌 [Shevchenko A, Wilm M, Vorm O, Mann M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 1996; 68: 850-858] 참조). 추출된 펩티드 용액을 동결건조시키고, 질량 분광법 분석을 위해 0.1％ 아세트산을 사용하여 20 ㎕로 재구성하였다. 혈소판-유래 및 혈장-유래된 MP 펩티드의 3가지 군을 준비하고, 이들 샘플을 각각 LC/MS에 의해 2회 분석하였다.
ICAT-표지화, 전기영동, 분해 및 펩티드 풍부화. 단백질의 상대적 정량화에 이어 ICAT 표지를 도 1B에 도시된 바와 같이 수행하였다. 요컨대, 혈소판-유래 및 혈장-유래된 미세입자 펠렛을 PBS (포스페이트 완충 염수, pH 7.4)에 다시 현탁시키고, 단백질 농도를 결정하였다. 쌍을 이룬 샘플 (혈장 MP-유래 및 혈소판-유래된 MP)의 등가의 단백질 양을 함유하는 용액을 동결건조시키고, 변성 완충액 중 1％ SDS에 다시 현탁시켰다. 다음과 같은 변형 사항으로 지시된 바와 같이 ICAT 표지화 키트 (어플라이드 바이오시스템즈, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)를 사용하여 샘플을 표지화하고 처리하였다.
처음 표지화 반응은 각각의 혈장 MP 제제로부터 수득한 적은 양의 단백질 때문에 1/2의 제안된 부피, 단백질량 및 ICAT 시약으로 수행하였다. 차등적으로 표지된 단백질은, 로딩 완충액이 환원제 또는 SDS를 함유하지 않는 것을 제외하고는 상기 기재된 바와 같이 혼합하고, 겔에 적용하고, 전기영동시키고, 겔로부터 절단하였다. 단백질을 트립신으로 분해하고, 겔로부터 추출하고, 제조자가 제안한 바와 같이 아비딘 컬럼을 통해 처리하였다. 샘플을 동결건조시키고, 질량 분광법 분석을 위해 0.1％ 아세트산을 사용하여 20 ㎕로 재구성하였다. 이 절차는, 상기 샘플 중 2개의 샘플에 대해서는 가벼운 ICAT 시약으로 표지된 혈장 MP를 사용하고, 세번째 샘플에는 무거운 ICAT 시약으로 표지된 혈장 MP를 사용하여, 3회 반복하였다.
액체 크로마토그래피/질량 분광법 (LC/MS) 및 단백질 확인. 샘플을 비규격 5-20 ㎛ C18 수지로 패킹된 360 ㎛ o.d. × 75 ㎛ i.d. 미세 모세관 융합 실리카 예비컬럼에 로딩하였다. 샘플 로딩 후에, 예비컬럼을 15분 동안 0.1％ 아세트산으로 세척하여 임의의 완충액 염 또는 겔 오염물질을 제거하였다. 이어서, 예비컬럼을 통합된 전자분사 방출구가 구축된 규격 5 ㎛ C18 수지로 패킹된 360 ㎛ o.d. × 50 ㎛ i.d. 분석용 컬럼에 연결시켰다. 샘플을 1100 시리즈 2-원 HPLC 용매 전달 시스템 (아질런트(Agilent), 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)을 이용하여 써모피니간 LTQ 이온 트랩 질량 분광분석기 (써모 일렉트론 코포레이션(Thermo Electron Corp.), 미국 캘리포니아주 산 로즈 소재)로 직접 60 nL/분의 유속으로 구배 용리하였다. 다른 실시예에서는, 우수한 질량 분해능을 제공하는 써모피니간 LTQ-FT 기기를 사용하여 샘플을 분석하였다. 사용되는 HPLC 계단식 구배는 처음에 100％ A, 5％ B (5분), 50％ B (220분), 100％ B (240분)이였으며, 280분에 다시 100％ A로 회복된다 (용매 A = 0.1 M 아세트산, 용매 B = 0.1 M 아세트산 중 70％ 아세토니트릴). LTQ 질량 분광분석기는 데이타-의존적 방식으로 작동시켰으며, 여기서 우선 처음 MS 스캔은 질량 범위 300 내지 2000 Da에 걸친 이온의 질량 대 전하 (m/z) 비를 기록한 후에, 10종의 최대 풍부한 이온을 이후의 충돌에 의해 활성화되는 해리에 대해 자동적으로 선별하여 MS/MS 스펙트럼을 기록하였다.
시퀘스트® 프로그램 (써모 일렉트론 코포레이션)을 이용하여 NCBI 웹사이트로부터 다운로드한 인간 단백질 데이타베이스에 대해 모든 MS/MS 데이타를 검색하였다. 표지되지 않은 펩티드의 경우, 시스테인 잔기에 대한 57 Da의 정적 변형을 검색 파라미터로 사용하였다. ICAT-표지된 펩티드의 경우, 227.127의 정적 변형은 가벼운 동위원소 표지에 사용하고, 추가의 9 Da은 무거운 ICAT-표지된 펩티드에 사용하였다. 앞서 기재된 바와 같이 (문헌 [Washburn MP, Wolters D, Yates JR, 3rd. Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology. Nat Biotechnol. 2001; 19: 242-247] 참조), 2.0 (+1 전하), 2.2 (+2 전하) 및 3.5 (+3 전하) 이상의 상관 관계 값을 비롯한 표준 기준의 일차-통과 필터링을 사용하여 펩티드를 확인하였으며, 모든 펩티드는 완전하게 트립신 분해성이어야 한다. 단백질 배정은 상기 기준을 통과한 2개 이상의 MS/MS 스펙트럼 매치를 필요로 한다. 차등적으로 발현되는 것으로 결정된 모든 단백질에 대해 하나의 단백질 당 하나 이상의 MS/MS 스펙트럼-펩티드 서열 매치를 수동적으로 확인하였다.
스펙트럼 계수를 사용하는 표지되지 않은 펩티드의 비교 분석. 표지되지 않은 도식 (도 1A)의 경우, 상기 기재된 품질 기준을 통과하지 못한 모든 검색 결과는 제외시켰다. 각각의 펩티드에 대한 스펙트럼의 수를 결정하고, 검출된 총 단백질의 수를 계산하였다. 임의의 단백질이 혈장 MP 또는 혈소판 MP에 대해 2 미만의 스펙트럼 계수를 갖는 경우, 이는 그 집단으로부터 제외된다. 10 이상의 전체 스펙트럼 계수를 갖는 단백질만을 이 방법에 의해 추가로 분석하였다. 혈소판 MP에 대한 혈장 MP로부터의 스펙트럼의 비를 계산하고, log 2 변환시키고, 이어서 vWF로부터 유래된 펩티드를 제외하고는 0.00의 전체 비율 점수에 대해 조정하였다. log 점수의 표준 편차 (SD)를 계산하고, 평균보다 위로 (또는 아래로) 3이 넘는 SD를 갖는 모든 단백질이 "높은 신뢰도"로 풍부한 것으로 (또는 고갈된 것으로) 간주하였다. 평균 보다 2 내지 3 더 큰 SD의 log 2 점수를 갖는 단백질을 추가로 조사해야 하는 가능성 있는 후보로 분류하였다.
MSight®을 사용하는 ICAT-표지된 펩티드의 비교 분석. MSight® (바이오인포매틱스 익스패시 웹사이트의 스위스 연구소(Swiss Institute of Bioinformatics Expasy website)로부터 자유롭게 입수가능함)를 사용하여 비교 정량화를 수행하였다. XCalibur 소프트웨어 (써모 일렉트론 코포레이션)를 사용하여 생성된 데이타 파일 (.RAW)을 ReaDW (시스템즈 바이올로지 연구소(Institute for Systems Biology), 미국 워싱턴주 시애틀 소재)를 사용하여 mzXML 파일로 전환시켰다. 이들 파일을 MSight®로 삽입하고, 펩티드를 수동적으로 정량화하였다. 상기 기재된 바와 같이 시퀘스트®을 이용하여 펩티드를 확인하였다. 이들 실시 중 어느 하나의 작은 부분에 대한 MSight® 디스플레이의 샘플 대표도를 도 2에 나타내었다 (이온 강도는 나타내지 않음). 가능하다면, 시퀘스트® 결과를 기초로 한 3가지 모든 ICAT 분석에서 검출된 펩티드를 정량화하였다. 이어서, 높은 이온 강도를 갖는 펩티드를 정량화하고, 다시 시퀘스트® 결과와 연계시켰다. 피크를 정량화하기 위한 시도는 때로는 양호하지 못한 신호-대-노이즈 비, 중첩 펩티드, 및 주어진 피크의 모호한 식별 때문에 실패하기도 한다.
달리 언급하지 않는다면, ICAT 정량화 결과는 3가지 ICAT 실시 중 적어도 2가지 실시에서 양호한 피크 정량화가 가능하고, 이들 2가지 실시에서 다르게 표지되는 경우에만 기록한다. 이로부터 94개의 펩티드를 정량화하였다. 차등적 표지 화를 이용하여, 혈소판 MP에 대한 혈장 MP에서의 상대적 정량화의 비를 계산하고, 이들 비의 log 2 변환을 수행하고, vWF를 제외하고 0.00의 전체 log 2 점수를 생성하도록 조절하였다. vWF는 혈장 MP에서 상당히 풍부하게 존재함이 명백하고, 이 단백질에 대해 조사된 많은 수의 펩티드 및 풍부화 정도 때문에 제외된다. 유의성을 결정하기 위해, 쌍-형성 t-검정을 사용하여 혈장 MP와 혈소판 MP 사이의 펩티드 발현 강도 차이를 조사하였다. P<0.05를 사용하여 차등적으로 발현되는 펩티드를 결정하였다.
<결과>
스펙트럼 계수를 사용하는 혈장 MP 및 혈소판 MP의 상대적 정량화. 혈장 MP 및 혈소판 MP를 3 개체로부터 단리하였으며, 단백질을 처리하고, 펩티드로 분해하였으며, 각각에 대한 펩티드 분석을 2회 반복 수행하였다. 시퀘스트®을 이용하여 MS/MS 스펙트럼을 검색하고, 일차-통과 필터링을 통과하지 못한 임의의 스펙트럼을 제외시켰다. 혈장 MP로부터, 1회 실시 당 1343±589개 스펙트럼 (6회 실시에서 총 8058개 스펙트럼)을 얻었으며, 2개 이상의 스펙트럼을 갖는 3726개의 고유 펩티드 및 550개의 고유 단백질을 확인하였다 (나타내지 않음). 혈소판 MP로부터, 본 발명자들은 1회 실시 당 2087±812개 스펙트럼 (6회 실시에서 총 12,522개 스펙트럼)을 얻었으며, 2개 이상의 스펙트럼을 갖는 6975개의 고유 펩티드 및 1004개의 고유 단백질을 확인하였다 (결과는 나타내지 않음).
10 이상의 누적 스펙트럼 계수를 갖는 단백질의 경우, 혈장 MP와 혈소판 MP 사이에서 상대적 스펙트럼 계수를 비교하였다 (결과는 나타내지 않음). 스펙트럼 계수비의 log 2 값을 0.00의 평균으로 정규화하였으며 (vWF는 제외), 이는 혈장 및 혈소판 MP의 단백질의 동등한 대표의 귀무 가설을 나타낸다. 도 3은 펩티드가 혈소판 및 혈장 MP 모두에서 검출되는 모든 단백질에 대해 정규화된 log 2 비를 도시하고 있다. 또한, 펩티드가 혈장 MP에서는 검출되지만 혈소판 MP에서는 검출되지 않는 23개의 단백질이 존재하며 (아래 표 1 참조), 이는 모두 높은 신뢰도를 갖는다 (평균으로부터 3 초과하여 떨어진 표준 편차). 이들 중 하나인 폰 빌리브란트 인자 (vWF)는 혈장 MP에서 명백하게 과다발현되었다 (혈소판 미세입자 위로 3 초과의 표준 편차, 혈장 MP에서의 745개 스캔 대 혈소판 MP에서의 23개 스캔). 다른 2가지도 과다발현되는 것으로 나타났으며 (보다 낮은 신뢰도를 가짐 - 평균으로부터 2 내지 3 떨어진 표준 편차), 본원 발명자들은 또한 ICAT-표지를 이용하여 이들을 조사하고자 하였다 ("스캔 수에 기초한 차등적으로 발현되는 펩티드의 ICAT 정량화"라는 부제의 섹션 참조). 본원 발명자들은 전체 24개의 단백질이 혈소판 MP에 비해 혈장 MP에서 높은 신뢰도로 풍부함을 밝혀내었다. 이들 단백질 및 검출된 펩티드 서열이 완벽하게 기재되도록 결정되었다 (결과는 나타내지 않음). 혈소판 MP에서 높은 신뢰도로 풍부한 단백질은 발견되지 않았다.
하기 표 1은 단백질이 혈소판-유래된 미세입자와 비교하여 혈장-유래된 미세입자에서 고유하게 발현하거나 유의하게 과다발현된다는 것을 보여준다.
Figure 112009034545712-PCT00001
ICAT를 사용한 혈장 MP 및 혈소판 MP의 정량 분석
혈소판 MP 대 혈장 MP의 단백질 조성의 차이를 조사하기 위한 상보적 방법으로서, 동위원소 표지를 이용한 차등 분석을 수행하였다. MP를 차등적으로 표지하고, PAGE, 트립신 분해, 추출 및 LC/MS 이전에 혼합하였다 (도 1B). 이를 3회 수행하고, 94가지의 보다 풍부한 펩티드를 정량하였다 (결과는 나타내지 않음). 혈소판 MP에 대한 혈장 MP에서의 펩티드 존재량 비의 log 2 값을 계산하고, vWF로부터의 펩티드를 제외하고 평균을 0.00으로 조정하였다 (도 4). 3가지 단백질 (알부민, 베타 글로빈 및 vWF)로부터의 펩티드의 발현은 혈소판 MP에 비해 혈장 MP에서 일관되게 풍부화되었다. vWF에 대한 결과는 스펙트럼 계수 분석으로부터 얻어진 것과 부합하였다. 알부민 및 베타 글로빈 (및 여러 여타 헤모글로빈 단백질)에 대한 스펙트럼 계수는 혈소판 MP에 비해 혈장 MP에서 모두 약 2배 더 높은 반면, 이전 방법은 풍부화를 증명하기에 정량적으로 충분하지 못했다.
혈소판 기능과 통상적으로 관련되어 있는 3가지 단백질인 트롬보스폰딘, 및 인테그린 알파 2b 및 베타 3으로부터의 펩티드는 혈소판 MP에서 풍부화되는 것으로 보인다. 보다 편재성인 단백질, 예컨대 세포골격 단백질로부터의 펩티드는 그러한 풍부화를 보이지 않는다. 한가지 가능한 설명은 혈소판 MP가 혈장에 있는 경우, 이들은 분해, 절단, 또는 표면에의 결합에 의해 특정 단백질을 잃을 수 있다는 것일 수 있다. 20％의 MP 조차도 혈소판 기원이 아니기 때문에 (이 방법에 의해 검출되는 신호의 충분한 희석을 유도하지 않을 것임), 이는 여타 공급원으로부터의 MP의 존재에 단순히 기인할 것 같지는 않아 보인다.
스캔 수를 기초로 한 차등적으로 발현된 펩티드의 ICAT 정량화
표지되지 않은 단백질의 스펙트럼 계수 분석의 결과를 확인하기 위하여, 스펙트럼 계수 분석을 기초로 하여 한 분획물에 풍부화된다고 결정된 모든 단백질 (vWF 제외)로부터의 펩티드를 조사하였다 (결과는 나타내지 않음). 이들 27개 단백질 중에서, 이들 중 16개로부터의 펩티드에 대한 스펙트럼을 3가지 ICAT 분석 중 하나 이상으로 검출하였다. 표지되지 않은 샘플의 스펙트럼 계수와 유사하게, 이들 "풍부화된 단백질"에 대한 두 샘플 간에 ICAT-표지된 단백질의 스펙트럼 계수의 극적인 차이가 존재하는데, 오직 2개의 스펙트럼이 혈소판 MP에서 검출된 반면, 혈장 MP에서 상기 단백질로부터의 펩티드에 대해 63개의 스펙트럼이 검출된다 (결과는 나타내지 않음). 시퀘스트에 의해 확인된 63개 펩티드 중에서, 33개 (27개는 상이한 것으로 나타남)의 펩티드의 이온 강도를 정량할 수 있다. 많은 경우에서, 혈소판 미세입자 샘플로부터의 펩티드가 시각적으로 검출되지 않고, 배경 이온 강도가 사용된다는 것을 주목하는 것이 중요하다. 이는 혈장 MP에서의 배수 풍부화의 과소평가를 초래하기 쉽다. 특히, 이는 적은 존재량으로 인한 불량한 신호-대-잡음 비를 갖는 수많은 펩티드에 대해 사실이다. 혈장 MP에서 풍부화되는 것으로 여겨지는 모든 단백질로부터의 펩티드는 1.58 초과의 조정된 log 2 점수를 갖고, 이는 3배 이상의 농도 증가를 나타낸다. 혈소판 MP에서 풍부화된 다이나민 1-유사 단백질은 0.00 미만인 log 2 점수를 갖고, 이는 분획물 중에 실제로 풍부화되었다는 것을 시사한다.
토의: 2가지 방법 (스펙트럼 계수 대 ICAT-표지)으로부터의 결과들을 비교하는 것은 각각의 상대적 강점 및 약점에 대한 많은 정보를 제공하여 준다. 스펙트럼 계수 방법의 가장 명백한 강점은, 광범위하고 시간 소비적인 수동 정량 없이 수많은 단백질 차이를 생성할 수 있는 능력을 가지고 있다는 것이다. ICAT 기반 방법의 주요 강점은 그의 우수한 정량화이고; 존재량에 있어서 2배 차이를 검출할 수 있다. 이들 차이를 결정하는 것이 현재 극도로 시간 소비적인 한, 보다 나은 소프트웨어의 개발 및 이용가능성은 이러한 문제점을 경감시켜야 한다. 스펙트럼 계수는 이온 전류가 배경 보다 높게 나타나지 않는 경우에도 보다 적은 존재량의 펩티드/단백질에 대해 작용하는 것으로 보인다는 것을 주목하는 것은 흥미롭다. 이들 특징은 두 방법의 상보적 성질을 증명한다.
건강한 자원자로부터 단리된 미세입자의 분석은 동일한 개체로부터 단리된 혈소판 미세입자와 비교하여 혈장 MP에서 풍부화된 24개의 유전자 생성물을 나타낸다. 총 860개의 질량 스펙트럼 및 325개의 펩티드로 나타난 이들 중 23개로부터의 펩티드는 혈소판 MP에서 검출되지 않았다. 통계적 분석을 넘어서, 검출된 차이의 신뢰도는 직접 ICAT-기반 비교법을 사용한 확인에 의해 더 개선된다. 본 연구는 처음으로, 비편향된 방법으로 LC/MS를 사용하여 혈소판-유래된 미세입자와 비교시의 혈장 미세입자의 단백질 조성을 정의한다. 예상된 바와 같이, 혈장 MP에서 확인된 209개의 유전자 생성물 중 186개 또한 혈소판 미세입자 및 혈소판에서도 발견되어, 이는 대부분의 혈장 MP가 혈소판으로부터 유래되었다는 것을 확인한다. 그러나, 본 출원인은 유의하고 잠재적으로 생물학상 중요한 차이를 발견하였다. 스펙트럼 계수에 의해 측정된 것과 같은 거의 모든 (24개 중 23개) 차등적으로 발현된 유전자 생성물은 혈장-유래된 MP에서만 발견되고, 혈소판-유래된 MP에서는 발견되지 않았다. 여러 방면의 추론은 혈장 단백질로의 오염이 주요 인자가 아니라는 것을 시사한다. 첫째로, 가장 풍부한 혈장 단백질, 알부민, IgG, 트랜스페린, 피브리노겐 및 IgA 중 오직 하나인 트랜스페린은 스펙트럼 계수에 기반하여 혈소판 MP에 비해 혈장 MP에서 풍부화되었고, 이 단백질은 상기 계수들 중 상대적으로 낮은 수를 갖는다 (109번째로 가장 풍부한 단백질). 그의 수용체, 아마도 엑소좀에서의 막 단백질 (하기 참조)은 거의 2배의 스펙트럼 계수를 갖는다. 둘째로, 혈장 MP에서 검출된 혈장-유래 단백질은 그것이 오염물질이었다면 예상되는 바와 같이 무작위 수집이 아니다. 예를 들어, 이들 단백질 중 7가지는 세포의 아팝토시스와 관련되어 있다. 이들 중 4가지인 보체 3, 보체 4B, 보체 4 결합 단백질 α 및 β는 보체 경로로부터의 것들이다.
유핵 세포가 보체-유도된 세포사에 내성을 갖게 되는 한 메카니즘은 막으로부터 보체 성분을 방출하는 것이다. 본 출원인의 연구에서 검출된 보체 성분은 준임상적 자가면역 과정에 의해 생성된 MP를 나타낼 수 있다. 보체 C3은 3가지 별개 경로인 통상적인 (항체-개시) 경로, 렉틴 (미생물-개시) 경로 및 대체 경로 중 어느 하나에 의해 활성화될 수 있는 가장 중요한 보체 성분이다. 가장 적당한 설명은 자가항체에 의한 통상적인 경로 (C3 및 C4를 포함함)의 준임상적 활성화이다. 준임상적 수준의 자가항체는 건강한 개체에서 폭넓게 발견된다. 이들 중 일부는 예를 들어 혈액형 항원에 대한 소위 천연 항체를 포함한다. 다른 것들은 특정 병원체, 예컨대 스트렙토코쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)에 대한 것이고, 내인성 산화된 지질, 예컨대 oxLDL과 교차 반응한다. 그러나, C4는 렉틴 경로 및 통상적인 경로 모두에 관여하고, 따라서 본 출원인은 장내 또는 여타 공생 세균총이, 보체-결합된 막의 미세입자로의 배출을 유도하는 준임상적 보체 활성화를 위한 자극을 제공할 수 있다는 것을 배제할 수 없다. C4BP (C4 결합 단백질)는 보체 조절 활성을 아팝토시스성 세포의 표면에 국한시키는 역할을 하면서 통상적인 경로 및 대체 경로 모두를 억제하는 강력한 순환 가용성 억제제이고, 이는 엑토시토시스를 겪어 MP를 방출한다. 이들 복합체의 부분은 단백질 S, 아팝토시스성 세포의 식작용을 자극하는 것으로 독립적으로 밝혀진 혈장 MP에서 풍부화된 또다른 단백질을 포함한다.
혈장 MP에서 풍부화된 2가지 여타 단백질, CD5-유사 항원 및 갈렉틴 3-결합 단백질 또한 아팝토시스의 억제와 관련되어 있다. CD5-유사 항원 (또한 SP-α로도 불림)은 광범위하게 연구되지는 않았지만, 그의 마우스 동족체, AIM (대식세포에서의 아팝토시스 억제제)은 여러 유익한 연구들을 가지고 있다 (문헌 [Joseph SB, et. al., Cell. 2004; 119: 299-309] 및 [Miyazaki T, et. al., J Exp Med. 1999; 189: 413-422] 참조). 간 X 수용체 (LXR)가 결핍된 마우스로부터의 세포는 리스테리아 모노사이토게네스 (LXRα에 의한 조절을 위한 직접적인 표적인 AIM에 매우 의존성임)로 공격받은 경우 가속화된 아팝토시스를 겪는다. 유사하게, 흉선세포는 AIM 결핍 마우스에서 아팝토시스에 대한 증가된 감수성을 갖는 것으로 나타났다. 갈렉틴 3-결합 단백질 (또한 Mac-2 결합 단백질로도 불림)은 갈렉틴 3과 결합하여, 아팝토시스에 대한 세포 내성을 증가시킨다. 혈장 MP에서의 이들 모든 단백질의 존재는 보다 큰 백분율의 이들 입자가, 아팝토시스성 세포로부터 유래되었거나 또는 미세입자가 아팝토시스를 막기 위해 방출되었다는 표시라는 것을 시사한다.
혈장 MP와 관련된 단백질의 또다른 세트는 철 수송 및 헤모글로빈 클리어런스에 관한 것: 트랜스페린, 트랜스페린 수용체, 합토글로빈 및 합토글로빈-관련 단백질이다. 따라서, 그의 리간드, 트랜스페린과 함께 혈장 미세입자에서의 그의 존재는 필연적이다. 합토글로빈은 특히 신장에서 세포에 달리 독성인 유리 헤모글로빈을 결합하는 존재하는 단백질이다. 헤모글로빈은 혈장 MP 및 혈소판 MP 모두에서 본 출원인의 분석에 의해 검출되어, 이는 합토글로빈-헤모글로빈 복합체가 MP와 결합할 수 있다는 것을 시사한다. 합토글로빈 및 합토글로빈-관련 단백질이 혈장 MP에서 과다발현되는지의 이유는 알려지지 않았다.
혈장 MP에서 과다발현되는 혈장 단백질의 세번째 카테고리는 면역글로불린이고, 면역글로불린 (Ig) J 쇄 및 카파 쇄로 나타낸다. 이는 면역글로불린의 무작위 선택이 아니며, 또한 혈장 오염을 보다 간단히 설명하도록 한다. IgJ는 모든 천연 항체를 포함하는 IgM과 관련된다. 또한, 상기 논의된 바와 같이 여러 보체 성분이 풍부화된다. 이러한 발견은, 통상적인 보체 경로가 IgM 자가-항체를 통해 낮은 수준에서 활성화되어, 영향받는 세포막으로부터 IgJ 및 결합된 보체 성분을 제거하는 알려지지 않은 세포 (혈소판 아님)로부터의 미세입자의 형성을 유도할 수 있다는 본 출원인의 생각과 부합한다.
혈소판 MP와 비교하여 혈장 MP에서 과다발현되는 본원에서 발견된 4가지 단백질은 지질단백질과 결합한다 (결과는 나타내지 않음). 상기 기재된 여타 것들과는 달리, 이들은 킬로미크론 (apo A-I 및 C-III), 킬로미크론 잔존물질 (apo E), VLDL (apo A-I, B100 및 C-III) 및 IDL (apo B100 및 E) 분획물의 보다 큰 혈장 지질단백질로의 혈장 MP의 오염을 나타낼 가능성이 매우 높다. 혈장 지질단백질은 그의 크기, 그리고 이에 따른 그의 겔 여과 특성이 MP와 유사하기 때문에 분획물이 미세입자와 중첩되는 것으로 보인다 (결과는 나타내지 않음). 이들이 최종 원심분리 단계 후에 상층액 중에 남아야 하는 한, 그의 펠렛으로의 오염은 피하기 어렵다. 혈장 미세입자에서 과다발현되는 것으로 밝혀진 4가지 지질단백질 이외에도, 아포지질단백질 A-II, C-II, L-I 및 Lp(a)가 혈장 MP에서만 발견되었지만, 각각에 대한 스펙트럼 수는 10 미만이었고, 추가 조사하지 않았다. 혈액 응고와 관련된 3가지 단백질인 단백질 S, 인자 VIII 및 vWF (데이터는 나타내지 않음)는 혈소판 MP와 비교하여 혈장 MP에서 풍부화되었다.
본원에 개시된 바와 같이 혈장 MP에서 매우 풍부화된 혈소판 MP에서의 vWF는 예상치 못한 것이고, 내피세포 vWF가 혈장 MP와 결합하거나, 또는 심지어 그의 형성을 촉진한다는 것을 시사한다. 내피세포 vWF는 바이벨-펠라드 소체 (Weibel-Palade body)로부터 분비되고, 질환 증상 하에 내피-유래된 MP에 존재한다고 이전에 밝혀졌다. 그것은 매우 큰 다량체로 존재하고, MMP-13에 의해 절단된다. 본 출원인의 프로테옴 분석은 단량체와 다량체 간을 구별하지 않는다. 응고 인자와 혈소판-결합 인자의 결합은, 혈장 MP가 전-응고제 표면이고, 신생 혈전과 결합한다는 생각과 전적으로 부합한다.
FCGBP는 장 및 결장 배상 세포에 의해 생성되는 알려지지 않은 기능을 가진 단백질이다. 그의 세포 공급원 및 그의 IGG를 결합하는 능력으로 인해, 점막에의 항원 침윤을 막는 것을 도울 것이라고 가정하였다. 고바야시 (Kobayashi) 등은 FCGBP가 보체-매개된 반응을 억제할 수 있다는 것을 발견하였고, 그것이 점막 표면의 면역학적 방어에 있어서 중요한 역할을 수행할 수 있다고 제안하였다 (문헌 [Gut. 2002; 51: 169-176] 참조). 이것이 상기 논의한 본 출원인의 엑토좀 생성 이론과 함께 진척된 반면, FCGBP와 혈관 조직에서의 세포사의 예방과의 관계를 지지하는 증거는 거의 없었다. 이는 FCGBP 생성의 위치를 고려하면 특히 사실이다. 그러나, 혈장 MP에서의 이 단백질의 검출은 특히 혹자가 그의 보급률을 고려하는 경우 매우 흥미롭다 (54개의 고유 펩티드를 포함하는 167개의 스펙트럼 계수).
남은 3가지 단백질 중에서, 프로피오닐-조효소 A 카르복실라제 알파 및 뇌 아데닐레이트 시클라제는 세포내 단백질이고, 반면 테나신(tenascin)은 세포외 매트릭스 단백질이다. 프로피오닐-조효소 A 카르복실라제는 아미노산, 홀수-쇄 지방산 및 여타 대사물질의 이화작용에 관여하는 미토콘드리아 효소이다. 테나신은 임시 및 종양 매트릭스와 관련된 세포외 매트릭스 단백질이되, 대부분의 성숙한 조직에서는 발견되지 않는다. 테나신은 작은 손상 및 상처 치유 부위에서 분비될 수 있고, 빠른 교체를 수반하는 세포, 예컨대 백혈구 및 상처 섬유모세포는 MP와 결합된 테나신을 방출할 수 있다. 별법으로, 테나신은 MP 분획물 중에 이동하는 응집물을 형성할 수 있다. 이들 3가지 단백질 모두는 혈장 MP 분획물 중에서 예측하지 못한 것들이다. 이들의 의미를 조사하기 위해 추가의 연구가 필요하다. 그러나, 이들은 명백하게 혈장 단백질 오염물질의 무작위 분류는 아니다.
결론적으로, 본 게시내용은 혈장- 및 혈소판-유래된 미세입자 단백질 간의 유의한 차이를 입증한다. 이러한 차이의 대부분은 아팝토시스 또는 철 수송과 관련된 단백질이다. 매우 적은 단백질이 혈장 오염물질로 분류될 수 있는 혈장 MP에서 검출된다는 것을 재확인하였다. 보체, 응고 및 여타 과정에 대한 생물학을 연구하는데 있어서, 미세입자는 이제 세포로부터 상기 성분들을 제거하기 위한 중요한 기여자로 고려되어야 할 것이다. 병리학적 상태 하의 극적인 차이가 존재하는지 아닌지 밝혀야 하는 것이 남아있고, 매우 다양한 질환에서의 그들의 중요성을 결정하는 것이 다음 단계이다.
<관절염에 대한 후보 바이오마커>
상기 기재된 절차를 사용하여 후보 관절염 바이오마커를 확인하였다. 연령, 흡연, 성별 및 위험 인자에 대해 부합하는 5명의 환자로부터 혈액 샘플을 채취하였다. 대상군인 한 환자는 관절염을 앓고 있었다. 이 환자의 샘플을 2회 분석하였고, 또한 2회 분석된 나머지 4명과 비교하였다. 하기 표 2에 나타낸 단백질은 대조군 (즉, 나머지 환자)과 비교하여 엄격한 통계적 시험 (스튜던트 T 검정 후 다중 비교를 위한 본페로니 교정)에 의해 측정된 바와 같이 본 경우에서 유의하게 과다발현되었다. 혈액 채취의 공지된 문제점, 예컨대 용혈과 관련된 단백질은 제거하였다. 제거된 단백질의 한 예는 SPTB 스펙트린 베타 동형체 a (주로 적혈구 세포에서 발견되고, 혈액 샘플링에서 통상의 현상인 용혈과 관련된 것으로 알려진 단백질임)이다. 컬럼 "본페로니"는 본페로니-교정된 p-값 (0.01에서 절삭)을 포함한다. 나타낸 모든 단백질은 양성 바이오마커이다 (즉, 이들은 관절염이 존재하는 경우에 보다 높아짐). 음성 바이오마커 (즉, 질환에 걸린 샘플에서 보다 덜 검출되는 단백질)는 본 분석의 목적을 위해 제거하였다. 제거한 음성 바이오마커의 한 예는 STXBP2 신탁신-결합 단백질 2이고, 이는 환자에서 0회, 그리고 대조군에서 9회 발견되었다. 음성 바이오마커도 또한 유용할 수 있으나, 양성 바이오마커가 종종 보다 바람직하다.
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사용되었지만 본원에 기재하지 않는 여타 방법들은 잘 공지되어 있고, 세포 생물학, 분자 생물학, 생화학, 분석 화학, 생물정보학 및 통계학 분야의 당업자의 능력 내에 있다. 본 발명은 오직 본원에 기재된 분석 및 방법에만 제한되는 것으로 해석되어서는 안되고, 여타 방법 및 분석 또한 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 당업자는 여타 분석 및 방법들이 본원에 기재된 절차를 수행하는데 이용가능하다는 것을 알 것이다. 단락 제목들은 참조를 위해, 그리고 특정 섹션들을 배치하는데 도움을 주기 위해 본원에 포함되었다. 이들 단락 제목들은 그 이하에 기재된 개념들의 범주를 제한하려는 것이 아니며, 이들 개념은 전체 명세서에 걸쳐 여타 섹션에서도 적용될 수 있다. 본원에 인용된 각각의 그리고 모든 특허, 특허 출원 및 문헌의 개시내용은 그 전체가 본원에 참고문헌으로 포함된다. 본 발명이 특정 실시양태에 대해 개시되었지만, 본 발명의 여타 실시양태 및 변경들이, 당업자가 본 발명을 제조하거나 사용할 수 있게 하기위해 제공된 개시된 실시양태의 상기 기재에 의해 발명될 수 있다는 것은 명백하다. 상기 실시양태에 대한 다양한 변형이 당업자에게 쉽게 명백할 것이고, 본원에 정의된 포괄적 원칙들이 본 발명의 취지 또는 범주를 벗어나지 않고 여타 실시양태에 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본원에 나타낸 실시양태에 제한되는 것으로 의도하지 않고, 본원에 개시된 원칙 및 신규 특성에 부합하는 가장 넓은 범주에 따른다.

Claims (20)

  1. (a) 대상군으로부터의 하나 이상의 혈액 샘플 및 대조군으로부터의 하나 이상의 혈액 샘플로부터 얻어진 혈액 혈장 미세입자로부터 단백질을 단리하는 단계;
    (b) 단백질을 확인하는 단계;
    (c) 통계적 시험을 적용하여 확인된 각 단백질의 존재량을 측정하는 단계; 및
    (d) 하나 이상의 대상군 혈액 샘플에서 확인된 각 단백질의 존재량을 하나 이상의 대조군 혈액 샘플에서의 동일한 단백질의 존재량과 비교하여 양성 및 음성 바이오마커의 존재를 결정하는 단계
    를 포함하는, 혈장 미세입자 서브-프로테옴에서 후보 바이오마커를 확인하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단백질을 단리하는 단계 (a)가
    (e) 혈액 샘플로부터 혈장 미세입자-풍부화된 분획물을 단리하는 단계;
    (f) 풍부화된 분획물로부터 혈장 미세입자를 정제하는 단계; 및
    (g) 정제된 미세입자로부터 단백질을 단리하는 단계
    를 더 포함하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 혈장 미세입자-풍부화된 분획물을 단리하는 단계 (e)가
    (h) 혈소판-결핍 혈장 (PPP)을 혈액 샘플로부터 분리하는 단계; 및
    (i) 크기에 의해 분획화하여 혈장 미세입자-풍부화된 분획물을 얻는 단계
    를 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 혈장 미세입자를 정제하는 단계 (f)가
    (j) 혈장 미세입자-풍부화된 분획물을 분획화하여 혈장 미세입자를 얻는 단계
    를 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 단백질을 단리하는 단계 (g)가
    (k) 얻어진 혈장 미세입자를 탈지하여 단백질을 얻는 단계
    를 포함하는 방법.
  6. 제2항에 있어서,
    (l) 임의로, 얻어진 단백질을 절단하여 펩티드를 얻는 단계
    를 더 포함하는 방법.
  7. 제3항에 있어서, 혈장 미세입자-풍부화된 분획물을 분리하는 단계 (h)를 원심분리에 의해 수행하는 방법.
  8. 제3항에 있어서, 크기에 의해 분획화하여 정제하는 단계 (i)를 분획화된 혈장 미세입자를 크기 배제 컬럼을 통해 유출시킴으로써 수행하는 방법.
  9. 제4항에 있어서, PPP를 분획화하는 단계 (j)를 원심분리에 의해 수행하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 원심분리가 혈장 미세입자를 포함하는 펠렛을 형성하기에 충분한 것인 방법.
  11. 제5항에 있어서, 탈지 단계 (k)를 혈장 미세입자를 겔 전기영동함으로써 수행하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 겔 전기영동이 1D SDS PAGE인 방법.
  13. 제6항에 있어서, 절단 단계 (l)를 탈지된 단백질을 적절한 효소로 분해함으로써 수행하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 효소가 트립신인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 확인 단계 (b)를 얻어진 단백질 또는 펩티드의 서열 분석에 의해 수행하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 확인 단계 (b)를 얻어진 펩티드의 서열 분석에 의해 수행하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 서열 분석을 질량 분광법에 의해 수행하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 서열 분석을 HPLC-MS/MS에 의해 수행하는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 통계적 시험을 적용하는 단계 (c)를 이온 전류, 스펙트럼 계수 및 커버율 (coverage)로부터 선택된 방법을 이용함으로써 수행하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 사용되는 통계적 방법이 대상군 및 대조군 사이의 스펙트럼 계수를 비교하는 것인 방법.
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