NO330259B1 - Stabilisert HSA-fritt farmasøytisk preparat omfattende i det vesentlige monomert interferon-ß, fremgangsmåte for fremstilling derav, samt fremgangsmåte for å øke oppløseligheten av interferon-ß i et preparat. - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår generelt farmasøytiske preparater og mer spesielt stabiliserte formuleringer av interferon-[$ som er frie for humanserumalbumin som en tilsatt, farmasøytisk eksipient. Oppfinnelsen angår videre en fremgangsmåte for fremstilling av preparatene samt en fremgangsmåte for å øke oppløseligheten av interferon-p (IFN-P) eller en biologisk aktiv variant derav i et farmasøytiske preparat i fravær av humant serum albumin.

Oppfinnelsens bakgrunn

Interferonene er en familie av glykoproteiner hvis sekresjon fra celler induseres av et antall signaler inkludert viruser, dobbeltkjedede RNA'er, andre polynukleotider, antige-ner og mitogener. Interferoner oppviser diverse biologiske aktiviteter inkludert antivirale, antiproliferative og immunomodulatoriske aktiviteter. Minst tre distinkte typer av humaninterferoner, a, (5 og y, er kjent basert på et antall faktorer inkludert antivirale og antiproliferative aktiviteter.

Interferon-p (IFN-b) er den først identifiserte effektive behandling for de med multippel sklerose (MS) og er påvist å redusere antallet angrep hos pasienter med relapserende og remitterende MS, og sekundær progressiv MS. IFN-p preparater er også brukbare ved behandling av hepatitt B- og -C infeksjoner.

På samme måte som med alle proteinbaserte farmasøytika er et hovedhinder som må overvinnes ved bruk av IFN-p som terapeutisk middel, det tap av farmasøytisk brukbar-het som kan oppstå på grunn av den manglende stabilitet i farmasøytiske formuleringer. Den fysiske mangel på stabilitet som truer polypeptidaktiviteten og effektiviteten for farmasøytiske formuleringer inkluderer denaturering og dannelse av oppløselige og uoppløselige aggregater, mens kjemiske instabiliteter inkluderer hydrolyse, imiddannel-se, oksydasjon, racemisering og deamidering. Noen av disse forandringer er kjent for å føre til tap eller reduksjon av den farmasøytiske aktivitet for proteinet av interesse. I andre tilfeller er de nøyaktige virkninger av disse forandringer ukjent men de resulterende nedbrytningsprodukter anses fremdeles å være farmasøytisk ikke-akseptable på grunn av potensialet for uønskede bivirkninger.

Stabiliseringen av polypeptider i farmasøytiske preparater forblir et område der prøving og feiling spiller en vesentlig rolle (for en oversikt henvises det til Wang (1999) "Int. J. Pharm." 185:129-188; Wang andHanson (1988) "J. Parenteral Sei. Tech." 42:S3-S-26). Eksipienter som settes til farmasøytiske polypeptidformuleringer for å øke deres stabilitet inkluderer buffere, sukkere, surfaktanter, aminosyrer, polyetylenglykoler og polyme-rer, men den stabiliserende virkning for disse kjemiske additiver varierer avhengig av proteinet.

Et av hovedhinderne for fremstilling av farmasøytiske, stabiliserte IFN-P formuleringer har vært en dårlig oppløselighet for IFN-P molekylet. Dagens formuleringer benytter anvendelsen av HSA som et oppløselighetsfremmende middel for IFN-p. Imidlertid har bruken av HSA mangler. HSA er et produkt fra menneskeblod og må derfor høstes fra menneskelige individer. Selv om skritt er tatt for å redusere risikoen bærer bruken av humanblodprodukter som HSA med seg den potensielle innføring av humanviruser som HIV og HCV. Innføringen av HSA i formuleringen interferer også med evnen til på riktig måte å bestemme stabiliteten for IFN-p i formuleringen. Dette fordi HSA og IFN-p begge er proteiner og fordi HSA interfererer med noen av de IFN-p stabilitetsindike-rende analyser.

Videre er IFN-p et protein som viser aggregatdannelse når det fremstilles i farmasøytis-ke preparater og derfor kompromitteres mengden av dette protein i sin monomere biologisk aktive tilstand under lagring av disse preparater. Aggregatdannelse med et polypeptid som IFN-p under lagring av et farmasøytisk preparat kan ugunstig påvirke den biologiske aktivitet for polypeptidet og derved resultere i tap av terapeutisk effektivitet for det farmasøytiske preparat. Videre kan aggregatdannelse forårsake andre problemer som blokkering av rør, membraner eller pumper når det farmasøytiske IFN-P preparat administreres ved bruk av et infusjonssystem. I tillegg har injeksjon av et farmasøytisk preparat som omfatter den aggregerte form av et protein et potensiale for å generere en immunogen reaksjon til det aggregerte protein.

US 5,004,605 A beskriver farmasøytiske preparater omfattende interferon-p, fortrinnsvis rekombinant humant interferon-p, og en buffer valgt fra fosforsyre, glycin og sitron-syre ved en konsentrasjon på 1 til 50 med mer. Denne publikasjonen gir imidlertid ingen indikasjoner på at ionestyrken for formuleringen er av avgjørende betydning.

Som en konsekvens foreligger det et behov for ytterligere farmasøytiske IFN-p preparater som omfatter fysiologisk kompatible stabilisatorer som forbedrer oppløseligheten for dette protein og stabiliserer proteinet mot aggregatdannelse og derved øker den farma-søytiske anvendelighet.

Oppsummering av oppfinnelsen

Preparater omfattende interferon-[$ (IFN-P) som terapeutisk aktiv komponent og metoder som er brukbare ved deres fremstilling tilveiebringes ved hjelp av foreliggende oppfinnelse. Preparatene er stabiliserte, farmasøytiske preparater som er frie for humanserumalbumin (HSA) som farmasøytisk eksipient og som omfatter i det vesentlige monomer IFN-p, oppløseliggjort i en formulering av lav ionestyrke.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig et stabilisert, HSA-fritt, farmasøytisk preparat som omfatter et i det vesentlig monomert interferon-P (IFN-P) eller en biologisk aktiv variant derav, oppløseliggjort i en formulering med lav ionestyrke, der formuleringen med lav ionestyrke er en oppløsning som omfatter en buffer i en mengde som er tilstrekkelig til å holde pH-verdien i preparatet innen ± 0,5 enheter av en spesifisert pH-verdi, der denne er rundt 3,0 til rundt 5,0, hvorved formuleringen har en ionestyrke som ikke er større enn rundt 20mM.

Et ikke-ioniske tonisitetsmiddel kan innarbeides i det farmasøytiske preparat for å gjøre preparatet isotonisk der dette tonisitetsmiddel er et karbohydrat.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre en fremgangsmåte for å øke oppløseligheten for interferon-P (INF-P) eller en biologisk aktiv variant derav i et farmasøytisk preparat i fravær av humant serum albumin, som omfatter å fremstille preparatet med en formulering av lav ionestyrke, der formuleringen av lav ionestyrke er en oppløsning som omfatter en buffer i en mengde tilstrekkelig til å holde pH-verdien i preparatet til rundt ± 0,5 enheter av en spesifisert pH-verdi der den spesifiserte pH-verdien er rundt 3,0 til rundt 5,0, hvor formuleringen har en ionestyrke som ikke er større enn rundt 20mM, og å innarbeide

nevnte IFN-P eller den biologisk aktive variant derav i nevnte preparat.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for fremstilling av et HSA-fritt, farmasøytisk preparat omfattende i det vesentlige monomert interferon-P (IFN-P), som omfatter å fremstille preparatet med en formulering av lav ionestyrke der formuleringen av lav ionestyrke er en oppløsning som omfatter en buffer i en mengde tilstrekkelig til å opprettholde pH-verdien i preparatet til innen ± 0,5 enheter av en spesifisert pH-verdi der denne er rundt 3,0 til rundt 5,0, idet formuleringen har en ionestyrke ikke større enn rundt 20mM, og å innarbeide nevnte IFN-P eller den biologisk aktive variant derav i preparatet.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere under henvisning til de vedlagte figurer der:

Figur 1 viser IFN-P-lb oppløseligheten i natriurnkloridoppLøsninger.

Figur 2 viser IFN-P-lb oppløseligheten i formuleringer av lav ionestyrke.

Figur 3 viser effekten av pH 3,0 på IFN-p-lb aggregattilstanden.

Figur 4 viser effekten av pH 4,0 på IFN-P-lb aggregattilstanden.

Figur 5 viser effekten av pH 5,0 på IFN-P-lb aggregattilstanden.

Figur 6 viser effekten av ionestyrken (0 mM NaCl) på IFN-P-lb aggregattilstanden. Figur 7 viser effekten av ionestyrken (50 mM NaCl) på IFN-p-lb aggregattilstanden. Figur 8 viser effekten av ionestyrken (150 mM NaCl) på IFN-P-lb aggregattilstanden. Figur 9 viser aggregattilstanden for IFN-p-lb i en pH 3,0 formulering inneholdende kun 5 mM glycinbuffermidlet. Figur 10 viser effekten av et ikke-ionisk tonisitetsmiddel (9 % sukrose) på aggregattilstanden for IFN-p-lb i formuleringen som vist i figur 9. Figur 11 viser effekten av et ikke-ionisk tonisitetsmiddel (9 % trehalose) på aggregattilstanden for IFN-^-lb i formuleringen som vist i figur 9. Figur 12 viser prosentandel innledende IFN-p-lb konsentrasjon i lyofiliserte formuleringer inneholdende 9 % trehalose eller 9 % sukrose etter 8 ukers lagring ved 40 °C. Konsentrasjonen ble bestemt ved UV-absorpsjon. Figur 13 viser prosent av hovedtopp IFN-p-lb i lyofiliserte formuleringer inneholdende 9 % trehalose eller 9 % sukrose etter 8 ukers lagring ved 40 °C. Prosentandel av hovedtoppen ble bestemt ved RP-HPLC analyse. Figur 14 viser prosentandel av initial IFN-P-lb konsentrasjon i lyofiliserte formuleringer inneholdende 9 % trehalose etter 9 måneders lagring ved 5 °C eller 30 °C. Konsentrasjonen ble bestemt ved UV spektroskopi. Figur 15 viser prosentandel av hovedtopp IFN-p-lb i lyofiliserte formuleringer inneholdende 9 % trehalose etter 9 måneders lagring ved 5 °C eller 30 °C. Prosent hovedtopp ble bestemt ved RP-HPLC analyse. Figur 16 viser prosentandel initial IFN-p-lb konsentrasjon i flytende formuleringer inneholdende 9 % trehalose eller 9 % sukrose etter 9 ukers lagring ved 30 °C. Konsentrasjonen ble bestemt ved UV absorbans. Figur 17 viser prosentandel av hovedtopp IFN-p-lb i flytende formuleringer inneholdende 9 % trehalose eller 9 % sukrose etter 8 ukers lagring ved 30 °C. Prosent hovedtopp ble bestemt ved RP-HPLC analyse. Figur 18 viser prosentandel av initial IFN-p-lb konsentrasjon i flytende formuleringer inneholdende 9 % trehalose eller 9 % sukrose etter 9 måneders lagring i ampuller ved 5 °C. Konsentrasjonen ble bestemt ved UV spektroskopi. Figur 19 viser prosentandel hovedtopp IFN-P-lb i flytende formuleringer inneholdende 9 % trehalose eller 9 % sukrose etter 9 måneders lagring i ampuller ved 5 °C. Prosent hovedtopp ble bestemt ved RP-HPLC analyse. Figur 20 viser prosentandel av initial IFN-P-lb konsentrasjon i flytende formuleringer inneholdende 9 % trehalose eller 9 % sukrose etter 9 ukers lagring ved 30 °C. Konsentrasjonen ble bestemt ved UV spektroskopi. Figur 21 viser prosentandel av initial IFN-p-lb konsentrasjon i lyofiliserte formuleringer inneholdende 9 % trehalose eller 9 % sukrose etter 8 ukers lagring ved 40 °C. Konsentrasjonen ble bestemt ved UV spektoskopi. Figur 22 viser prosentandel av initial IFN-P-lb konsentrasjon i flytende formuleringer inneholdende 5 % mannitol ved 6 måneders lagring ved 5 °C. Konsentrasjonen ble bestemt ved UV spektroskopi. Figur 23 viser prosentandel av hovedtopp IFN-P-lb i flytende formuleringer inneholdende 5 % mannitol med 6 måneders lagring ved 5 °C. Prosentandel av hovedtopp ble bestemt ved RP-HPLC.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot stabiliserte, farmasøytiske preparater som omfatter interferon-p (IFN-p) og metoder for deres fremstilling. Disse preparater fremstilles i fravær av humant serum albumin (HSA) og er således frie for denne farmasøytiske eksipient. Slike preparater kalles heretter "HSA-frie" farmasøytiske IFN-p preparater. Preparatene omfatter i det vesentlige monomert IFN-p som er oppløseliggjort i en formulering av lav ionestyrke. Med "lav ionestyrke" formulering menes en oppløsning som omfatter en buffer i en mengde som er tilstrekkelig til å holde pH-verdien for det farma-søytiske preparat innen ± 0,5 enheter av en spesifisert pH-verdi og som har en ionestyrke som ikke er større enn rundt 20 mM. Med "ionestyrke" menes den standard kjemiske definisjon slik den anvendes på en oppløsning der ionestyrken i en oppløsning er lik en halv £Cjzi<2>der c er konsentrasjonen og z er ladningen. Bufferen er til stede i formuleringen av lav ionestyrke ved en konsentrasjon rundt 1 mM til rundt 30 mM, helst rundt 2 mM til rundt 25 mM, mer foretrukket rundt 2 mM til rundt 20 mM, helst rundt 2 mM til rundt 10 mM og aller helst rundt 2 mM til rundt 5 mM. I enkelte utførelsesformer omfatter således formuleringen av lav ionestyrke en buffer i en konsentrasjon på rundt 2 mM til rundt 10 mM, rundt 2 mM til rundt 7 mM, rundt 2 mM til rundt 5 mM, rundt 2 mM, rundt 3 mM, rundt 4 mM eller rundt 5 mM. Egnede buffere som kan benyttes for å fremstille formuleringen av lav ionestyrke der IFN-p er oppløseliggjort inkluderer glycin, aspartinsyre, natriumsuksinat, -citrat, -format, -acetat-, glutaminsyre, histidin, imidazol og fosfat, fortrinnsvis glycin, aspartinsyre og natriumsuksinat og aller helst glycin og aspartinsyre.

Formuleringen av lav ionestyrke har en ionestyrke som ikke er større enn rundt 20 mM. I enkelte utførelsesformer blir formuleringens ionestyrke kun bestemt av bufferkonsentrasjonen og således har formuleringen ikke ytterligere ionespesies, som natriumklorid, kaliumklorid, magnesiumklorid, ammoniumsalt eller lignende, som kan bidra til ionestyrken.

Bruken av en formulering av lav ionestyrke som er en oppløsning omfattende en buffer i en konsentrasjon av rundt 1 mM til rundt 30 mM, fortrinnsvis rundt 2mM til rundt 5 mM, muliggjør fremstilling av stabiliserte, farmasøytiske IFN-p preparater men med en pH-verdi fra rundt 3,0 til rundt 5,0, fortrinnsvis rundt 3,0 til rundt 4, 5, helst rundt 3,0 til rundt 4,0, aller helst rundt 3,5 til rundt 4,0 og spesielt rundt 4,0, avhengig av den spesi-elle, benyttede buffer. Når således bufferen er glycin, er pH-verdien i preparatet rundt 3,0 til rundt 3,5, fortrinnsvis rundt 3,0. Når bufferen er aspartinsyre, er pH-verdien i preparatet rundt 3,5 til rundt 4,5 og fortrinnsvis rundt 4,0. Når bufferen er natriumsuksinat er pH-verdien i preparatet rundt 4,5 til rundt 5,0 og fortrinnsvis rundt 5,0.

Ved å holde pH-verdien i de farmasøytiske IFN-p preparater ifølge oppfinnelsen innen området rundt 3,0 til rundt 5,0 er det mulig å øke oppløseligheten for IFN-p i disse preparater ut over det som vanligvis er mulig i fravær av bruken av humant serum albumin. Ved videre å innarbeide IFN-p i en formulering av lav ionestyrke som definert her er det mulig å fremstille farmasøytiske preparater som omfatter i det vesentlige monomert IFN-p. Med "i det vesentlige monomert" menes at hovedandelen av IFN-P på vektbasis som er til stede i preparatet foreligger i monomer form heller enn i aggregert form. Med "aggregert" menes en fysisk interaksjon mellom polypeptidmolekylene som resulterer i dannelsen av multimerer (dimerer, trimerer og så videre) som kan forbli oppløselige eller som kan presipitere ut av oppløsningen. Den monomere form av IFN-p polypeptidet forblir oppløselig og blir derfor sagt å være "oppløseliggjort" i formuleringene av lav ionestyrke eller de farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen. Vektprosentande-len av IFN-p som foreligger i monomer form i de HSA-frie preparater ifølge oppfinnelsen kan variere fra 80 % og oppover. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således HSA-frie, farmasøytiske IFN-p preparater som omfatter minst rundt 80 % av det an gjeldende IFN-p i sin monomere form i motsetning til den aggregerte form, fortrinnsvis minst rundt 85 %, helst rundt 90 % og aller helst rundt 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % eller mer av dette IFN-p i sin monomere form.

I enkelte utførelsesformer av oppfinnelsen omfatter det HSA-fire, farmasøytiske IFN-P preparat videre et ikke-ionisk tonisitetsmiddel i en mengde tilstrekkelig til å gjøre preparatet isotonisk med kroppsfluider. Preparatet kan gjøres isotonisk med et antall ikke-ioniske tonisitetsmodifiserende midler som vanligvis er kjent for fagfolk. Disse er typiske karbohydrater av forskjellig klassifisering (se for eksempel Voet and Voet (1990) "Biochemistry" (John Wiley & Sons, New York). Monosakkarider som er klassifisert som aldoser, som glukose, mannose, arabinose og ribose så vel som de som er klassifisert som ketoser, som fruktose, sorbose og xylulose kan benyttes som ikke-ioniske tonisitetsmidler ved oppfinnelsen. Disakkarider, som sukrose, maltose, trehalose og laktose kan også benyttes. I tillegg er alditoler (acykliske polyhydroksyalkoholer) som glycerol, mannitol, xylitol og sorbitol, ikke-ioniske tonisitetsmidler som kan benyttes ifølge oppfinnelsen. De mest foretrukne ikke-ioniske tonisitetsmidler er trehalose, sukrose og mannitol, eller en kombinasjon av disse. Det ikke-ioniske tonisitetsmiddel settes til i en mengde som er tilstrekkelig til å gjøre formuleringen isotonisk med kroppsfluider. Innarbeidet i de HSA-frie, farmasøytiske IFN-p preparater er det ikke-ioniske tonisitetsmiddel i stede i en konsentrasjon på rundt 1 til rundt 10 %, avhengig av det benyttede middel. I en utførelsesform er således det ikke-ioniske tonisitetsmiddel trehalose eller sukrose i en konsentrasjon på rundt 8 til rundt 10 % og fortrinnsvis rundt 9 %, be-regnet som vekt per volum, og fortrinnsvis er det trehalose i denne konsentrasjon. I en annen utførelsesform er det ikke-ioniske tonisitetsmiddel mannitol i en konsentrasjon på rundt 4 % til rundt 6 %, fortrinnsvis rundt 5 % på vektbasis per volum. I nok en utførel-sesform er det ikke-ioniske tonisitetsmiddel en kombinasjon av trehalose og mannitol, eller sukrose og mannitol der trehalose og sukrose er til stede i en konsentrasjon på rundt 1 % vekt/volum og mannitolen er til stede i en konsentrasjon av rundt 3 % til rundt 5 % vekt/volum, fortrinnsvis rundt 4,6 % vekt/volum.

De HSA-frie, farmasøytiske IFN-p preparater ifølge oppfinnelsen omfatter flytende blandinger og tørkede former derav. For oppfinnelsens formål skal uttrykket "flytende" eller "væske", når det gjelder farmasøytiske preparater eller formuleringer, være ment å inkludere uttrykket "vandig" og inkluderer flytende formuleringer som er frosset. Med "tørket form" menes at det flytende, farmasøytiske preparat eller den angjeldende formulering er tørket, enten ved frysetørking (det vi si lyofilisering, se for eksempel Willi-am and Polli (1984) "J. Parenteral Sei. Technol." 38:48-59), spraytørking (se Masters

(1991) i "Spray-Drying Handbook" (5. utg., Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), s. 491-676; Broadhead et al. (1992) "Drug Devel. Ind. Pharm." 18: 1169-1206; og Mementhaler et al. (1994) "Pharm. Res." 11: 12-20), eller lufttørking (Carpenter and Crowe (1988) "Cryobiology" 25:459-470; og Roser (1991) "Biopharm." 4:47-53). Uttrykket "lyofilisere" i forbindelse med farmasøytiske IFN-P formuleringer er ment å henvise til hurtigfrysetørking under redusert trykk av et antall ampuller der hver inneholder en enhetsdose av interferonformuleringen ifølge oppfinnelsen. Lyofiliseringsinn-retninger, som gir den ovenfor angitte lyofilisering, er kommersielt tilgjengelige og kan lett brukes av fagmannen på området. I en utførelsesform ifølge oppfinnelsen fremstilles det flytende preparat som et lyofilisert preparat.

I andre utførelsesformer av oppfinnelsen kan de HSA-frie, farmasøytiske IFN-p preparater ifølge oppfinnelsen fremstilles i en form som er egnet for pulmonær avlevering og administrering av preparatet til individet via pulmonær inhalering. Med "pulmonær inhalering" menes at det farmasøytiske preparat direkte administreres til lungen ved avlevering av preparatet i en aerosol eller et annet egnet preparat fira en avleveringsinnretning i oralkaviteten hos individet når dette inhalerer gjennom oralkaviteten. Med "aerosol" menes en suspensjon av faste eller flytende partikler i strømmende luft eller en annen fysiologisk akseptabel gasstrøm. Andre egnede preparater inkluderer damp eller spraypreparater, så lenge partiklene omfattende proteinpreparatet avgis i et størrel-sesområde konsistent med det som er beskrevet for en tørrpulverform av det farmasøy-tiske preparat som definert nedenfor. Pulmonærinhalering kan også oppnås ved andre egnede metoder som velkjente for fagmannen. Disse kan inkludere væskeinstillering ved bruk av en egnet innretning eller andre slike metoder. Pulmonærinhalering resulterer i avsetning av det inhalerte proteinpreparat i alveolene i individets lunger. Når de først er avsatt kan proteinet absorberes, passivt eller aktivt, gjennom alveolepitel- og kapillærepitelsjiktene inn i blodstrømmen for etterfølgende systemisk fordeling.

Pulmonæradministrering av et polypeptid eller protein som IFN-p krever avlevering av den biologisk aktive substans fra en avleveringsinnretning inn i et individs oralkavitet ved inhalering. I forbindelse med oppfinnelsen blir HSA-firie, farmasøytiske preparater omfattende IFN-p eller varianter derav administrert via inhalering av en aerosol eller et annet egnet preparat som oppnås fira en vandig eller ikke-vandig oppløsnings- eller sus-pensjonsform, eller et fast eller tørt pulver av det farmasøytiske preparat, avhengig av den benyttede avleveringsinnretning. Slike avleveringsinnretninger er velkjente for fagmannen og inkluderer forstøvere, doserte inhalatorer og tørrpulverinhalatorer, eller en hvilken som helst annen egnet avleveringsmekanisme som tillater avlevering av et farmasøytisk preparat som en vandig eller ikke-vandig oppløsning eller suspensjon eller som et faststoff eller et tørt pulver. Benyttet innenfor konteksten farmasøytisk preparat, egnet for pulmonær avlevering, har disse uttrykk den følgende tilsiktede betydning. Med "vandig" menes et preparat som er tildannet med, inneholdende eller oppløst i vann, inkludert blandinger der vann er den overveiende substans i blandingen. En overveiende substans er til stede i en større mengde enn en annen komponent i blandingen. Med "ikke-vandig" menes et preparat fremstilt med, inneholdende eller oppløst i en substans forskjellig fra vann eller blandinger der vann ikke er den overveiende substans i blandingen. Med "oppløsning" menes et homogent preparat av to eller flere stoffer som kan være faste, flytende, gasser eller hvilke som helst kombinasjoner derav. Med "suspensjon" menes en blanding av stoffer slik at et eller flere uoppløselige stoffer homogent er dispergert i en annen overveiende substans.

For oppfinnelsens formål benyttes uttrykkene "faststoff og "tørrpulver" om hverandre under henvisning til de farmasøytiske, HSA-frie preparater som er egnet for pulmonær avlevering. Med "fast" eller "tørrpulver" form av et farmasøytisk preparat menes at preparatet er tørket til et finoppdelt pulver med et fuktighetsinnhold under 10 vekt-%, vanligvis under rundt 5 vekt-% og helst under rundt 3 vekt-%. Denne tørrpulverform av preparatet består av partikler omfattende IFN-p eller varianter derav. Foretrukne partik-kelstørrelser er mindre enn rundt 10,0 um midlere diameter, helst mindre enn rundt 7,0 um, aller helst mindre enn rundt 6,0 um og spesielt i området 0,1 til 5,0 um, helt spesielt i området rundt 1,0 til rundt 5,0 um midlere diameter.

Således kan et HSA-fritt, flytende farmasøytisk preparat omfattende IFN-P eller varianter derav og som er ment for pulmonær avlevering, enten benyttes som en flytende opp-løsning eller suspensjon i avleveringsinnretningen eller først prosesseres til en tørrpul-verform ved bruk av lyofilisering eller spraytørking som velkjent på området. Der en flytende oppløsning eller suspensjon benyttes i avleveringsinnretningen kan en forstø-ver, en doseringsinhalator eller en annen egnet avleveringsinnretning i en enkelt eller flerfraksjonert dose, ved pulmonær inhalering, avgi en farmasøytisk effektiv mengde av preparatet til individets lunger som dråper med den samme partikkelstørrelse som angitt ovenfor for tørrpulverformen. Med "farmasøytisk effektiv mengde" menes en mengde som er brukbar ved terapi, forebyggelse eller diagnose av en sykdom eller tilstand re-sponsiv til IFN-p. Den flytende oppløsning eller suspensjon av preparatet kan benyttes med fysiologisk egnede stabilisatorer, eksipienter, viskositetsmodifiserere, massegiven-de midler, surfaktanter eller kombinasjoner derav, velkjente for fagmannen, så lengde de ikke kompromitterer egenskapene for de HSA-frie IFN-p preparater ifølge oppfinnelsen.

Der det flytende, farmasøytiske preparat lyofiliseres før bruk i den pulmonære avleveringsinnretning blir det lyofiliserte preparat malt opp for å oppnå det finoppdelte tørr-pulver bestående av partikler innenfor det ønskede størrelsesområdet, som angitt ovenfor. Der spraytørking benyttes for å oppnå en tørrpulverform av det flytende, farmasøy-tiske preparat blir prosessen gjennomført under betingelser som gir et i det vesentlige amorft finoppdelt tørrpulver bestående av partikler innen det ønskede størrelsesområde som definert ovenfor. Hvis tilsvarende det farmasøytiske utgangspreparat allerede foreligger i lyofilisert form kan preparatet males opp for å oppnå tørrpulverformen for etter-følgende preparering som en aerosol eller et annet preparat egnet for pulmonærinhalering. Der det farmasøytiske utgangspreparat foreligger i spraytørket form er preparatet fortrinnsvis preparert slik at det allerede befinner seg i tørrpulverform med den egnede partikkelstørrelse for avgivelse som en vandig eller ikke-vandig oppløsning eller suspensjon eller tørrpulverform i henhold til pulmonæradministrering. For metoder for fremstilling av tørrpulverformer av farmasøytiske preparater kan det for eksempel henvises til WO 96/32149, WO 97/41833, WO 98/29096 samt US 5 976 574, 5 985 248 og 6 001 336.

Den resulterende tørrpulverform av preparatet anbringes så i en egnet avleveringsinnretning for etterfølgende preparering som en aerosol eller et annet egnet preparat som avgis til individet via pulmonærinhalering. Der tørrpulverformen av det farmasøytiske preparat skal prepareres og avgis som en vandig eller ikke-vandig oppløsning eller suspensjon benyttes det en doseringsinhalator eller en annen egnet avleveringsinnretning. En farmasøytisk effektiv mengde av tørrpulverformen av preparatet administreres i en aerosol eller et annet preparat egnet for pulmonærinhalering. Mengden tørrpulverform av preparatet anbrakt i avleveringssystemet er tilstrekkelig til å gi avlevering av en far-masøytisk effektiv mengde av preparatet til individet ved inhalering. Således vil mengden av tørrpulverformen som anbringes i avleveringsinnretningen kompensere for muli-ge tap til innretningen under lagring og avlevering av tørrpulverformen av preparatet. Etter anbringelsen av tørrpulverformen i en avleveringsinnretning blir de riktig dimen-sjonerte partikler som angitt ovenfor suspendert i et aerosoldrivmiddel. Den trykksatte, ikke-vandige suspensjon frigis så fra avleveringsinnretningen til individets luftveier under inhalering. Avleveringsinnretningen avgir i en enkelt eller i en flerdoseform, ved pulmonærinhalering, en farmasøytisk effektiv mengde av preparatet til individets lunger. Aerosoldrivmidler kan være et hvilket som helst materiale som benyttes for dette formål som et klorfluorkarbon, et hydroklorfluorkarbon, et hydrofluorkarbon eller et hydrokarbon inkludert triklorfluormetan, diklordifluormetan, diklortetrafluormetan, diklordifluormetan, diklortetrafluoretanol og 1,1,1,2-tetra-fluoretan eller kombinasjoner derav. En surfaktant kan settes til det farmasøytiske preparat for å redusere adhesjonen av det proteinholdige tørrpulver til veggene av avleveringsinnretningen hvorfra aeroso-len avgis. Egnede surfaktanter for denne tilsiktede bruk omfatter sorbitantrioleat, soya-lecitin eller oleinsyre. Innretninger egnet for pulmonæravlevering av en tørrpulverform av et proteinpreparat som ikke-vandig suspensjon er kommersielt tilgjengelige. Eksempler på slike innretninger inkluderer Ventolin doseringsinhalatoren (Glaxo Inc., Research Triangle Parak, NC) og Intal Inhaler (Fisons, Corp., Bedford, MA). Det skal også henvises til de aerosolavleveringsinnretninger som er beskrevet i US 5 522 378, 5 775 320, 5 934 272 og 5 960 792.

Der den faste form eller tørrpulverformen av det farmasøytiske, HSA-frie IFN-p preparat skal avgis som en tørrpulverform, benyttes det fortrinnsvis en tørrpulverinhalator eller en annen egnet avleveringsinnretning. Tørrpulverformen av det farmasøytiske preparat prepareres fortrinnsvis som en tørrpulveraerosol ved dispergering i strømmende luft eller en annen fysiologisk akseptabel gasstrøm på konvensjonell måte. Eksempler på kommersielt tilgjengelige tørrpulverinhalatorer som er egnet for anvendelse ifølge de her beskrevne metoder er Spinhaler pulverinhalatoren (Fisons Corp., Bedford, MA) og Ventolin Rotahaler (Glaxo, Inc., Research Triangle Park, NC). Det skal også henvises til de tørrpulveravleveirngsinnretninger som er beskrevet i WO 93/00951, WO 96/09085, WO 96/32152 samt i US 5 458 135, 5 785 049 og 5 993 783.

Tørrpulverformen av det farmasøytiske HSA-frie preparat omfattende IFN-p eller en biologisk aktiv variant derav kan rekonstitueres til en vandig oppløsning for etterføl-gende avlevering som en vandig oppløsningsaerosol ved bruk av en forstøver, en doseringsinhalator eller en annen egnet avleveringsinnretning. Når det gjelder en forstøver blir den vandige oppløsning holdt i et fluidreservoar og konvertert til en vandig spray, kun en liten del av denne forlater forstøveren for avlevering til et individ på et hvilket som helst gitt tidspunkt. Den gjenværende spray renner tilbake i fluidreservoaret i for-støveren der den forstøves igjen til en vandig spray. Denne prosess gjentas inntil fluidreservoaret er avgitt i sin helhet eller inntil administreringen av den aerosoliserte spray avsluttes. Slike forstøvere er kommersielt tilgjengelige og inkluderer for eksempel Ul-travent forstøveren (Mallinckrodt Inc., St. Louis, MO) og Acorn II forstøveren (Mar-quest Medical Products, Englewood, CO). Det skal også henvises til de forstøvere som er beskrevet i WO 93/00951 og den innretning for avlevering av aerosoliserte vandige formuleringer som er beskrevet i US 5 544 646.

De farmasøytiske, HSA-frie IFN-fJ preparater ifølge oppfinnelsen er "stabiliserte" formuleringer. Med "stabilisert" menes at preparatene bibeholder IFN-p polypeptidet i det vesentlige i sin monomere tilstand under lagring og derfor blir den terapeutiske effektivitet for dette polypeptid ikke kompromittert på grunn av aggregatdannelse. Med "under lagring" menes et flytende, farmasøytisk preparat eller en formulering i preparert tilstand, men som ikke umiddelbart er administrert til et individ. I stedet blir det, etter preparering, pakket for lagring, enten i flytende form, i frosset tilstand eller i en tørket form for senere rekonstituering til flytende form eller en annen form som er egnet for administrering til et individ. Denne stabilitet oppnås i fravær av bruken av HSA som stabili-serings- og oppløseliggjørende middel. Fortrinnsvis blir preparatene ifølge oppfinnelsen lagret direkte i sin flytende form for å trekke full fordel av det hensiktsmessige med å oppnå lagringsstabilitet i flytende form, lett administrering uten rekonstituering og mu-ligheten til å supplere formulering i på forhånd oppfylte sprøyter ferdig for bruk eller som multidosepreparater hvis formuleringen er kompatibel med bakeriostatiske midler. De stabiliserte, HSA-frie IFN-p preparater ifølge oppfinnelsen har fortrinnsvis en holdbarhet på minst 6 måneder, 12 måneder, 18 måneder og helst minst 20 måneder, aller helst rundt 22 måneder og helt spesielt minst rundt 24 måneder ved lagring ved 2-8 °C.

Metoder for overvåkning av stabiliteten av farmasøytiske, HSA-frie IFN-p preparater ifølge oppfinnelsen er tilgjengelige i teknikken og inkluderer de metoder som er beskrevet for eksempel i eksemplene her. Således kan IFN-p aggregatdannelse under lagring av et flytende, farmasøytisk preparat ifølge oppfinnelsen lett bestemmes ved å måle forandringen i oppløselig IFN-p i oppløsningen med tiden. Mengden av oppløselig polypeptid i oppløsning kan kvantifiseres ved et antall analytiske analyser som er tilpasset detektering av IFN-p. Slike analyser inkluderer for eksempel revers fase (RP)-HPLC og UV absorbsjonsspektoskopi som beskrevet i eksemplene nedenfor. Bestemmelse av både oppløselige og uoppløselige aggregater under lagring i flytende formulering kan for eksempel oppnås ved bruk av analytisk ultrasentrifugering som angitt i eksemplene, for å adskille mellom den del av det oppløselige polypeptid som er til stede som opplø-selige aggregater og den del som er til stede i ikke-aggregert, biologisk aktiv, molekylær form.

De stabiliserte, farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen omfatter IFN-p og varianter derav. Uttrykket "IFN-p" slik det her benyttes henviser til IFN-p eller varianter derav, noen ganger kalt IFN-P lignende polypeptider. Humane IFN-P varianter som kan være naturlig forekommende (for eksempel alleliske varianter som opptrer på IFN-P lokus) eller er produsert rekombinant, har aminosyresekvenser som er de samme som, tilsvarende eller i det vesentlige tilsvarende, den mature, native IFN-p-sekvens. Fragmenter av IFN-P eller trunkerte former av IFN-P som bibeholder sin aktivitet, er også omfattet. Disse biologiske aktive fragmenter eller trunkerte former av IFN-p genereres ved å fjerne aminosyrerester fra full-lengde IFN-p aminosyresekvensen ved bruk av rekombinante DNA teknikker som velkjent for fagmannen. IFN-p polypeptider kan glykosyleres eller avglykosyleres idet det er rapportert i litteraturen at både den glykosylerte og ikke-glykosylerte IFN-p viser kvalitativt tilsvarende spesifikke aktiviteter og derfor er glykosyldelen ikke involvert i, og bidrar ikke til, den biologiske aktivitet hos IFN-p.

IFN-P variantene som omfattes av oppfinnelsen inkluderer muteiner av den mature, native IFN-P sekvens der en eller flere cysteinrester som ikke er vesentlige for den biologiske aktivitet, tilsiktet er deletert eller erstattet med andre aminosyrer for å eliminere seter for enten intermolekylær tverrbinding eller ukorrekt intramolekylær disulfidbin-dingsdannelse. IFN-P varianter av denne type inkluderer de som inneholder et glycin, valin, alanin, leucin, isoleucin, tyrosin, fenylalanin, histidin, tryptofan, serin, treonin eller metionin i stedet for cysteinet som finnes ved aminosyre 17 av den mature, native aminosyresekvens. Serin og treonin er de mest foretrukne erstatninger på grunn av den kjemiske analogi til cystein. Serinsubstitusjoner er mest foretrukket. I en utførelsesform er cysteinet som finnes ved aminosyre 17 i den mature, native sekvens erstattet med serin. Cystein 17 kan også deleteres ved bruk av i og for seg kjente metoder, se for eksempel US 4 588 584, noe som resulterer i et maturt IFN-p mutein som er en aminosyre kortere enn den mature native IFN-p. Som eksempler kan det også henvises til US 4 530 787,4 572 798 og 4 588 585. Således er IFN-p varianter med en eller flere mutasjoner som for eksempel forbedrer deres farmasøytiske anvendelighet, også omfattet av oppfinnelsen.

Fagmannen på området vil erkjenne at ytterligere forandringer kan innføres ved muta-sjon i nukleotidsekvensen som koder IFN-p for derved å føre til forandringer i IFN-p aminosyresekvensen, uten å endre den biologiske aktivitet for interferonet. Således kan et isolert nukleinsyremolekyl som koder en IFN-p variant med en sekvens som skiller seg fra aminosyresekvensen for det mature, native IFN-p, skapes ved å innføre en eller flere nukleotidsubstitusjoner, -addisjoner, eller -delesjoner i den tilsvarende nukleotidsekvens som beskrevet her, slik at en eller flere aminosyresubstitusjoner, -addisjoner eller -delesjoner innføres i det kodede IFN-p. Mutasjoner kan innføres ved standard teknikker som seterettete mutagenese og PCR-mediert mutagenese. Slike IFN-fJ varianter kan også være tilstede i preparatet ifølge oppfinnelsen.

For eksempel kan konservative aminosyresubstitusjoner foretas ved en eller flere pre-dikterte, fortrinnsvis ikke-essensielle aminosyrerester. En "ikke-essensiell" aminosyrerest er en rest som kan endres fra villtypesekvensen av IFN-P uten å endre den biologiske aktivitet, mens en "essensiell" aminosyrerest kreves for biologisk aktivitet. En "kon-servativ aminosyresubstitusjon" er en der aminosyreresten erstattes med en aminosyrerest som har en tilsvarende sidekjede. Familier av aminosyrerester med tilsvarende sidekjeder er definert i teknikken. Disse familier inkluderer aminosyrer med basiske sidekjeder (for eksempel lysin, arginin eller histidin), sure sidekjeder (for eksempel aspar-tin- eller glutaminsyre), ikke-ladede, polare sidekjeder (som glycin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tyrosin eller cystein), ikke-polare sidekjeder (for eksempel alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, metionin eller tryptofan), ^-forgrenede sidekjeder (for eksempel treonin, valin eller isoleucin) og aromatiske sidekjeder (for eksempel tyrosin, fenylalanin, tryptofan eller histidin). Slike substitusjoner vil ikke foretas for be-varte aminosyrerester eller for aminosyrerester som befinner seg i en bevart del.

Alternativt kan variant IFN-p nukleotidsekvenser tildannes ved å innføre mutasjoner vilkårlig langs hele, eller en del av, en IFN-p kodende sekvens som ved metningsmuta-genese, og de resulterende mutanter kan avsøkes med henblikk på biologisk IFN-P aktivitet for å identifisere mutantene som bibeholder aktiviteten. Etter mutagenese kan det kodede protein uttrykkes rekombinant og proteinets aktivitet kan bestemmes ved bruk av standard analyseteknikker som beskrevet her.

Biologisk aktive varianter av IFN-p vil generelt ha minst 80 %, fortrinnsvis rundt 90 % til rundt 95 % eller mer og aller helst rundt 96 % til rundt 99 % eller mer aminosyresekvensidentitet til aminosyresekvensen av maturt, nativt IFN-p, som tjener som sammen-ligningsgrunnlag. Med "sekvensidentitet" menes at de samme aminosyrerester finnes i variantpolypeptidet og i polypeptidmolekylet som tjener som referanse når et spesifisert segment av aminosyresekvensen i varianten innrettes og sammenlignes med aminosyresekvensen i referansemolekylet.

I den hensikt å oppnå optimal innretning av de to sekvenser for bestemmelse av sekvensidentitet, kan det etterfølgende segment av aminosyresekvensen i varianten ha ytterligere aminosyrerester eller deleterte aminosyrerester i forhold til aminosyresekvensen i referansemolekylet. Det påfølgende segment som benyttes for sammenligning med referanseaminosyresekvensen vil omfatte minst 20 på hverandre følgene aminosyrerester. Korreksjoner for øket sekvensidentitet assosiert med inklusjon av gap i variantens aminosyresekvens kan foretas ved å legge inn gapkompensasjon. Metoder for sekvens-innretning er velkjent i teknikken.

Således kan bestemmelsen av den prosentvise identitet mellom hvilke som helst to sekvenser gjennomføres ved bruk av en matematisk algoritme. Et foretrukket eksempel på en matematisk algoritme som benyttes for sammenligning av sekvenser er algoritmen ifølge Myers and Miller (1988) "Comput. Appl. Biosci." 4:11-7. Slike algoritmer benyttes i ALIGN programmet (versjon 2,0), som er en del av GCG innretningsprogrampak-ken. En PAM120 vektresttabell, en gaplengdestraff på 12 og en gapstraff på 4 kan benyttes med ALIGN programmet når man sammenligner aminosyresekvenser. Et annet eksempel på en matematisk algoritme for bruk ved sammenligning av to sekvenser er algoritmen ifølge Karlin og Altschul (1990) "Proe. Nat. Acad. Sei. USA" 90:5873-5877, modifisert som i Karlin og Altschul (1993) "Proe. Nat. Acad. Sei. USA" 90:5873-5877. En slik algoritme er innarbeidet i NBLAST- og XBLAST programmene til Altschul et al. (1990) "J. Mol. Biol." 215:403-410. BLAST aminosyresekvenssøk kan gjennomføres med XBLAST programmet, bedømmelse = 50, ordlengde = 3, for å oppnå aminosyresekvenser tilsvarende polypeptidet av interesse. For å oppnå "gapped" innretninger for sammenligningsformålene kan gapped BLAST benyttes som beskrevet av Altschul et al. (1997) "Nucleic Acids Res." 25:3389-3402. Alternativt kan PSI-BLAST benyttes for å gjennomføre et integrert søk som detekterer fjerne sammenhenger mellom molekyler, se til dette Altshcul et al. (1997) supra. Når man benytter BLAST-, gapped BLAST-, eller PSI-BLAST programmer kan default parametrene brukes, se http:// www. ncbi. nlm. nih. gov. Det skal videre henvises til ALIGN programmet (Dayhoff

(1978) i "Atlas of Protein Sequence and Structure" 5:Suppl. 3, "National Biomedical

Research Foundation", Washington, D.C.) og programmer i "Wisconsin Sequence Analysis Package", versjon 8 (tilgjengelig fra Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin), for eksempel GAP programmet der default parametrene for programmene benyttes.

Når man tar i betraktning prosentandelen aminosyresekvensidentitet kan visse aminosy-rerestposisjoner være forskjellige som et resultat av konservative aminosyresubstitusjoner som ikke påvirker egenskapene for proteinfunksjonen. I disse tilfellene kan prosent dual sekvens identitet justeres oppover for å ta hensyn til likhetene i konservativt substi-tuerte aminosyrer. Slike justeringer er velkjente i teknikken og det henvises for eksempel til Myers and Miller (1988) "Comput. Appl. Biosci." 4:11-17.

Biologisk aktive IFN-P varianter som kan anvendes i forbindelse med oppfinnelsen inkluderer også IFN-p polypeptider som har vært kovalent bundet med for eksempel polyetylenglykol (PEG) eller albumin. Disse kovalente hybrid IFN-P molekyler har visse

ønskelige farmasøytiske egenskaper som forlenget serumhalveringstid etter administrering til en pasient. Metoder for å skape PEG-IFN addukter involverer kjemisk modifise-ring av monometoksypolyetylenglykol for å skape en aktivert forbindelse som vil reagere med IFN-p. Metoder for fremstilling og bruk av PEG-forbundne polypeptider er for eksempel beskrevet av Delgado et al. (1992) i "Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst." 9:249-304. Metoder for å tildanne albuminfusjonspolypeptider involverer fusjon av de kodende sekvenser for polypeptidet av interesse, (for eksempel IFN-p) og albumin, og er beskrevet i US 5 876 969.

Biologisk aktive varianter av IFN-P som omfattes kan anvendes i forbindelse med oppfinnelsen skal bibeholde IFN-p aktiviteter, særlig for å muliggjøre binding til IFN-p reseptorer. I enkelte utførelsesformer bibeholder IFN-p varianten minst rundt 25 %, rundt 50 %, rundt 75 %, rundt 85 %, rundt 90 %, rundt 95 %, rundt 98 %, rundt 99 % eller mer av den biologiske aktivitet for polypeptidene hvis aminosyresekvens er gitt i figurene 1 og 2. IFN-p varianter hvis aktivitet er øket sammenlignet med aktiviteten for polypeptidene som vist i figurene 1 og 2, er også omfattet. Den biologiske aktivitet for IFN-P variantene kan måles på en hvilken som helst i og for seg kjent måte. Eksempler på slike analyser kan finnes hos Fellous et al. (1982) "Proe. Nati. Acad. Sei. USA" 79:3082-3086; Czerniecki et al. (1984) "J. Virol." 49(2):490-496; Mark et al. (1984) "Proe. Nati. Acad. Sei. USA" 81:5662-5666; Branca et al. (1981) "Nature" 277:221-223; Williams et al. (1979) "Nature" 282:582-586; Herberman et al. (1979) "Nature" 277:221-223; Anderson et al. (1982) "J. Biol. Chem." 257(19):11301-11304; og de IFN-p potensanalyser som er beskrevet her (se eksempel 2).

IFN-p i formluleringene ifølge oppfinnelsen kan stamme fra hvilke som helst animalske spesies inkludert fugler, hundedyr, hornkveg, griser, hester og mennesker. Fortrinnsvis stammer IFN-p fra en pattedyrspesies når formuleringen skal benyttes ved behandling av en pattedyr IFN-p lidelse og aller helst er den fra et pattedyr av samme spesiet som pattedyr som undergår behandling for en slik lidelse. Når således pattedyret som blir behandlet er et menneske blir individet fortrinnsvis gitt et farmasøytisk, HSA-fritt pre parat som i det vesentlige omfatter monomert humant IFN-p eller biologisk aktive varianter derav.

Eksempler på IFN-P polypeptider og IFN-P variantpolypeptider som kan anvendes i forbindelse med oppfinnelsen er angitt hos Nagata et al. (1980) "Nature" 284:316-320; Goeddel et al. (1980) "Nature" 287:411-416; Yelverton et al. (1981) "Nucleic Acids Res." 9:731-741; Streuli et al. (1981) "Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A." 78:2848-2852; EP028033B1 og EP109748B1. Se også US 4 518 584, 4 569 908, 4 588 585, 4 738 844, 4 753 795,4 769 233, 4 793 995,4 914 033,4 959 314, 5 545 723 og 5 814 485. Disse henvisninger gir også rettledning når det gjelder rester og områder av IFN-p polypeptidet som kan endres uten tap av biologisk aktivitet.

I en utførelsesform av oppfinnelsen er det angjeldende IFN-P i de stabiliserte, farmasøy-tiske formuleringer det mature, native IFN-p polypeptid. I en annen utførelsesform er det angjeldende IFN-p i disse formuleringer det mature IFN-p polypeptid der cysteinet som finnes ved aminosyre 17 i den mature native sekvens er erstattet med seriner som diskutert ovenfor. Imidlertid omfatter oppfinnelsen også andre utførelsesformer der det angjeldende IFN-p i de stabiliserte, farmasøytiske formuleringer er et hvilket som helst biologisk aktivt IFN-p polypeptid eller en variant som beskrevet annensteds her.

I enkelte utførelsesformer av oppfinnelsen blir IFN-p fremstilt rekombinant. Med "rekombinant fremstilt IFN-P" menes IFN-p som har en biologisk aktivitet som er sam-menlignbar med matur, nativ IFN-p og som er fremstilt ved rekombinante DNA-teknikker. IFN-P kan fremstilles ved å dyrke en vertscelle som er transformert med en ekspresjonsvektor omfattende en nukleotidsekvens som koder et IFN-p polypeptid. Vertscellen er en som kan transkribere nukleotidsekvensen og produsere det ønskede protein og kan være prokaryotisk (for eksempel E. coli) eller eukaryotisk (for eksempel en gjær-, insekt- eller pattedyrcelle). Eksempler på rekombinant produksjon av IFN-P er gitt hos Mantei et al. (1982) "Nature" 297:128; Ohno et al. (1982) "Nucleic Acids Res." 10:967; Smith et al. (1983) "Mol. Cell. Biol." 3:2156, og US 4 462 940, 5 702 699 og 5 814 485. Humane interferongener er klonet ved bruk av rekombinant DNA ("rDNA") teknologi og er uttrykt i E. coli (Nagola et al. (1980) "Nature" 284:316, Goeddel et al.

(1980) "Nature" 287:411; Yelverton et al. (1981) "Nuc. Acid Res." 9:731; Streuli et al.

(1981) "Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A." 78:2848). Alternativt kan IFN-p produseres ved et transgent dyr eller en plante som er genetisk modifisert for å uttrykke IFN-p proteinet av interesse i henhold til metoder som er velkjente i teknikken. Proteiner eller polypeptider som viser native interferon-p-lignende egenskaper kan også fremstilles ved rDNA teknologi ved å ekstrahere poly-A-rike 12S messenger RNA fra viralt induserte humanceller, syntetisering av dobbelttrådet cDNA ved bruk av mRNA som et templat, innføring av cDNA i en egnet kloningsvektor, transformering av egnede mikroorganismer med vektoren, høsting av mikroorganismene og ekstrahering av interferon-p derfra, se for eksempel EP 28033 (publisert 6. mai 1981); 32134 (publisert 15. juli 1981) og 34307 (publisert 26. august 1981), som alle beskriver forskjellige metoder for fremstilling av interferon-[$ under anvendelse av rDNA teknikker.

Alternativt kan IFN-p syntetiseres kjemisk, ved en hvilken som helst av flere teknikker som er velkjente for fagmannen på peptidområdet, se for eksempel Li et al. (1983) "Proe. Nati. Acad. Sei. USA" 80:2216-2220, Steward and Young (1984) "Solid Phase Peptide Synthesis" (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois), og Baraney and Merrifield (1980) "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology" utg. Gross and Meinhofer, Vol. 2 (Academic Press, New York, 1980) s. 3-254, som diskuterer fast-fase peptid-synteseteknikker; og Bodansky (1984) "Principles of Peptide Synthesis" (Springer-Verlag, Berlin) og Gross and Meinhofer, utg. (1980) "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", Vol. 1 (Academic Press, New York), som diskuterer klassiske oppløs-ningssynteser. IFN-p kan også fremstilles kjemisk ved samtidig multippel peptidsynte-se, se for eksempel Houghten (1984) "Proe. Nati. Acad. Sei. USA" 82:5131-5135 samt US4631 211.

Det rekombinant fremstilte IFN-p for bruk ved fremstilling av de stabiliserte, farmasøy-tiske HSA-frie IFN-P preparater ifølge oppfinnelsen kan gjenvinnes og renses ved bruk av metoder som er velkjente for fagmannen. Slike metoder inkluderer de som er beskrevet i US 4 462 940 og 5 702 699. Disse metoder gjenvinner interferonet i ren form av IFN-p som tenderer til å danne aggregater i fravær av SDS som benyttes som oppløse-liggjørende middel. Videre eksponerer disse metoder proteinet til høye pH-betingelser som ugunstig kan påvirke proteinets biologiske egenskaper og som kan resultere i preparater inneholdende restmengder av SDS som benyttes for å oppløseliggjøre proteinet under rensing. Mens således IFN-p kan oppnås ved bruk av disse metoder, gjenvinnes og renses det fortrinnsvis ved den forbedrede metode som er beskrevet i de paralleltlø-pende søknad "Forbedret fremgangsmåte for proteinrensing og gjenvinning" av 27. ok-tober 2000, US SN 60/243,965, den paralleltløpende provisoriske søknad med tittelen "Forbedret fremgangsmåte for proteinrensing og gjenvinning" av 9. april 2001, US SN 60/282,607, samt den provisoriske søknad inngitt samtidig med denne med tittelen "Metoder for proteinrensing og gjenvinning", US SN60/330,375.

To forbedrede rense- og gjenvinningsmetoder for IFN-p er beskrevet i disse paralleltlø-pende, og samtidig inngitte, søknader. Den første av disse rense- og gjenvinningsmetoder omfatter presipitering av i det vesentlige renset IFN-fJ med en alkohol som en alifa-tisk alkohol, og oppløsning av det presipiterte IFN-P i guanidinhydroklorid. Den resulterende oppløsning fortynnes så i en egnet buffer for å renaturere proteinet. Den andre av disse rense- og gjenvinningsmetoder unngår presipiteringstrinnet. På denne måte blir en prøve omfattende i det vesentlige renset IFN-P blandet med guanidinhydroklorid for å danne en oppløsning omfattende oppløseliggjort denaturert IFN-P; denne oppløsning fortynnes så i en egnet buffer for å renaturere proteinet. I begge metoder blir oppløs-ningen omfattende renaturert IFN-P så diafiltrert eller dialysert til en buffer benyttet for farmasøytiske formål. Når det benyttes for å fremstille et HSA-fritt, farmasøytisk preparat ifølge oppfinnelsen blir det rensede, renaturerte IFN-P protein diafiltrert eller dialysert inn i en formulering av lav ionestyrke ifølge oppfinnelsen som beskrevet i eksempel 8 nedenfor.

Preparater omfattet av oppfinnelsen kan ha helt ned til 0,01 mg/ml IFN-P og helt opp til 20,0 mg/ml IFN-p på vekt/volumbasis. I forskjellige utførelsesformer er IFN-p til stede i konsentrasjoner på rundt 0,01 mg/ml til rundt 20,0 mg/ml, rundt 0,015 mg/ml til rundt 12,5 mg/ml, rundt 0,025 mg/ml til rundt 10,0 mg/ml, rundt 0,05 mg/ml til rundt 8,0 mg/ml, rundt 0,075 mg/ml til rundt 6,0 mg/ml, rundt 0,1 mg/ml til rundt 4,0 mg/ml, rundt 0,125 mg/ml til rundt 2,0 mg/ml, rundt 0,175 mg/ml til rundt 1,0 mg/ml, rundt 0,2 mg/ml til rundt 0,5 mg/ml, rundt 0,225 mg/ml til rundt 0,3 mg/ml, og rundt 0,25 mg/ml.

I enkelte utførelsesformer omfatter formuleringene ifølge oppfinnelsen en farmasøytisk akseptabel bærer. Med "farmasøytisk akseptabel bærer" menes en bærer som konven-sjonelt benyttes i teknikken for å lette lagring, administrering og/eller helbredende ef-fekt av den eller de terapeutiske bestanddeler. En bærer kan også redusere eventuelle uønskede bivirkninger hos IFN-p. En egnet bærer bør være stabil, det vil si ikke i stand til å reagere med andre bestanddeler i formuleringen. Den bør ikke fremkalle signifikan-te lokale eller systemiske ugunstige virkninger i resipienter ved de doseringer og konsentrasjoner som benyttes for behandling. Slike bærere er generelt kjent i teknikken. Egnede bærere for bruk ifølge oppfinnelsen er de vanligvis benyttede store, stabile mak-romolekyler som gelatin, kollagen, polysakkarid, monosakkarider, polyvinylpyrrolidon, polymelkesyre, polyglykolsyre, polymere aminosyrer, fikserte oljer, etyloleat, liposo-mer, glukose, laktose, mannose, dekstrose, dekstran, cellulose, sorbitol, polyetylengly kol (PEG) og lignende. Bærere for langsom frigivning som hyaluronsyre kan også være egnet, se særlig Prisell et al. (1992) "Int. J. Pharmaceu." 85:51-56 og US 5 166 331.

De farmasøytiske preparater kan i tillegg omfatte et oppløseliggjørende middel eller en oppløselighetsforbedrer som bidrar til proteinets oppløselighet utover den forbedrede oppløselighet som oppnås ved bruk av formuleringene av lav ionestyrke som er beskrevet her. Forbindelser inneholdende en guanidiniumgruppe og helst arginin, er egnede oppløselighetsforbedrere for IFN-p. Eksempler på slike oppløselighetsforbedrere inkluderer aminosyren arginin, så vel som aminosyreanaloger av arginin som bibeholder evnen til å forbedre oppløseligheten for IFN-|J. Slike analoger inkluderer dipeptider og tripeptider som inneholder arginin. Ytterligere egnede oppløseliggjørende midler er beskrevet i US 4 816 440,4 894 330, 5 004 605, 5 183 746, 5 643 566 samt hos Wang et al. (1980) "J. Parenteral Drug Assoc." 34:452-462.

I tillegg til de midler som er beskrevet ovenfor kan andre stabiliseringsmidler som ety-lendiamintetraeddiksyre (EDTA) eller et av dennes salter som dinatrium EDTA, settes til for ytterligere å forbedre stabiliteten for de flytende, farmasøytiske preparater. EDTA virker som en oppfanger for metallioner som er kjent for å katalysere mange oksy-dasjonsreaksjoner og gir derfor et ytterligere stabiliseringsmiddel. Andre egnede stabiliseringsmidler inkluderer ikke-ioniske surfaktanter inkludert polyoksyetylensorbitoleste-re, som polysorbat 80 (Tween 80) og polysorbat 20 (Tween 20); polyoksypropylen-polyoksyetylenestere, som Pluronic F68 og Pluronic F127; polyoksyetylenalkoholer, som Brij 35; simetikon; polyetylenglykol, som PEG400; lysofosfatidylkolin; og polyoksyetylen-p-t-oktylfenol, som Triton X-100. Klassisk stabilisering av farmasøytiske preparater med surfaktanter er for eksempel beskrevet av Levine et al. (1991), "J. Parenteral Sei. Technol." 45(3): 160-165.

En farmasøytisk effektiv mengde av en stabilisert, flytende, HSA-fri IFN-P formulering ifølge oppfinnelsen, eller av en farmasøytisk, rekonstituert, stabilisert, lyofilisert HSA-fri IFN-p formulering ifølge oppfinnelsen administreres til et individ. Med "farmasøy-tisk effektiv mengde" menes en mengde som er brukbar ved terapi, forebyggelse eller diagnose av en sykdom eller en tilstand. Egnede veier for administrering inkluderer oral, nasal, pulmonær og parenteral administrering, inkludert transdermal, intravenøs, intra-muskulær, subkutan, intraarteriell og intraperitoneal injeksjon eller infusjon. I en slik utførelsesform skjer administreringen ved injeksjon, fortrinnsvis subkutan injeksjon. Injeksjonsformer av preparatene ifølge oppfinnelsen inkluderer oppløsninger, suspen-sjoner og emulsjoner. Karakteristisk omfatter en terapeutisk effektiv mengde av IFN-p rundt 0,01 ug/kg til rundt 5 mg/kg av preparatet, fortrinnsvis rundt 0,05 ug/kg til rundt 1000 ug/kg, helst rundt 0,1 ug/kg til rundt 500 ug/kg og aller helst rundt 0,5 ug/kg til rundt 30 ug/kg.

I en utførelsesform blir de stabiliserte, HSA-frie farmasøytiske preparater omfattende i det vesentlige monomer IFN-|J formulert til en enhetsdose og kan foreligge i injiserbar eller infuserbar form som oppløsning, suspensjon eller emulsjon. Videre kan den lagres frosset eller preparert i tørket form som lyofilisert pulver, som så kan rekonstitueres til den flytende oppløsning, suspensjon eller emulsjon før administrering ved hjelp av en hvilken som helst av tallrike metoder inkludert oral eller parenteral administrering. Det stabiliserte, farmasøytiske preparat kan steriliseres ved membranfiltrering og lagres i enhetsdose- eller multidosebeholdere, som for eksempel forseglede ampuller. Ytterligere metoder for formulering av et farmasøytisk preparat er generelt kjent i teknikken og kan benyttes for ytterligere å øke lagringsstabiliteten for det farmasøytiske preparat som beskrevet her, forutsatt at det ikke ugunstig påvirker de fordelaktige effekter ved stabili-seringsmidlene som her beskrevet. En grundig diskusjon av formuleringer og valg av farmasøytisk akseptable bærere, stabilisatorer og så videre kan finnes i "Remington's Pharmaceutical Sciences" (1990) (18. utg., Mack Publishing Company, Eaton, Pennsyl-vania).

Formuleringer omfattende en effektiv mengde av de farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen omfattende p-interferon (IFN-p) eller en variant derav, så som muteinet av humant IFN-p (hIFN-p) kalt hIFN-pseri7er brukbare ved diagnose, forebyggelse og terapi (lokal eller systemisk) av kliniske indikasjoner som responderer på terapi med dette polypeptid. Slike kliniske indikasjoner inkluderer for eksempel lidelser eller sykdom-mer i sentralnervesystemet (CNS), hjernen og/eller ryggmargen, inkludert Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, Lewy kroppsdementia, multippel sklerose, epilepsi, cere-bellær ataksi, progressiv supranukleær lammelse, amyotrofisk lateral sklerose, affektive lidelser, angstlidelser, obsessiv kompulsive lidelser, personlighetsforstyrrelser, opp-merksomhetsmangellidelser, oppmerksomhetsmangel-hyperaktivitetslidelser, Tourette Syndrome, Tay Sachs, Nieman Pick og schizofreni; nerveskade fra cerebrovaskulære lidelser som slag i hjernen eller ryggmargen, fra CNS infeksjoner inkludert meningitt og HIV, fra tumorer i hjernen og ryggmargen eller fra en prionsykdom; autoimmune syk-dommer inkludert ervervet immunsvikt, rheumatoid artritt, psoriasis, Crohns sykdom, Sjøgrens sykdom, amyotrofisk lateral sklerose, og lupus; og cancere inkludert bryst-, prostata-, blære-, nyre- og koloncancere. Administrering av IFN-p eller dennes muteiner til mennesker eller dyr kan skje oralt, intraperitonealt, intramuskulært, subkutant, intra-venøst, intranasalt eller pulmonært etter legens anbefaling.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer, som omtalt ovenfor, en metode for å øke opp-løseligheten av interferon-p (IFN-P) eller biologisk aktive varianter derav i et farmasøy-tisk preparat i fravær av human serum albumin. Metoden omfatter å preparere preparatet med en formulering av lav ionestyrke, som beskrevet annensteds her, slik at pH-verdien for preparatet holdes ved rundt pH 3,0 til rundt pH 5,0, og å innarbeide det angjeldende IFN-p eller den biologisk aktive variant derav i preparatet. I en utførelsesform omfatter formulering av lav ionestyrke glycin, aspartinsyre eller natriumsuksinat som buffer i en konsentrasjon på rundt 1 mM til rundt 30 mM, fortrinnsvis rundt 2 mM til rundt 5 mM. Preparatet kan videre omfatte et ikke-ionisk tonisitetsmiddel i en mengde tilstrekkelig til å gjøre preparatet isotonisk med kroppsfluider, som beskrevet annensteds her. I en utfø-relsesform blir det ikke-ioniske tonisitetsmiddel valgt fra gruppen bestående av trehalose, sukrose, mannitol og en hvilken som helst kombinasjon derav. Ved videre å holde pH-verdien i preparatet mellom rundt 3,0 og 5,0, fortrinnsvis ved rundt 4,0, er det mulig å bibeholde majoriteten av IFN-P i den monomere tilstand. Således tilveiebringer oppfinnelsen også en metode for å fremstille et stabilisert, HSA-fritt, farmasøytisk preparat omfattende i det vesentlige monomert IFN-p, som angitt ovenfor.

De følgende eksempler skal illustrere oppfinnelsen.

EKSPERIMENTELT

Foreliggende oppfinnelse ble oppnådd ved bedre forståelse av oppløseligheten og stabi-litetsegenskapene for IFN-p-lb. De foretrukne karakteristika for HSA fri IFN-p-lb formuleringer er et pH-område rundt 3,0 til rundt 5,0 og betingelser med meget lav ionestyrke. Bruken av betingelser med meget lav ionestyrke innen dette pH-område resulterer i et høyere innhold av monomert IFN-P-lb og lavere innhold av aggregerte IFN-P-lb spesies. Disse betingelser gir IFN-p-lb oppløselighet og -stabilitet slik det tidligere ikke har kunnet oppnås uten bruk av HSA i formuleringen. Dette gir også formuleringer med et maksimalt innhold av monomert IFN-p-lb.

IFN-p-lb for bruk i disse forsøk ble produsert i E. coli, i det vesentlige som beskrevet i de første flere rensetrinn som angitt i US 4 462 940 og/eller 4 816 400. Det vil si at transformerte bakterier ble benyttet for å produsere IFN-P; vertscellene ble konsentrert og deres cellevegger oppbrutt for å oppnå IFN-p-lb bulkmateriale.

Dette således oppnådde IFN-p-lb bulkmateriale inneholder 50 mM natriumacetat, lmM EDTA, 0,1 % natriumdodecylsulfat (SDS) ved pH 5,5. For å tilveiebringe utgangsmate-rialet for oppløselighet- og stabilitetsmålinger som beskrevet nedenfor ble SDS fjernet fra IFN-P-lb bulkmateriale ved å bringe materialet gjennom en G-25 kolonne (Pharma-cia) som var ekvilibrert med 1,5 mM natriumhydroksyd ved pH > 11. Etter samling fra G-25 kolonnen ble et volum av IM glycin, pH3, tilsvarende rundt 1/10 av det oppsam-lede tilsatt under heftig omrøring for å justere pH-verdien til rundt 3. Materialet ble lagret ved 4 °C eller frosset for etterfølgende bruk i oppløselighets- og stabilitetsmålinger.

Eksempel 1: - Bestemmelse av oppløseligheten av IFN-p-lb Initialforsøk ble gjennomført for å forstå oppløseligheten for IFN-P-lb under et vidt spektrum av betingelser for pH-verdi, buffertype og ionestyrke. En oppløsning av IFN-p-lb (-0,8 mg/ml IFN-p-lb i 100 mM glycin, pH 3,0) ble dialysert mot bufrene i tabell 1. Resultatene er vist i figur 1. Disse resultater viser at oppløseligheten for IFN-p-lb er avhengig av pH-verdi og ionestyrke. IFN-p-lb ved pH 3,0 forblir oppløselighet ved alle konsentrasjoner av natriumklorid til 200 mM. For formuleringer ved pH 4,0 ble IFN-P-lb mindre oppløselig etter hvert som natriumkloridkonsentrasjonen nærmet seg 150 mM. For formuleringer ved pH 5,0 ble IFN-p-lb mindre oppløselig når formuleringen inneholdt kun 100 mM natriumklorid. Sett under ett antyder disse data at IFN-p-lb er mest oppløselig i formuleringer ved pH 3,0, mindre oppløselig i formuleringer ved pH 4,0 og minst oppløselige ved pH 5,0. Disse data indikerer også at en økning av ionestyrken i formuleringen (ved å øke natriumkloridkonsentrasjonen) også reduserer opplø-seligheten for IFN-p-lb.

Mens forsøkene ovenfor var i stand til å bestemme betingelser som er gunstige for IFN-p-lb oppløseligheten, bestemte de ikke oppløselighetsgrensen ved noen av de gitte betingelser. Et etterfølgende forsøk ble gjennomført for å bestemme oppløselighetsgrense-ne for IFN-P-lb. For å maksimalisere IFN-P-lb ble det benyttet formuleringer av lav ionestyrke (det vil si 5 mM buffer og ingen salter som natriumklorid). Etter dialyse ble IFN-p-lb konsentrert for å bestemme oppløselighetsgrensen ved en gitt formulering. Resultatene av disse forsøk er vist i figur 2. Formuleringer ved pH 3,0 og 4,0 er mest oppløselig og viser en oppløselighet på minst 16 mg/ml. Formuleringene ved pH 5 var oppløselige til rundt 8 mg/ml. Formuleringer over pH 5,0 var oppløselige kun til rundt 0,2 mg/ml. Disse resultater igjen indikerer at pH-verdien har en kraftig virkning på opp-løseligheten for IFN-p-lb. Formuleringer av lav ionestyrke ved pH 3,0 og pH 4,0 er mer oppløselige enn ved pH 5,0. Over pH 5,0 er IFN-p-lb i det vesentlige uoppløselig i formuleringer av lav ionestyrke.

Eksempel 2 - Analytiske ultrasentrifugeringsforsøk

Mens oppløselighetsforsøkene kan bestemme hvor mye IFN-|$-lb som befinner seg i oppløsning er andre teknikker nødvendige for å bestemme aggregeringstilstanden for proteinet. Det er viktig å bestemme hvorvidt et protein er monomert i en gitt formulering og å bestemme hvor mye av proteinet (hvis overhodet) som foreligger i høyere or-denformer som dimerer, trimerer og så videre. Analytisk ultrasentrifugering er en av de beste teknikker for å belyse aggregeringstilstanden for proteiner (se Liu and Shire

(1999) "J. Pharm. Sei." 88:1237-1241). Disse forsøk ble gjennomført for å karakterisere monomerinnholdet av flere IFN-|$-lb formuleringer ved bruk av analytisk ultrasentrifugering. Disse analytiske ultrasentrifugeringsforsøk ble alle gjennomført med et forskjellig preparat av IFN-p-lb. På denne måte inneholdt hvert forsøk en vanlig formulering (5 mM glycin, pH 3,0). Imidlertid varierte hver av disse vanlige formuleringer noe når det gjelder prosentandel monomer (figur 3 - 89,8 %, figur 6 - 94,2 %, figur 9 - 86,3 %). Gjenvinnings- og grenseprosedyren som ble benyttet for å preparere disse UN-^-lb formuleringer ga en viss aggregering av IFN-p-lb molekylet, av i det vesentlige kovalent art. 5 mM glycin, pH 3,0 formuleringen for hvert forsøk tjente derfor som basislinje for mengden aggregat i formuleringen ved begynnelsen av hvert forsøk.

Det første forsøk undersøkte effekten av pH-verdien på IFN-P-lb aggregeringstilstanden. Formuleringer ved pH 3,0 (inneholdende kun 5 mM glycin for å bufre oppløsning-en), pH 4,0 (inneholdende kun 5 mM aspartinsyre for å bufre oppløsningen) og pH 5,0 (inneholdende kun 5 mM natriumsuksinat for å bufre oppløsningen) ble analysert. Resultatene er vist i figurene 3,4 og 5. Hovedtoppen i disse profiler tilsvarte molekylvekten på rundt 20 kDa som er meget nær molekylvekten til IFN-p-lb (19.878 kDa). Hovedtoppen er derfor IFN-p-lb monomeren. Større spesies (dimerer, trimerer og så videre) tilsvarer høyere sedimenteringskoeffisienter. Disse resultater viser at mens IFN-p-lb er i det vesentlige monomer ved pH 3,0 og 4,0 (rundt 90 %) begynner molekylet ved pH 5,0 å aggregere til høyere ordensspesies og er kun cirka 75 % monomer. Disse resultater antyder at aggregeringstilstander for IFN-p-lb er ømfintlige overfor endringer i pH-verdi og at IFN-P-lb monomeren favoriseres av lav pH betingelser, som pH 3,0 og pH 4,0.

Det andre forsøk undersøkte effekten av ionestyrken på IFN-p-lb aggregeringstilstanden. Ionestyrken for formuleringen ble øket i formuleringer ved pH 3,0 (bufiret med 5 mM glycin) ved tilsetning av 0,50 mM, og 150 mM natriumklorid. Resultatene er vist i figurene 6, 7 og 8. For formuleringen som ikke inneholdt tilsatt natriumklorid (figur 6) utgjorde monomerformen av IFN-p-lb rundt 94 % av det totale IFN-p-lb (det vil si 94 % hovedtopp). Når 50 mM natriumklorid settes til formuleringen faller monomerinnholdet til rundt 76 % (figur 7) og med 150 mM natriumklorid i formuleringen faller monomerinnholdet til mindre enn 10 % (figur 8). Disse resultater antyder at aggregeringstilstanden for IFN-p-lb er meget ømfintlig overfor ionestyrken og at IFN-p-lb monomeren favoriseres av betingelser med lav ionestyrke.

Et ønskelig karakteristikum for en injiserbar, farmasøytisk formulering er at den er isotonisk med kroppsfluider. Ioniske stoffer (som natriumklorid) og ikke-ioniske stoffer (som sukrene sukrose og trehalose) kan benyttes for å gjøre formuleringene isotoniske med kroppsfluider. De tidligere analytiske ultrasentrifugeringsforsøk undersøkte formuleringer som enten ikke var isotoniske (inneholdende kun 5 mM buffer) eller inneholdt natriumklorid som en ionisk tonisitetsgjører. Et tredje forsøk undersøkte virkningen av ikke-ioniske tonisitetsmidler på aggregeringstilstanden for IFN-p-lb. I disse forsøk ble det preparert tre formuleringer med pH 3,0 (bufret med 5 mM glycin). En inneholdt kun det glycinbufrede middel, den andre ble tonisifisert med 9 % sukrose og den tredje med 9 % trehalose. Analytiske ultrasentrifugeringsresultater er vist i figurene 9,10 og 11. Monomerinnholdet for formuleringen med kun buffermidlet (figur 9) er rundt 96 %. Ved tilsetning av enten sukrose (figur 10) eller trehalose (figur 11) som tonisitetsmiddel er monomerinnholdet rundt 89 %. Disse resultater antyder at ikke-ioniske tonisitetsmidler som sukrose og trehalose ikke fremmer aggregering av IFN-p-lb molekylet.

Eksempel 3 - Stabilitet for lyofilisert IFN-P-lb HSA frie formuleringer under akselererte temperaturbetingelser

HSA-frie formuleringer av IFN-p-lb ved pH 3,0 (5 mM glycin som buffer) og pH 4,0 (5 mM aspartinsyre som buffer) inneholdende enten 9 % trehalose (pH 3,0 og pH 4,0)

eller 9 % sukrose (pH 4,0) ble lyofilisert. De lyofiliserte formuleringer ble så lagret ved 40 °C og stabiliteten målt over 8 uker. Sukrose og trehalose er typiske stabiliseringsmidler som benyttes i lyofiliserte formuleringer. Et nivå på 9 % av disse reagenser benyttes slik at den rekonstituerte formulering vil være isotonisk med kroppsfluider. For å minimalisere ionestyrken for formuleringene, og således mengden aggregert IFN-P-lb, ble mengden buffer holdt på et minimumsnivå. Således var alle bufrene ved en konsentrasjon på 5 mM.

De typiske lagringsbetingelser for farmasøytiske proteinprodukter er ofte 5 °C. Imidlertid benyttes akselererte temperaturbetingelser ofte i formuleringsstudier for å øke ned-brytningshastigheten for en spesiell formulering slik at relevante stabilitetsdata kan samles i løpet av kortere tid. I dette forsøk ble 40 °C benyttet for å forsøke tvungen ned-brytning av IFN-P-lb i HSA-frie formuleringer. Resultater for konsentrasjonsmålingene og revers-fase HPLC (RP-HPLC) analyser vises i figurene 12 og 13. Disse resultater viser at selv ved høyere temperaturer viser disse IFN-p-lb formuleringer ingen detekterbare endringer over en 8 ukers studie.

Eksempel 4 - Stabilitet for lyofiliserte IFN-P-lb HSA-frie formuleringer inneholdende trehalose under reelltids lagringsbetingelser

Selv om en typisk lagringsbetingelse for proteinfarmasøytika er 5 °C er det ønskelig å ha et produkt med stabilitet ved romtemperatur (25 °C til 30 °C). I dette forsøk ble det lyofilisert formuleringer inneholdende 9 % trehalose (5 mM glycin, pH 3, eller 5 mM aspartinsyre, pH 4). En konsentrasjon på 9 % trehalose ble benyttet slik at de rekonstituerte formuleringer ville være isotoniske med kroppsfluider. Formuleringer ble lagret ved 5 °C og 30 °C og stabiliteten målt over 9 måneder. Resultater for konsentrasjonsmålingene og revers-fase HPLC (RP-HPLC) analyser er vist i figur 14 og figur 15. Disse resultater viser at selv ved 30 °C viser disse IFN-p-lb formuleringer ingen detekterbare endringer over studiens 9 måneder.

Eksempel 5 - Stabilitet for flytende IFN-P-lb HSA-frie formuleringer under akselererte temperaturbetingelser

Stabiliteten for HSA-frie formuleringer av IFN-p-lb ved pH 3,0 og pH 4,0 ble også undersøkt i væsketilstand. Sammensetningen for formuleringene var den samme som

skissert i eksempel 3 (9 % trehalose (pH 3,0 og pH 4,0) eller 9 % sukrose (pH 4,0)). For å minimalisere ionestyrken i formuleringene og derved å minimalisere mengden aggregerte IFN-p-lb molekyler ble mengden buffer nok en gang holdt ved et minimumsnivå

(5 mM). Flytende formuleringer ble lagret ved 30 °C og stabiliteten målt over 9 uker. Den typiske lagringsbetingelsen for flytende proteinformuleringer er 5 °C. Derfor repre-senterer 30 °C akselererte temperaturbetingelser som er satt opp for å øke hastigheten for IFN-p-lb nedbrytningen. Resultater som vist i figur 16 (konsentrasjonsmålinger) og figur 17 (revers-fase HPLC analyse) viser ingen detektbare endringer i formuleringene over studiens 9 uker. Disse resultater antyder at i disse formuleringer, og under disse betingelser, er IFN-P-lb stabil over studiens forløp.

Eksempel 6 - Stabilitet for flytende IFN-p-lb HSA-frie formuleringer under reelltids lagringsbetingelser

I dette forsøk ble flytende formuleringer inneholdende 9 % trehalose (5 mM glycin, pH 3, eller 5 mM aspartinsyre, pH 4) eller 9 % sukrose (5 mM glycin, pH 3 eller 5 mM aspartinsyre, pH 4) undersøkt under reelltids lagringsbetingelser ved 5 °C. Formuleringene ble fylt i ampuller og stabiliteten målt over 9 måneder. Resultater for konsentrasjonsmålingene og revers-fase HPLC (RP-HPLC) analyse er vist i figur 18, henholdsvis 19. Disse resultater antyder at IFN-p-lb i disse formuleringer er stabil over studiens 9 måneder.

Eksempel 7 - Trehalose foretrekkes over sukrose som ikke-ionisk tonisitetsmiddel for IFN-p-lb formuleringer

I dette forsøk ble formuleringer inneholdende 9 % trehalose (5 mM glycin, pH 3 eller 5 mM aspartinsyre, pH 4) og 9 % sukrose (5 mM glycin, pH 3, eller 5 mM aspartinsyre, pH 4) preparert og fylt i ampuller som en væske, og ampuller med samme formulering ble lyofilisert. Stabilitetene ble målt under akselererte temperaturbetingelser som ofte er prediktive for stabilitetsrekkefølgen for formuleringer for et gitt protein. Flytende formuleringer ble lagret ved 30 °C i 9 uker og lyofiliserte formuleringer ble lagret ved 40 °C i 8 uker. Resultatene av konsentrasjonsmålingene er vist i figur 20 (væske) og figur 21 (lyofilisert). Disse resultater antyder at formuleringer ved pH 3 inneholdende sukrose viser en tilsynelatende økning i konsentrasjonen. Denne tilsynelatende økning i konsentrasjonen skyldes hydrolysen av sukrose ved lav pH-verdi under dannelse av reduserende sukker, noe som resulterer i ikke-enzymatisk brunfarving (det vil si Maillard reaksjo-nen) i formuleringene. Trehalose er meget mer resistent mot hydrolyse og er derfor foretrukket over sukrose i disse formuleringer (se 0'Brien (1996) "Science" 61:679-682).

Eksempel 8: Fjerning av SDS og formulering av IFN-P-lb med bruk av guanidin-hydrokloridpresipitering

Renset IFN-p-lb (1 11,91 mg/ml i 0,4 % SDS, 50mM acetatbuffer, pH 5,5) ble lagret ved 5 °C. Under lagringen presipiterte noe av det tilstedeværende SDS. 250 ml av dette materialet (477,5 mg) ble blandet med 229 g guanidinhydroklorid (6 M, totalt volum 400 ml) og omrørt ved romtemperatur i 15 minutter ved bruk av en magnetisk rørestav. Denne 6 M guanidinhydroklorid/proteinoppløsning ble så filtrert med en Sartobran<®>P Capsule (0,45 um porestørrelse) for å fjerne det presipiterte SDS. Proteinkonsentrasjo-nen, bestemt ved UV ved 280 nm, var 1,02 mg/ml. Proteinutbyttet var 406 mg eller 85 %.

De 400 ml guanidinhydrokloridbehandlede materialer ble konsentrert ved bruk av et Millipore<®>Labscale<®>TFF diafiltreringssystem (Millipore, Inc.) med to Pellicon<®>XL Biomax<®>0,1 cm<2>10 kD polysulfonmembraner (Millilpore, Inc.). Volumet etter kon-sentreringstrinnet var 37 ml med en proteinkonsentrasjon på 10,3 mg/ml for et utbytte etter konsentrering på 381 mg eller 93 %.

Ved bruk av en overføringspipette ble 10 ml (103 mg) av den konsentrerte guanidinhydroklorid/proteinoppløsning gradvis satt til 590 ml 5 mM glycin, pH 3,2, oppløsning. Bufferen ble tilsatt under hurtig omrøring ved bruk av en magnetisk rørestav og pro-teinoppløsningen ble tilsatt direkte til den dannede virvel. Denne 60 gangers fortynning av 6 M guanidinhydroklorid/proteinoppløsningen gav en 0,1 M guanidinhydroklorid/proteinoppløsning ved 0,17 mg/ml. Disse 600 ml ble overført til en 500 ml skala diafiltreringsenhet utstyrt med to Pellicon<®>II 10kD, 0,1 m2 polysulfonmembraner. Denne oppløsning ble først konsentrert til~400 ml til en proteinkonsentrasjon på 0,23 mg/ml og deretter diafiltrert mot 9 volumendringer (3,61) av 5 mM glycin ved pH 3,2. Det endelige diafiltrat (402 ml) ble målt ved UV ved 280 nm for en sluttproteinkonsent-rasjon på 0,23 mg/ml med et 92,46 mg eller 90 % utbytte for diafiltreringstrinnet og et totalutbytte på 72 % oppløselig protein for renseprosessen.

Eksempel 9 - Stabilitet av flytende IFN-p-lb HSA-frie formuleringer inneholdende

mannitol som tonisitetsmiddel

I dette forsøk ble flytende formuleringer inneholdende 4 mM aspartinsyre, 5 % mannitol undersøkt ved reelltids lagringsbetingelser ved 5 °C. Tre separate preparater (i figurene kalt prep A, prep B og prep C) ble preparert fra en enkelt porsjon av HSA-fritt IFN-P-lb og fylt i ampuller. Ampullene ble lagret ved 5 °C og stabiliteten for formuleringene målt over 6 måneder. Resultater for konsentrasjonsmålingene og revers-fase HPLC (RP-HPLC) analyse er vist i figurene 22, henholdsvis 23. Resultater viste at ingen detekbare endringer inntrådte i disse IFN-P-lb formuleringer over studiens varighet på 6 måneder.

Claims (73)

1. Stabilisert, HSA-fritt, farmasøytisk preparat,karakterisertv e d at det omfatter et i det vesentlige monomert interferon-p (IFN-p) eller en biologisk aktiv variant derav, oppløseliggjort i en formulering med lav ionestyrke, der formuleringen med lav ionestyrke er en oppløsning som omfatter en buffer i en mengde tilstrekkelig til å holde pH-verdien i preparatet innen ± 0,5 enheter av en spesifisert pH-verdi der denne er rundt 3,0 til rundt 5,0, hvorved formuleringen har en ionestyrke som ikke er større enn rundt 20 mM.

2. Preparat ifølge krav 1,karakterisert vedat bufferen er til stede i en konsentrasjon fra rundt 2 mM til rundt 20 mM.

3. Preparat ifølge krav 1,karakterisert vedat bufferen er til stede i en konsentrasjon fra rundt 1 mM til rundt 10 mM.

4. Preparat ifølge krav 3,karakterisert vedat bufferen er til stede i en konsentrasjon fra rundt 2 mM til rundt 10 mM.

5. Preparat ifølge krav 4,karakterisert vedat bufferen er til stede i en konsentrasjon fra rundt 2 mM til rundt 7 mM.

6. Preparat ifølge krav 5,karakterisert vedat bufferen er til stede i en konsentrasjon fra rundt 2 mM til rundt 5 mM.

7. Preparat ifølge krav 1,karakterisert vedat bufferen er til stede i en konsentrasjon på rundt 5 mM.

8. Preparat ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat bufferen er valgt fra: glycin, aspartinsyre, natriumsuksinat, citrat, format, acetat, glutaminsyre, histidin, imidazol og fosfat.

9. Preparat ifølge krav 8,karakterisert vedat bufferen er glycin.

10. Preparat ifølge krav 8,karakterisert vedat bufferen er citrat.

11. Preparat ifølge krav 8,karakterisert vedat bufferen er acetat.

12. Preparat ifølge krav 8,karakterisert vedat bufferen er format.

13. Preparat ifølge krav 8,karakterisert vedat bufferen er histidin.

14. Preparat ifølge krav 8,karakterisert vedat bufferen er natriumsuksinat.

15. Preparat ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat ionestyrken av formuleringen bestemmes uteluk-kende ved bufferkonsentrasjonen.

16. Preparat ifølge krav 15,karakterisert vedat formuleringen ikke inneholder ytterligere ioniske species.

17. Preparat ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat den spesifiserte pH er fra rundt 3,0 til rundt 4,5.

18. Preparat ifølge krav 17,karakterisert vedat den spesifiserte pH er rundt 3,0 til rundt 4,0.

19. Preparat ifølge krav 18,karakterisert vedat den spesifiserte pH er rundt 3,5 til rundt 4,0.

20. Preparat ifølge krav 19,karakterisert vedat den spesifiserte pH er rundt 4,0.

21. Preparat ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat formuleringen omfatter et ikke-ionisk tonifiserende middel i en mengde som er tilstrekkelig til å gjøre formuleringen isotonisk med kroppsfluider.

22. Preparat ifølge krav 21,karakterisert vedat det ikke-ioniske tonifiserende midlet er en monosakkaridaldose eller -ketose.

23. Preparat ifølge krav 21,karakterisert vedat det ikke-ioniske tonifiserende midlet er et disakkarid.

24. Preparat ifølge krav 21,karakterisert vedat det ikke-ioniske tonifiserende midlet er en alditol.

25. Preparat ifølge krav 23,karakterisert vedat det ikke-ioniske tonifiserende midlet er trehalose.

26. Preparat ifølge krav 23,karakterisert vedat det ikke-ioniske tonifiserende midlet er sukkrose.

27. Preparat ifølge krav 26,karakterisert vedat det ikke-ioniske tonifiserende midlet er mannitol.

28. Preparat ifølge krav 21,karakterisert vedat det ikke-ioniske tonifiserende midlet er trehalose, sukkrose, mannitol eller en kombinasjon derav.

29. Preparat ifølge et hvilket som helst av krav 21 til 28 ,karakterisert vedat det ikke-ioniske tonifiserende midlet er tilstede ved en konsentrasjon på rundt 1% til rundt 10%.

30. Preparat ifølge krav 29,karakterisert vedat det ikke-ioniske tonifiserende midlet er trehalose eller sukkrose tilstede ved en konsentrasjon på rundt 8% til rundt 10 vekt-% pr. volum.

31. Preparat ifølge krav 29,karakterisert vedat det ikke-ioniske tonifiserende midlet er mannitol tilstede ved en konsentrasjon på rundt 4% til rundt 6 vekt-% pr. volum.

32. Preparat ifølge krav 31,karakterisert vedat det ikke-ioniske tonifiserende midlet er mannitol tilstede ved en konsentrasjon på rundt 5 vekt-% pr. volum.

33. Preparat ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat IFN-P er humant IFN-p.

34. Preparat ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat IFN-P er glykosylert.

35. Preparat ifølge hvilket som helst av krav 1 til 33,karakterisert vedat IFN-P er uglykosylert.

36. Preparat hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat IFN-p er kovalent forbundet med polyetylenglykol.

37. Preparat ifølge hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat IFN-p er fremstilt rekombinant.

38. Preparat ifølge krav 37,karakterisert vedat IFN-p er fremstilt ved dyrkning av en vertscelle transformert med en ekspresjonsvektor omfattende en nukleotidsekvens som koder et IFN-P polypeptid, og hvor vertscelle er prokaryotisk.

39. Preparat ifølge krav 37,karakterisert vedatlFN-Per fremstilt ved dyrkning av en vertscelle transformert med en ekspresjonsvektor omfattende en nukleotidsekvens som koder et IFN-p polypeptid, og hvor vertscelle er eukaryotisk.

40. Preparat ifølge krav 39,karakterisert vedat vertscellen er en gjærcelle.

41. Preparat ifølge krav 39,karakterisert vedat vertscellen er en insektscelle.

42. Preparat ifølge krav 39,karakterisert vedat vertscellen er en pattedyrcelle.

43. Preparat ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat IFN-p er tilstede ved en konsentrasjon på rundt 0,01 mg/ml til rundt 20,0 mg/ml.

44. Preparat ifølge krav 43,karakterisert vedat IFN-p er tilstede ved en konsentrasjon på rundt 0,015 mg/ml til rundt 12,5 mg/ml.

45. Preparat ifølge krav 43,karakterisert vedat IFN-p er tilstede ved en konsentrasjon på rundt 0,025 mg/ml til rundt 10,0 mg/ml.

46. Preparat ifølge krav 43,karakterisert vedat IFN-p er tilstede ved en konsentrasjon på rundt 0,05 mg/ml til rundt 8,0 mg/ml.

47. Preparat ifølge krav 43,karakterisert vedat IFN-p er tilstede ved en konsentrasjon på rundt 0,075 mg/ml til rundt 6,0 mg/ml.

48. Preparat ifølge krav 43,karakterisert vedat IFN-p er tilstede ved en konsentrasjon på rundt 0,1 mg/ml til rundt 4,0 mg/ml.

49. Preparat ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat preparatet omfatter EDTA eller et av dens salter.

50. Preparat ifølge krav 49,karakterisert vedat preparatet omfatter dinatrium EDTA.

51. Preparat ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat preparatet omfatter en ikke-ionisk surfaktant.

52. Preparat ifølge krav 51,karakterisert vedat den ikke-ioniske surfaktanten er en polyoksyetylen sorbitolester.

53. Preparat ifølge krav 51,karakterisert vedat den ikke-ioniske surfaktanten er polysorbat 80.

54. Preparat ifølge krav 51,karakterisert vedat den ikke-ioniske surfaktanten er polysorbat 20.

55. Preparat ifølge krav 51,karakterisert vedat den ikke-ioniske surfaktanten er en polyoksypropylen-polyoksyetylen ester.

56. Preparat ifølge krav 51,karakterisert vedat den ikke-ioniske surfaktanten er Pluronic F68.

57. Preparat ifølge krav 51,karakterisert vedat den ikke-ioniske surfaktanten er Pluronic F127.

58. Preparat ifølge krav 51,karakterisert vedat den ikke-ioniske surfaktanten er en polyoksyetylenalkohol.

59. Preparat ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat preparatet lagres i en forhåndsfylt, bruksferdig sprøyte.

60. Preparat ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat preparatet har en holdbarhet på minst 6 måneder ved lagring ved 2-8°C.

61. Preparat ifølge krav 60,karakterisert vedat preparatet har en holdbarhet på minst 12 måneder ved lagring ved 2-8°C.

62. Preparat ifølge krav 60,karakterisert vedat preparatet har en holdbarhet på minst 18 måneder ved lagring ved 2-8°C.

63. Preparat ifølge krav 60,karakterisert vedat preparatet har en holdbarhet på minst 20 måneder ved lagring ved 2-8°C.

64. Preparat ifølge krav 60,karakterisert vedat preparatet har en holdbarhet på minst 22 måneder ved lagring ved 2-8°C.

65. Preparat ifølge krav 60,karakterisert vedat preparatet har en holdbarhet på minst 24 måneder ved lagring ved 2-8°C.

66. Preparat ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, for anvendelse ved behandling av multippel sklerose.

67. Preparat ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvor preparatet administreres ved injeksjon.

68. Preparat ifølge krav 67, hvor preparatet administreres ved subkutan injeksjon.

69. Fremgangsmåte for å øke oppløseligheten for interferon-p (IFN-P) eller en biologisk aktiv variant derav i et farmasøytisk preparat i fravær av humant serum albumin,karakterisert vedat den omfatter å fremstille preparatet med en formulering av lav ionestyrke, der formuleringen av lav ionestyrke er en opp-løsning som omfatter en buffer i en mengde tilstrekkelig til å holde pH-verdien i preparatet til ± 0,5 enheter av en spesifisert pH-verdi der den spesifiserte pH-verdi er rundt 3,0 til rundt 5,0 hvor formuleringen har en ionestyrke som ikke er større enn rundt 20 mM, og å innarbeide nevnte IFN-p eller den biologisk aktive variant derav i nevnte preparat.

70. Fremgangsmåte ifølge krav 69,karakterisert vedat preparatet er et preparat som definert i et hvilket som helst av krav 1 til 68.

71. Fremgangsmåte for fremstilling av et HSA-fritt, farmasøytisk preparat omfattende i det vesentlige monomert interferon-p (UN-p),karakterisertv e d at den omfatter å fremstille preparatet med en formulering av lav ionestyrke der formuleringen av lav ionestyrke er en oppløsning som omfatter en buffer i en mengde tilstrekkelig til å opprettholde pH-verdien i preparatet til innen ± 0,5 enheter av en spesifisert pH-verdi der denne er rundt 3,0 til rundt 5,0 idet formuleringen har en ionestyrke ikke større enn rundt 20 mM, og å innarbeide nevnte IFN-p eller den biologisk aktive variant derav i preparatet.

72. Fremgangsmåte ifølge krav 71,karakterisert vedat preparatet er et preparat som definert i et hvilket som helst av krav 1 til 68.

73. Farmasøytisk preparat,karakterisert vedat det er fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 71.