DE4323436C2 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung von humaner Thyreoidaler Peroxidase und Kit für die Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von humaner Thyreoidaler Peroxidase (hTPO) in biologischen Flüssigkeiten, in Kulturmedien, Gewebsextrakten und hochgereinigte natürliche hTPO oder rekombinante hTPO enthaltenden Flüssigkeiten, sowie einen Kit zur Durchführung eines solchen Verfahrens.

Humane Thyreoidale Peroxidase (im folgenden in der Regel nur mit dem Kürzel hTPO bezeichnet) ist ein an die Thyreoid- Membranen gebundenes glykosyliertes Hämoprotein, das wichti­ ge Funktionen bei der Biosynthese der Schilddrüsenhormone erfüllt. Die Primärstruktur der hTPO wurde aufgeklärt, nachdem es verschiedenen Gruppen gelungen war, das hTPO-Gen zu klonieren.

In der Veröffentlichung von Jean RUF, Marie-Elisabeth TOU­ BERT, Barbara CZARNOCKA, Jos´e-Martine DURAND-GORDE, Mireil­ le FERRAND und Pierre CARAYON, "Relationship between Immuno­ logical Structure and Biochemical Properties of Human Thy­ roid Peroxidase", in Endocrinology, Volume 125, No. 3, Seiten 1211 bis 1218, sind die Ergebnisse einer Untersuchung zur Aufklärung der dreidimensionalen Struktur von hTPO mit Hilfe einer Kartierung ihrer antigenen Oberfläche unter Verwendung von verschiedenen monoklonalen Antikörpern (mAk) beschrieben. Auf die genannte Literaturstelle wird im fol­ genden mehrfach Bezug genommen werden, wobei diese Litera­ turstelle dann stets kurz als "J. Ruf et al in Endocrinology 125" bezeichnet wird. Die genannte Literaturstelle enthält auch einen Überblick über die Literatur zu der Funktion und der Aufklärung der Struktur der hTPO, wobei auf alle zitier­ ten Publikationen ergänzend Bezug genommen wird.

Es hat sich gezeigt, daß hTPO nicht nur wegen ihrer eigent­ lichen Funktion bei der Biosynthese der Schilddrüsenhormone von Bedeutung ist, sondern auch deshalb, weil sich herausge­ stellt hat, daß hTPO mit dem sogenannten mikrosomalen Anti­ gen identisch ist, das als Autoantigen von zirkulierenden Autoantikörpern erkannt wird, die bei den meisten Patienten mit Schilddrüsenautoimmunerkrankungen nachgewiesen werden können.

Wegen ihrer hohen diagnostischen Bedeutung wurden bereits eine ganze Reihe von Nachweisverfahren für Autoantikörper gegen hTPO bzw. das mikrosomale Antigen entwickelt, die große praktische Bedeutung erlangt haben. Eine jüngere Entwicklung der Anmelderin der vorliegenden Anmeldung ist beschrieben im deutschen Patent DE 41 20 412 C1, bei dem der Nachweis des Vorhandenseins von Autoantikörpern gegen hTPO dadurch erfolgt, daß bei Anwesenheit der gesuchten Antikör­ per der Aufbau eines Sandwiches aus a) einem ersten Antikör­ per, insbesondere einem monoklonalen Antikörper, b) dem vorzugsweise in roher, nativer Form zugesetzten Antigen hTPO sowie c) einem weiteren markierten, vorzugsweise ebenfalls monoklonalen Antikörper gestört wird. Bezüglich weiterer Tests zur Bestimmung von Autoantikörpern gegen hTPO wird auf die Einleitung des deutschen Patents DE 41 20 412 C1 ver­ wiesen.

Da es bei dem eben kurz beschriebenen Verfahren um den Nachweis von Autoantikörpern geht, die in der Regel in hohen Konzentrationen im Serum von Patienten vorkommen, die an Autoimmunerkrankungen der Schilddrüse leiden, war es für das Funktionieren der genannten Tests primär erforderlich, daß auf ausreichend reproduzierbare Weise ein Sandwich aus den beiden Antikörpern und dem in relativ hoher Konzentration zugesetzten rohen, nativen Antigen ausgebildet wird, dessen Aufbau durch die Anwesenheit von Autoantikörpern gegen hTPO gestört wird. Für den beschriebenen Test war es nicht erfor­ derlich, daß der Aufbau des durch die Anwesenheit der ge­ suchten Autoantikörper gestörten Sandwiches mit großer Empfindlichkeit erfolgt. Ein Verfahren zur präzisen Routinebestimmung von hTPO stand bisher nicht zur Verfügung.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein für die Routinebestimmung in Klinik und Labor geeignetes Verfahren zu schaffen, das eine hochempfindliche Messung des Antigens hTPO in verschiedenen biologischen Flüssigkeiten sowie insbesondere auch in Gewebsextrakten, Kultmedien und ähnlichen Flüssigkeiten der Laborpraxis ermöglicht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher gemäß Patentanspruch 1 ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von humaner Thyreodialer Peroxidase (hTPO) in biologischen Flüssigkeiten, Kulturmedien, Gewebsextrakten und hochgereinigte natürliche hTPO oder rekombinierte hTPO enthaltenden Flüssigkeiten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Bestimmung als an sich bekannten Zweiseiten-Bindungstest unter Verwendung eines ersten monoklonalen Antikörpers gegen hTPO und mindestens eines weiteren monoklonalen Antikörpers gegen hTPO (mAk₁, mAk₂) durchführt, von denen der erste (mAk₁) hTPO in einem gegen Denaturierung empfindlichen Bereich erkennt, der an der Bindung von Autoantikörpern gegen hTPO und an der Enzyminhibierung beteiligt ist, während der mindestens eine weitere Antikörper (mAk₂) hTPO in einem Bereich erkennt, dessen Bindungseigenschaften durch Denaturierung von hTPO nicht beeinträchtigt werden.

Vorzugsweise Ausführungsformen des genannten Verfahrens sowie die Grundzusammensetzung von bevorzugten Kits zur Durchführung eines solchen Verfahrens sind in den Patent­ ansprüchen 2 bis 11 wiedergegeben.

Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung einschließlich ihrer Hintergründe und ihrer besonderen Ausführungsformen und Vorteile noch näher erläutert.

Während der Nachweis von Autoantikörpern gegen hTPO Gegen­ stand umfangreicher Forschungs- und Entwicklungsarbeiten war, existieren bisher noch keine zuverlässigen und im Handel verfügbaren Verfahren zum Nachweis von hTPO in biolo­ gischen Flüssigkeiten, Kulturmedien und anderen biologischen Materialien im weitesten Sinne dieses Begriffs.

Die einzige bei einer Literaturrecherche ermittelte Be­ schreibung einer direkten Messung von hTPO findet sich in T.J. Wilkin und J.L. Diaz "Approaches to the measurement of TPO in serum", in: Thyroperoxidase and Thyroid Autoimmunity, Ed. P. Carayon, J. Ruf. Colloque INSERM/John Libbey Eurotext Ltd., 1990, Vol. 207, Seiten 169-172. In der genannten Arbeit wird versucht, den Gehalt von zirkulierender hTPO zu bestimmen. Es wird berichtet, daß Versuche zur Schaffung eines enzymatischen Tests auf der Basis eines Guajacol- Assays nicht zum Erfolg führten. Die Verfasser führten daher ihre Messungen mit einem Radioimmunoassay durch, bei dem gereinigte, mit ¹²⁵I markierte hTPO mit einem polyklonalen Kaninchen-Anti-hTPO-Serum zu Immunkomplexen umgesetzt wurde, die nach dem Doppel-Antikörperverfahren durch Zugabe eines Esel-Anti-Kaninchen-Globulins ausgefällt wurden.

Zur Bestimmung des hTPO-Gehalts wurde der Grad der Verdrän­ gung der markierten hTPO aus den ausgefällten Immunkomplexen ermittelt. Das beschriebene Verfahren weist eine geringe Empfindlichkeit von ca. 2 ng/ml auf, und die mit dem genann­ ten Verfahren ermittelten Serumskonzentrationen von hTPO waren so hoch, daß starker Anlaß besteht, an der Korrektheit der nach dem angegebenen Verfahren erhältlichen Werte zu zweifeln. Anlaß für den Versuch, hTPO-Konzentrationen im Serum zu messen, war der Wunsch, verschiedene Theorien zur Entstehung von Autoantikörpern gegen hTPO bei Autoimmuner­ krankungen der Schilddrüse auf ihre mögliche Richtigkeit zu überprüfen. Eine dieser Theorien geht davon aus, daß die Ausbildung von Autoantikörpern darauf zurückzuführen ist, daß normalerweise in der Zelle oder Zellmembran fixierte körpereigene Substanzen, z. B. das Enzym hTPO, aufgrund einer Schädigung der Zelle oder Zellmembran in den Blutkreislauf gelangen können und dort eine "normale" Immunreaktion des Körpers auf normalerweise nicht im Kreislauf vorhandene Antigene auslösen.

In der Arbeit von U. Feldt-Rasmussen, M. Hoier-Madsen, J. Date und M. Blichert-Toft in der gleichen Veröffentlichung: Thyroperoxidase and Thyroid Autoimmunity, Seite 173, wird ebenfalls versucht, Schlüsse auf die Konzentration von hTPO im Serum zu ziehen, und zwar im Anschluß an eine Schild­ drüsenoperation. Mangels eines geeigneten Verfahrens zur Bestimmung von hTPO wurde die meßbare Konzentration von anti-hTPO-Autoantikörpern ermittelt, und die Erniedrigung der meßbaren Konzentration wurde mit einer äquivalenten Freisetzung von hTPO korreliert, die über eine Bindung von Autoantikörpern deren meßbare Konzentration vermindert. Die indirekte Bestimmung von zirkulierender hTPO für die Ernied­ rigung der Autoantikörperkonzentration erfolgte, weil zwar Tests zur Bestimmung derartiger Autoantikörper verfügbar waren, jedoch kein zuverlässiger Test zur direkten Bestim­ mung von hTPO-Konzentrationen. Eine indirekte Bestimmung hat jedoch stets den Nachteil, daß in sie sehr viele, nicht überprüfbare Annahmen eingehen, die die Wertigkeit der erhaltenen Ergebnisse stark einschränken.

Die beiden zuletzt genannten Arbeiten, die den Versuch einer Bestimmung von hTPO in biologischen Flüssigkeiten beschreiben, schildern verschiedene Gründe dafür, warum es von wissen­ schaftlichem und klinischem Interesse sein kann, nicht nur Autoantikörper gegen hTPO, sondern auch selbst hTPO in einem direkten Verfahren messen zu können. Weitere Bereiche, in denen ein zuverlässiges Verfahren zur Bestimmung des Schlüs­ selenzyms hTPO hilfreich wäre, betreffen in vitro Untersu­ chungen, bei denen mit biologischen Proben, einschließlich Zellkulturen (Primärkulturen, konstanten Zellkulturen) gearbeitet wird, da es in diesem Bereich wesentlich sein kann, festzustellen, ob die Zellkulturen eine Peroxidase wie hTPO enthalten. So ist es z. B. auch bekannt, daß Peroxidasen beim Metabolisumus von Chemikalien eine wesentliche Rolle spielen und dabei wesentlich an der Bildung bestimmter Metaboliten beteiligt sein können, die z. B. für die Toxizi­ tät bestimmter Substanzen wesentlich sein können. Ferner ist ein zuverlässiges Verfahren zur direkten Bestimmung von hTPO auch für die Konzentrationsermittlung bzw. Eichung und Standardisierung von hTPO-Gehalten in Handelsprodukten oder bei gentechnologisch erhaltenen Produkten und Zwischenpro­ dukten einsetzbar.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird erstmals ein Verfahren geschaffen, das eine hochempfindliche Messung des Antigens hTPO nach dem an sich bekannten Zweiseiten-Bin­ dungstest (Sandwich-Assay) ermöglicht. Bei dem Verfahren wird im Einklang mit dem an sich bekannten Verfahrensprinzip auf einer Festphase, vorzugsweise auf der Wandung beschich­ teter Polystyrolröhrchen, ein monoklonaler Anti-hTPO-Anti­ körper fixiert, und unter Verwendung eines weiteren markier­ ten Anti-hTPO-Antikörpers, der vorzugsweise mit einem Akri­ diniumester chemilumineszent markiert ist, wird ein hoch­ sensitiver hTPO-Assay (untere Nachweisgrenze ca. 26 pg TPO/ml) mit hoher Dynamik (Meßbereich mehr als drei Größen­ ordnungen) und hoher Reproduzierbarkeit (mittlerer Inter­ assay-Variationskoeffizient 3,6%) geschaffen.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise zwei Antikörper verwendet, die auch in dem Verfahren gemäß DE 41 20 412 C1 verwendet werden können und die den in J.Ruf et al, Endocrinology 125 beschriebenen Antikörpern aus den Klonen mit den Nummern 15 und 53 (im folgenden kurz mAk 15 und mAk 53 genannt) entsprechen. Zur Vervollständigung der Offenbarung der vorliegenden Anmeldung wurden die beiden bevorzugt verwendeten Antikörper vorsorglich in Form der diese Antikörper produzierenden Hybridomzellen bei "DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH", Maschenroder Weg 1b, Braunschweig, DE, nach dem Budapester Vertrag hinterlegt. Die Hinterlegungsnummern sind für das Hybridom mit der Bezeichnung "TPO#15-4-G2" DSM ACC2154 (Annahmetag 14.09.1993) und für das Hybridom "TPO#53" DSM ACC2137 (Annahmetag 07.07.1993).

Wie in der Literaturstelle J. Ruf et al, Endocrinology 125 erläutert wird, gehört dabei der mAk 15 zu den Antikörpern, die hTPO in einem Bereich binden, der auch an der Bindung von Autoantikörpern gegen hTPO beteiligt ist und außerdem an der Enzyminhibierung. Da die Bindung des mAk 15 an hTPO unter Bedingungen, die eine Denaturierung von hTPO erwarten lassen, stark vermindert wird, kann geschlossen werden, daß der genannte monoklonale Antikörper eine bestimmte Konforma­ tion von hTPO erkennt (d. h. ein sogenannter Konformations- Antikörper ist). Der vorzugsweise als weiterer markierter monoklonaler Antikörper eingesetzte mAk 53 (J. Ruf et al, Endocrinology 125) gehört dagegen zu den Antikörpern, deren Bindung durch Denaturierung der hTPO sehr viel weniger beeinträchtigt wird, so daß angenommen wird, daß dieser monoklonale Antikörper eher einen Bereich der primären Aminosäuresequenz erkennt und somit ein sogenannter sequen­ zieller Antikörper ist.

Obwohl eine Verwendung der beiden genannten Antikörper zu einem hervorragenden Verfahren zur Bestimmung von hTPO führt, liegt es jedoch im Bereich der vorliegenden Erfin­ dung, anstelle des markierten mAk 53 oder zusätzlich zu diesem einen oder mehrere markierte(n) mono- oder auch poly­ klonale(n) Antikörper mit vergleichbaren Eigenschaften zu verwenden, d. h. sequenzielle Antikörper im obigen Sinne, die die Bindung von hTPO an einen mAk 15 nicht stören. Insbeson­ dere kann der mAk 53 auch zusammen mit einem der monoklona­ len Antikörper 30 oder 47 (J.Ruf et al., Endocrinology 125) verwendet werden oder durch ein Gemisch der genannten beiden monoklonalen Antikörper ersetzt werden. Die Verwendung eines Gemischs zweier der genannten monoklonalen Antikörper ist von besonderem Interesse im Hinblick auf die Arbeit von C. de Micco, J. Ruf, M.A. Chrestian, N. Gros, J.F. Henry und P. Carayon, ebenfalls in der bereits erwähnten Veröffentlichung Thyroperoxidase and Thyroid Autoimmunity, Vol. 207, Seiten 133-136. Die Autoren zeigen in der genannten Veröffentli­ chung, daß die monoklonalen Antikörper 30 und 47 in unter­ schiedlicher Weise an die hTPO von Gewebsproben binden, und zwar in Abhängigkeit davon, ob die Gewebsproben einem gesun­ den Gewebe oder einem gutartigen Tumor entstammen oder ob sie einem malignen Tumor entstammen. Indem man bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur quantitativen Bestimmung von hTPO zwei monoklonale Antikörper, die unterschiedliche Arten von Markierungen aufweisen bzw. eine Unterscheidung ihrer individuellen Markierungen gestatten, im Gemisch einsetzt, kann man z. B. aus der gleichmäßigen oder unterschiedlichen Bindung der beiden Antikörper und damit auch der beiden unterschiedlichen Markierungen auf den Gesundheitszustand des Gewebespenders rückschließen.

Obwohl diese genannte Verfahrensweise eindeutig von der vorliegenden Erfindung mitumfaßt werden soll, wird in der Folge nicht mehr näher darauf eingegangen. Nachfolgend wird nunmehr das bevorzugte Verfahren zur Bestimmung von hTPO unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern 15 und 53 entsprechend der genannten Veröffentlichung J. Ruf et al, Endocrinology 125, (Hinterlegungsbezeichnungen TPO # 15-4-G2 bzw. TPO # 53 bei DSM) noch näher beschrieben.

In den Figuren zeigen:

Fig. 1 die Ergebnisse der hTPO Messung nach dem erfindungs­ gemäßen Verfahren in unterschiedlichen Meßmatrices;

Fig. 2 die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bei verschie­ denen Gewebsextrakten gemessenen spezifischen hTPO Werte, und

Fig. 3 den Einfluß der Anwesenheit von Leupeptin auf die Reproduzierbarkeit der in Gewebsextrakten gemessenen hTPO Werte mit zunehmendem Alter der Proben.

Beispiel 1. Immobilisierung eines monoklonalen Anti-hTPO-Antikörpers auf einer festen Phase

Als Antikörper, der an die feste Phase gekoppelt wird, wurde der bei DSM unter der Hinterlegungsbezeichnung TPO # 15-4-G2 hinterlegte Antikörper, der dem Antikörper mAk 15 (J. Ruf et al, Endocrinology 125) entspricht, gewählt. Die Kopplung des genannten monoklonalen Antikörpers an eine feste Phase wurde als Beschichtung eines Polystyrolröhrchens nach bekanntem Verfahren wie folgt durchgeführt:

Teströhrchen aus Polystyrol mit Abmessungen von 12×75 mm (bezogen von der Firma Greiner) wurden mit je 1 µg des Anti­ hTPO-Antikörpers 15 in 300 µl einer wäßrigen Pufferlösung (10 mM Tris-HCl; 10 mM Natriumchlorid; pH 7,8) befüllt. Nach einer 20stündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde zwei­ mal gewaschen (je 4,5 ml H₂O). Anschließend wurden die Röhr­ chen mit einer Lösung aus 0,5% BSA (bovines Serumalbumin) abgesättigt, indem sie mit der Absättigungslösung befüllt, zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und danach durch Dekantieren des Inhalts geleert wurden. Anschließend wurden die Röhrchen mit der aufgebrachten Beschichtung lyophili­ siert. In dieser Form wurden die Röhrchen gebrauchsfertig dem Testkit für das Verfahren beigegeben.

2. Herstellung eines mit einem Chemilumineszenz-Label mar­ kierten Anti-hTPO-Antikörpers

150 µg des affinitätschromatographisch gereinigten, bei DSM unter der Hinterlegungsbezeichnung TPO # 53 hinterlegten Antikörpers, der dem Antikörper mAk 53 (J. Ruf et al, Endo­ crinology 125) entspricht, Proteinkonzentration 1 mg/ml in 20 mM Natriumphosphat, pH 7,4 wurden mit 25 nmol Akridiniu­ mester (Aktivester) umgesetzt. Nach einer Inkubationszeit von 30 min wurde über HPLC an einer WATERS-Shodex WS 803- Säule ungebundenes freies Label von dem markierten Antikör­ per abgetrennt (Flußgeschwindigkeit 1 ml/min, Laufmittel 150 mM Natriumphosphat, pH 7,2).

Der auf diese Weise erhaltene gereinigte Tracer wird auf eine Totalaktivität von 1×10⁸RLU (relative Lichteinheiten) pro ml verdünnt in 50 mM Hepes-Puffer, 1% BSA (Firma MILES), 1 mg/ml Maus-IgG (Fa. SCANTIBODIES), pH 6,5, und in Portio­ nen von 0,5 ml in 10-ml-Braunglasflaschen abgefüllt und anschließend lyophilisert.

Die lyophilisierten Röhrchen wurden dem Kit beigegeben. Vor der Durchführung eines Anti-hTPO-Tests wird der Tracer mit jeweils 5 ml eines Puffers mit folgender Zusammensetzung rekonstituiert: 50 mM Hepes, 100 mM Natriumchlorid, 0,5% Triton X100 (Firma PIERCE), pH 6,5, der ebenfalls Bestand­ teil des Testkits ist.

3. Herstellung der Standards bzw. Kalibratoren

Es können verschiedene Kalibratoren verwendet werden:

• a) Hochreine Thyreoidale Peroxidase, isoliert aus humanen Schilddrüsenmembranen und affinitätschromatographisch gerei­ nigt (vgl. J. Ruf et al, Endocrinology).
• b) Rekombinante humane Thyreoidale Peroxidase (affinitäts­ gereinigt), die bei der Firma WBAG Resources/Zürich erhält­ lich ist, mit einer hTPO-Konzentration von 36,96 µg/ml in einer Pufferlösung von 25 mM Tris-HCl (pH 7,4) mit einem Gehalt von 0,1 M KI.
• c) Crude, aus humaner Schilddrüse isolierte thyreoidale Peroxidase, hergestellt gemäß P 41 20 412 C1, deren Gehalt an a) oder b) kalibriert ist.

Zur Herstellung der Kalibratoren wird hTPO in den entspre­ chenden Konzentrationen als Fünffach-Konzentrat in PBS (phosphatgepufferte Salzlösung) + 1% BSA, 0,6% Triton X100 (Firma PIERCE) verdünnt und in Portionen von je 0,2 ml in 2- ml-Glasflaschen abgefüllt und anschließend lyophilisiert. Für den Gebrauch werden die Kalibratoren in dem Medium auf ein Volumen von 1,0 rekonstituiert, in dem die gewünschte Messung erfolgen soll (z. B. Serum oder Puffer).

Bei der Messung wird so vorgegangen, daß man in die mit dem immobilisierten monoklonalen Antikörper beschichteten Röhr­ chen 200 µl der Standards bzw. der Proben pipettiert, und dann jeweils 100 µl Trace pipettiert. Nach einer Inkuba­ tionszeit von 16 bis 20 Stunden bei Raumtemperatur unter striktem Lichtausschluß aufgrund der Lichtempfindlichkeit des Lumineszenz-Labels werden jedem Röhrchen 1 ml Wasch­ lösung zugesetzt, wonach der Röhrcheninhalt dekantiert wird. Anschließend wird dreimal mit je 1 ml Waschlösung und an­ schließendes jeweiliges Dekantieren gewaschen. Anschließend werden die Röhrchen 5 bis 10 min mit der offenen Seite nach unten auf Löschpapier gestellt, um die Restflüssigkeit aufzusaugen. Anschließend werden alle beschichteten Röhrchen in ein Luminometer zur Messung des Chemilumineszenzsignals gegeben, wobei man die erforderlichen Reagenzien auf bekann­ te Weise, vorzugsweise automatisch, zugibt und die Licht­ ausbeute in einem Zeitraum von 1 s mißt.

Ergebnisse

Unter Verwendung des beschriebenen Reagenziensatzes und des angegebenen Meßprotokolls wurden mit steigenden hTPO-Mengen steigende Mengen des Tracers auf die Röhrchenoberfläche gebunden. Es zeigte sich, daß der resultierende Test eine hohe Meßdynamik aufweist, die über drei Größenordnungen geht (lineares Meßsignal von 0,02 bis über 50 ng TPO/ml).

Der Verlauf der Standardkurve wird, wie nicht anders zu erwarten, von den verwendeten Meßmedien beeinflußt, wobei Fig. 1 die für die Meßmedien Puffer, Medium + 10% FCS, Serum, Speichel, Plasma und Urin erhaltenen Standardkurven wiedergibt.

Ein wesentlicher Vorteil des Designs des vorliegenden Ver­ fahrens für den Anwender besteht darin, daß die Kalibratoren in jedem gewünschten Meßmedium rekonstituiert werden können, so daß eine völlige Freiheit bezüglich der Auswahl der sogenannten Meßmatrix gegeben ist. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren liefern die affinitätsgereinigte native hTPO und affinitätsgereinigte rekombinante hTPO identische Meßergeb­ nisse.

Die Sensitivität (untere Nachweisgrenze des Tests) wurde mit 26 pg hTPO/ml (Mittelwert der RLU-Werte des Nullstandards plus 3fache Standardabweichung in Puffermatrix) ermittelt, ein überraschend guter Wert.

Es ist somit unter Verwendung des geschilderten Tests zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich, hTPO mit hoher Sensitivität, Dynamik und Selektivität in prak­ tisch jedem beliebigen Medium zu bestimmen.

Es ist allerdings darauf hinzuweisen, daß man bei einer Bestimmung in biologischen Flüssigkeiten, z. B. Serum, in denen man mit dem Vorliegen auch von auto-Anti-hTPO-Antikörpern rechnen muß, einen sogenannten Wiederfindeversuch auf das Vorliegen von Autoantikörpern durchführen muß. Ggf. können Antikörper auch in einem dem eigentlichen Meßver­ fahren vorgelagerten Schritt aus einer derartigen Probe entfernt werden. Ferner liegt es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, den beschriebenen Test-Kit so abzuwandeln, daß man die verwendeten Antikörper in umgekehrter Auswahl immo­ bilisiert bzw. markiert und das Verfahren mit einem zwi­ schengeschalteten Waschschritt durchführt, da der monoklona­ le Antikörper 53 zwar hTPO bindet, jedoch mit entsprechenden Autoantikörpern nicht reagiert.

Bei einer Messung von hTPO in Schilddrüsengewebsextrakten ist es ferner anzuraten, im Interesse reproduzierbarer Meßergebnisse die hTPO-Bestimmung in Anwesenheit eines Endoproteaseninhibitors, insbesondere eines Leupeptins, durchzuführen (vgl. nachfolgendes Anwendungsbeispiel).

Anwendungsbeispiel Bestimmung der hTPO-Menge in verschiedenen humanen Schild­ drüsengewebsextrakten Durchführung

Unmittelbar nach der operativen Entfernung der Gewebe werden die Proben auf Trockeneis eingefroren und bis zur weiteren Verwendung bei minus 20°C gelagert. Nach dem Auftauen der Gewebe wird das Material gewogen und mit dem 10fachen Gewicht an PBS-Puffer, der zusätzlich 0,5% Triton X100 und 500 µM Leupeptin enthält, homogenisiert (Ultra-Turras Homo­ genisator, IKA-Werke/Staufen; 5mal bei maximaler Drehzahl je 10 s). Nach einer 30minütigen Inkubation werden die Proben für eine Stunde bei 100 000 g zentrifugiert, und der resul­ tierende Überstand wird auf seinen Proteingehalt und hTPO- Gehalt vermessen. Der resultierende Quotient aus hTPO-Menge und Proteinmenge ist in der Fig. 2 angegeben.

Wie der Fig. 2 zu entnehmen ist, ist der spezifische hTPO- Gehalt unterschiedlicher Schilddrüsengewebe bzw. Operations­ materialien drastischen Veränderungen unterworfen. Schon bei der gezeigten geringen Probenzahl werden die Differenzen im spezifischen Gehalt von bis zu einem Faktor von 8 gefunden.

Ferner ist darauf hinzuweisen, daß es sich überraschender­ weise gezeigt hatte, daß, mit dem erfindungsgemäßen hTPO- Assay gemessen, der hTPO-Gehalt in Schilddrüsenextrakten während einer Lagerung bei 4°C mit der Zeit drastisch an­ steigt. Verantwortlich für diesen Effekt scheint eine Leu­ peptin-sensitive Protease zu sein, da Leupeptin diesen Effekt praktisch vollständig unterdrückt (vgl. Fig. 3), weshalb im Interesse reproduzierbarer Meßergebnisse die Bestimmung der hTPO in Gewebsextrakten in Anwesenheit von Leupeptin erfolgen muß. Interessanterweise hat sich dabei auch noch gezeigt, daß die Geschwindigkeit der hTPO-Zunahme stark von dem individuellen Gewebe abhängig ist (Daten nicht gezeigt).

Claims (11)

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von humaner Thyreoidaler Peroxidase (hTPO) in biologischen Flüssigkei­ ten, Kulturmedien, Gewebsextrakten und hochgereinigte natür­ liche hTPO oder rekombinante hTPO enthaltenden Flüssigkei­ ten, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bestimmung als an sich bekannten Zweiseiten-Bindungstest unter Verwendung eines ersten monoklonalen Antikörpers gegen hTPO und minde­ stens eines weiteren monoklonalen Antikörpers gegen hTPO (mAk₁, mAK₂) durchführt, von denen der erste (mAk₁) hTPO in einem gegen Denaturierung empfindlichen Bereich erkennt, der an der Bindung von auto-Antikörpern gegen hTPO und an der Enzyminhibierung beteiligt ist, während der mindestens eine weitere Antikörper (mAk₂) hTPO in einem Bereich erkennt, dessen Bindungseigenschaften durch Denaturierung von hTPO nicht wesentlich beeinträchtigt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der erste monoklonale Antikörper (mAK₁) in immobilisierter Form an eine Festphase gebunden und im Überschuß gegenüber der in der zu untersuchenden Probe zu erwartenden hTPO Konzentration verwendet wird, und daß der mindestens eine weitere monoklonale Antikörper (mAk₂) markiert ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der mindestens eine weitere monoklonale Antikörper (mAk₂) mit einem Chemiluminszenzlabel, einem Radioisotop, einem Enzym­ label oder einem Fluoreszenzlabel markiert ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Chemilumineszenzlabel ein Akridiniumester ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeich­ net, daß neben dem wenigstens einen markierten monoklonalen Antikörper ein zusätzlicher markierter monoklonaler oder polyklonaler Antikörper gegen hTPO vorhanden ist, der anhand seiner unterschiedlichen Markierung von dem wenigstens einen markierten Antikörper unterscheidbar ist und sich von diesem außerdem auch noch dadurch unterscheidet, daß er hTPO in einem unterschiedlichen Bereich und/oder mit einer unter­ schiedlichen Affinität bindet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der erste monoklonale Antikörper (mAk₁) ein monoklonaler Antikörper ist, der von dem unter der Bezeichnung TPO # 15-4-G2 (DSM ACC2154) hinterlegten Hybridom erzeugt wird, und daß der eine weitere monoklonale Antikörper oder einer der weiteren monoklonalen Antikörper ein monoklonaler Antikörper (mAk₂) ist, der von dem unter der Bezeichnung TPO # 53 (DSM ACC2137) hinterlegten Hybridom erzeugt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß man feststellt, ob die weiteren, unter­ schiedlich markierten Antikörper in ähnlicher Weise oder in stark voneinander abweichender Weise gebunden werden, und daß man daraus Rückschlüsse auf das Vorliegen oder Nichtvor­ liegen einer malignen Erkrankung zieht.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß auf ihren Gehalt an hTPO zu bestimmende humane Gewebsextrakte nach ihrer Gewinnung mit einem Protea­ seninhibitor für Endoproteasen versetzt werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Proteaseinhibitor Leupeptin verwendet wird.

10. Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Festphase mit einem ersten monoklonalen Antikörper gegen hTPO (mAk₁) in lyophilisierter Form, mindestens einen weiteren markierten Antikörper (mAK₂), vorzugsweise ebenfalls in lyophilisierter Form, sowie einen definierte Mengen an hTPO enthaltenden Kalibrator in lyophilisierter Form sowie übliche Puffer, Lösungsmittel und ggf. Reagenzien für den Nachweis des Markierungslabels enthält.

11. Kit nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß er als Kalibrator i) hochgereinigte hTPO aus humanen Schild­ drüsenmembranen, ii) rekombinante hTPO oder iii) crude, aus humanen Schilddrüsen isolierte und gegen i) oder ii) kali­ brierte hTPO enthält.