NO330690B1

NO330690B1 - Stabiliserte interferonsammensetninger, forfyllt sproyte inneholdende denne, fremgangsmate for fremstilllling samt formulering

Info

Publication number: NO330690B1
Application number: NO20032033A
Authority: NO
Inventors: Sidney N Wolfe; Maninder S Hora
Original assignee: Novartis Vaccines & Diagnostic
Priority date: 2000-11-07
Filing date: 2003-05-06
Publication date: 2011-06-14
Also published as: US20060008447A1; ES2330508T3; US7662369B2; PT1343518E; CA2428144C; WO2002038170A2; HU228583B1; EP1343518B1; PL366329A1; DE60139339D1; NO20032033D0; PL209928B1; BG107887A; CA2428144A1; BG66082B1; AU2002230707B2; IL155788A0; EP1343518A2; AU3070702A; JP4129178B2

Description

Oppfinnelsen angår generelt farmasøytiske sammensetninger, mer spesielt stabiliserte væskeformuleringer eller lyofiliserte formuleringer av proteiner, inkludert interferon-p og andre.

Interferonene er en familie glykoproteiner der sekresjonen fra celler induseres av et antall signaler inkludert virus, dobbelttrådet RNA, andre polynukleotider, antigener og mitogener. Interferoner har flere biologiske aktiviteter, inkludert antivirale, antiproliferative og immunmodulerende aktiviteter. Minst tre ulike typer humane interferoner, a, P og y er identifisert basert på et antall faktorer, inkludert antivirale og antiproliferative aktiviteter.

Interferon-p (IFN-P) er den første identifiserte effektive behandling for de med multippel sklerose (MS), og er vist å redusere antall angrep som pasientene lider av med tilba-kefall og remitterende MS. IFN-p-sammensetningene er også nyttig ved behandling av hepatitt B- og C-infeksjoner.

Som for alle proteinbaserte farmasøytiske preparater er et hovedhinder som må over-vinnes ved anvendelsen av IFN-p som et terapeutisk middel tap av farmasøytisk nytte som kan være resultat av dens ustabilitet i farmasøytiske formuleringer. Fysikalske ustabiliteter som truer polypeptidaktiviteten og effektiviteten i de farmasøytiske formuleringer inkluderer denaturering og dannelse av løselige og uløselige aggregater, mens kjemiske ustabiliteter inkluderer hydrolyse, imiddannelse, oksidering, racemisering og deamidering. Noen av disse endringene er kjent å føre til tap eller reduksjon av den far-masøytiske aktivitet til proteinet av interesse. I andre tilfeller er den nøyaktige virkning-en av disse endringer ukjent, men de dannede degraderte produkter anses fortsatt å være farmasøytisk uakseptable på grunn av muligheten for uønskede bivirkninger.

Ustabilitet av polypeptider i farmasøytiske preparater har direkte innvirkning på deres farmasøytiske anvendbarhet, slik retningslinjer for godkjennelse av proteinbaserte far-masøytiske midler understreker at endringer i aktivitet og molekylegenskaper av polypeptidet bør være minimal. Se f.eks. rapport av 30. november 1995, angående stabili-tetstesting av bioteknologiske/biologiske produkter utgitt av "International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (en trilateral organisasjon som utformer politiske anbefalinger innenfor det farmasøytiske området for implementering i EU, Japan og U.S.A.), som uttaler "der betydelige kvalitative eller kvantitative endringer som er indikasjon på dannelse av degraderingsprodukter påvises under langtids-, aksellererte- og/eller stresstabilitetsstudier, bør betraktninger gjøres i forhold til den mulige skade og behovet for karakterisering og kvantifisering av degraderingsprodukter innenfor langtidsstabilitetsprogrammet".

Følgelig er det behov for ytterligere proteinfarmasøytiske sammensetninger, som inkluderer IFN-P-sammensetninger, omfattende fysiologisk kompatible stabilisatorer som er hovedsakelig fri for reduserende forurensninger, dermed stabiliseres proteinet og den farmasøytiske anvendbarheten økes.

Oppsummering av oppfinnelsen

Sammensetninger omfattende IFN-p som en terapeutisk aktiv komponent og svært ren mannitol som en eksipiens frembringes. Sammensetningene kjennetegnes ved forbedret stabilitet under lagring sammenlignet med IFN-P-sammensetninger inneholdende mannitol som ikke er svært rent. Fremgangsmåter for å lage disse fremgangsmåtene frembringes også.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 viser en sammenligning av RP-HPLC-kromatogrammer for dekstroseformulert IFN-p-bulk og lyofilisert pulver inkubert ved 50°C i 1 uke. Dannelse av glykosylert IFN-P-addukter i formuleringen lagret ved 50°C observeres som en annen (Bl) topp (ved omtrent fraksjon 48) forut for hoved-IFN-P-toppen (ved omtrent fraksjonene 49-50). Se eksempel 1. Figur 2 viser massespekteret for bulkdekstroseformulert IFN-p. Mange små topper påvises i tillegg til hoved-IFN-P-toppen ved 19878 amu. Se eksempel 1. Figur 3 viser massespekteret for en prøve av dekstroseformulert IFN-P lyofilisert fra bulksammensetningen og lagret ved 50°C i 1 uke. I motsetning til fig. 2 tilsvarer hoved-toppene IFN-P-addukter. Se eksempel 1. Figur 4 viser en sammenligning av RP-HPLC-kromatogrammene for USP mannitolformulert IFN-P-bulk og lyofilisert pulver inkubert ved 50°C i 1 uke. Dannelsen av glykosylert IFN-P-addukter i formuleringen oppbevart ved 50°C (tilsynekomst av Bl-toppen) ses ikke. Se eksempel 1. Figur 5 viser massespekteret til USP mannitolformulert IFN-P-bulk. IFN-P påvises som en topp ved 19880 amu. Se eksempel 1. Figur 6 viser massespekteret til USP mannitolformulert IFN-P som er lyofilisert og inkubert ved 50°C i 1 uke. Dannelse av ytterligere topper (som representerer addukter) kan ses i spekteret. Se eksempel 1. Figur 7 viser massespekteret av urenset mannitolformulert IFN-p. Dannelsen av flere ytterligere topper (som representerer addukter) kan ses i dette spekteret. Se eksempel 1. Figur 8 viser massespekteret av IFN-P formulert med metanolekstrahert mannitol fra den samme produksjonsserien som anvendt i figur 7. Størrelsen og antallet av addukt-topper er vesentlig redusert. Se eksempel 1. Figur 9 viser massespekteret av en IFN-P-formulering omfattende høyt renset mannitol (metanolekstrahert, karbonbehandlet, ultrafiltrert og omkrystallisert). Bare tre små topper, i tillegg til den dominerende toppen som representerer umodifisert IFN-p ses. Se eksempel 1. Figur 10 viser massespekteret til IFN-P formulert i fravær av mannitol. Fra dette spekteret kan det ses at de dominerende sekundære topper tilstede i fig. 9 ikke dannes ved in-teraksjon med svært renset mannitol, da de finnes også i fravær av eksipiens. Se eksempel 1. Figur 11 viser massespekteret til IFN-P formulert med USP-mannitol, analysert på den samme dagen som fig. 9 ovenfor. Dette spekter bekrefter at IFN-P formulert med USP-mannitol danner ytterligere topper (addukter) som ikke er tilstede i en IFN-P-formulering omfattende svært renset mannitol. Se eksempel 1. Figur 12 viser stabilitetsevalueringsdata for IFN-P-dekstroseformuleringer som beskrevet i eksempel 2. Figur 13 viser stabilitetsevalueringsdata for IFN-P-formuleringen omfattende svært renset mannitol som beskrevet i eksempel 2. Figur 14 viser stabilitetsevalueringsdata for produksjonsserie 006 av IFN-p-formuleringer omfattende svært renset mannitol som beskrevet i eksempel 3. Figur 15 viser stabilitetsevalueringsdata for produksjonsserie 008 av IFN-P-formuleringer omfattende svært renset mannitol som beskrevet i eksempel 3. Figur 16 viser stabilitetsevalueringsdata for produksjonsserie 009 av IFN-p-formuleringer omfattende svært renset mannitol som beskrevet i eksempel 3. Figur 17 viser den reduserende aktivitet tilstede i ulike prøver av mannitol. Prøvene 1-3 er USP-mannitol som ikke er metanolekstrahert, karbonfiltrert eller ultrafiltrert; prøvene 4-6 er USP-mannitol som er metanolekstrahert, og prøvene 7-9 er mannitol som er metanolekstrahert, karbonbehandlet, ultrafiltrert og rekrystallisert.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot IFN-P-farmasøytiske sammensetninger med økt stabilitet og fremgangsmåter for deres fremstilling. Sammensetningene omfatter IFN-P og svært renset mannitol. Den svært rensede mannitol øker stabiliteten for formuleringen ved å redusere dannelsen av degraderingsprodukter. Det stabiliserte IFN-p-formuleringen er fordelaktig ved at den er tryggere (på grunn av reduksjon i potensielle skadelige bivirkninger) og mer økonomisk (på grunn av en økning i holdbarhetstiden til formuleringen).

Foreliggende oppfinnelse omfatter sammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter biologisk aktivt IFN-P og svært renset mannitol, hvori nevnte svært rensede mannitol har en reduserende aktivitet på mindre enn 20 deler per million.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også forfyllt sprøyte, kjennetegnet ved at den omfatter sammensetningen som nevnt over.

Videre omfatter foreliggende oppfinnelse fremgangsmåte for å fremstille en formulering av biologisk aktivt IFN-p med forbedret stabilitet, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter fremstilling av en formulering omfattende IFN-P og svært renset mannitol i en mengde tilstrekkelig for å stabilisere nevnte IFN-P, hvor nevnte svært rensede mannitol har en reduserende aktivitet på mindre enn 20 deler per million.

Omfattet av foreliggende oppfinnelse er også formulering, kjennetegnet ved at den er fremstilt ifølge fremgangsmåten ifølge hvilke som helst av kravene 19-2.

Den økte stabiliteten av sammensetningen ifølge oppfinnelsen er et resultat av anvendelse av mannitol som er høyt renset. Det er et nytt funn ifølge oppfinnelsen at mannitol som ikke er høyt renset inneholder en reduserende aktivitet som interagerer med IFN-P og frembringer uønskede addukter (degraderingsprodukter), mens mannitol som er høyt renset ikke inneholder denne reduserende aktivitet og forårsaker ikke dannelse av disse adduktene i IFN-P-formuleringene. Eksperimentelle resultater presentert her i dokumentet (se eksempel 1 i eksperimentavsnittet) antyder at den reduserende aktivitet tilstede i urenset mannitol som er ansvarlig for IFN-P-adduktdannelsen ikke er en reduserende sukkeraktivitet fordi adduktene dannet ved tilstedeværelse av mannitol som ikke er svært renset kan skilles tydelig fra adduktene dannet ved tilstedeværelse av eksipienser som kjent å ha reduserende sukkeraktivitet (f.eks. dekstrose).

"Svært renset mannitol" slik det anvendes her i dokumentet, betegner mannitol med et

lavt nivå av reduserende aktivitet. Den reduserende aktiviteten til svært renset mannitol, er mindre enn 20 ppm USP målt ved den reduserende aktivitetsanalysen beskrevet andre steder i dokumentet. I ulike utførelsesformer er den reduserende aktivitet til svært renset mannitol mindre enn 19 ppm, mindre enn 18 ppm, mindre enn 17 ppm, mindre enn 16

ppm, mindre enn 15 ppm, mindre enn 14 ppm eller mindre enn 13 ppm. I en utførelses-form er svært renset mannitol USP (United States Pharmacopeia) eller ACS (American Chemical Society)-kvalitetsmannitol som har gjennomgått de tilleggsvise trinn av: 1) metanolekstrahering; 2) karbonbehandling; 3) ultrafiltrering; og 4) omkrystallisering. Den svært rensede mannitol er tilstede ved en konsentrasjon tilstrekkelig for å stabilisere formuleringen. Formuleringene som utgjør oppfinnelsen kan ha så lite som omtrent 0,1% svært renset mannitol eller så mye som 7,5% svært renset mannitol (vekt/volum). I ulike utførelseformer er mannitolen tilstede ved en konsentrasjon på ca. 0,2% til ca. 7,0%, ca. 0,25% til ca. 2,5% og ca. 1,25%.

US 4465622 A beskriver rensing av interferon og viser til at det rensede interferonet kan ha en pH 2-9 og at løsningen kan stabiliseres ved å tilsette 0,005 -1% protein, som humant albumin, 1-10% sukker, for eksempel mannitol, eller 0,01-1% aminosyrer som glycin. IWO 95/31213 Al blir formuleringer som inneholder IFN-P stabilisert med en polyol, for eksempel mannitol, beskrevet. Formuleringene inneholder også humant albumin. Her diskuteres også stabiliteten til proteiner i slike løsninger og de finner at det var en mindre degradering av IFN-p formuleringer inneholdende en polyol som mannitol enn formuleringer med sakkarose eller glycin. Sammensetninger med pH mellom 3 og 4 beskrives, hvor det tilsettes humant albumin i en konsentrasjon på 0,5-0,8%.

Både flytende og lyofiliserte farmasøytiske sammensetninger omfattende IFN-p som en terapeutisk aktiv komponent og svært renset mannitol som en eksipiens er beskrevet. For hensikter ifølge oppfinnelsen er betegnelsen "flytende" med hensyn på farmasøytis-ke sammensetninger eller formuleringer tilsiktet å inkludere betegnelsen "vandig". Betegnelsen "lyofilisert" med hensyn på IFN-p-farmasøytiske formuleringer har til hensikt å betegne en rask frysetørking under redusert trykk av flere ampuller, der hver inneholder en enhetsdose av interferonforuleringen ifølge oppfinnelsen. Frysetørkere, som utfø-rer den ovenfor beskrevne frysetørkingsprosess, er kommersielt tilgjengelige og enkle å betjene av fagpersoner innen teknikken. I en utførelsesform ifølge oppfinnelsen er den flytende sammensetningen lyofilisert.

Den flytende eller lyofiliserte IFN-P-formuleringen ifølge oppfinnelsen er "stabilisert". Ved "stabiliserte" sammensetninger eller ved sammensetninger med "økt stabilitet" eller "forbedret stabilitet" er det tilsiktet sammensetninger som har økt lagringsstabilitet i forhold til UN-|3-sammensetninger formulert med mannitol som ikke er svært renset. Denne økning i stabilitet bekreftes ved en nedgang i dannelsen av IFN-P-addukter eller degraderingsprodukter under lagring sammenligning med formuleringer med mannitol som ikke er svært renset. Dannelsen av addukter eller degraderingsprodukter kan måles ved massespektrometriske analyser beskrevet her i dokumentet. En stabilisert svært renset mannitolformulert IFN-P-sammensetning ifølge oppfinnelsen erkarakterisert vedfravær av de tilleggsvise topper som observeres i USP-mannitolformulert IFN-P sammenlignet med en IFN-P-sammensetning formulert uten mannitol, slik det ble bestemt ved massespektrometrisk analyse beskrevet her i dokumentet. Se f.eks. massespekteret til IFN-P formulert med svært renset mannitol vist i fig. 9, som viser at ingen ytterligere topper sammenlignet med massespekteret til IFN-P formulert uten mannitol vist i fig. 10.1 motsetning viser massespekteret av IFN-P formulert med USP-mannitol i fig. 11 flere ytterligere topper (addukter) sammenlignet med massespekteret til IFN-P formulert uten mannitol. De stabiliserte IFN-P-farmasøytiske formuleringer ifølge oppfinnelsen bibeholder deres styrke og inneholder mindre enn 0,02 mg/ml glukosylert IFN-P for en periode på opptil 2 år når de lagres ved 30°C og minst 2 år ved lagring ved 25°C.

De stabiliserte farmasøytiske formuleringer ifølge oppfinnelsen omfatter IFN-P og variasjoner av denne. Betegnelsen "IFN-P" som anvendt her i dokumentet betegner IFN-P eller variasjoner av denne, noen ganger betegnet IFN-p-lignende polypeptider. Humane IFN-P-varianter, som kan være naturlig forekommende (f.eks. allele varianter som opp-står ved IFN-P-lokuset) eller rekombinant fremstilt, med aminosyresekvenser som er like som, tilsvarende med eller hovedsakelig tilsvarende til det modne native IFN-P-sekvensen. Fragmenter av IFN-p eller trunkerte former av IFN-p som bibeholder sin aktivitet er også omfattet. Disse biologisk aktive fragmenter eller avkortede former av IFN-P dannes ved å fjerne aminosyrerester fra fullengde IFN-P-aminosyresekvensen ved anvendelse av rekombinante DNA-teknikker vel kjent innen feltet. IFN-P-polypeptidene kan være glykosylerte eller uglykosylerte, siden det er rapportert fra litte- råturen at både glykosylerte og uglykosylerte IFN-P viser kvalitativt like spesifikke aktiviteter og at derfor er glykosylenhetene ikke involvert i og bidrar ikke til den biologiske aktiviteten til IFN-p.

IFN-P-variantene omfattet her i dokumentet inkluderer mutasjoner av den modne native IFN-p-sekvensen (se f.eks. U.S. patent nr. 5,814,485), der en eller flere cysteinrester som ikke er essensielle for biologisk aktivitet med hensikt er fjernet eller erstattet med andre aminosyrer for å eliminere seter for enten intermolekylære kryssbinding eller feil-aktig intramolekylær disulfidbrodannelse. IFN-P-varianter av denne type inkluderer de som inneholder en lysin, valin, alanin, leucin, isoleucin, tyrosin, fenylalanin, histidin, tryptofan, serin, treonin eller metioninsubstitusjon for cysteinet ved posisjon 17 i den modne native aminosyresekvensen. Serin og treonin er de mest foretrukne erstatninger på bakgrunn av deres kjemiske likheter med cystein. Serinsubstitusjonene er mest foretrukket. Se f.eks. IFN-p-varianten der cystein i aminosyreposisjon 17 av den modne native sekvensen er erstattet med serin (U.S. patent nr. 5,814,485). Cystein 17 kan også fjernes ved anvendelse av fremgangsmåter kjent innen teknikken (se f.eks. U.S. patent nr. 4,588,584), hvilket resulterer i en moden IFN-P-mutasjon som er en aminosyre kor-tere enn det modne native IFN-p. Se også som eksempel U.S. patent nr. 4,530,787; 4,572,798; og 4,588,585. Følgelig, er IFN-P-varianter med en eller flere mutasjoner som forbedrer f.eks. deres farmasøytiske anvendbarhet også omfattet av foreliggende oppfinnelse.

Fagpersonen innen teknikken vil forstå at ytterligere endringer kan introduseres ved mutasjon i nukleotidsekvensene som koder for IFN-P, hvilket fører til endringer i IFN-P-aminosyresekvensen, uten å endre den biologiske aktiviteten til interferonet. Følgelig, kan et isolert nukleinsyremolekyl som koder for en IFN-P-variant med en sekvens som er forskjellig fra aminosyresekvensen til den modne native IFN-P dannes ved å introdusere en eller flere nukleotidsubstitusjoner, addisjoner, eller delesjoner i den tilsvarende nukleotidsekvensen beskrevet her i dokumentet, slik at en eller flere aminosyresubstitusjoner, addisjoner eller delesjoner introduseres i det kodede IFN-p. Mutasjoner kan introduseres ved standard teknikker, slik som setedirigert mutagenese og PCR-mediert mutagenese. Slike IFN-P-varianter er også omfattet av foreliggende oppfinnelse.

Konservative aminosyresubstitusjoner kan f.eks. utføres ved en eller flere forutsigbare, fortrinnsvis ikke-essensielle aminosyrerester. En "ikke-essensiell" aminosyrerest er en rest som kan endres fra villtypesekvensen av IFN-P uten å endre dens biologiske aktivitet, mens en "essensiell" aminosyrerest er nødvendig for den biologiske aktivitet. En "konservativ aminosyresubstitusjon" er en der aminosyreresten erstattes med en aminosyrerest med en tilsvarende sidekjede. Familier av aminosyrerester med like sidekjeder er definert innen teknikken. Disse familier inkluderer aminosyrer med basiske sidekjeder (f.eks. lysin, arginin, histidin), sure sidekjeder (f.eks. asparginsyre, glutaminsyre), uladede polare sidekjeder (f.eks. glycin, asparagin, glutaminsyre, serin, treonin, tyrosin, cystein), ikke-polare sidekjeder (f.eks. alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, metionin, tryptofan), beta-forgrenede sidekjeder (f.eks. treonin, valin, isoleucin), og aromatiske sidekjeder (f.eks. tyrosin, fenylalanin, tryptofan, histidin). Slike substitusjo-ner vil ikke utføres på konserverte aminosyrerester, eller på aminosyrerester som befin-ner seg innenfor et konservert område.

Alternativt, kan variant IFN-P-nukleotidsekvenser lages ved å introdusere mutasjoner tilfeldig langs hele eller deler av en IFN-P-kodene sekvens, slik som ved mettet mutagenese, eller ved at de resulterende mutasjoner screenes for IFN-p-biologisk aktivitet for å identifisere mutanter som bibeholder aktiviteten. Etter mutagenese kan det kodede protein utrykkes rekombinant, og proteinaktiviteten kan bestemmes ved anvendelse av standard analyseteknikker beskrevet her i dokumentet.

Biologisk aktive varianter av IFN-P vil vanligvis ha minst 80%, helst ca. 90% til ca. 95% eller mer og aller helst ca. 96% til ca. 99% eller høyere aminosyresekvensidentitet med referanse IFN-P-polypeptidet som fungerer som grunnlag for sammenligningen, f.eks. nativt humant IFN-p. Med "sekvensidentitet" er det tilsiktet at de samme aminosyrerester finnes innenfor variantpolypeptidet og polypeptidmolekylet som fungerer som en referanse når et spesifisert, sammenhengende segment av aminosyresekvensen av varianten oppstilles og sammenlignes med aminosyresekvensen til referansemolekylet.

For å få en optimal oppstilling av de to sekvenser i den hensikt å bestemme sekvensidentitet, kan det sammenhengende segment av aminosyresekvens til varianten ha ytterligere aminosyrerester eller slettede aminosyrerester med hensyn på aminosyresekvensen til referansemolekylet. Det sammenhengende segment anvendt for sammenligning med referanseaminosyresekvensen vil omfatte minst 20 sammenhengende aminosyrerester. Korreksjoner for økt sekvensidentitet forbundet med inklusjon av åpninger i va-riantens aminosyresekvens kan lages ved å oppstille straffepoeng "gap penalty". Fremgangsmåter for sekvensoppstilling er vel kjent innen teknikken.

Følgelig kan bestemmelse av prosentvis identitet mellom hvilke som helst to sekvenser utføres ved anvendelse av en matematisk algoritme. Et foretrukket eksempel på en matematisk algoritme anvendt for sammenligning av sekvenser er algoritmen ifølge Myers og Miller (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-7. En slik algoritme anvender ALIGN-programmet (versjon 2.0), som er en del av GCG-oppstillingsprogramvaren. En PAM120-vektresttabell, en gap penalty-lengde på 12 og en gap penalty på 4 kan anvendes med ALIGN-programmet når aminosyresekvensene sammenlignes. Et annet foretrukket eksempel på en matematisk algoritme som kan anvendes ved sammenligning av to sekvenser er algoritmen ifølge Karlin og Altschul (1990) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90:5873-5877, modifisert som i Karlin og Altschul (1993) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90:5873-5877. En slik algoritme inkorporeres i NBLAST- og XBLAST-programmene ifølge Altschul et al. (1990)./. Mol. Biol. 215:403-410. BLAST-aminosyresekvenssøk kan utføres med XBLAST-programmet, score = 50, ordlengde = 3, for å oppnå amino-syresekvenslikheter med polypeptidet av interesse. For å oppnå gap-oppstillinger for å sammenligne, kan "gapped" BLAST anvendes som beskrevet i Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3403. Alternativt kan PSI-BLAST anvendes for å utføre et "interated" søk som påviser fjerne forhold mellom molekyler. Se Altschul et al. (1997) supra. Når programmene BLAST, "gapped" BLAST eller PSI-BLAST-programmene anvendes kan standardparametere anvendes. Se http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Se også ALIGN-programmet (Dayhoff (1978) i Atlas of Protein Sequence and Structure 5:Suppl. 3, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.) og program-men i Wisconsin Sequence Analysis Package, versjon 8 (tilgjengelig fra Genetics Com-puter Group, Madison, Wisconsin), f.eks. GAP-programmet der standardbetingelsene for programmet anvendes.

Når den prosentvise aminosyresekvensidentitet vurderes, kan noen aminosyrerestposi-sjoner være forskjellig som et resultat av konservative aminosyresubstitusjoner, som ikke påvirker egenskapene til proteinet. I disse tilfeller kan prosent sekvensidentitet jus-teres oppover for å gjøre rede for likheter i de konservativt substituerte aminosyrer. Slike justeringer er vel kjent innen teknikken. Se f.eks. Myers og Miller (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17.

Biologisk aktive IFN-p-varianter ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer også IFN-P-polypeptider som er kovalent bundet med f.eks. polyetylenglykol (PEG) eller albumin. Disse kovalente hybrid IFN-P-molekylene har visse fordelaktige farmasøytiske egenskaper slik som en forlenget serumhalveringstid etter administrering til en pasient. Fremgangsmåter for å lage PEG-IFN-addukter involverer kjemiske modifiseringer av monometoksypolyetylenglykol for å danne en aktivert forbindelse som vil reagere med IFN-p. Fremgangsmåter for å lage og anvende PEG-bundede polypeptider er f.eks. beskrevet av Delgado et al. (1992) Crit. Rev. ner. Drug. Carrier Sy st. 9:249-304. Fremgangsmåter for å lage albuminfusjonspolypeptider involverer fusjon av de kodende sekvenser for polypeptidet av interesse (f.eks. IFN-P) og albumin og er beskrevet i U.S. patent nr. 5,876,969. Disse IFN-p-hybridmolekyler vil reagere med urenheter tilstede i USP-mannitol og vil være stabile når de formuleres med svært renset mannitol.

Biologisk aktive varianter av IFN-P ifølge oppfinnelsen bør bibeholde IFN-P-aktiviteter, spesielt evnen til å binde til IFN-p-reseptorer. Ifølge noen utførelsesformer bibeholder IFN-P-varianten minst ca. 25%, ca. 50%, ca. 75%, ca. 85%, ca. 90%, ca. 95%, ca. 98%, ca. 99% eller høyere biologisk aktivitet i forhold til IFN-P-referansepolypeptidet, f.eks. nativt humant IFN-p. IFN-P-varianter der aktiviteten er økt i forhold til IFN-p-referansepolypeptidet er også omfattet. Den biologiske aktiviteten til IFN-P-variantene kan måles med en hvilken som helst kjent metode innen teknikken. For eksempel kan slike analyser finnes i Fellous et al. (1982) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79:3082-3086; Czerniecki et al. (1984) J. Virol. 49(2):490-496; Mark et al. (1984) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:5662-5666; Brancaer al. (1981) Nature 277:221-223; Williams et al. (1979) Nature 282:582-586; Herberman et al. (1979) Nature 277:221-223; Anderson et al. (1982)./. Biol. Chem. 257(19):11301-11304; og IFN-p-styrkeanalyser beskrevet her i dokumentet (se eksempel 2).

IFN-P ifølge formuleringene ifølge oppfinnelsen kan være fra en hvilken som helst dy-reart inkludert, men ikke begrenset til, fugl, hundedyr, kveg, svin, hestedyr og menneske. Fortrinnsvis er IFN-P fra en pattedyr art, når formuleringen skal anvendes for behandling av IFN-P-forstyrrelser hos pattedyr, og helst fra et pattedyr av samme art som pattedyret som skal gjennomgå behandling for en slik forstyrrelse.

Eksempler på IFN-p-polypeptider og IFN-p-variantpolypeptider omfattet av foreliggende oppfinnelse er beskrevet i Nagata et al. (1980) Nature 284:316-320; Goeddel et al.

(1980) Nature 287:411-416; Yelverton et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9:731-741; Streuli et al. (1981) Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 78:2848-2852; EP028033B1 og EP109748B1. Se også U.S. patent nr. 4,518,584; 4,569,908; 4,588,585; 4,738,844; 4,753,795; 4,769,233; 4,793,995; 4,914,033; 4,959,314; 5,545,723 og 5,814,485. Dokumentene gir også retningslinjer i forhold til rester og områder av IFN-P-polypeptidet som kan endres uten tap av biologisk aktivitet. I en utførelsesform ifølge oppfinnelsen, er IFN-P i de stabiliserte farmasøytiske formuleringer modent nativt IFN-p-polypeptid. I en annen utførelsesform, er IFN-p i disse formuleringene modent IFN-P-polypeptid der cysteinet ved aminosyre 17 i den modne native sekvens er erstattet med serin som diskutert tidligere. Imidlertid omfatter foreliggende oppfinnelse andre utførelsesformer der IFN-P i den stabiliserte farmasøytiske formulering er et hvilket som helst biologisk aktivt IFN-p-polypeptid eller -variant som beskrevet hvor som helst her i dokumentet.

I noen utførelsesformer ifølge oppfinnelsen er IFN-P produsert rekombinant. Ved "rekombinant produsert IFN-P" menes et IFN-p som har sammenlignbar biologisk aktivitet med modent nativt IFN-P og som er blitt tilberedt ved rekombinante DNA-teknikker. IFN-P kan fremstilles ved å dyrke en vertscelle transformert med en ekspresjonsvektor omfattende en nukleotidsekvens som koder for et IFN-P-polypeptid. Vertscellen er en som kan transkribere nukleotidsekvensen og produsere det ønskede protein, og kan være prokaryot (f.eks. E. coli) eller eukaryot (f.eks. gjær, insekt eller pattedyrcelle). Eksempler på rekombinant produksjon av IFN-P er gitt i Mantei et al. (1982) Nature 297:128; Ohno et al. (1982) Nucleic Acids Res. 10:967; Smith-a/. (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156 og U.S. patent nr. 4,462,940, 5,702,699 og 5,814,485. Se også U.S. patent nr. 5,795,779, der IFN-P-la er fremstilt rekombinant i kinesisk hamsterovarie (CHO)-celler. Humane interferongener er blitt klonet ved anvendelse av rekombinant DNA ("rDNA)-teknologi og er blitt uttrykt i E. coli (Nagola et al. (1980) Nature 284:316; Goeddel et al. (1980) Nature 287:411; Yelverton et al. (1981) Nuc. AcidRes. 9:731; Streuli et al. (1981) Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A. 78:2848). Alternativt kan IFN-p fremstilles i et transgent dyr eller plante som er genetisk konstruert til å uttrykke IFN-P - proteinet av interesse ifølge fremgangsmåter kjent innen teknikken.

Alternativt kan IFN-P syntetiseres kjemisk ved hvilke som helst av flere teknikker kjent for fagpersoner innen peptidområdet. Se f.eks. Li et al. (1983) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80:2216-2220, Steward og Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois) og Baraney og Merrifield (1980) The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, red. Gross og Meinhofer, bind 2 (Academic Press, New York, 1980), s. 3-254, som diskuterer fastfasepeptidsynteseteknikker; og Bodansky

(1984) Principles of Peptide Synthesis (Spring-Verlag, Berlin) og Gross og Meinhofer, red. (1980) The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, bind 1 (Academic Press, New York), som diskuterer klassisk syntese i løsning. IFN-P kan også fremstilles kjemisk ved fremgangsmåter for samtidig multippel peptidsyntese. Se f.eks. Houghten (1984) Proe. Nati. Acad Sei. USA 82:5131-5135; og U.S. patent nr. 4,631,211. Sammensetningene som omfattes av foreliggende oppfinnelse kan ha så lite som 0,01 mg/ml IFN-P og så mye som ca. 15 mg/ml IFN-P (vekt/volum). I ulike utførelsesformer er IFN-P tilstede ved en konsentrasjon på ca. 0,015 mg/ml til ca. 12,5 mg/ml, ca. 0,025 mg/ml til ca. 10 mg/ml, ca. 0,05 mg/ml til ca. 8 mg/ml, ca. 0,075 mg/ml til ca. 6 mg/ml, ca. 0,1 mg/ml til ca. 4 mg/ml, ca. 0,125 mg/ml til ca. 2 mg/ml, ca. 0,175 mg/ml til ca. 1 mg/ml, ca. 0,2 mg/ml til ca. 0,5 mg/ml, ca. 0,225 mg/ml til ca. 0,3 mg/ml, og ca. 0,25 mg/ml.

I noen utførelsesformer omfatter formuleringene ifølge oppfinnelsen en farmasøytisk akseptabel bærer. Ved "farmasøytisk akseptabel bærer" menes en bærer som anvendes konvensjonelt innen teknikken for å lette lagring, administrering og/eller de helbredende virkninger av de terapeutiske ingredienser. En bærer kan også redusere en hvilken som helst uønsket bivirkning av IFN-p. En egnet bærer bør være stabil, dvs. uten evne til å reagere med andre ingredienser i formuleringen. Den bør ikke produsere betydelig loka-le elle systemiske skadelige virkninger hos mottakeren ved doser og konsentrasjoner anvendt ved behandlingen. Slike bærere er vanligvis kjente innen teknikken. Egnede bærere ifølge denne oppfinnelsen er de konvensjonelt anvendte store stabile makromo-lekyler slik som albumin, gelatin, kollagen, polysakkarid, monosakkarider, polyvinyl-pyrrolidon, polymelkesyre, polyglykolsyre, polymere aminosyrer, faste oljer, etyloleat, liposomer, glukose, sukrose, laktose, mannose, dekstrose, dekstran, cellulose, sorbitol, polyetylenglykol (PEG) og lignende. Bærere for langsom frigivelse slik som hyaluron-syre kan også være egnet. Se spesielt Prisell et al. (1992) Int. J. Pharmaceu. 85:51-56, og U.S. patent nr. 5,166,331. Andre akseptable komponenter i sammensetningen inkluderer farmasøytisk akseptable midler som modifiserer isotonisiteten inkludert vann, salter, sukkere, polyoler, aminosyrer og buffere. Eksempler på egnede buffere inkluderer fosfat, sitrat, suksinat, acetat og andre organiske syrer eller deres salter og salter som endrer tonisiteten slik som natriumklorid, natriumfosfat, natriumsulfat, kaliumklorid, og kan også inkludere bufferene opplistet ovenfor.

I noen utførelsesformer ifølge oppfinnelsen er den farmasøytisk akseptable bærer humant albumin. Det humane albumin kan være naturlig forekommende humant albumin eller rekombinant redusert humant albumin; disse to former betegnes her i dokumentet felles som "humant albumin". Formuleringene ifølge oppfinnelsen kan ha så lite som 0,01% humant albumin og så mye som ca. 15% humant albumin (vekt/volum). I noen utførelsesformer er det humant albumin tilstede ved en konsentrasjon på ca. 0,025% til ca. 12,5%, ca. 0,05% til ca. 10%, ca. 0,1% til ca. 9%, ca. 0,25% til ca. 8%, ca. 0,5% til ca. 7%, ca. 0,6% til ca. 2%, ca. 0,7% til ca. 1,75%, ca. 0,75% til ca. 1,5%, ca. 1,2% til ca. 1,3% og ca. 1,25%.

Den farmasøytiske sammensetning kan ytterligere omfatte et løseliggjøringsmiddel eller et middel som øker løseligheten. Forbindelser som inneholder en guanidiniumgruppe, helst arginin, er egnede løselighetsforsterkere for IFN-p. Eksempler på slike løselighets-forsterkere inkluderer aminosyren arginin, så vel som aminosyreanalogene til arginin som bibeholder evnen til å øke løseligheten av IFN-p. Slike analoger inkluderer, uten å begrense, dipeptider og tripeptider som inneholder arginin. Ytterligere egnede løselig-gjøringsmidler er diskutert i U.S. patent nr. 4,816,440; 4,894,330; 5,004,605; 5,183,746; 5,643,566; og Wang et al. (1980) J. Parenteral Drug Assoc. 34:452-462.

kke-begrensende eksempler på løseliggjøringsmidler omfattet av foreliggende oppfinnelse inkluderer surfaktanter (detergenter) som har en egnet hydrofob/hydrofil balanse

for å løseliggjøre IFN-p. Sterke naturlige eller syntetiske anioniske surfaktanter slik som alkalimetallsalter av fettsyrer og alkalimetallalkylsulfater kan anvendes. Slike midler vil vanligvis inneholde 10 til 14 karbonatomer. Natriumdodecylsulfat (SDS) og natriumlau-rat er særlig foretrukne løseliggjøringsmidler. Eksempler på andre løseliggjøringsmidler som kan anvendes i sammensetningene ifølge oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til, natriumdodecylsulfonat, natriumdecylsulfat, natriumtetradecylsulfat, na-triumtridecylsulfonat, natriummyrisatat, natriumkaproylat, natriumdodecyl N-sarkosinat, og natriumtetradecyl N-sarkosinat. Klassisk stabilisering av farmasøytiske midler ved surfaktanter eller emulgatorer er f.eks. f.eks. i Levine et al. (1991) J. Parenteral Sei. Technol. 45(3):160-165. Ytterligere egnede surfaktanter diskuteres i U.S. patent nr. 4,507,281; 4,816,440; og 5,183,746.

I tillegg til midlene beskrevet ovenfor, kan andre stabiliserende midler, slik som etylen-diamintetraeddiksyre (EDTA) eller et av dens salter slik som dinatrium-EDTA, tilsettes for ytterligere å øke stabiliteten av de flytende farmasøytiske sammensetninger. EDTA virker som en scavenger for metallioner kjent for å katalysere mange oksidasjonsreak-sjoner, følgelig fremskaffes et ytterligere stabiliserende middel.

Der IFN-p-formuleringen anvendes for avlevering til et pattedyr slik som et menneske, vurderes også isotonisiteten til sammensetningen. I en utførelsesform er den frembragte sammensetningen for en injiserbar løsning av IFN-P av samme isotonisitet, eller tilsvarende, som pasientserumet eller kroppsvæskene. For å oppnå isotonisitet, kan et salt slik som natriurnklorid, kaliumklorid eller en fosfatbuffer tilsettes løsningen i en passende konsentrasjon.

pH i formuleringen betraktes også. De stabiliserte IFN-P-formuleringene ifølge oppfinnelsen har en pH-område fra ca. 3,0 til ca. 9,0. Egnede pH-områder inkluderer f.eks. ca. 4,0 til ca. 8,8, ca. 5,0 til ca. 8,6, ca. 6,0 til ca. 8,4, ca. 6,8 til ca. 8,2, ca. 6,9 til ca. 8,0, ca. 7,0 til ca. 7,8, ca. 7,1 til ca. 7,7, ca. 7,2 til ca. 7,6 og ca. 7,3 til ca. 7,5.

En farmasøytisk effektiv mengde av en stabilisert flytende IFN-P-formulering eller en rekonstituert stabilisert lyofilisert farmasøytisk IFN-p-formulering ifølge oppfinnelsen administreres til et individ. Ved "farmasøytisk effektiv mengde" menes en mengde som er nyttig for behandling, forebyggelse eller diagnose av sykdommen eller tilstanden. Typiske administrasjonsmåter inkluderer, men er ikke begrenset til, oral administrering, nasal avlevering, pulmonær avlevering og parenteral administrering, inkludert trans-dermal, intravenøs, intramuskulær, subkutan, intraarteriell og intraperitoneal injeksjon eller infusjon. I en slik utførelsesform, er administrasjonsmåten ved injeksjon, fortrinnsvis subkutan injeksjon. Injiserbare former av sammensetningene ifølge oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til, løsninger, suspensjoner og emulsjoner. En terapeutisk effektiv mengde av IFN-P omfatter typisk ca. 0,01 ug/kg til ca. 5 mg/kg av sammensetningen, fortrinnsvis ca. 0,05 ug/kg til ca. 1000 ug/kg, helst fortrinnsvis ca. 0,1 ug/kg til ca. 500 ug/kg, og aller helst ca. 0,5 ug/kg til ca. 30 ug/kg.

I en utførelsesform formuleres den stabiliserte farmasøytiske sammensetningen omfattende IFN-P i en enhetsdose og kan være i en injiserbar eller infunderbar form slik som løsning, suspensjon eller emulsjon. Videre kan den lagres nedfryst eller tilberedt i en tørket form, slik som frysetørket pulver, som kan rekonstitueres til den flytende løsning, suspensjon eller emulsjon før administrering ved ulike metoder inkludert orale eller parenterale administrasjonsmåter. Den stabiliserte farmasøytiske sammensetning kan steriliseres ved membranifltrering og lagres i enhetsdoser eller flerdosebeholdere slik som forseglede glass eller ampuller. Ytterligere fremgangsmåter for å formulere en far-masøytisk sammensetning vel kjent innen teknikken kan anvendes for ytterligere å øke lagringsstabiliteten av de farmasøytiske sammensetningene beskrevet her i dokumentet forutsatt at de ikke på en skadelig måte påvirker de gunstige effektene av den svært rensede mannitolen som beskrives. En grundig diskusjon angående formulering og utvel-gelse av farmasøytisk akseptable bærer, stabilisatorer etc. kan finnes i Remington ' s Pharmaceutical Sciences (1990) (18. utgave, Mack Pub. Co., Eaton, Pennsylvania).

I noen utførelsesformer er de flytende sammensetningene ifølge oppfinnelsen pakket i en sprøyte (en forfyllt sprøyte ifølge oppfinnelsen). I en utførelsesform, kan den forfyllte sprøyten omfatte en sammensetning ifølge oppfinnelsen deretter fryses. Denne frosne forfyllte sprøyten er nyttig for lagring eller transporteringsformål.

Eksperimenter

Eksempel 1: Utvikling av en farmasøytisk IFN- B- formulering med økt stabilitet

I. Innledning

Farmasøytiske IFN-P-formuleringer inneholdende dekstrose som en eksipiens er kjent innen teknikken. Når slike formuleringer inkuberes ved en temperatur på 37°C eller høyere, danner dekstrosen i disse formuleringene kovalente addukter med IFN-P som kan påvises ved RP-HPLC (reversfase høyytelses væskekromatografi). IFN-p formulert med USP-mannitol danner ikke RP-HPLC-påvisbare kovalente addukter under de samme betingelser. USP-mannitol inneholder imidlertid forurensninger som kombinert med IFN-P danner adduktforbindelser som påvises ved elektrospraymassespektrometri. Egenskapene til forurensningene i USP-mannitol er ukjent. Dannelsen av disse addukter (eller degraderingsprodukter) betraktes å være farmasøytisk uønsket og også farmasøy-tisk uakseptable, da gjeldende retningslinjer for polypeptidbaserte farmasøytiske midler understreker viktigheten av minimalisering av dannelsen av degraderingsprodukter i formuleringer. Degraderingsprodukter anses å være uønsket eller uakseptabelt fordi de øker sjansen for at de polypeptidbaserte farmasøytiske middel vil forårsake uventede bivirkninger. Det er de oppfinneriske trekk ifølge foreliggende oppfinnelse at IFN-P viser økt stabilitet når det formuleres med mannitol som er svært renset, slik at dens reduserende aktivitet er mindre enn 20 ppm sammenlignet med når den formuleres med mannitol som ikke er svært renset. Det er ytterligere oppfinneriske trekk ifølge foreliggende oppfinnelse at rensing av USP-mannitol ved ekstrahering med metanol, karbonbehandling, ultrafiltrering og omkrystallisering fører til en mannitolpreparering med en reduserende aktivitet på mindre enn 20 ppm.

II. Fremgangsmåter

IFN-p-lb for anvendelse i disse eksperimenter ble fremstilt i E. coli hovedsakelig som beskrevet i U.S. patent nr. 4,462,940 og 5,702,699. Natriumdodecylsulfat og salter ble fjernet fra IFN-P ved kromatografi; og IFN-P-lb ble kombinert med en løsning av humant albumin ved en pH på 11,5-12,0; pH i løsningen ble justert til 7,5 med HC1; og en løsning inneholdende eksipiensen (mannitol eller dekstrose) ble tilsatt til en sluttkon- sentrasjon på 1,25%. Sluttkonsentrasjonen av humant albumin i formuleringen var 1,25% vekt/volum.

IFN-P-lb fra disse formuleringer ble tilberedt for massespektrometri ved RP-HPLC. Denne fremgangsmåten muliggjør kvantifisering av glukosylert IFN-P-lb etter det er løst som en adskilt topp (Bl) på kromatogrammet. Påvisningsgrensen for glukosylert IFN-P-lb med denne metoden er 0,02 mg/ml. Når mengden av denne toppen er mindre enn 0,02 mg/ml, summeres de to arealtoppene og sammenlignes med en uformulert IFN-P-referanse for å bestemme totalt IFN-P-lb-innhold. Når topparealet er større enn 0,02 mg/ml, bestemmes dens konsentrasjon uavhengig og rapporteres.

Følgende utstyr og deres respektive forhandleres bruksanvisning ble anvendt ved analyse.

Løsningsmiddelleveringssystem: Waters 626 Gradientpumpe

Injeksjonssystem: Waters 717 pluss Autosampler

200 ml injeksjonssløyfe

polypropylen autosamplerampuller med Teflon septa

nedkjølt autosamplertemperaturkontroll satt til 4°C

84% acetonitril anvendes som nålevask.

Kolonnevarmer: Waters 600

Kolonnevarmer satt til 40°C

Kolonne: BAKERBOND Wide-Pore Butyl C4 RP-Column, 300Å 5 ug, 4,6 mm (ID) 250 mm, J.T. Baker part number 22010.

Kolonnen kobles i løsningsmiddelstrømmen, som antydet på kolonnemerket, og plasse-res i en kolonnevarmer.

Detektor: Waters 486 UV detektor

Bølgelengde settes til 214 nm.

Datasystemets inndata er udempet.

Datasystem: P.E. Nelson Turbochrom Data System.

Lyofilisert IFN-P-formuleringsprøver ble rekonstituert med 1,20 ml 0,54% natriumklorid, vendt forsiktig for blanding og inkubert ved romtemperatur for 30 ± 5 minutter. Kalibratoren er en uformulert IFN-P-referanse. Kalibratorstamløsningen fortynnes til omtrent 0,5 mg/ml, og konsentrasjonen til den fortynnede kalibratorløsningen bestemmes ved UV-absorbans (gjennomsnitt av 6 replikater). Sluttkonsentrasjonen på den fortynnede kalibratorløsningen er gjennomsnitt av UV-absorbansavlesningene dividert med 1,7 (ekstinksjonskoeffisienten til IFN-P-lb). Den fortynnede kalibratorløsnings-konsentrasjonen bestemmes ved absorbans til 3 signifikante tall. Kalibratorløsningen ble deretter fortynnet til 0,25 mg/ml for anvendelse som arbeidskalibreringsløsning.

Autosampleren ble programmert til å injisere 20 (il pr. injeksjon ved 70 minutters intervaller. Datasystemets spenningsområde fra 1 volt, prøvefrekvensen var 1 punkt pr. se-kund og akvisisjonstiden var 70 minutter. Eluent A var 0,1% TFA (trifluoreddiksyre, HPLC-kvalitet), og eluent B var 84% acetonitril (HPLC-kvalitet) og 0,084% TFA (HPLC-kvalitet). Den eluente strømningshastigheten ble satt til 1,0 ml/minutt (70% eluent A og 30% eluent B), og kolonnen ble ekvilibrert i 1 time. Etter detektorens grunnlinje og systemet var ekvilibrert, ble en blank gradient analysert. Analysen begyn-te der ingen tydelig topper var tilstede i den andre gradientblanken.

IFN-p-konsentrasjonen bestemmes ut i fra summen av arealet til toppene som tilsvarer den umodifiserte IFN-p ("B"-toppen) og den glukosylerte IFN-p ("Bl"-toppen). Der kalibreringsløsningen er uformulert IFN-P ved 0,25 mg/ml, er f.eks. IFN-P-konsentrasjonen (mg/ml)=(testprøvens totale toppareal B1 + B/det totale kalibrerings-topparealet Bl+B) x 0,25 mg/ml.

Elektrospraymassespekteret (ES-MS) data ble oppnådd ved anvendelse av fraksjoner fra denne kromatografi. Fraksjoner av hver topp ble samlet og konsentrert før analysen. Elektrospraymassespekter ble oppnådd ved anvendelse av en API 100 singel-kvadruppel massespektrometer (Perkin-Elmer Sciex Instruments, Thornhill, Ontario, Kanada) i kontakt med en Harvard-sprøytepumpe (Harvard Apparatus, South Natick, MA) og en Rheodyne 8125 injektor med 100 uM i.d. fusert silikarørledning. Massespekteret ble registrert i den positive modus ved scanning av et masse/ladningsforhold (w/z)-område på 140 til 2500 ved 6 s/scan ved anvendelse av en trinnstørrelse på 0,2 Da. Massespektrometeret ble kalibrert ved anvendelse av en polypropylenglykolblan-ding inneholdende 3,3 x IO"<5>M PPG 425, 1 x 10"<4>M PPG 1000 og 2 x 10"<4>PPG 2000 (Aldrich Chemical Co.) i 50:50:0,1 vann:metanol:maursyre (volum:volum:volum) inneholdende 2 mM ammoniumacetat. En alikvot av proteinløsningen (20-50 pM i 2 ul) ble introdusert til massespektrometerets ionekilde i 49:40:1 vann:acetonitril:eddiksyre ved 20 ul/min. Siden proteinene introduseres i ionekilden ved lav pH, protoneres de basiske setene (f.eks. nitrogenatomene i sidekjedene til arginin, lysin og histidin) i varierende grad, hvilket resulterer i molekylære ioner med flere ladningstilstander, f.eks. [M+H]<+>, [M+2H] 9-1-, avhengig av antall seter tilgjengelige for protonering. Detektoren registrerer w/z-forholdene til de molekylære ioner i de ulike ladningstilstander og massespekteret kan tolkes ved anvendelse av Biotoolbox-programvare (Perkin-Elmer Sciex Instruments) for å oppnå proteinmolekylmassen. Nøyaktigheten på molekylmassemålingene ved 20 kDa var innenfor 2 kDa.

Den reduserende aktiviteten til mannitol ble bestemt ved en modifisering av USP-protokollen. Protokollen måler reduksjon av Cu<2+>i basisk løsning i nærvær av bicinko-ninsyre (BCA, Pierce, tilberedt ifølge produsentens bruksanvisning). BCA danner komplekser med Cu<1+>, og dette kompleks har en blå farge med en toppabsorbans (A) ved 562 nm.

To mannitolprøver (500 (il av en 150 mg/ml mannitolløsning) ble analysert ved hver betingelse. Standardkurven ble dannet ved anvendelse av seriefortynninger av en gluko-seløsning med kjent reduserende aktivitet. 500 ul av den tilberedte BSA-løsningen ble tilsatt hver testprøve, standardprøve og blankprøve, og inkubert ved 60°C i 40 minutter. Glukoseprøvene ble tilpasset en lineær kurve, og den redusende aktivitet til mannitol-testprøvene (i ppm) ble beregnet som ((A562til mannitolprøve/vinkelkoeffisienten til)/(mannitolinnhold i mg/ml) (1000)) x IO<6>.

III. Resultater og diskusjon

Glukosylering ble påvist i dekstroseformuleringen ved anvendelse av massespektrometri som multipler av 162 Dalton tillagt molekylmassen til IFN-P-lb. Analysen av IFN-P-lb-peptidene har antydet at disse addukter er et resultat av reduksjon mellom

reduserende sukkere og proteinlysinrester (Amadori-reaksjoner). Figur 1 sammenligner RP-HPLC-kromatogrammet til den formulerte bulk av dekstroseformuleringen med den frysetørkede formuleringen lagret ved 50°C i 1 uke. Figuren viser at IFN-P-lb i dekstroseformuleringen reagerer raskt ved 50°C for å danne Bl-toppen i den frysetørkede til-stand. ES-MS av den formulerte bulken (figur 2) har ingen topper forbundet med gluko-seaddukter (pluss 162). I motsetning, viser massespekteret til den inkuberte frysetørkede dekstroseformuleringen (figur 3) uttalt modifisering. Følgelig, reagerer glukosen med IFN-P-lb for å danne forbindelser som påvises ved RP-HPLC der strukturen bekreftes ved ES-MS.

Til forskjell danner ikke en IFN-p-lb-formulering laget med USP-mannitol forbindelser som kan påvises som topp Bl ved RP-HPLC. Figur 4 sammenligner mannitolformulert bulk med frysetørket formulering oppbevart i 7 dager ved 50°C. Det er tydelig at ingen Bl-topp dannes. Imidlertid viser massespekteret av den formulerte bulken i figur 5 tilstedeværelse av en topp ved 20040, og massespekteret til den inkuberte frysetørkede mannitolformuleringen i figur 6 har en ny topp ved 20201. Mengden av addukter dannet med mannitol kan ikke kvantifiseres med ES-MS; imidlertid er ofte signalene til adduktene nær deteksjonsgrensen til instrumentet. Mekanismen for dannelse av disse topper er ikke kjent. Reaksjonen mellom mannitol og IFN-P-lb danner ikke forbindelser lik de forbindelser som dannes med dekstrose eller glukose; ingen Bl-topp dannes. Følgelig antyder disse data at en renere form av mannitol er nødvendig for å forhindre dannelse av IFN-p-lb-addukter.

Mannitol som er blitt metanolekstrahert for å redusere forurensninger ble deretter un-dersøkt for sine effekter på stabiliteten av IFN-p-lb. IFN-p-lb ble formulert med tre ulike produksjonsserier av metanolekstrahert mannitol, og den formulerte bulken og testprøver fra sluttbeholder ble analysert ved anvendelse av RP-HPLC- og ES-MS-analyser beskrevet ovenfor. Figur 7 viser massespekteret til IFN-P-lb formulert med ubehandlet mannitol, og figur 8 viser massespekteret til IFN-p-lb formulert med den samme produksjonsserie av mannitol som ble renset med metanol. Alle tre produksjonsseriene av mannitol viser det samme mønsteret. Figur 17 viser at metanolbehandling fjerner mer enn halvparten av den reduserende aktiviteten. Helt tydelig, fjerner metanolbehandling forurensninger som danner komplekser med IFN-p-lb, men noen trenger ikke være fullstendig fjernet ved denne behandling.

For å redusere de gjenværende forurensninger i metanolen, ble tre ytterligere trinn tilført renseprosedyren. Disse tilleggsvise trinn er karbonbehandling, ultrafiltrering og omkrystallisering. Tre produksjonsserier av metanolekstrahert, karbonbehandlet, ultrafiltrert og omkrystallisert mannitol ble testet som ovenfor. Den kolorimetriske reduserende aktivitetsanalysen viste at de tilleggsvise rensetrinn reduserte innholdet av reduserende aktivitet til ca. 10 ppm (se figur 17, prøvene 7-9). En formulering ble tilberedt med svært renset mannitol. Et massespekter av formuleringen tilberedt med svært renset mannitol (figur 9) viste ingen ytterligere topper som var tilstede i formulert bulk tilberedt uten mannitol og analysert på samme dag som en negativ kontroll (figur 10). Et massespekter av en formulering tilberedt med USP-mannitol (figur 11) ble også analysert samme dag som en positiv kontroll. Følgelig gir den ekstra behandlingen av mannitol et produkt som har lav reduserende aktivitet og som ikke synes å reagere med IFN-p-lb ved ES-MS.

Eksempel 2: Stabilitet av IFN- B- formuleringer omfattende svært renset mannitol; kort tids aksellerert studie

I. Innledning

Eksperimentelle formuleringer av IFN-p-lb ble tilberedt med dekstrose og mannitol som beskrevet ovenfor, og en akselerert stabilisert studie ble utført for å sammenligne disse formuleringer. Stabiliteten til formuleringen ble testet under to ulike betingelser. Den første var å utsette formuleringene for høyt temperaturstress, og det andre var å måle stabilitet ved langtidslagring ved romtemperatur. Ingen endringer ble påvist i formuleringen omfattende svært renset mannitol ved lagring ved 25°C i 3 måneder, og styrken til formuleringen ble opprettholdt omtrent uendret etter lagring ved 37°C i 3 måneder eller ved 50°C i 1 måned.

II. Fremgangsmåter

Prøver av hver formulering ble lagret ved 8°C, 25°C eller 37°C i 3 måneder. I tillegg, ble det ved to månederstidspunktet tatt prøver fra hver temperatur og lagret ved 50°C i ytterligere 1 måned. Hensikten med 50°C skiftet var å forverre de potensielle endringene som kan ha funnet sted under de første 2 månedene av lagringen og følgelig muliggjøre en bedre bestemmelse av om plassering ved 25°C og 37°C i 2 måneder gjør produktet mottakelig for en raskere degradering når den returneres til den opprinnelige lagrings-temperatur på 8°C.

Den spesifikke aktivitet til IFN-P-lb ble analysert som følger. A549 humane lungekar-cinomceller (ATCC CCL 185) og murine encefalomyokardittvirus, stamme EMC (ATCC VR-129B) ble skaffet fra American Type Culture Collection. Formuleringsprø-ver ble rekonstituert med 1,2 ml fortynningsmiddel (0,54% NaCl), seriefortynnet i vekst/analysemedium, og tilsatt en plate med 96 brønner sammen med IFN-P-lb-standarder. Volumet av fortynnet IFN-P i hver brønn var 100 ul. A549-celler i vekst/analysemedium (Eagle's MEM med Earle's salter og 2,2 g/l natriumbikarbonat, 8,9% føtalt bovint serum, 1,79 mM L-glutamin, 89 U/ml penicillin og 89 ug streptomy-cin/ml) ble tilsatt ved en konsentrasjon på 1 x IO<4>celler pr. brønn. Platen ble deretter inkubert i en fuktet 37°C ± 2°C, 5 ± 1% CCvinkubator. Ved slutten av denne inkubering ble celler infisert med EMC-virus ved flere infeksjoner på mellom 5 og 16. Platene ble deretter inkubert i 24 ± 1 time i en fuktet 37° ± 2°C, 5 ± 1% C02-inkubator. Cellene ble farget med forvarmet (37°C) MTT (3-[4,5-dimetyltiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromid, 5 mg/ml, 50 ul/brønn) og inkubert som før i 3,5 til 4,5 timer. Mediet ble sugd fra cellene, 100 ul fargeoppløsningsløsning (81% volum/volum 2-propanol, 3% vekt/volum natriumdodecylsulfat, 0,04 N HC1) ble tilsatt hver brønn. Platene ble deretter inkubert i 30-60 minutter ved romtemperatur i mørket. Platene ble deretter ristet i 8 ± 3 minutter på en plateristemaskin. Til slutt ble absorbansen for hver brønn ved 570 nm målt på en mikroplatespektrofotometer. Aktiviteten til IFN-P-standarder ble tilpasset en lineær regressjonskurve, og aktivitetene til testprøvene ble bestemt ut i fra denne kurven. Den spesifikke aktiviteten for hver prøve ble beregnet basert på mengden av prøve anvendt.

RP-HPLC-analyser av IFN-p-lb-konsentrasjonen ble utført som beskrevet ovenfor. Adduktdannelse ble også registrert i redusert SDS-PAGE Western blot som en tydelig økning i molekylvekten av IFN-P-lb-båndet.

III. Resultater og diskusjon

Styrken (den spesifikke aktivitet) til mannitolformuleringene forble omtrent uendret under studien, men den til dekstroseformuleringen økte. Eksponering for temperaturer på 37°C i 1 måned hadde ingen effekt på styrken (se figurene 14 og 15). For IFN-P-lb-mannitolformuleringen forble mengden av glykosylert IFN-p-lb under deteksjonsgrensen under hele studien, selv ved 50°C. I motsetning ble glykosylering påvist i dekstroseformuleringen etter 2 måneder ved 37°C og etter 2 uker ved 50°C. Uttalt glykosylering modifiserte kromatogrammet for mye for å måle det totale IFN-P-lb-innholdet. Adduktdannelsen i dekstroseformuleringen ble også påvist i den reduserte SDS-PAGE Western blot etter 2 måneders lagring ved 37°C eller 1 måneds lagring ved 50°C, men ikke etter 3 måneders lagring ved 25°C. I motsetning, ble ingen endringer i SDS-PAGE Western blot observert for mannitolformuleringen under en hvilken som helst av lag-ringsbetinge Isene.

Eksempel 3: Langtidsstabilitet av IFN- P- formuleringer omfattende svært renset mannitol

Tre produksjonsserier (N006, N008 og N009) av IFN-P-lb-formuleringer omfattende svært renset mannitol ble lagret ved 37°C, 25°C eller 30°C og stabiliteten ble analysert ved 3 måneders intervaller i 1 år, og et 6 måneders intervall i ytterligere 1 år. Stabiliteten ble analysert ved fremgangsmåtene beskrevet ovenfor.

Alle tre produksjonsseriene opprettholdt styrken gjennom 24 måneder ved 4°C og 30°C. Dataene er vist i figurene 16-18.1 tillegg, viste alle de tre produksjonsseriene ikke mer enn 0,02 mg/ml av toppen Bl (glukosylerte IFN-p-forbindelser) ved alle temperaturer og tidspunkter som ble testet.

Det er fullt mulig for en fagperson å anvende ekvivalenter til de spesifikke utførelses-former ifølge oppfinnelsen som beskrevet her i dokumentet for IFN-p. I tillegg, vil fag personer innen teknikken forstå, at de ovennevnte eksperimenter og formuleringer som er gitt og som anvender IFN-p som et eksempel, kan anvendes for proteiner generelt, og i særdeleshet farmasøytiske proteiner. Farmasøytiske proteiner kan være humant vekst-hormon, alle interferoner, alle interleukiner, kolonistimulerende faktorer (GM-CSF, G-CSF, M-CSF), beta-glukocerebrosidase, tyrotropiner, etanercept, monoklonale antistof-fer (f.eks. abcicimab, basiliximab, palivizumab, rituximab og transtuzumab), blodfakto-rer (f.eks. faktor Vila og faktor VIII), enzymer (f.eks. urokinase, asparaginase, anistreplase, og alteplase).

Claims

1. Sammensetning,karakterisert vedat den omfatter biologisk aktivt IFN-J3 og svært renset mannitol, hvori nevnte svært rensede mannitol har en reduserende aktivitet på mindre enn 20 deler per million.

2. Sammensetning ifølge krav 1,karakterisert vedat den svært rensede mannitol er tilstede ved en konsentrasjon på 0,25% til 5% vekt pr. volum.

3. Sammensetning ifølge krav 1,karakterisert vedat nevnte IFN-p er tilstede ved en konsentrasjon på 0,01 mg/ml til 15 mg/ml.

4. Sammensetning ifølge krav 1,karakterisert vedat den har en pH innenfor et område på pH 3,0 til pH 9,0.

5. Sammensetning ifølge krav 1,karakterisert vedat den ytterligere omfatter humant albumin.

6 Sammensetning ifølge krav 5,karakterisert vedat det humane albumin er tilstede ved en konsentrasjon på 0,01 til 15% vekt pr. volum.

7. Sammensetning i følge krav 1,karakterisert vedat nevnte IFN-P er rekombinant humant IFN-P, hvor nevnte rekombinante humant IFN-P, er tilstede ved en konsentrasjon på 0,01 mg/ml til 15 mg/ml, det nevnte svært rensede mannitol er tilstede ved en konsentrasjon på 0,25% til 5% vekt pr. volum, pH av sammensetningen er 3,0 til 9,0, og sammensetningen omfatter ytterligere humant albumin ved en konsentrasjon på 0,01% til 15% vekt pr. volum.

8. Sammensetning i følge krav 1,karakterisert vedat IFN-P er rekombinant humant IFN-P, hvor nevnte rekombinante humane IFN-P er tilstede i en konsentrasjon på 0,05 mg/ml til 1 mg/ml, der nevnte svært rensede mannitol er tilstede ved en konsentrasjon på 0,25% til 2,5% vekt pr. volum, pH av sammensetningen er 6,8 til 8,2, og sammensetningen omfatter ytterligere humant albumin ved en konsentrasjon på 0,25% til 2,5% vekt pr. volum.

9. Sammensetning i følge krav 1,karakterisert vedat IFN-P er rekombinant humant IFN-P, hvor nevnte rekombinante humane IFN-P er tilstede i en konsentrasjon på 0,25 mg/ml, det svært rensede mannitol er tilstede ved en konsentrasjon på 1,25% vekt pr. volum, pH av sammensetningen er 7,3 til 7,5, og sammensetningen omfatter ytterligere humant albumin ved en konsentrasjon på 1,25% vekt pr. volum.

10. Sammensetning ifølge krav 8,karakterisert vedat den ytterligere omfatter tilstrekkelig natriumklorid for å gjøre sammensetningen isoton.

11. Sammensetning ifølge krav 7-9,karakterisert vedat sammensetningen er en væske eller sammensetningen er frosset eller lyofilisert.

12. Sammensetning i følge hvilke som helst av kravene 1-11,karakterisert vedat nevnte biologisk aktive IFN-P er polypeptidet med aminosyren sekvensen til det modne native humane IFN-P eller polypeptidet med aminosyresekvensen til det modne native humane IFN-p med en serin rest substituert for cysteinresten som finnes som aminosyre syre 17 i det modne native humane IFN-P.

13. Sammensetning ifølge krav 12,karakterisert vedat nevnte IFN-P er glykosylert eller uglykosylert.

14. Sammensetning i følge hvilke som helst av kravene 1-13,karakterisert vedat IFN-P er rekombinant fremstilt.

15. Sammensetning i følge hvilke som helst av kravene 1-14,karakterisert vedat det svært rensede mannitol har en reduserende aktivitet på mindre enn 15 deler per million..

16. Sammensetning i følge hvilke som helst av kravene 1-15,karakterisert vedat det svært rensede mannitol har en reduserende aktivitet på mindre enn 13 deler per million..

17. Forfyllt sprøyte,karakterisert vedat den omfatter sammensetningen i følge krav 1.

18. Forfyllt sprøyte ifølge krav 17,karakterisert vedat sammensetningen er frosset.

19. Fremgangsmåte for å fremstille en formulering av biologisk aktivt IFN-P med forbedret stabilitet,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter fremstilling av en formulering omfattende IFN-P og svært renset mannitol i en mengde tilstrekkelig for å stabilisere nevnte IFN-P, hvor nevnte svært rensede mannitol har en reduserende aktivitet på mindre enn 20 deler per million.

20. Fremgangsmåte i følge krav 19 ,karakterisert vedat den omfatter trinnene: a) fjerning av natriumdodecylsulfat, og salter fra IFN-p ved kromatografi; b) kombinering av IFN-P med en løsning av humant albumin ved en pH på 11,5 til 12,0; c) justering av pH i løsningen til 7,5 med HC1; og d) tilsetning av en løsning av svært renset mannitol.

21. Fremgangsmåte ifølge krav 20,karakterisert vedat den ytterligere omfatter trinnet tilsetning av tilstrekkelig natriumklorid for å gjøre sammensetningen isoton.

22. Fremgangsmåte ifølge krav 20 eller 21,karakterisertv e d at den ytterligere omfatter trinnet lyofilisering av formuleringen.

23. Fremgangsmåten i følge hvilke som helst av kravene 19-22,karakterisert vedat det svært rensede mannitol har en reduserende aktivitet på mindre enn 15 deler per million..

24. Fremgangsmåten i følge hvilke som helst av kravene 19-23,karakterisert vedat det svært rensede mannitol har en reduserende aktivitet på mindre enn 13 deler per million..

25. Formulering,karakterisert vedat den er fremstilt iføl-ge fremgangsmåten ifølge hvilke som helst av kravene 19-24.