CZ20031259A3 - Stabilizované interferonové prostředky - Google Patents

Description

Stabilizované interferonové prostředky

Oblast techniky

Vynález se týká obecně farmaceutických prostředků, zvláště stabilizovaných kapalných nebo 1yofi 1 izováných formulací proteinů včetně například interferonu-β.

Dosavadní stav techniky

Interferony jsou rodinou glykoproteinů, jejichž sekrece z buněk je vyvolávána řadou signálů, včetně virů, dvouřetězcových RNA, jiných polynukleotidů, antigenů a mitogenů. Interferony vykonávají řadu biologických aktivit, včetně antivirových, antiproliferativních a imunomodulatorních působení. Rozeznávají se alespoň tři odlišné typy lidských interferonů, a, p a gama, rozlišené na bázi různých faktorů včetně ani tivirového a antiproliferativního působení.

Interferon-p (IFN-p) je prvním identifikovaným léčivem pro lidi s rozptýlenou sklerózou (MS) a ukázalo se, že snižuje počet záchvatů, jimiž trpí pacienti s nově vzplanutou a chvílemi polevující MS. Prostředky IFN-p jsou vhodné také k léčení infekcí hepatitidy B a C.

Jako u všech léčiv na bázi proteinů, je hlavní překážkou, která musí být překonána při použití IFN-p jako terapeutického činidla, ztráta farmaceutické užitečnosti, která může pocházet z nestability farmaceutických prostředků. K fyzikálním nestabilitám, které provázejí polypetidové působení a účinnost farmaceutických formulací patří denaturace a vytváření rozpustných a nerozpustných agregátů, přičemž k chemickým nestabilitám patří hydrolýza, vytváření imidů, oxidace, racemizace a deamidace. O řadě z těchto změn je známo, že vedou ke ztrátě nebo ke snížení farmaceutického působení příslušného proteinu.

««····· · · · · · ·

V jiných případech jsou příčiny těchto zffiěn neznámé, avšak výsledné produkty odbourání se stále považují za farmaceuticky nepřijatelné, vzhledem k potenciálním nežádoucím vedlejším liči nkům .

Nestabilita polypeptidů ve farmaceutických prostředcích dopadá přímo na jejich farmaceutickou užitečnost, přičemž směrnice, stanovená pro schválení léčiv na bázi proteinů, zdůrazňuje, že změny v působení a molekulárních charakteristik polypeptidů mají být minimální. Připomíná se například zpráva z 30. listopadu 1995 o testování stability biotechnologických/ biologických produktů na mezinárodní konferenci International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (tripartitní organizace, která podává doporučení týkající se farmaceutické politiky pro platnost v Evropské Unii, Japonsku a USA), podle které: kdykoli se zjistí významné kvalitativní nebo kvantitativní změny indikativní pro vytváření produktů odbourání během studil dlouhodobé, urychlené a/nebo stresové stability, je třeba věnovat pozornost potenciálním rizikům a nutnost charakterizovat a kvantifikovat degradační produkty v programu dlouhodové stabi1 i ty.

V důsledku toho je potřeba dalších farmaceutických prostředků, včetně prostředků IFN-β, obsahujících fyziologicky přijatelné stabilizátory, které jsou v podstatě prosté redukčních nečistot, čímž stabilizují protein a podporují farmaceutickou užitečnost.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je prostředek obsahující IFN-β nebo jeho variantu a vysoce vyčištěný mannitol.

Vynález se týká prostředků obsahujících IFB-β jako tera• · 9 • · · · • · · · ··· ··· • ······· · · ·· · · • · · ··· · · · · ·· · · · · ·· ·· peuticky účinnou látku a vysoce vyčištěný· nannitol jako excipient. Prostředky se vyznačují zlepšenou stabilitou během skladování ve srovnání s prostředky IFN-β obsahujícími raannitol, který není vysoce vyčištěn. Vynález se také týká způsobu přípravy takových prostředků.

Vynález blíže objasňuje následující podobný pops s připojenými obrázky.

Seznam obrázků na výkresech

Ha obr. 1 je porovnání chromatogramů RP-HPLC pro s dextrózou formulovaný IFN-β a lyofi 1izovaný prášek inkubovaný jeden týo den při teplotě 50 C. Vytváření glukozylováných aduktů IFN-β e

ve formulaci udržované na teplotě 50 C se považuje za výskyt druhého píku (Bl) (při přibližně frakci 48) předcházející hlavní pík IFN-β (při přibližně frakci 49 až 50) (příklad 1).

o

Spodní křivka je pro 7 dní při teplotě 50 C.

Na obr. 2 je hmotové spektrum pro s dextrózou formulovaný IFN-β. Je zjistitelných několik malých píků k hlavnímu píku IFN-β při 19878 amu (příklad 1). Na ose x je na horním grafu M/Z, na spodním grafu hmota, AMU, na ose y na obou grafech je intenzita, CPS.

Na obr. 3 je hmotové spektrum pro s dextrózou formulovaný IFN-β lyofi 1izovaný z hmoty prostředku a skladovaný jeden týden při teplotě 50 °C. Na rozdíl od obr. 2 odpovídají převažující píky aduktům IFN-β (příklad 1). Na ose x je na horním grafu M/Z, na spodním grafu hmota, AMU, na ose y na obou grafech je intenzita, CPS.

Na obr. 4 je porovnání chromátogramů RP-HPLC pro USP mannitolem formulovanou IFN-β hmotu a pro lyofi 1izovaný prášek inkuo bovaný jeden týden při teplotě 50 C. Vytváření aduktů gluko4 • · ···· · · · ·· · * ···«··· · · · · · · • · · ··· ···· o

zylováného IFN-p ve formulaci udržované na teplotě 50 C (vzhled píku Bl) není patrno (příklad 1). Spodní křivka je pro 7 dní při teplotě 50 C.

Obr. 5 ukazuje hmotovvé spektrum USP s mannitolem formulované IFN-p hmoty. IFN-p je zjištěn jako pík při 19880 amu (přiklad 1) . Na ose x je na horním grafu M/Z, AMU na spodním grafu hmota, AMU na ose y na obou grafech je intenzita, CPS.

Obr. 6 ukazuje hmotové spektrum USP s mannitolem formulovaného IFN-p, který byl lyofilizován a inkubován jeden týden při teplotě 50 C. Ve spektru je patrný výskyt přídavných plků (představujících adukty) (příklad 1). Na ose x je na horním grafu M/Z, AMU na spodním grafu hmota, AMU na ose y na obou grafech je intenzita, CPS.

Obr. 7 ukazuje hmotové spektrum s nečištěným mannitolem formulovaného IFN-p. V tomto spektru jsou patrny četné přídavné píky (představující adukty) (příklad 1). Na ose x je na horním grafu M/Z, na spodním grafu hmota, AMU, na ose y na obou grafech je intenzita, CPS.

Obr. 8 ukazuje hmotové spektrum IFN-p formulovaného s methanolem extrahovaným mannitolem ze stejné dávky jako na obr. 7. Velikost a počet aduktových plků jsou podstatně sníženy (příklad 1). Na ose x je na horním grafu M/Z, na spodním grafu hmota, AMU, na ose y na obou grafech je intenzita, CPS.

Obr. 9 ukazuje hmotové spektrum formulace IFN-p obsahující vysoce vyčištěný mannitol (extrahovaný methanolem, zpracovaný uhlíkem, ultrafi 1trovaný a rekrystalizovaný) . Jsou patrné pouze tři malé píky s převažujícím pikem představujícím nemodifikovaný IFN-p (příklad 1). Na ose x je na horním grafu M/Z, na spodním grafu hmota, AMU, na ose y na obou grafech je intenzita, CPS.

4 * 4 4

4 4

4 4#

4 4 4

44

44444 4 4

4 4 4

Obr. 10 ukazuje hmotové spektrum IFN-p formulovaného v nepřítomnosti mannitolu. Z tohoto spektra je patrno, že převažující sekundární píky, přítomné na obr. 9, nejsou vytvořeny interakcí s vysoce vyčištěným mannitolem, jak se také vyskytují v nepřítomnosti excipientu (příklad 1). Na ose x je na horním grafu M/Z, na spodním grafu hmota, AMU, na ose y na obou grafech je intenzita, CPS.

Obr. 11 ukazuje hmotové spektrum IFN-β formulovaného s USP mannitolem, provedené stejného dne jako na obr. 9. Toto spektrum potvrzuje, že IFN-p formulovaný s USP mannitolem vytváří přídavné píky (adukty), které se nevyskytují ve formulaci IFN-p, obsahující vysoce vyčištěný mannitol (příklad 1). Na ose x je na horním grafu M/Z, na spodním grafu hmota, AMU, na ose y na obou grafech je intenzita, CPS.

Na obr. 12 je vyhodnoceni dat stability pro IFN-p dextrózové formulace, jak je popsáno v příkladu 2. Ve sloupci I je charakteristika produktu, ve sloupci II teplota skladování za chránění před světlem, ve sloupci III jsou měsíce, ve sloupci IV potence, specifická aktivita v U/mg, ve sloupci V koncentrace glúkosy1ováného IFN-p-lb v mg/ml, ve sloupci VI celková koncentrace IFN-p-lb v mg/ml. Výraz DEXTROSE znamená dextrózu a výraz T00 DEGRADED příliš degradováno.

Na obr. 13 je vyhodnocení dat stability pro formulaci IFN-p obsahující vysoce vyčištěný mannitol, jak je popsáno v příkladu 2. Ve sloupci I je charakteristika produktu, ve sloupci II teplota skladování za chránění před světlem, ve sloupci III jsou měsíce, ve sloupci IV potence, specifická aktivita v U/mg, ve sloupci V koncentrace glúkosy1ováného IFN-p-lb v mg/ml, ve sloupci VI celková koncentrace IFN-p-lb v mg/ml. Výraz HIGHLY PURIFIED MANNITOL znamená vysoce čištěný mannitol.

Na obr. 14A je vyhodnocení dat stability pro dávku 006 formu6 9 9 9 9 9

9 9 9«

9« »90 ·« 9«99 * · · · 9 9 • * · 9 9 · • 999 99 « ·

9 9 9 9 9 9

9 9* 99 lácí IFN-β obsahujících vysoce vyčištěný mannitol, jak je popsáno v příkladu 3. Ve sloupci I je teplota skladování, ve sloupci II měsíce skladování, ve sloupci III barva koláče, ve sloupci IV vzhled po rekonstituci, ve sloupci V čirost po rekonstituci, ve sloupci VI barva po rekonstituci, ve sloupci VII zbytková vlhkost, ve sloupci VIII hodnota pH po rekonstituci, ve sloupci IX potence, ve sloupci X integrita v obalu zkouška barvy, ve sloupci XI sterilita.

Na obr. 14B je vyhodnocení dat stability pro dávku 006 formulací IFN-β obsahujících vysoce vyčištěný mannitol, jak je popsáno v příkladu 3. Ve sloupci I je teplota skladování, ve sloupci II měsíce skladování, ve sloupci III interferon 177-lb (pík B + pík Bl), ve sloupci IV pík B1 (glykozylováného produktu) .

Na obr. 15A je vyhodnocení dat stability pro dávku 008 formulaci IFN-β obsahujících vysoce vyčištěný mannitol, jak je popsáno v příkladu 3. Ve sloupci I je teplota skladování, ve sloupci II měsíce skladování, ve sloupci III barva koláče, ve sloupci IV vzhled po rekonstituci, ve sloupci V čirost po rekonstituci, ve sloupci VI barva po rekonstituci, ve sloupci VII zbytková vlhkost, ve sloupci VIII hodnota pH po rekonstituci, ve sloupci IX potence, ve sloupci X integrita v obalu zkouška barvy, ve sloupci XI sterilita.

Na obr. 15B je vyhodnocení dat stability pro dávku 008 formulací IFN-β obsahujících vysoce vyčištěný mannitol, jak je popsáno v příkladu 3. Ve sloupci I je teplota skladování, ve sloupci II měsíce skladování, ve sloupci III interferon 177-lb (pík B + pík Bl), ve sloupci IV pík Bl (glykozylováného produktu) .

Na obr. 16A je vyhodnocení dat stability pro dávku 009 formulací IFN-β obsahujících vysoce vyčištěný mannitol, jak je po7 ·« * • ♦ « • ·

A

«· ···« • * · « · ·

psáno v příkladu 3. Ve sloupci I je teplota skladování, ve sloupci II měsíce skladování, ve sloupci III barva koláče, ve sloupci IV vzhled po rekonstituci, ve sloupci V čirost po rekonstituci, ve sloupci VI barva po rekonstituci, ve sloupci VII zbytková vlhkost, ve sloupci VIII hodnota pH po rekonstituci, ve sloupci IX potence, ve sloupci X integrita v obalu zkouška barvy,

Na obr. 16B je vyhodnocení dat stability pro dávku 009 formulací IFN-β obsahujících vysoce vyčištěný mannitol, jak je popsáno v příkladu 3. Ve sloupci I je teplota skladování, ve sloupci II měsíce skladování, ve sloupci III interferon 177-lb (pík B ♦ pík B1) , ve sloupci IV pík B1 (glykozylováného produktu) .

Obr. 17 ukazuje redukční působení různých vzorků mannitolu. Vzorky 1 až 3 odpovídají USP mannitolu, který nebyl extrahovaný methanol em, filtrovaný uhlíkem nebo ultrafiltrovaný, vzorky 4 až 6 odpovídají USP mannitolu, který byl extrahovaný methanolem a vzorky 7 až 9 odpovídají mannitolu, který byl extrahovaný methanolem, zpracovaný uhlíkem, ultrafi 1trovaný a rekrystalováný.

Vynález se týká farmaceutických prostředků s IFN-0 se zvýšenou stabilitou a způsobů pro jejich přípravu. Prostředky obsahují IFN-β a vysoce vyčištěný mannitol. Vysoce vyčištěný mannitol zvyšuje stabilitu formulací snižováním tvoření degradačních produktů. Stabilizovaná formulace s IFN-β je výhodná v tom, že je bezpečnější (v důsledku snížení potenciálních škodlivých vedlejších účinků) a ekonomičtější (v důsledku zvýšení skladovatelnosti formulace).

Zvýšenou stabilitu prostředků podle vynálezu způsobuje použiti mannitolu, který byl vysoce vyčištěn. Vynález je založen na poznatku, že mannitol, který nebyl vysoce vyčištěn, působí • · · · · · • · · · ·· · ·· · • ····· · · · · · · · · ·· · ··· ···· • · · · · · ·· · · redukčně a v interakci s IFN-/3 produkuje nežádoucí adukty (degradační produkty), zatímco mannitol, který je vysoce vyčištěn, nemá toto redukční působení a nezpůsobuje vytváření těchto aduktů ve formulacích IFN-p. Experimentální výsledky (příklad 1 v pokusné části) naznačují, že redukční aktivita nevyčištěného mannitolu, způsobující tvoření aduktů IFN-p není výsledkem redukčního působení cukru, jelikož vytvářené adukty v přítomnosti mannitolu, který není vysoce vyčištěn, jsou zřetelně odlišné od aduktů vytvářených v přítomnosti excipientů se známou redukční aktivitou cukrů (například dextrózy).

Výrazem vysoce vyčištěný mannitol se zde vždy míní mannitol mající nízkou míru redukční aktivity. Redukční aktivita vysoce vyčištěného mannitolu je menší než 20 dílů na milion podle směrnice United States Pharmacopeia (USP) měřená zde popsanou zkouškou redukční aktivity. V různých provedeních je reduční aktivita vysoce vyčištěného mannitolu menší než 19 dílů na milion, menší než 18 dílů na milion, menší než 17 dílů na milion, menší než 16 dílů na milion, menší než 15 dílů na milion, menší než 14 dílů na milion, nebo menší než 13 dílů na milion. V jednom provedení je vysoce vyčištěným mannitolem podle USP nebo podle American Chemical Society (ACS) produkt, který byl dodatečně podroben: 1) methanolové extrakcí, 2) zpracování uhlím, 3) ultrafiltraci, 4) rekrystalizaci. Vysoce vyčištěný mannitol je obsažen v koncentraci postačující ke stabilizaci formulace. Formulace podle vynálezu mohou mít přibližně 0,1 % vysoce vyčištěného mannitolu nebo až přibližně 7,5 % vysoce vyčištěného mannitolu (hmotnost/objem). V různých provedeních je mannitol obsažen v množství přibližně O,2 % až přibližně 7,0 %, přibližně 0,25 % až přibližně 2,5 % a přibližně 1,25 %.

Vynález se týká jak kapalných a lyofi 1izovaných farmaceutických prostředků obsahujících IFN-p jako terapeuticky účinnou látku, tak vysoce vyčištěného mannitolu jako excipientů.

• · · · · · ·· ··· · • · ···· ·

Pro účely vynálezu má výraz kapalný z hlediska farmaceutických prostředků nebo formulací zahrnovat výraz vodný”. Výraz lyofi 1izovaný“ se týká z hlediska farmaceutických formulací s IFN-β rychlého sušení vymrazováním za sníženého tlaku řady lékovek, z nichž každá obsahuje jednotkovou dávku interferonové formulace podle vynálezu. Lyofi 1 izátory, které provádějí popsanou lyofilizaci, jsou obchodně dostupné a pracovníci v oboru je snadno ovládají. V jednom provedení vynálezu je kapalný prostředek 1yof i 1 i zován.

Kapalné nebo 1yofi 1 izované formulace IFN-β podle vynálezu jsou stabilizovány. Stabilizovanými prostředky nebo prostředky majícími zlepšenou stabilitu se míní prostředky, které mají větší stálost při skladování oproti prostředkům s IFN-β formulovaným s mannitolem, který nebyl vysoce vyčištěn. Toto zvýšení stability se projevuje poklesem tvoření aduktů IFN-β nebo degradativních produktů během skladování v porovnání s formulacemi s mannitolem, který nebyl vysoce vyčištěn. Tvoření aduktů nebo degradativních produktů se dá měřit dále popsanou zkouškou hmotové spektroskopie. Stabilizovaný IFN-β prostředek, formulovaný s vysoce čistým mannitolem, se vyznačuje nepřítomností přídavných píků, které jsou patrné v USP mannitol formulovaném IFN-β ve srovnání s prostředky IFN-β formulovanými bez mannitolu, stanoveno dále popsanou zkouškou hmotové spektroskopie. Například hmotové spektrum IFN-β, formulovaného s vysoce čistým mannitolem, znázorněné na obr. 9, nevykazuje žádné přídavné píky v porovnání s hmotovým spektrem IFN-β formulovaným bez mannitolu na obr. 10. Na rozdíl od toho hmotové spektrum IFN-β, furmulováného s USP mannitolem, znázorněné na obr. 11, vykazuje četné přídavné píky (adukty) ve srovnání s hmotovým spektrem IFN-β formulovaného bez mannitolu. Stabilizované farmaceutické formulace IFN-β podle vynálezu si zachovávají svou potenciální schopnost a obsahují méně než 0,02 mg/ml glukozylatovaného IFN-β po dobu až přibližně dvou

B let při sklsadování při teplotě 30 C a alespoň dva roky při skladování při teplotě 25 C.

Stabilizované farmaceutické formulace obsahují IFN-β a jeho varianty. Výrazem IFN-β se zde vždy míní IFN-p nebo jeho varianty, označované někdy jako polypeptidy podobné IFN-p. Lidské varianty IFN-p, které se mohou vyskytovat jako přírodní (například alleiické varianty, které se vyskytují v místě IFN-p) nebo připravené rekombinantně, mají sekvence aminokyselin, které jsou stejné nebo podobné, nebo v podstatě podobné zralé nativní sekvenci IFN-p. Zahrnuty jsou také fragmenty IFN-p nebo zkomolené formy IFN-p, které si uchovávají svou aktivitu. Tyto biologicky aktivní fragmenty nebo zkomolené formy IFN-p se vytvářejí odejmutím zbytků aminokyselin ze sekvence IFN-p plné délky aminokyseliny pomocí rekombinantnich DNA, v oboru dobře známých technik. Polypeptidy IFN-p mohou být glykozylované nebo neglykozylováné: podle literatury jak glykozylované tak neglykozylováné IFN-p vykazují kvalitativně podobné specifické aktivity, proto nejsou glykozylové podíly zahrnuty v biologické aktivitě IFN-p a nepřispívají k ní.

loučeny nebo nahraženy keliminaci nesprávnou

Varianty IFN-p podle vynálezu obsahují muteiny zralé nativní sekvence IFN-p (například americký patentový spis číslo US 5 814485), kde jeden nebo několik cysteinových zbytků, které nejsou nezbytné pro biologickou aktivitu, byly záměrně vyjednou nebo několika aminokyselinami míst pro buď intermolekulární zesítěni nebo pro intraraolekulární disulfidovou vazbu. K. variantám tohoto typu patří varianty, které obsahují glycin, valin, alanin, leucin, isoleucin, tyrosin, fenylalanin, histidin, tryptofan, serin, threonin nebo methionin substituovaný pro cystein nacházející se u aminokyseliny 17 sekvence zralé nativní aminokyseliny. Serin a threonin jsou výhodnějšími náhradami, vzhledem ke svému chemickému analogu cysteinu. Nejvýhodnějšími jsou substituce šeřinu, například varianta IFN-p, kde cystein u aminokyse1 iny 17 zralé nativní sekvence je nahrašen serinem ·· · · • ·· · ·· · · · · · · · · (americký patentový spis číslo US 5 814485). Cystein 17 může být také vyřazen způsoby známými v oboru (například americký patentový spis číslo 4 588584), což vede ke zralému muteinu IFN-β, který je o jednu aminokyselinu kratší než zralý nativní IFN-β (americké patentové spisy číslo US 4 530787, US 4 572798 a 4 588585). Vynález tedy zahrnuje varianty IFN-β s jednou nebo s několika mutacemi, které zlepšují například jejich farmaceutickou užitečnost.

Pracovníkům v oboru je zřejmé, že mohou být zavedeny přídavné změny mutací do nukleotidových sekvencí kódujících IFN-β, vedoucí tak ke změnám v sekvenci aminokyselin IFN-β, aniž se změní biologické působení interferonu. Může být tedy vytvořena varianta izolované molekuly nukleové kyseliny kódující variantu IFN-β mající sekvenci, která se liší od sekvence aminokyselin pro zralý nativní IFN-β zavedením jedné nebo několika nukleot idových substitucí, adicí nebo vyřazením do odpovídající nukleotidové sekvence podle vynálezu tak, že se do zakódovaného IFN-β zavede jedna nebo několik substituci, adicí nebo delecí aminokyseliny. Mutace mohou být zavedeny standardními technikami, jako je na místo zaměřená mutageneze a PCR-zprostředkovaná mutageneze. Takové varianty IFN-β vynález také zahrnuje .

Například mohou být provedeny konzervativní aminokyselinové substituce jednoho nebo několika předpověděných, s výhodou neesenciálních aminokyselinových zbytků. Neesenciálním aminokyselinovým zbytkem je zbytek, který může být zaměněn ze sekvence IFN-β standardního typu, aniž se změní jeho biologická aktivita, zatímco zbytek esenciální“ aminokyseliny je potřebný pro biologiockou aktivitu. “Konzervativní substituce aminokyselin“ je substituce, při které je zbytek aminokyseliny nahražen zbytkem aminokyseliny majícím podobný boční řetězec. Rodiny zbytků aminokyselin, majících podobné boční řetězce, jsou v oboru definovány. Do těchto rodin patří aminokyseliny • · · · 9 « · · * · · • · · · * · · · · ·

se zásaditými bočními řetězci (například lysin, arginin, histidin), s kyselými bočními řetězci (například kyselina asparagová, glutamová), s nenabitými polárními bočními řetězci (například glycin, asparagin, glutamin, serin, threonin, tyrosin, cystein), s nepolárními bočními řetězci (například alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, raethionin, tryptofan), s beta-rozvětvenými bočními řetězci (například threonin, valin, isoleucin) a s aromatickými bočními řetězci (například tyrosin, fynylalanin, tryptofan, histidin). Takové substituce by se neprováděly pro konzervované zbytky aminokyselin, nebo pro zbytky aminokyselin majících konzervovaný motiv.

Alternativně je možno provádět variantní sekvence nukleotidu IFN-p zaváděním mutací nahodile podél celku nebo části sekvence kódující IFN-p, jako saturační mutageneze a výsledné mutanty mohou být skrínovány se zřetelem na biologickou aktivitu IFN-p k identifikování mutantů, které si uchovávají aktivitu. Po mutagenezi, muže být zakódovaný protein expresován rekombinantně a aktivita proteinu může být stanovena pomocí standardní, zde popsané techniky.

Biologicky aktivní varianty IFN-β mají obvykle alespoň 80% výhodněji 90% až přibližně 95% nebo větší a nejvýhodněji přibližně 96% až přibližně 99% nebo vyšší aminokyselinovou identitu s referenčním polypeptidem IFN-p, který slouží jako základna pro porovnání, například nativní lidský IFN-p. Pojmem sekvenční identita se míní stejné zbytky aminokyselin uvnitř variant polypeptidu a polypeptidové molekuly, které slouží jako referenční seskupeni souvislého segmentu aminokyselinové sekvence varianty a porovnává se s aminokyselinovou sekvencí referenční molekuly.

Pro účely optimálního seskupení obou segmentů pro účely stanovení sekvenční totožnosti může mít přilehlý segment ami13 · ·· 999· 99 9··· ··« · · 9 9 9 9

9 9 9 ··· 9 9 9 • 9 9999 9999 999 9

999 999 9999

9 99 9 9999 nokyselinové sekvence varianty přídavné aminokyselinové zbytky nebo vypuštěné aminokyselinové zbytky ve vztahu k sekvenci aminokyselin referenční molekuly. Přilehlý segment, použitý k porovnání se sekvencí referenční aminokyseliny, bude obsahovat alespoň 20 přilehlých zbytků aminokyselin. Korekce pro zvýšenou totožnost sekvencí spojené s vměstky a mezerami aminokyselinové sekvence varianty je možno provést stanovením mezerových testů. Způsoby seskupování sekvencí jsou v oboru dobře známy.

Stanovení procenta totožnosti dvou sekvencí se může provádět pomocí matematických algoritmů. Jedním výhodným příkladem, který není tedy míněn jako jakékoliv omezení, matematického algoritmu používaného k porovnávání sekvencí je algoritmus podle Myerse a Millera (Comput. Appl. Biosci 4, str. 11 až 17, 1988). Takový algoritmus je využit v programu ALIGN (verze

2,0), který je součástí softwarového souboru GCG. K porovnání sekvencí aminokyselin je možno použít tabulky PAM120 hmotnostního zbytku, třestu 12 za délku mezery a trestu 4 za mezeru s programem ALIGN. Jiným výhodným příkladem, který není tedy míněn jako jakékoliv omezení, matematického algoritmu k použití při porovnávání dvou sekvencí je algoritmus podle Karlina a Altschul (Proč. Nat. Acad. Sci USA 90, str. 5873 až 5877, podle Karlina a Altschula (Proč. 5873 až 5877, 1993). Takový algoritmus je zabudován do programů NBLAST a XBLAST (Altschul a kol., J. Mol. Biol. 2125, str. 403 až 410 (1990). Vyhledávání BLAST aminokyselinové sekvence se může provádět za použiti programu XBLAST, skóre=50, délka slova=3, k získání aminokyselinové sekvence podobné sledovanému polypeptidu. K získání seskupení mezer pro porovnávací účely je možno použít mezerového BLAST (Altschul a kol., Nucleic Acids Res. 25, str. 3389 až 3402, 1997), Alternativně lze použít PSI-BLAST k provádění průzkumu, který odhalí vzdálenostní poměry mezi molekulami (Altschul a kol., 1997). Při použití programů BLAST, mezerový

1990), modifikovaného jako Nat. Acad. Sci USA 90, str, ·· · ·· · • · · · • ·· ·♦ · ·

BLAST nebo PSI-BLAST je mošno použit standardních parametrů (http://www.nebi,nim.nih.gov: téš ALIGN program [Dayhol, Atlas of Protein Sequence and Structure 5, suppl.3, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C, 19783) a program ve Wisconsin Sequence Analysis Package, Veršion 8 (obchodní produkt Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin), například program GAP, kde se vyušívá standardních parametrů programů.

Pokud jde o procento totošnosti sekvencí aminokyselin, mohou se některé polohy zbytků aminokyselin lišit jako výsledek konzervativních aminokyselinových substitucí, které neovlivňují vlastnosti funkce proteinu. V těchto případech můše být procento totožnosti sekvence určováno směrem kupředu na úkor podobnosti v konzervativně substituovaných aminokyselinách. Taková nastavení jsou v oboru dobře známá (například Myers a Miller, Compt. Appl. Biosci. 4, str. 11 až 17, 1988).

Biologicky aktivní varianty IFN-β, zahrnuté do vynálezu, obsahují také polypeptidy IFN-p, které mají na sebe kovalentně navázané například polyethylenglykol (PEG) nebo albumin. Tyto kovalentní hybridní molekuly IFN-p mají některé Žádoucí vlastnosti, jako je rozšířený poločas životnosti séra po podání pacientovi. Způsoby vytváření aduktů PEG-IFN zahrnuje chemickou modifikaci monomethoxypolyethylenglykolu k vytvoření aktivované sloučeniny, která reaguje s IFN-p. Způsoby přípravy a použití s PEG vázaných polypeptidů popsal například Delgado a kol. (Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst. 9, str. 249 až 304, 1992). Jakožto způsoby vytváření albuminových fuzních polypeptidů se uvádí fuze kódujících sekvencí pro příslušné polypeptidy (například IFN-β) a albumin a jsou popsány v americkém patentovém spise číslo US 5 876 969. Tyto hybridní molekuly IFN-p reagují s nečistotami obsaženými v USP mannitolu a jsou stabilnější, jsou-li formulovány s vysoce vyčištěným mannitolem.

• # · 9 · · • ·· · • 99 ·

9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 9

99 9 9

Biologicky aktivní varianty IFN-β, zahrnuté do vynálezu, si uchovávají aktivity IFN-β, zejména schopnost vázat receptory IFN-/3. V některých provedeních si varianta IFN-£ uchovává alespoň přibližně 25%, přibližně 50%, přibližně 75%, přibližně 85%, přibližně 90%, přibližně 95%, přibližně 98%, přibližně 99%, nebo vyšší biologickou aktivitu referenčního polypeptidu IFN-/3, například nativního lidského IFN-p. Varianty IFN-fJ, jejichž aktivita je zvýšena ve srovnání s aktivitou referenčního polypeptidu IFN-β, jsou také zahrnuty. Biologické aktivity variant IFN-β je možno měřit způsoby známými v oboru. Příklady takových zkoušek popsal Fellous a kol. (Proč. Nati. Acad. Sci USA 79, str. 3082 až 3086, 1982), Czerniecki a kol. (J. Virol. 49 (2), str. 490 až 496, 1984), Mark a kol. (Proč. Nat. Acad. Sci. USA 81, str. 5662 až 5666, 1984), Branca a kol. (Nátuře 277, str. 221 až 223, 1981), Williams a kol. (Nátuře 282, str. 582 až 586, 1979), Herberman a kol., Nátuře 277, str. 221 až 223, 1979), Anderson a kol. (J. Biol. Chem. 257, str. 11301 až 11304, 1982) a zkouška potence IFN-fS je popsána také níže (příklad 2).

IFN-p formulace podle vynálezu mohou být od jakýchkoli živočišného druhu, včetně, nikoliv však jako omezení, ptáků, králíků, hovězího dobytka, vepřů, koní a lidí. S výhodou je IFN-0 od savců, má-li být prostředku použito k léčení poruch IFN-/3 savců a výhodně od savců stejného druhu, jako je savec podrobený léčení pro takovou poruchu.

Jakožto neomezující příklady polypeptidů IFN-p a variant polypeptidů IFN-β podle vynálezu se uvádějí polypeptidy IFN-/3 a varianty, které popsal Nagata a kol. (Nátuře 284, str. 316 až 320, 1980), Goeddel a kol. (Nátuře 287, str. 411 až 416, 1980), Yelverton a kol. (Nucleic Acids Res. 9, str. 731 až 741, 1981), Streuli a kol. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78, str. 2848 až 2852, 1981), evropský patentový spis číslo EP 0 28033B1 a EP 109748 B1 a též americký patentový spis číslo US »· · * * · • · · ·

9 99 9

9 9

9 9 • · · · ·

99999 · 9

9 9 9

518584, US 4 569908, US 4 588585, US 4 738844, US 4 753795, US 4 769233, US 4 793995, US 4 914033, US 4 959314, US 5545723 a US 5 814485. V této literatuře jsou také pokyny týkající se zbytků a regionů polypeptidů IFN-β, které se mohou zaměňovat bez ztráty biologické aktivity.

V jednom provedení vynálezu je IFN-β ve stabilizovaných farmaceutických formulacích zralý nativní polypeptid IFN-β. V jiném provedení je IFN-β v těchto formulacích zralý polypeptid IFN-/3, kde cystein, nacházející se u am i noky sel iny 17 zralé nativní sekvence, je nahražen shora uvedeným serinem. Avšak vynález zahrnuje jiná provedení, kde IFN-β ve stabilizované farmaceutické formulaci je jakýkoli biologicky aktivní polypeptid IFN-β nebo jinde popsaná varianta.

V některých provedeních podle vynálezu je IFN-β produkován rekombinantně. Za rekombinantně produkovaný IFN-β se považuje IFN-β, který má porovnatelné biologiocké působení jako zralý nativní IFN-β a byl připraven rekombinantní technikou DNA. IFN-β se může připravovat pěstováním hostitelské buňky, transformované expresním vektorem zahrnujícím nukletidovou sekvenci, která kóduje polypeptid IFN-β. Hostitelskou buňkou je buňka, která může transkribovat nukleotidovou sekvenci a vytvářet žádaný protein a může být prokaryotická (například E. coli) nebo eukaryotická (například kvasnice, hmyzí nebo savčí buňka). Příklady rekombinantní produkce IFN-β jsou uvedeny v literatuře (Mantei a kol., Nátuře 297, str. 128, 1982; Ohno a kol., Nucleic Acids Res. 10, str. 967, 1982; Smith a kol., Mol. Cell. Biol. 3, str. 2156, 1983; a v americkém patentovém spise číslo US 4 462940, US 5 702699 a US 5 814485; též US 5 795 779, kde IFN-β-la je rekombinantně vyroben z vaječníkových buněk čínského křečka (CHO). Lidské interferonové geny byly klonovány pomocí rekombinantní technologie DNA (“rDNA) a byly expresovány v E.coli (Nagola a kol.,Nátuře 284, str. 316, 1980; Goeddel a kol., Nátuře 287, str. 411, 1980; Yelverton a •v «*»(

4 • 9 • 9

499·

9

9

9

9 kol., Huc. Acid Res. 9, str. 731, 1981; Streuli a kol., Proč. Nati. Acad. Sci USA 78, str. 2848, 1981). Alternativně může být IFN-β produkován transgenickým živočichem nebo rostlinou, která byla geneticky zaměřena na expresi žádaného proteinu IFN-β způsoby známými v oboru.

Alternativně může být IFN-β syntetizován chemicky jedním ze způsobů známých pracovníkům v peptidovém oboru (například Li a kol., Proč. Nati. Acad. Sci USA 80, str. 2216 až 2220, 1983; Stevard a Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, 1984; a Baraney a Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, 1980, nakladatel Gross a Meinhofer, sv. 2, Academie Press, New York, 1980, str.3 až 254, popisující techniku syntesy peptidů v pevném stavu; Bodansky, Princi ples of Peptide Synthesis, Sprínger Verlag Berlin, 1984, a nakladatel Gross a Meinhofer, 1980, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, sv. 1, Academie Press, New York), pojednávající o klasické roztokové syntese. IFN-p se může také chemicky připravovat způsobem simultánní násobné syntesy peptidů (například Houghten Proč. Nati. Acad. Sci USA 82, str. 5131 až 5135, 1984; a americký patentový spis číslo US 4 631211).

Formulace zahrnuté podle vynálezu mohou mít přibližně 0,01 mg/ml IFN-/3 a přibližně 15 mg/ml IFN-0 (hmotnost/objem) . V různých provedeních je IFN-β obsažen v množství přibližně 0,015 mg/ml až přibližně 12,5 mg/ml, přibližně 0,025 mg/ml až přibližně 10 mg/ml, přibližně 0,05 mg/ml až přibližně 8 mg/ml, přibližně 0,075 mg/ml až přibližně 6 mg/ml, přibližně 0,1 mg/ml až přibližně 4 mg/ml, přibližně 0,125 mg/ml až přibližně 2 mg/ml, přibližně 0,175 mg/ml až přibližně 1 mg/ml, přibližně 0,2 mg/ml až přibližně 0,5 mg/ml, přibližně 0,225 mg/ml až přibližně 0,2 mg/ml a přibližně 0,25 mg/ml.

V některých provedeních zahrnuje formulace podle vynálezu

4 ·

4 4 4

4444 · 4

4444

4444

4 4 1

4 4 farmaceuticky přijatelný nosič. Označením “farmaceuticky přijatelný nosič“ se míní nosič, kterého se obvykle používá v oboru k usnadnění skladování, podávání a/nebo léčivého účinku terapeutických přísad. Nosič může také snižovat jakýkoli nežádoucí vedlejší účinek IFN-p. Vhodný nosič má být stabilní, tedy neschopný reagovat s jinými složkami formulace. Nemá vytvářet nežádoucí významné lokální nebo systemické účinky v recipientech při dávkování a v koncentracích používaných k léčení. Takové nosiče jsou v oboru obecně známy. Vhodnými nosiči podle vynálezu jsou obecně používané velké stálé makromolekuly, jako jsou například albumin, želatina, kolagen, polysacharid, aonosacharidy, polyvinylpyrroplidon, polymléčná kyselina, kyselina polyglykolová, polymerní aminokyseliny, ztužené oleje, ethyl oleát, liposomy, glukóza, sacharóza, laktóza, mannóza, dextróza, dextran, celulóza, sorbitol, polyethylenglykol (PEG). Vhodné mohou být nosiče s pomalým uvolňováním, jako je kyselina hyaluronová (zvláště Přiseli a kol., Int. J. Pharmaceu. 85, str. 51 až 56, 1992; a americký patentový spis číslo

US 5 166331). K jiným přijatelným složkám v prostředku patří příkladně, tedy nikoliv jako jakékoliv omezení, farmaceuticky přijatelná činidla, která modifikují isotonicitu, včetně vody, solí, cukrů, polyolů, aminokyselin a pufrů. Příklady vhodných pufrů jsou fosfáty, citrát, sukcinát, acetát a jiné organické kyseliny nebo jejich soli a soli, které modifikují toníci tu, jako je chlorid sodný, fosforečnan sodný, síran sodný, chlorid draselný a také shora jmenované pufry.

V některých provedeních vynálezu je farmaceuticky přijatelným nosičem lidský albumin. Lidský albumin může být přírodně se vyskytující lidský albumin nebo rekombinantně produkovaný lidský albumin; tyto dvě formy jsou zde sjednoceny po pojmem lidský albumin“. Formulace podle vynálezu mohou obsahovat přibližně 0,01 % lidského albuminu a až přibližně 15 % lidského albunminu (hmotnost/objem). V různých provedenách je lidský albumin obsažen v koncentraci přibližně 0,025 % až přibližně ·« · • 4» « · * • * · · · · « 4«··«»· · • · · · * •» · ·· ···· • · t « • · · · « ♦ · 9 • < · · · • ·· · ·

12.5 %, přibližně 0,05 % až přibližně 10 %, přibližně 0,1 % až přibližně 9 %, přibližně 0,25% až přibližně 8 %, přibližně 0,5 % aě přibližně 7 %, přibližně 0,6 % až přibližně 2 %, přibližně 0, 7 % až přibližně 1,75 %, přibližně 0,75 % až přibližně

1.5 %, přibližně 1,2% až přibližně 1,3 % a přibližně 1,25 %.

Farmaceutický prostředek může dále obsahovat rozpouštědlo nebo činidlo usnadňující rozpouštění. Sloučeniny obsahující guanidiniovou skupinu, nejvýhodněji arginin, jsou vhodnými činiteli podporujícími rozpouštění IFN-β. Příklady takových rozpouštění podporujících činidel jsou aminokyselina arginin a jiné aminokyselinové analogy argininu, které si ponechávají schopnost usnadňovat rozpouštění IFN-β. K takovým analogům patří bez omezení dipeptidy a tripeptidy, ktreré obsahují arginin. 0 dalších vhodných rozpouštěcích činidlech pojednávají americké patentové spisy číslo US 4 816 440, US 4 894 330, US

004 605, US 5 183746, US 5 643 566 a Hang a kol.(J. Parenteral Drug Assoc. 34, str. 452 až 462, 1980).

Jako neomezující příklady solubi1izačních činidel vhodných podle vynálezu se uvádějí povrchově aktivní činidla (detergenty), které mají vhodně vyvážený hydrofobní a hydrofilní poměr k rozpouštění IFN-β. Použít lze silných přírodních nebo syntetických aniontových povrchově aktivních činidel, jako jsou soli alkalických kovů mastné kyseliny a alkylsulfáty alkalických kovů. Taková činidla obsahují obvykle 10 až 14 atomů uhlíku. Zvláště výhodnými solubi1izačními činidly jsou dodecylsulfát sodný (SDS) a laurát sodný. Jako jiné neomezující příklady solubi 1 izačních činidel vhodných pro prostředky podle vynálezu se uvádějí natriumdodecylsulfonát, natřiumdecylsulfát, natriumtetradecylsulfát, natriumtridecylsulfonát, natriummyristát, natriumakroylát, natriumdodecyl-N-sarkosinát a natriumtetradecyl-N-sarkosinát. Klasickou stabilizaci farmaceutických činidel povrchově aktivnímičinidly nebo emulgátory popsal například Levine a kol. (J. Parenteral Sci. Technol. 45 (3), str.160 ·· 9999

9« 9 · 9 9 9 99« · • 99« «99 «9«

9 9999 9··· «99 9

9 999 9999 «9 9 «· 9 99 99 až 165, 1991). Další vhodná povrchově aktivní činidla jsou popsána v amerických patentových spisech číslo US 4 507281, US 4 816440 a US 5 183746.

Kromě shora uvedených činidel se mohou přidávat další stabilizační činidla, jako je kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA) nebo některá z jejích solí, jako je dinatřiumEDTA, i k dalšímu podpoření stability kapalných farmaceutických prostředků. EDTA působí jako lapač kovových iontů známých ke katalýze mnoha oxidačních reakcí, čímž představuje přídavné stabilizační činidlo.

Při podávání IFN-β savcům, jako jsou lidé, je třeba brát v úvahu isotonicitu prostředku. Tak v jednom provedení poskytuje injektovatelný roztok IFN-β isotonicitu stejnou nebo podobnou pacientově séru nebo tělních tekutin. K dosažení isotonicity se může přidávat do roztoku v přiměřené koncentraci chlorid sodný, draselný nebo fosfátový pufr.

Význam má také hodnota pH formulace. Stabilizované formulace IFN-β podle vynálezu mají hodnotu pH přibližně 3,0 až přibližně 9,0. Vhodnými rozsahy pH jsou například přibližně 4,0 až přibližně 8,8, přibližně 5,0 až přibližně 8,6, přibližně 6,0 až přibližně 8,4, přibližně 6,8 až přibližně 8,2, přibližně 6,9 až přibližně 8,0 přibližně 7,0 až přibližně 7,8, přibližně 7,1 až přibližně 7,7, přibližně 7,2 až přibližně

7,6 a přibližně 7,3 až přibližně 7,5.

Farmaceuticky účinné množství stabilizovaných kapalných formulací IFN-β nebo rekonstituovaných stabilizovaných lyofilizovaných IFN-β farmaceutických formulací podle vynálezu se podává jedincům. Farmaceuticky účinným množstvím se zde míní množství, které je užitečné v léčení, prevenci nebo diagnostice choroby nebo stavu. Typickými cestami podání jsou příkladně, tedy nikoliv jako jakékoliv omezení, podání orální, nasál•· »·♦· • * · • « · • * · • · · ·· 9 ·· · * · · • · · » • · ···· « • · · • · · ·· ···* • · · • · · ♦ · · · • · · « ·· ·· ní, pulmonárni a parenterální podání včetně transdermálního, intravenosního, intramuskulárního, subkutánního, intraarteriálního a intraper itoneálního injektování nebo infuse. V jednom takovém provedení je podání injekcí, s výhodou subkutánní injekcí . Mezi injektovatelné formy prostředků podle vynálezu patří příkladně, tedy nikoliv jako jakékoliv omezení, roztoky, suspenze a emulze. Obvykle je terapeuticky účinným množstvím IFN-β přibližně 0,01 jjg/kg až přibližně 5 mg/kg prostředku, s výhodou přibližně 0,05 pg/kg až přibližně 1000 pg/kg, výhodněji přibližně 0,1 pg/kg až přibližně 500 pg/kg a ještě výhodněji přibližně 0,5 pg/kg až přibližně 30 pg/kg.

V jednom provedení je stabilizovaný farmaceutický prostředek obsahující IFN-β formulován v jednotkové dávce a může být v injektovatelné nebo infuzní formě, jako je roztok, suspenze nebo emulze. Keromě toho se může skladovat zmrazený nebo připravený ve vysušené formě, jako je lyofi 1izovaný prášek, který se může rekonstituovat na kapalný roztok, suspenzi nebo emulzi před podáním jedním z různých způsobů včetně orální nebo parenterální cesty podání. Stabilizovaný farmaceutický prostředek může být sterilován membránovou filtrací a skladuje se v obalech na jednu dávku nebo několok dávek, jako jsou lékovky nebo ampule. Dalších způsobů formulování farmaceutických prostředků obecně v oboru známých je možno použít k podpoře stálosti při skladování zde popsaných farmaceutických prostředků za předpokladu, že škodlivě neovlivní příznivé působení vysoce vyčištěného mannitolu podle vynálezu. Podrobné pojednání o formulacích a volbě farmaceuticky přijatelných nosičů a stbilizátorů je v publikaci Remington s Parmaceutical Sciences (1990) (18. vydání, Mack Pub.Co., Eaton, Pennsylvania) ,

V několika provedeních, jsou prostředky podle vynálezu baleny v injekční sříkačce (injekční stříkačky pre-filled“ podle vynmálezu). V jednom provedení může být předběžně plněná

9

9

9 9

9 9 »9 • · 9999

9999 »·♦·

9 9 9

9 9 «

9 9 9 9

9 9 9 9

99 99 injekční stříkačka podle vynálezu zmrazená. Tato zmrazená předběžně plněná injekční stříkačka je vhodná ke skladování nebo pro transportní účely.

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Vývoj farmaceutické formulace IFN-p se zvýšenou stabilitou

I. Úvod

Farmaceutické formulace IFN-p, obsahující dextrózu jako excipient, jsou v oboru známy. Jsou-li takové prostředky inkua bovány při teplotě 37 C nebo vyšší, vytváří dextróza v těchto formulacích kovalentní adukty s IFN-p, které mohou být zjištěny pomocí RP-HPLC (vysoce výkonná kapalinové reverzní fázová chromatografie). IFN-p formulovaný s mannitolem USP nevytváří kovalentní adukty za stejných podmínek zjistitené RP-HPLC. Avšak USP mannitol obsahuje nečistoty, které reagují s IFN-p za vzniku aduktů, zjišťovaných elektrosprejovou hmotovou spektrometrií. Povaha nečistot v mannitolu USP není známa. Předpokládá se, že tvoření těchto aduktů (degradativních produktů) je farmaceuticky nežádoucí a dokonce farmaceuticky nepřijatelné, jelikož běžné směrnice pro léčiva na bázi polypeptidů zdůrazňují význam minimalizace tvorby degradativních produktů ve formulacích. Degradativní produkty se považují za nežádoucí nebo nepřijatelné, jelikož zvyšují nebezpečí, že léčiva na bázi polypeptidů způsobí nežádoucí vedlejší účinky. Novým poznatkem podle vynálezu je, že IFN-p vykazuje zvýšenou stabilitu při formulaci s vysoce vyčištěným mannitolem tak, že jeho redukční aktivita je menší než 20 ppm v porovnání s případem,

9 • 9 9 * 9 9 9

9 999

9 9 9 9

9999999 9

9 9 9 •9 9999

9 9 • 99

9 9 9

9 9 9

99 kdy je formulován s mannitolem, který není vysoce vyčištěný. Novým poznatkem podle vynálezu dále je, še čištění USP mannitolu extrakcí methanolem, zpracováním uhlím, ultrafi 1trací a rekrystaližací vede k mannitolovým prostředků, se sníženou redukční aktivitou, která je menší než 20 ppm.

II. Metody

IFN-p-lb pro použití v těchto testech byl připraven v E. coli v podstatě způsobem popsaným v americkém patentovém spise číslo US 4 462940 a US 5 702699. Natriundodecylsulfát a soli se odstraní z IFN-p chromatografií a IFN-p-lb se zkombinuje s roztokem lidského albuminu při hodnotách pH li,5 až 12,0; hodnota pH roztoku se nastaví na 7,5 kyselinou chlorvodíkovou a roztok obsahující excipient (mannitol nebo dextrózu) se přidá k dosažení celkové koncentrace 1,25%. Konečná koncentrace lidského albuminu ve formulaci je 1,25% hmotnost/objem.

IFN-p-lb z těchto formulací se připraví pro hmotovou spektrometrii pomocí RP-HPLC. Tento způsob umožňuje kvantifikaci glukozylováného IFN-p-lb po jeho zjištění jako samostatného píku (Bl) na chromatogramu. Detekční mez pro glukozylovaný IFN-p-lb při této metodě je 0,02 mg/ml. Je-li velikost tohoto píku menší než 0,02 mg/ml, sečtou se obě píkové plochy a porovnají se s neformulovanou referencí IFN-p k získání obsahu IFN-p-lb. Je-li píková plocha větší než 0,02 mg/ml, jeho koncentrace se stanoví nezávisle a uvede se ve zprávě.

Pro analysu se použije následujícího zařízení a příslušných výrobcových návodů.

Solvent Delivery System: čerpadlo Waters 626;

Injekční systém: Waters 717 plus automatický vzorkovač 200 ml injekční smyčka;

polypropylenové lékovky automatického vzorkovače s telfonem ·* 44« 4 •9 ·*»· • · * 4 » · * « · · ·*94» · ♦ * · *94 4 t · 4 · » · « · * 4 • 4 4 94 ♦ <4 94 septa:

β nastvení teploty 4 C chlazeného automatického vzorkovače:

84% acetonitril se použije k promytí jehly: ohřívač sloupce: Waters 600:

O ohřívač souboru sloupce na 40 C:

Sloupec: BAKERBOND Wide-Pore Butyl C4 RP. sloupec 30 pm, 5 Pm,

4,6 mm (vnitřní průměr) 250 mm, J.T. Baker díl č. 22010.

Sloupec je spojen ve směru proudění rozpouštědla, jak vyznačeno na vinětě, a vloží se do sloupcového ohřívače.

Detektor: Waters 486 UV Detektor;

Délka vlny nastavena na 214 na:

přívod systému dat je nezeslabován:

Data System: p.E. Nelson Turbochrom Data System.

Vzorky 1yofi 1 izované formulace IFN-β se rekonstituují 1,20 ml 0,54% roztoku chloridu sodného, mírně se začnou míchat a inkubují se při teplotě okolí 30 +5 minut. Kalibrátor je neformulovaný IFN-β srovnávací vzorek. Kalibrační zásobní roztok se zředí na přibližně 0,5 mg/ml a koncentrace zředěného kalibračního roztoku se určí UV absorbanci (průměr ze 6 opakování). Konečná koncentrace zředěného kalibračního roztoku je průměr čtení UV absorbance dělený 1,7 (což je extinkční součinitel IFN-D-lb). Koncentrace zředěného kalibračního roztoku se stanoví absorbanci na 3 významná místa. Kalibrační roztok se pak zředí na 0,25 mg/ml pro použití jako pracovní kalibrační roztok .

Automatický vzorkovač se nastaví na 20 μΐ na injekci v 70-minutových intervalech. Napětí data systému je 1 volt, rychlost vzorkování je 1 bod za sekundu a akviziční doba je 70 minut. Elučním činidlem A je 0,1% TFA (tri 1fuoroctová kyselina třídy HPLC) a elučním činidlem B je 84% acetonitril (třídy HPLC) a 0,084% TFA (třídy HPLC). Průtočná rychlost elučního činidla se nastaví na 1,0 ml/min (70 % elučního činidla A a 30

·♦ * • ♦ · · « · • · · · · · « a · ···» · · · · • · · · · » ·· « ♦· · % elučního činidla B) a sloupec se vyrovnává 1 hodinu. Po vyvážení základní linie detektoru a systému, se analyzuje gradientovy slepý vzorek. Analýza začíná, když ve druhém gradientovém slepém vzorku nejsou žádné významé píky.

Koncentrace IFN-p se stanoví ze součtu ploch píků odpovídajících nemodifikovanému IFN-p (pík B ) a glukozylovánému IFN-p (pík Bl). Například když je kalibračním roztokem neformulovaný IFN-p při 0,25 mg/ml, koncentrace IFN-p (mg/ml) = (celková plocha píku testovaného vzorku Bl + B/kalibrátorová celková plocha píku Bl + B) x 0,25 mg/ml.

Data z elektrosprejových hmotových spekter (ES-MS) se získají použitím frakcí z této chromatografie. Frakce každého píku se před analýzou shromáždí a zkoncentruj! se. Elektrospre jová hmotová spektra se získají použitím single-guadruple hmotového spektometru API 100 (Perkins Elmer Sciex Instruments, Thornhill, Ontario, Kanada) připojeného na čerpadlo Harvard syringe pump (Harvard Apparatus, South Natick, MA) a injektor Rheodyne 8125 s 100 pM vnitřním průměrem potrubí taveného oxidu křemičitého. Hmotová spektra se zaznamenají v pozitivním druhu skanováním poměru hmota/šarže (m/z) v rozsahu 140 až 2500 při 6 s/skan pomocí velikosti kroku 0,2 Da. Hmotový spektrometr je kalibrován pomocí směsi polypropylen/glýko1 obsahující 3,3xlO-⁵M PPG 425, 1 xl0~⁴ M PPG 1000 a 2xl0’⁴ PPG 2000 (Aldrich Chemical Co.) v systému (objemově) 50:50=1 voda/ methanol/kysel ina mravenčí obsahujícím 2 mM octanu amonného. Podíl proteinového roztoku (20-50 pM ve 2 pl) se zavede do zdroje iontů hmotového spektrometru v systému 49:40=1 voda/acetonitri 1/kysel ina octová při 20 pl/min. Jelikož se proteiny zavádějí do zroje iontů při nízké hodnotě pH, bázická místa (například atom dusíku v bočním řetězci zbytků argininu, lysinu a histidinu) se protonují na různé stupně, čímž vzniknou molekulové ionty s četnými stavy náboje, například tM+H]⁺, [M+2H3²* v závislosti na počtu míst přístupných pro protonaci.

Detektorové záznamy poměrů m/z molekulových iontů v různých stavech náboje a hmotová spektra se mohou dekonvolutovat pomocí softwaru Biotoolbox (Perkin-Elmer Sciex Instruments) k získání proteinové molekulové hmoty. Přesnost měření molekulové hmoty při 20 kDa je ve 2 kDa.

Redukční aktivita mannitolu se zjišťuje modifikací protokolu USP. Protokol měří redukci něďnatých iontů v alkalickém roztoku v přítomnosti bicinchoninové kyseliny (BCA, Pierce, připravené podle výrobcových instrukcí). BCA vytváří komplex s měďným iontem a tento komplex má modré zabarvení s píkovou absorbancí (A) při 562 nm.

Pro každý stav se zkoušejí dva mannitolové vzorky (500 yl mannitolového roztoku 150 mg/ml). Standardní křivka se vytvoří pomocí sériových zředění glukózového roztoku se známou redukční aktivitou. Do každého zkoušeného vzorku se přidá 500 μΐ připraveného roztoku BCA, standardní vzorek a slepý vzorek a o

inkubují se 40 minut při teplotě 60 C. Glukózové standardy se přiřadí k lineární křivce a redukční aktivita mannitolových zkušebních vzorků (v ppm) se vypočte jako ((Assz vzorek mannitolu/ ski on standardní křivky)/(obsah mannitolu v mg/ml)(1000)) x 10⁶.

III. Výsledky a diskuse

Glukózyláce se stanoví v dextrozové formulaci pomocí hmotové spektrometrie jako násobek 162 Dal tonů přidaných k molekulové hmotě IFN-p-lb. Analýza peptidů IFN-p-1 předpokládá, že tyto adukty pocházejí z reakce redukčních cukrů s protein lysinovými zbytky (Amadori reakce). Obr. 1 porovnává chromatogram RP-HPLC formulované hmoty dextrozové formulace s formulae cí sušené vymrazováním uskladněné 1 týden při teplotě 50 C. Obr. 1 ukazuje, že IFN-p-lb v dextrozové formulaci reaguje oo chotně při teplotě 50 C za vytvoření píku B1 ve stavu sušeném

4 «4 • ♦ · 4 4 • 44« 4 4

4 «··4 4 · · · 4 · 4

4 4 4 4

44*4 44 4444

4« 4

4 4 4

4 4 · 4

4 4 4 4

44 44 vymrazováním. ES-MS formulované hmoty (obr. 2) nemá píky související s glukózovými adukty (plus 162). Na rozdíl od toho hmotová spektra inkubované formulace sušené vymrazováním (obr. 3) vykazují extenzivní modifikaci. Glukóza tedy reaguje s IFN-β-lb za vzniku druhů, které jsou zjištěny RP-HPLC, jejichž struktura je potvrzena ES-MS.

Na rozdíl od toho formulace IFN-β-lb připravené s USP mannitolem netvoří druhy, které lze detekovat jako pík B1 při RP-HPLC. Obr. 4 porovnává mannitolem formulovanou hmotu s fore mulací sušenou vymrazováním drženou 7 dní na teplotě 50 C. Zřetelně se netvoří žádný pík. Avšak hmotová spektra formulované hmoty na obr. 5 nevykazuje přítomnost píku při 20040, inkubované mannitolové formulace sušené 6 má nový pík při 20201. Množství vytvořeného aduktu s mannitolem nemůže být kvantifikováno ES-MS; avšak signály pro adukt jsou často blízko mezi detekce přístroje. Mechanismus vytvážení těchto píků není znám. Reakce mannitolu s IFN-β-lb netvoří druhy podobné druhům vytvořeným s dextrózou nebo glukózou; nevytváří se žádný pík B1. Data tedy naznačují, že k zabránění tvoření aduktů ΙΓΝ-β-lb je nutný čistší forma mannitolu.

a hmotové spektrum vymrazováním na obr.

Mannitol, který byl methanolem extrahován ke snížení nečistot, se pak testuje na účinek na stabilitu IFN-β-lb. IFN-β-lb se formuluje se třemi různými dávkami methanolem extrahovaného mannitolu a formulovaná hmota a koncové konteinerové testovací vzorky se zkoumají použitím shora popsaných testů RP-HPLC a ES-MS. Obr. 7 ukazuje hmotové spektrum IFN-β-lb formulovaného s neupraveného mannitolem a obr. 8 ukazuje hmotové spektrum IFN-β-lb formulovaného se stejnou dávkou mannitolu, který byl čištěn methanolem. Všechny tři dávky nmannitolu ukázaly podobný obrazec. Obr. 17 ukazuje že zpracování methanolem snižuje více než na polovinu redukční aktivitu. Je zřejmé, že methanolové čištění odstraňuje nečistoty, které vytvářejí kom28 φ» · • φ · φ φ • · · · φ · • φ φφφφ φ φ φ φφφ * φ φ· φ φφ

Φφ φφφφ φφ φφφφ φφφ φ φ φφφ φ φφφ φ φ φ φ · φ φ φφ φφ plexy s IFN-fJ-lb, avšak několik jich nebylo tímto zpracováním úplně odstraněno.

Ke snížení zbývajících nečistot v mannitolu se zařazují do čistícího procesu tři další stupně. Těmito přídavnými stupni je zpracování uhlím, ultrafi 1trace a rekrystalizace. Zkoušejí se tři dávky methanolem extrahované, zpracované uhlím, ultrafi 1trované a rekrystalizované mannitoly jako shora. Koloriometrická zkouška redukční aktivity ukazuje, že přídavné čisticí stupně snížily obsah aktivity na přibližně 10 ppm (viz obr. 17, vzorky 7 až 9). Formulace se připraví s vysoce vyčištěným mannitolem. Hmotové spektrum formulace, připravené s vysoce vyčištěným mannitolem (obr. 9), nevykazuje žádné přídavné píky, které nebyly obsaženy ve formulované hmotě připravené bez mannitolu a průběh stejného dne jako negativní kontrola (obr. 10). Hmotové spektrum formulace, připravené s USP mannitolem (obr.11), proběhla téhož dne jako pozitivní kontrola. Dodatečné zpracování mannitolu tedy poskytuje produkt, který má nízkou redukční aktivitu a nejeví se, že by reagoval s IFN-p-lb podle ES-MS.

Příklad 2

Stabilita formulací IFN-β obsahujících vysoce vyčištěný mannitol= krátkodobá urychlená studie

I. Úvod

Připraví se experimentální formulace IFN-0-lb s dextrózou a s mannitolem, jak popsáno shora, a provede se urychlená studie stability k porovnání těchto formulací. Stabilita formulace se testuje za dvou různých podmínek. První je podrobení formulace stresu z vysoké teploty, ta druhá je měření stability při dlouhodobém skladování při teplotě místnosti. Nezjišťují se žádné změny ve formulaci obsahující vysoce vyčištěný ·· · • · · · · • · · · · · • · ···· » · · • · · · · ·* · ·· ···· ·· ···· • · · · • · · · • · · · · * · · · · 9 ·· ·· o

mannitol po tříměsíčním skladování při teplotě 25 C a schopnost formulace zůstala v podstatě nezměněná po skladování tři e o měsíce při teplotě 37 C nebo jeden měsíc při teplotě 50 C.

II. Metody

Vzorky každé formulace se uskladní na dobu tří měsíců při teplotách 8 C, 25 C nebo 37 C. Kromě toho po 2 měsících se odeberou z každé teploty vzorky a skladují se další měsíc při

O z O teplotě 50 C. Účelem posunutí na teplotu 50 C je urychlit potenciální změny, ke kterým mohlo dojít v prvních dvou měsících skladování a tím umožnit lepší určení, zda umístění při teplotách 25 C a 37 C na dobu dvou měsíců určuje produkt k rychlejší degradaci když se vrátí na původní teplotu skladování 8 c.

Specifická aktivita IFN-0lb se zkoumá takto: Ze sbírek American Type Cul ture Collection se získají buňky A549 lidského rakovinového plicního karcinomu (ATCC CCL 185) a myší vir encefalomyocarditis kmen EMC (ATCC VR-129B). Vzorky formulace se rekonstitují 1,2 ml ředidla (0,54 % NaCl), sériově se zředí v prostředí Grovn/Assay Media a vnesou se na 96-důlkovou destičku spolu se standardy IFN-B-lb. Objem zředěného IFN-/3 v každém důlku je 100 pl. Buňky A549 v prostředí Grovn/Assay Media (Eagle MEM s Earle solí a 2,2 g/1 hydrogenuhl1ičitanu sodného, 8,9 % hovězího zárodečného séra, 1,79 mM L-glutaminu, 89 U/ml pěnici 11 inu a 89 pg streptomycinu /ml) se přidají při koncentraci lxlO⁴ buněk/důlek. Destička se pak inkubuje v zavlhčeném inkubátoru při 37 ±2 C, 5 + 1 % CO2 Ke konci této inkubace se buňky naočkují virem EMC za násobku infekce v rozmezí 5 a 16. Destičky se pak inkubují po dobu 24 ± 1 hodina v zavlčeném inkubátoru 37 ±2 C, 5 ± 1 % CO2. Buňky se vybarví předehřátým (37 C) roztokem 3-[4,5 dimethylthiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazolbromidu (MTT 5 mg/ml, 50 pl/důlek) a inkubují se, jak shora uvedeno, 3,5 až 4,5 hodin. Prostředí se od• · · · saje z buněk a 100 jut 1 zabarveného solubí1 izačni ho roztoku (81 % objem/objem 2-propanolu, 3 % hmotnost/objem natriumdodecylsíranu, 0,04 N HC1) se přidá do každého důlku. Destičky se inkubují 30 až 60 minut v temnotě při teplotě okolí. Destičky se pak natřásejí 8+3 minuty na mikrodestičkovém šejkru. Nakonec se měří absorbance každého důlku při 570 nm na mikrodestičkovém spektrofotometru. Aktivita standardů IFN-β se vynese na lineární regresní křivku a aktivity zkušebních vzorků se určí z této křivky. Specifická aktivita každého vzorku se vypočte na základě hmoty použitého vzorku.

Provede se analysa RP-HPLC koncentrace IFN-β-lb jak shora popsáno. Vytváření áduktu se také monitoruje v redukovaných SDS-PAGE Western blot jako zdánlivý nárůst molekulové hmotnosti pásu IFN-β-lb.

III. Výsledky a dikuse

Potence (specifická aktivita) mannitolových formulací zůstane během studie v podstatě nezměněná, zatímco u dextrózoo vých formulaci vzrůstá. Vystavení při teplotě 37 C po dobu jednoho měsíce nemá účinek na potenci (viz obr. 14 a 15). U formulací IFN-β-lb s mannitolem zůstane množství glukozylovaného IFN-β-lb pod mezí detekce po dobu studie i při teplotě 50

C. Na rozdíl od toho byla zjištěna glykozylace v dextrózových o

formulacích po dvou měsících při teplotě 37 C a po dvou týdo nech při teplotě 50 C. Rozsáhlá glykozylace modifikuje chromatogram příliš ke změření obsahu IFN-fl-lb. Tvoření aduktů v dextrózové formulaci je také zjištěno v redukovaných SDS-PAGE e

Western blot po dvou měsících skladování při teplotě 37 C neo bo jednoměsíčním skladování při teplotě 50 C, nikoli však po o

tříměsíčním skladování při teplotě 25 C. Na rozdíl od toho se nepozorují žádné změny v SDS-PAGE Western blot pro mannitolové formulace za kterýchkoliv podmínek skladování.

Příklad 3

Dlouhodobá stabilita formulací IFN-β obsahujících vysoce vyčištěný mannitol

Tři dávky (N006, N008 a NOO9) formulací IFN-<3-lb, obsahující vysoce vyčištěný mannitol, se skladuji při teplotách 4 C, 25 C a 30 C a stabilita se zkoumá v tříměsíčních intervalech po dobu 1 roku a v šestiměsíčních intervalech po další rok. Stabilita se zkoumá způsoby popsanými shora.

Všechny tři dávky si zachovávají schopnost během 24 měsíců při teplotě 4 Ca 30 C. Data jsou na obr. 16 až 18. Kromě toho nevykazují všechny tři dávky více neš 0,02 mg/ml píku B1 (glykozylováné druhy IFN-β) při všech teplotách a při testovaných časových bodech.

Pracovníci v oboru jsou schopni zjistit za využití rutinních zkušeností mnoho ekvivalentů specifického provedení vynálezu za využití IFN-β. Kromě toho pracovnici v oboru jsou schopni zjistit za využití rutinních zkušeností, že shora uvedené pokusy a formulace s použitím IFN-/3 jako příkladu jsou aplikovatelné pro proteiny obecně a pro nejzvláštnější farmaceutické proteiny. Farmaceutické proteiny zahrnují příkladně, tedy bez záměru na jakémkoliv omezení, následující proteiny: lidský růstový hormon, všechny interferony, všechny interleukiny, kolonie stimulající faktory (GM-CSF, G-CSF, M-CSF), p-glukocerebrosidáza, thyrotropiny, etanercept, monoklonální protilátky (například abciximab, basiliximab, palivizumab, rituximab a transtuzumab) krevní faktory (například faktor Vila a faktor VIII), enzymy (například urokináza, aspargináza, anístrepláza a altepláza). Takové ekvivalenty vynález zahrnuje.

Všechny shora uvedené literární a patentové publikace ve jsou určeny pracovníkům v oboru, pro možnost lepšího využívání • · vynálezu.

Průmyslová využitelnost

IFN-p nebo jeho varianty s vysoce vyčištěným mannitolem pro výrobu farmaceutických prostředků dlouhodobě skladovatelných.

Claims (40)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Prostředek, vyznačí jící bující IFN-p nebo jeho variantu a vysoce se t í m, še obsavyčištěný mannitol.
2. 2. Prostředek podle nároku 1,vyznačují se tím, še má zvýšenou stabilitu.
3. 3. Prostředek podle nároku 1,vyznačují se tím, še je lyofi 1izovaný.
4. 4. Prostředek podle nároku 1,vyznačují se tím, že je kapalný.
5. 5. Prostředek podle nároku 1,vyznačují se t í m, že vysoce vyčištěný mannitol je obsažen v množství přibližně 0,25 až přibližně 5 % hmotnost/objem.
6. 6. Prostředek podle nároku 1, vyznačují se tím, še IFN-p nebo jeho varianta je obsažen v množství přibližně 0,01 mg/ml až 15 mg/ml.
7. 7. Prostředek podle nároku 1, vyznačuj í t 1 m, že má hodnotu pH v rozmezí 3,0 až 9,0.
8. 8. Prostředek podle nároku 1, vyznačují se tím, že obsahuje lidský albumin.
9. 9. Prostředek podle nároku 8, vyznačují se tím, že lidský albumin je obsažen v množství přibližně 0,01 až přibližně 15 % hmotnost/objem.
10. 10. Prostředek vyznačují se tím, še obsahuje jako IFN-p rekombinantní lidský IFN-p v množství přibližně 0,01 mg/ml až přibližně 15 mg/ml, vysoce vyčištěný mannitol • · · · v moěství přibližně 0,25 % až přibližně 5 % hmotnost/objem, má hodnotu pH přibližně 3,0 až přibližně 9,0 a dále obsahuje lidský albumin v množství přibližně 0,01 % až přibližně 15 % hmotnost/objem.
11. 11. Prostředek podle nároku 10, vyznačují se tím, že je 1yofi 1 izováný.
12. 12. Prostředek podle nároku 10, vyznačuj í se tím, že je kapalný nebo zmražený.
13. 13. Prostředek vyznačují se tím, že obsahuje jako IFN-J3 rekombinantnl lidský IFN-p v množství přibližně 0,01 mg/ml až přibližně 15 mg/ml, vysoce vyčištěný mannitol v možství přibližně 0,25 % až přibližně 5 % hmotnost/objem, má hodnotu pH přibližně 3,0 až přibližně 9,0 a dále obsahuje lidský albumin v množství přibližně 0,01 % až přibližně 15 % hmotnost/objem a dostatek chloridu sodného k dosažení isotoniicity prostředku.
14. 14. Prostředek podle nároku 13, vyznačuj í se tím, že je lyofi 1izováný.
15. 15. Prostředek podle nároku 13, vyznačují se tím, že je kapalný nebo zmražený.
16. 16. Prostředek vyznačují se tím, že obsahuje jako IFN-p rekombinantnl lidský IFN-p v množství přibližně 0,05 mg/ml až přibližně 1 mg/ml, vysoce vyčištěný mannitol v možství přibližně 0,25 % až přibližně 2,5 % hmotnost/objem, má hodnotu pH přibližně 6,8 až přibližně 8,2 a dále obsahuje lidský albumin v množství přibližně 0,25 % až přibližně 2,5 % hmotnost/objem.
17. 17.

    Prostředek podle nároku 16, vyznačuj í • · · * · • · · « · · · · · ···· ··· ··· • ······· · · ·· · · t í m, že obsahuje dostatek chloridu sodného k dosažení isotoninicity prostředku.
18. 18. Prostředek podle nároku 16, vyznačuj í se tím, že je kapalný a kapalina je zmražena nebo lyofi 1izována
19. 19. Prostředek podle nároku 17, vyznačují se tím, že je kapalný a kapalina je zmražena nebo lyofi 1izována
20. 20. Prostředek vyznačují se tím, že obsahuje jako IFN-p rekombinantní lidský IFN-p v množství přibližně 0,25 mg/ml, vysoce vyčištěný mannitol v možství přibližně 1,25 % hmotnost/objem, má hodnotu pH přibližně 7,3 až přibližně 7,5 a dále obsahuje lidský albumin v množství přibližně 1,25 % hmotnost/objem.
21. 21. Prostředek podle nároku 20, vyznačují se t í m, že obsahuje dostatek chloridu sodného k dosažení isotoninici ty prostředku.
22. 22. Prostředek podle nároku 20, vyznačují se tím, že je kapalný a kapalina je zmražena nebo lyofi 1izována
23. 23. Prostředek podle nároku 21,vyznačují se t í m, že je kapalný a kapalina je zmražena nebo 1yofi 1izována
24. 24. Prostředek podle nároku 1,vyznačují se tím, že IFN-p je polypeptid se sekvencí aminokyselin zralého nativního lidského IFN-p.
25. 25. Prostředek podle nároku 24, vyznačují se t í m, že IFN-p je glykozylovaný nebo neglykosylováný.
26. 26. Prostředek podle nároku 1, vyznačuj í tím, že IFN-p je připravován rekombinantně.

    • · · · ···· · · · · · · • ······· ·· * · · · • · · · · · · · · · • · · · · · · · 9 9
27. 27. Předběžně plněná injekční stříkačka, vyznačuj í se t í m, že obsahuje prostředek podle nároku 1.
28. 28. Předběžně plněná injekční stříkačka podle nároku 27, vyznačují se tím, že prostředek je zmražený.
29. 29. Prostředek obsahující vyznačují se tím, že obsahuje IFN-/3 nebo jeho variantu a mannitol s redukční aktivitu menší než 20 ppm.
30. 30. Prostředek vyznačují se tím, že obsahuje farmaceutický polypeptid a vysoce vyčištěný mannitol.
31. 31. Prostředek podle nároku 30, vyznačují se tím, že farmaceutický polypeptid je volen ze souboru zahrnujícího lidský růstový hormon, interferon, interleukin, faktor stimulující granulocyt-makrofágovou kolonii, faktor stimulující granulocytovou kolonii, faktor stimulující makrofágovou kolonii, beta-glukocerebrosidázu, thyrotropiny, etanercept, monoklonální protilátky, faktor Vila, faktor VIII, urokinázu, asparginázu, anistreplázu a alteplázu.
32. 32. Způsob přípravy formulace IFN-β nebo biologicky aktivní jeho varianty se zlepšenou stabilitou, vyznačuj í se t í m, že se vytváří formulace obsahujících IFN-β nebo jeho biologicky aktivní variantu a vysoce vyčištěný mannitol ve množství postačujícím ke stabiliozaci IFN-β neboo jeho varianty.
33. 33. Formulace, vyznačují se tím, že se připravuje způsobem podle nároku 32.
34. 34. Způsob přípravy formulace IFN-β nebo jeho biologicky aktivní jeho varianty, vyznačují se tím, že • · » • · · • · ·

    9 9 9

    9 9999 99 99

    9 9 9 9 9 • · 9 9

    9 9 9 9

    9 9 9 9

    a) se odstraňuje natriumdodecylsulfát a soli ze IFN-β chromatograf i í ,

    b) kombinuje se IFN-β s roztokem lidského albuminu při hodnotě pH přibližně 11,5 až 12,0,

    c) nastavuje se hodnota pH roztoku na 7,5 kyselinou chlorovodíkovou a

    d) přidává se roztok vysoce vyčištěného mannitolu.
35. 35. Formulace vyznačují se tím, že je připravená způsobem podle nároku 34.
36. 36. Způsob podle nároku 34, vyznačují se tím, že se produkt lyofilizuje.
37. 37. Způsob zvyšování stability IFN-β nebo jeho variant ve farmaceutickém prostředku, vyznačují se tím, že se do prostředku vnáší vysoce vyčištěný mannitol v dostatečném množství ke stabilizaci IFN-β nebo jeho varianty.
38. 38. Způsob podle nároku 34, vyznačují se tím, že dále obsahuje stupeň přidávání dostatečného množství chloridu sodného k vytvoření komposice isotonickou.
39. 39. Formulace, vyznačují se tím, že se připravuje způsobem podle nároku 38.
40. 40. Způsob podle nároku 38, vyznačují se tím, že se produkt lyofilizuje.