JPH08512407A

JPH08512407A - ヒトの甲状腺パーオキシダーゼの定量的測定法及びキット

Info

Publication number: JPH08512407A
Application number: JP7504307A
Authority: JP
Inventors: ヴェッカーマン，レナーテ; バーグマン，アンドレアス
Original assignee: ベー．アール．アー．ハー．エム．エスディアグノスティカゲーエムベーハー
Priority date: 1993-07-13
Filing date: 1994-05-31
Publication date: 1996-12-24
Also published as: AU6930694A; EP0708924A1; WO1995002824A1; IL109795A0; DE4343255A1

Abstract

(57)【要約】生物流体、培地、組織抽出物及び高度に精製された天然のｈＴＰＯ又は組替えｈＴＰＯを含有する流体中のヒト甲状腺パ−オキシダ−ゼ（ｈＴＰＯ）の定量の為の方法であって、測定はそれ自体知られているサンドウィッチ検定として実施され、その測定中でｈＴＰＯに対する第一のモノクロ−ナル抗体、及び少なくとも１種の更に別のｈＴＰＯに対するモノクロ−ナル抗体が使用され（ＭＡＢ₁、ＭＡＢ₂）、それらのうち前者（ＭＡＢ₁）は変性に対し感受性の、そしてｈＴＰＯに対する自己抗体の結合中に関与する、そして酵素阻害に関与する領域中でｈＴＰＯを認識し、一方１又はそれ以上の別の抗体（ＭＡＢ₂）は、ｈＴＰＯの変性によっては本質的に結合性が損なわれない領域中てｈＴＰＯを認識することを特徴とする方法。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称ヒトの甲状腺パ−オキシダ−ゼの定量的測定法及びキット本発明は、生物流体、培地、組織抽出物及び高度に精製された天然のヒト甲状腺パ−オキシダ−ゼ（ｈＴＰＯ）又は組替えｈＴＰＯを含有している流体中の、ヒト甲状腺パ−オキシダ−ゼ（ｈＴＰＯ）を定量的に測定する方法、及びそのような方法を実施するキットに関する。ヒト甲状腺パ−オキシダ−ゼ（以下通常は単に省略形ｈＴＰＯで示す）は甲状腺の膜に結合したグリコシル化されたヘモ蛋白質であり、甲状腺ホルモンの生合成に重要な機能を行う。ｈＴＰＯの一次構造は種々のグル−プがｈＴＰＯ遺伝子をクロ−ニングするのに成功した後に決定された。ジ−ン・ラフ、マリ-エリザベ−ト・トゥ−ベ−ル、バ−バラ・ツァルノッカ、ジョゼ-マルティ−ヌ・デュラン-ゴルド、ミレ−ユ・フェランド、およびピエ −ル・カラヨンによって出版された、『ヒト甲状腺パ−オキシダ−ゼの免疫学的構造と生化学的な性質の間の関係（Relation ship between Immunological Stru cture and Biochemical Properties of Human Thyroid Peroxidase）』 Endocry nology,125巻,No.3,1211〜1218ペ−ジ、は種々のモノクロ−ナル抗体（ＭＡＢ）を使用してその抗原表面をマッピングすることによりｈＴＰＯの三次元構造を測定するために研究した結果を記載している。述べられた刊行物は以下に数回参照され、この刊行物は常に短くジェ−．ラフら、Endocrinology 125と呼ぶ。この述べられた刊行物はまたｈＴＰＯの構造の機能及び測定についての文献のレビュ−を含んでおり、引用されている全ての刊行物に対し、追加的に参照がなされる。ｈＴＰＯは、甲状腺ホルモン生合成におけるその実際の機能の為に重要であるだけではなく、ｈＴＰＯが、甲状腺の自己免疫病を有する殆どの患者中で検出することができる、循環している自己抗体の自己抗原として認識されている、いわゆるミクロソ−ム抗原に等しいということが解ったためにも、重要であることが解ってきた。その診断に於ける重要性の為、ｈＴＰＯまたはミクロソ−ム抗原に対する自己抗体の数多くの検出方法が既に開発され、そして実際に非常に重要となってきている。本出願人によって最近開発されたものがドイツ特許DE 41 20 412 C1に記載されており、ここでは、必要とされる抗体の存在下に於いては、a)第一の抗体、特にモノクロ−ナル抗体、b)好ましくは粗製の天然型で加えられる、抗原ｈＴＰＯ、及びc)更に別の標識された好ましくは同様なモノクロ−ナル抗体、のサンドウィッチの形成が撹乱されるという事実の為に、ｈＴＰＯに対する自己抗体の存在が検出される。ｈＴＰＯに対する自己抗体の測定の為の、更に別の試験については、ドイツ特許DE 41 20 412 C1のイントロダクションを参照することが出来る。すぐ上に短く述べた方法は、甲状腺の自己免疫病にかかっている患者の血清中に通常高濃度で生じる自己抗体の検出に関するものであるから、述べられた試験を機能させるためには、ｈＴＰＯに対する自己抗体の存在によってサンドウィッチの形成が攪乱されるそのサンドウィッチが、二つの抗体及び比較的高濃度で加えられる粗製の天然の抗原から、充分に再現性のある方法で形成されることが必須であった。記載される試験については、要求される抗体の存在によって攪乱されるサンドウィッチの形成が高い感度で行われることは必要ではない。本発明はDE 41 20 412 C1に従うｈＴＰＯに対する自己抗体の測定法に於いて使用できるもののような、二つのモノクロ−ナル抗体を使用して、種々の生物流体、特に組織抽出物、培地及び実験室で実施される類似の流体中の抗原ｈＴＰＯの高感度の測定を実施することができるという驚くべき発見に基づいている。請求項１に従うと、本発明は生物流体、培地、組織抽出物及び高度に精製された天然のｈＴＰＯ又は組替えｈＴＰＯを含有している流体中のヒト甲状腺パ−オキシダ−セ（ｈＴＰＯ）の定量的な測定法に関するものであって、この方法はｈＴＰＯに対する第一のモノクロ−ナル抗体及びｈＴＰＯに対する少なくとも一つの更に別のモノクロ−ナル抗体（ＭＡＢ₁、ＭＡＢ₂）を使用して、それ自体は知られているサンドウィッチ検定として測定が実施されることを特徴とするが、上記モノクロ− ナル抗体のうち前者（ＭＡＢ₁）は、変性に対し感受性である、ｈＴＰＯに対する自己抗体の結合において関与する、そして酵素阻害に関与する領域に於いてｈＴＰＯを認識するものであり、一方、更に別の一種類以上の抗体（ＭＡＢ₂）は結合性がｈＴＰＯの変性によって損なわれない領域でｈＴＰＯを認識するものである。述べられた方法の好ましい具体例及びそのような方法を実施する好ましいキットの基本的な組成が請求項２〜11に記載されている。本発明はその背景及び特定の具体例及び効果を含めて、以下に詳細に記載される。ｈＴＰＯに対する目己抗体の検出は、広範囲な研究及び開発の仕事のテ−マであってきたが、これまで生物流体、培地、及びこの用語の最も広い意味における他の生物学的材料中に於いてｈＴＰＯを検出するための方法として信頼できる商業的に利用できるものが無かった。文献の検索で見いだされる直接のｈＴＰＯ測定法のただ一つの記載は、Ｔ.Ｊ. ウィルキンおよびＪ.Ｌ.ディアズ『血清中のＴＰＯ測定法（Approaches to the measurement of TPO in serulm）』Thyroperoxidase and Thyroid Autoimmunity ,Ｐ.キャラヨン、Ｊ.ラフ.コロ−ク編インセルム（INSERM）／ジョン・リベイユ−ロテキストリミテッド,1990,207 巻,169〜172ベ−ジに見られる。この述べられた研究では、循環しているｈＴＰＯの含有量を測定する試みが為されている。グアヤコ−ル（guajacol）検定に基づく酵素試験を開発する試みは成功しなかったと報告されている。従ってその著者は、¹²⁵Ｉで標識された精製されたｈＴＰＯがポリクロ−ナルウサギ抗ｈＴＰＯ血清と反応され、免疫複合体を与え、これがロバの抗ウサギグロブリンを加えることによって二重抗体法によって沈殿されるラジオイミュノアッセイを用いて、その測定を実施している。ｈＴＰＯ含量を測定するために、沈殿した免疫複合体からの標識されたｈＴＰＯの置き換えの程度が測定された。この記載される方法は、約2ng/mlの低い感度を有し、述べられた方法に於いて測定されたｈＴＰＯ血清濃度は非常に高いので、述べられた方法によって得られる値の正しさを疑う充分な理由が存在する。血清中のｈＴＰＯ濃度を測定する理由は、甲状腺の自己免疫病中のｈＴＰＯに対する自己抗体の形成に対する種々の理論の正しさを試験したいという願望である。そのような理論の一つは、自己抗体の形成は細胞又は細胞膜中に通常は固定されている内因性の物質、例えば酵素ｈＴＰＯが細胞又は細胞膜の損傷の結果として血液循環に入ることが出来、そしてその循環中で循環中に正常な状態では存在しない抗原に対するその抗体の正常な免疫反応を生じるという事実に基づくと仮定している。同じ刊行物Tyroperoxidase and Tyroid Autoimmunity,173ペ−ジ中のＵ.フェルド-ラスムッセン、Ｍ.ホイエル-マドセン、Ｊ.デ−ト及びＭ.ブリッカ−ト-トフトによる研究では、甲状腺に対する手術後の血清中のｈＴＰＯの濃度について結論を導くことが試みられている。ｈＴＰＯを測定する適当な方法が存在しないなかで、抗ｈＴＰＯ自己抗体の測定可能な濃度が測定され、そしてその測定可能な濃度の減少を、自己抗体の結合により、その測定可能な濃度を減少させるｈＴＰＯの相当する放出として相関させられている。自己抗体濃度の減少に対する循環しているｈＴＰＯの間接的な測定は、そのような抗体の測定の為の試験が利用できるのに、ｈＴＰＯ濃度の直接測定についての信頼できる試験が存在しないから実施されたものである。しかしながら、各々の間接測定法は確認出来ない数多くの仮定に基づくものであって、得られた結果の価値を大きく制限するという欠点を有している。生物流体中のｈＴＰＯを測定する試みを記載している二つの最後に述べた研究論文は、ｈＴＰＯに対する自己抗体のみならず、直接法によってｈＴＰＯ自体も測定することが出来ることがなぜ科学的で且つ臨床的に興味があるものであるかについて、種々の理由を与えている。鍵をにぎる酵素であるｈＴＰＯの信頼できる測定法が有用である更に別の分野は、細胞培養基（一次培養基、定常的細胞培養基）を含めた生物試料を用いるイン・ビトロの研究分野である。なぜならばこの分野では、細胞培養基がｈＴＰＯなどのパ−オキシダ−ゼを含有しているかどうかを測定することが重要であり得るからである。また、例えばパ−オキシダ−ゼが、化学物質の代謝に於いて重要な役割を果たしていること、そして重要であり得るある種の代謝物の形成に於いて実質的に関与している可能性があること、例えばある種の物質の毒性について関与していることがあり得ることが知られている。更に、ｈＴＰＯの直接測定の信頼できる方法はまた、遺伝子工学によって得られる市販製品または生成物及び中間体中に於いてｈＴＰＯ濃度の濃度測定又は検量曲線作成（キャリブレ−ション）、及び標準化の為に使用することも出来る。本発明に従う方法は、初めて、それ自体は知られているサンドウィッチ検定によって、抗原であるｈＴＰＯの高感度測定を可能としている方法を与える。この方法でモノクロ−ナル抗ｈＴＰＯ抗体が、それ自体は知られている原理に従って、固相、好ましくは被覆されたポリスチレン試験管の壁上に固定され、そして高感度のｈＴＰＯ検定（26pg ＴＰＯ/mlの検出の下限）であって、非常に動的な特性を有するもの（測定範囲規模が３桁を越えている）、そして高度に再現性のあるもの（平均検定内分散係数が3.6％）が、好ましくはアクリジニウムエステルで標識され、化学発光性を有する、更に別の標識された抗ｈＴＰＯ抗体の使用で提供される。本発明に従う方法に於いて、DE 41 20 412 C1に従う方法に於いても使用できる、そしてジェ−.ラフら、Endocrinology 125中に記載される抗体に対応している、そして15及び53の数を有するクロ−ン（短縮形で、以下ＭＡＢ15及びＭＡＢ 53と述べる）からの二つの抗体が使用されるのが好ましい。本願の開示を完全にするために、二つの好ましくは使用される抗体は、これらの抗体を生じるハイブリド−マ細胞の形態で、用心の為にブタペスト協定に従いドイツ,ブラウンシュヴェ−グ，マッシェンロ−ダ− ヴェ−グ 1bの『DMS-Deutsche Sammlung von Mi kroorganismen und Zellkulturen GmbH』中に寄託されている。寄託番号は、名称『TPO # 15-4-G2』のハイブリド−マについて DSM ACC2154（受入日1993年9 月14日）、そしてハイブリド−マ『TPO # 53』についてDSM ACC2137（受入日199 3年7月7日）である。ジェ−.ラフら、Endocrinology 125によって刊行物中に説明されるように、ＭＡＢ15はｈＴＰＯに対する自己抗体の結合にも関与している、そして更に酵素阻害にも関与している領域に於いてｈＴＰＯと結合する抗体の一つである。ＭＡＢ１５のｈＴＰＯに対する結合は、ｈＴＰＯの変性が生じる可能性が高い条件下で大きく減少するので、述べられたモノクロ−ナル抗体はｈＴＰＯのある種の立体配位（即ち、いわゆる抗体のコンフォメ−ションである）を認識することが結論づけられうる。他方、ＭＡＢ53（ジェ −.ラフら、Endocrinology 125）は、好ましくは更に別の標識されたモノクロ− ナル抗体として使用されるが、これはｈＴＰＯの変性によってはずっと小さい程度しかその結合が損なわれない抗体の一つであるので、このモノクロ−ナル抗体は一次アミノ酸配列の領域を認識し、従っていわゆるシ−クエンシャルな抗体であることが椎測される。二つの述べられた抗体を使用することは、ｈＴＰＯの測定の為のすばらしい方法に導くものであるが、標識さＭＡＢ53の代わりに、又は標識されたＭＡＢ53に加えて比肩し得る性質を有する１またはそれ以上の標識されたモノクロ−ナルまたはポリクロ−ナル抗体、即ちｈＴＰＯのＭＡＢ15に対する結合を干渉しない、上記の意味に於けるシ−クエンシャルな抗体を使用することは、本発明の範囲内にある。特に、ＭＡＢ53はまた、モノクロ−ナル抗体30〜47の一つと共に使用することもでき（ジェ−.ラフら、Endocrinology 125）、又は二つの述べられたモノクロ−ナル抗体の混合物によって置き換えられることが出来る。述べられたモノクロ−ナル抗体の二つの混合物を使用することは、Ｃ.ド・ミッコ、Ｊ.ラフ、Ｍ. Ａ.クレスチャン、Ｎ.グロス、Ｊ.Ｆ.ヘンリ−及びＰ.キャラヨンによる論文に関連して特に興味があり、同様に上に述べた刊行物Thyroperoxidase and Autoim munity,207巻,133〜136ペ−ジに関連して特に興味がある。述べられた刊行物中では、著者はモノクロ−ナル抗体30及び47が、組織試料が健康な組織又は良性の腫瘍に由来するか、又はこれらが悪性の腫瘍に由来するかに依存して、異なる方法で組織試料のｈＴＰＯに結合することを示している。ｈＴＰＯの定量的な測定の為の本発明に従う方法に於いて、異なる種類の標識を有する、又は混合物として個々の標識の間に於ける区別を可能とする二つのモノクロ−ナル抗体を使用することによって、例えば、二つの抗体の、従って二つの異なる標識の同一又は異なる結合から組織提供者の健康状態についての結論を導き出すことが出来る。この述べられた手順は明らかに本発明によって包含されることが意図されるが、これは更に以下に議論しない。ジェ−.ラフら、Endocrinology 125による刊行物に従うモノクロ−ナル抗体15及び53（それぞれＤＳＭにおける寄託の名称がTP O # 15-4-G2及びTPO # 53）を用いるｈＴＰＯを測定する好ましい方法を、以下に詳細に記載する。図面に於いて、図１は異なる測定マトリックスに於ける本発明に従う方法によるｈＴＰＯ測定の結果を示す。図２は異なる組織抽出物の場合に於ける本発明に従う方法により測定された特定のｈＴＰＯ値を示している。図３は試料の古さが増すにつれての、組織抽出物中で測定されるｈＴＰＯの再現性に対する、ロイペプチンの存在影響を示している。実施例１．固相上へのモノクロ−ナル抗ｈＴＰＯ抗体の固定：抗体ＭＡＢ15に対応する、寄託名称TPO # 15-4-G2の下でＤＳＭに於いて寄託された抗体（ジェ−.ラフら、Endocrinology 125）を固相に結合される抗体として選択した。述べられたモノクロ−ナル抗体の固相への結合は、以下の様に既知の方法によってポリスチレン試験管を被覆することによって実施した。 12×75mmの寸法を有するポリスチレン試験管（グライナ−社から得られる）をそれぞれ300μl緩衝水溶液（1OmM トリスＨＣｌ；10mM 塩化ナトリウム；pH 7. 8）中の1μgの抗ｈＴＰＯ抗体で満たした。室温で20時間培養後、試験管を二度洗浄した（各回4.5mlのＨ₂Ｏ）。次に試験管を飽和溶液で満たすことによって0. 5％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の溶液で飽和させ、室温でそれらを二時間培養し、そして次に内容物を傾斜することによって空にした。試験管を次に適用された被膜と共に凍結乾燥した。このようにして使用準備の出来た試験管が本方法の為の試験キット中に含められた。２．化学発光標識で標識された抗ｈＴＰＯ抗体の製造：アフィニティクロマトグラフィ−で精製し、寄託名称 TPO # 53の下にＤＳＭで寄託した、そして抗体ＭＡＢ53に対応した（シェ−.ラフら、Endocrinology 1 25）150μgの抗体を、20mM リン酸ナトリウム pH 7.4中で蛋白質濃度1mg/mlで、 25nmolのアクリジンエステル（活性エステル）と反応させた。30分の培養時間の後、結合していない遊離標識を、標識された抗体から、WATERS-Shodex WS 803カラム上でＨＰＬＣによって分離した（流速1ml/分、移動相150mM リン酸ナトリウム pH 7.2）。この方法で得られた精製されたトレ−サ−を、50mM Hepes緩衝液、1％ BSA（マイルズ社からのもの）及び1mg/mlマウスＩｇＧ（スカンティボディ−ズ社からのもの）pH 6.5、中のml当たり1×10⁸ RLU（相対光単位）の合計活性に希釈し、そして0.5ml部分ずつ10mlのアンバ−ガラスの瓶中に充填し、次に凍結乾燥した。凍結乾燥した試験管をキット中に含めた。抗ｈＴＰＯ試験が実施される前に、トレ−サ−を各場合に次の組成を有している5mlの緩衝液で戻した：50mM Hepes 、100mM 塩化ナトリウム、0.5％トリトシＸ100（ビア−ス社からのもの）pH 6. 5、これもまた試験キットの一部である。３．標準又はキャリブレ−タ−（検量線作成物質）の製造種々のキャリブレ−タ−を使用できる： a)ヒト甲状腺膜から単雑され、アフィニティ−クロマトグラフィ−によって精製された非常に純粋な甲状腺パ−オキシダ−ゼ（ジェ−.ラフら、Endocrinology を参照）。 b)組替えヒト甲状腺パ−オキシダ−ゼ（アフィニティ−クロマトグラフィ−によって精製される）、これはＷＢＡＧリソ−シズ社／チュ−リッヒから入手でき、O.1 M Klを含有している25mM トリス HCl(pH 7.4）の緩衝液中、36.96μg/ml のｈＴＰＯ濃度を有している。 c)ヒト甲状腺から単離され、P 41 20 412 C1に従って製造される粗製の甲状腺パ−オキシダ−ゼであって、その内容物がa)又はb)を用いて検定（キャリブレ− ション）されたもの。キャリブレ−タ−の製造については、ｈＴＰＯは、PBS（リン酸塩緩衝化食塩溶液）＋1％ BSA及び0.6％トリトンＸ100（ビア−ス社からのもの）中の５倍濃縮物として適当な濃度に希釈され、各々0.2ml部分ずつ2m1のガラス瓶中に充填され、そして次に凍結乾燥される。これらのキャリブレ−タ−は、望まれる測定が実施される媒体（例えば、血清又は緩衝液）中の1.0の容量にそれらを戻すことによって使用される。測定は、標準又は試料の200μlが固定されたモノクロ −ナル抗体で被覆された試験管中にピペットで入れられ、そして次に100μlのトレ−サ−が各場合にピペットで入れられる手順によって実施される。発光性標識の光感受性のため、厳格に光を除外した下で室温に於いて16〜20時間の培養時間の後、1mlの洗浄溶液を各試験管に加え、その後試験管内容物を傾斜する。次に各回1mlの洗浄溶液で３回、洗浄を実施し、続いて各回傾斜を行う。試験管を、次に5〜10分間、開いた口を下に向けて残留する流体を吸取るために吸い取り紙上に置く。全ての被覆された試験管を、次に化学発光信号の測定の為にルミノメ −タ−中に置き、既知の方法で必要な試薬を、好ましくは自動的に加え、そして視感効率（Iuminous efficiency）を１秒間の期間測定する。結果：記載される試薬セット及び述べられた測定プロトコルを用いて、ｈＴＰＯの量の増加と共に増加するトレ−サ−の量が試験管表面に結合した。生じる試験は３桁の規模に渡っている高度に動的な範囲を有していることが解った（0.02から50 ng TPO/mlを越える線形の測定された信号）。予測されるように、標準曲線の形状は使用される測定媒体によって影響され、図１は測定媒体の緩衝液、媒体＋10％ FCS、血清、唾液、結晶及び尿について得られた標準曲線を示している。本方法の設計のユ−ザ−に対する重要な利点は、キャリブレ−タ−を任意の所望の測定媒体中で戻すことができ、従っていわゆる測定マトリックスの選択について完全に自由であるということである。本発明に従う方法に於いて、アフィニティ−クロマトグラフィ−によって精製された天然のｈＴＰＯ及びアフィニティ −クロマトグラフィ−によって精製された組替えｈＴＰＯは、測定に於いて同じ結果を与える。感度（試験の検出の下限）は26p8 ｈＴＰＯ/ml（参照標準のRLU値の平均値プラス緩衝液マトリックス中の三つの標準偏差）として測定され、これは驚くべき良好な値である。従って、本発明に従う方法を実施するために、記載される試験を使用して、高感度で、動的な範囲をもって、そして事実上任意の媒体中で選択性を持って、ｈＴＰＯを測定することが可能である。しかしながら、自己抗ｈＴＰＯ抗体の存在も予測されなくてはならない生物流体、例えば血清中に於ける測定に於いては、自己抗体の存在に対するいわゆるリカバリ−試験を実施しなくてはならない。必要ならば、抗体はまた実際の測定法に先立つ段階中でそのような試料から除去することもできる。更に、使用される抗体が逆の順序で固定又は標識されるように記載された試験キットを変更することも、また、モノクロ−ナル抗体53がｈＴＰＯに結合するが対応する目己抗体とは反応しないので、中間の洗浄段階を用いてこの方法を実施することも、本発明の範囲内である。甲状腺組織抽出物中のｈＴＰＯの測定に於いて再現性のある結果を得るためには、ｈＴＰＯ測定をエンドプロテア−ズ阻害剤、特にロイペプチンの存在下で実施することが勧められる（次の使用実施例を参照）。使用実施例種々のヒト甲状腺組織抽出物中のｈＴＰＯの量の測定手順組織の外科的な除去の直後に試料を固体二酸化炭素上で凍結させ、そして更に使用に要求されるまで-20℃で貯蔵した。組織の解凍後、この材料を秤量し、そして、追加的に0.5％のトリトンＸ100と500μmのロイペプチンを含有する、十倍の重量のＰＢＳ緩衝液と共にホモジナイズした（ウルトラ-ツラックスホモジナイザ−、IKA-ヴェルケ/シュタウフェン：各場合10sの最大スピ−ドに於いて５回）。30分間培養後、試料を100,000gに於いて１時間遠心し、そして生じる上澄み溶液を測定して、蛋白質とｈＴＰＯの含量を測定した。ｈＴＰＯの量及び蛋白質の量の生じる指数が図２に示される。図２に示されるように、甲状腺組織または手術で得た材料の個々のｈＴＰＯ含量は大きく変わる。示された少数の試料でも、８倍までの相対含量の差が見いだされる。また、驚くべきことに、本発明に従ってｈＴＰＯ検定によって測定された時、甲状腺抽出物中のｈＴＰＯ含量は４℃における貯蔵の間に時間と共に劇的に増加することが解ったことが指摘されなければならない。ロイペプチンに感受性のプロテア−ゼがこの影響の原因であるようである。なぜならば、ロイペプチンは実際上完全にこの影響を抑えるからである（図３を参照）。そして再現性のある結果を得るためには、組織抽出物中のｈＴＰＯの測定は、従ってロイペプチンの存在下で実施されなければならない。興味あることに、ｈＴＰＯの増加速度は個々の組織に非常に依存していることも解った（デ−タは示されていない）。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年７月２０日【補正内容】図３は、ＴＰＯの抽出物を室温て500μmのロイペプチンを加えて、又は加えずに貯蔵した実験の結果を示している。抽出物はＴＰＯ標準系を用いで異なる時間で測定した。この目的には、抽出物を標準緩衝液で希釈した。【図１】【図３】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＳＫ，ＵＳ

Claims

【特許請求の範囲】１．生物流体、培地、組織抽出物、及び高度に精製された天然のｈＴＰＯまたは組替えｈＴＰＯを含有している流体中のヒト甲状腺パ−オキシダ−ゼ（ｈＴＰＯ）の定量方法に於いて、測定がそれ自体知られているサンドウィッチ検定として実施され、その測定でｈＴＰＯに対する第一のモノクロ−ナル抗体及びｈＴＰＯに対する更に別の少なくとも１つのモノクロ−ナル抗体（ＭＡＢ₁，ＭＡＢ₂）が使用され、それらのうち前者（ＭＡＢ₁）は変性に感受性のある、そしてｈＴＰＯの対する自己抗体の結合に関与する、そして酵素阻害に関与する領域でｈＴＰＯを認識し、一方上記１又はそれ以上の別の抗体（ＭＡＢ₂）は結合性がｈＴＰＯの変性によって本質的に損なわれない領域に於いてｈＴＰＯを認識することを特徴とする方法。２．第一のモノクロ−ナル抗体（ＭＡＢ₁）が固相に固定形で結合され、調べる試料中で期待されるｈＴＰＯの濃度に対し過剰量で使用され、そして１又はそれ以上の別のモノクロ−ナル抗体（ＭＡＢ₂）が標識されていることを特徴とする、請求項１に記載の方法。３．上記１又はそれ以上の別のモノクロ−ナル抗体（ＭＡＢ₂）が化学発光標識、放射性同位元素、酵素標識、又は蛍光標識で標識されている請求項２に記載の方法。４．化学発光標識がアクリジニウムエステルである請求項３に記載の方法。５．上記の１又はそれ以上の標識されたモノクロ−ナル抗体に加えて、ｈＴＰＯに対する追加的な標識されたモノクロ−ナル又はポリクロ−ナル抗体が存在し、そしてその抗体は異なる標識によって上記１又はそれ以上の別の標識された抗体から区別することができ、更に異なる領域及び/又は異なる親和性でｈＴＰＯと結合する為に上記１又はそれ以上の別の標識された抗体と異なることを特徴とする請求項３又は４に記載の方法。６．第一のモノクロ−ナル抗体（ＭＡＢ₁）が名称TPO # 15-4-G2（DSM ACC2154 ）の下で寄託されているハイブリド−マによって造られるモノクロ−ナル抗体であり、１つの更に別のモノクロ−ナル抗体又は更に別のモノクロ−ナル抗体の１つが、名称TPO # 53（DSM ACC2137）の下に寄託されたハイブリド−マによって造られるモノクロ−ナル抗体（ＭＡＢ₂）である請求項１〜５の何れか一に記載の方法。７．別の異なる方法で標識された抗体が、同様な方法で結合されているかどうか、または大いに異なる方法で結合されているかどうかを測定し、そこから悪性の病気の存在又は非存在についての結論が導き出される、請求項５又は６の何れか一に記載の方法。８．エンドプロテア−ゼに対するプロテア−ゼ阻害剤が、ヒト組織抽出物が得られた後に、ｈＴＰＯが検定されるべきそのヒト組織抽出物に加えられる請求項１〜７の何れか一に記載の方法。９．ロイペプチンがプロテア−ゼ阻害剤として使用される請求項８に記載の方法。１０．ｈＴＰＯに対する凍結乾燥形の第一のモノクロ−ナル抗体（ＭＡＢ₁）を有している固相と、好ましくは同様に凍結乾燥形の少なくとも１つの更に別の標識された抗体（ＭＡＢ₂）と、そして、凍結乾燥形であって、定義された量のｈＴＰＯを含有しているキャリブレ−タ−を含み、そして通常の緩衝液、溶媒、及び必要ならば標識の検出の為の試薬を含有していることを特徴とする、請求項１〜９の何れか一に記載の方法を実施するためのキット。１１．キャリブレ−タ−として、i)ヒト甲状腺膜からの高度に精製されたｈＴＰＯ、ii)組替えｈＴＰＯ、又はiii)ヒト甲状腺がら単離され、そしてi)またはii) に対しキャリブレ−ションされた粗製ｈＴＰＯを含有していることを特徴とする請求項１０に記載のキット。