BG107887A

BG107887A - Стабилизирани интерферонови състави

Info

Publication number: BG107887A
Application number: BG107887A
Authority: BG
Inventors: Sidney N. Wolfe; Maninder S. Hora
Original assignee: Chiron Corporation
Priority date: 2000-11-07
Filing date: 2003-06-06
Publication date: 2004-01-30
Also published as: ES2330508T3; PL366329A1; CA2428144A1; WO2002038170A2; JP2008069171A; HU228583B1; HUP0301653A2; IL155788A; JP2004536021A; US7662369B2; JP4129178B2; CN1330372C; BG66082B1; NO20032033L; CZ20031259A3; AU3070702A; WO2002038170A3; US20020114782A1; EP1343518A2; NO330690B1

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася главно до фармацевтични състави, по-специално до стабилизирани течни или лиофилизирани форми на протеини, включително интерферон-β и други.

С Предшестващо състояние на техниката

Интерфероните са семейство на гликопротеини, чието секретиране от клетките се индуцира от редица сигнали, включващи вируси, двойно-верижна RNAs ,други полинуклеотиди, антигени и митогени. Интерфероните проявяват многобразна биологична активност, включително антивирусна, антипролиферативна, и имуномодулаторна активност. Напоследък три различни типа на човешки интерферони, α, β и γ , са различени на

С база редица фактори, включително и анти-вирусна и антипролиферативна активност.

Интерферон-β /INF-β/β идентифициран първоначално за ефективно лечение на мултиплетна склероза /MS/, и е показал, че понижава броя на атаките на пациентите с повтаряща се и отслабваща MS. Съставите с интерферон-β също са полезни при лечението на инфекции от хепатит В и С.

• · · · • · · · • · ·

Както при всички фармацевтични препарати на база’ протеин, основният недостатък, който трябва да се

преодолее при използването на интерферон-β като лекарствено средство е загубата на фармацевтична полезност, която може да бъде в резултат на неговата нестабилност във фармацевтичните форми, физическата нестабилност, която заплашва активността на полипепдита и ефективонстта му във фармацевтични форми, включва денатуриране и образуване на разтворими и неразтворими агрегати, докато химическата нестабилност включва хидролиза, образуване на имид, окисление, рацемизация и деамидиране. Някои от тези промени е известно, че водят до загубата или понижаването на фармацевтичната активност на включения протеин. В други случаи, точните резултати на тези промени са неизвестни, но получените в резултат продукти на деградация, все още се считат неприемливи от фармацевтична гледна точка, поради потенциалната възможност за нежелани странични ефекти.

Нестабилността на полипептидите във фармацевтичните препарати директно пречи на фармацевтчната им полезност, тъй като основните изисквания за подобряване на фармацевтичните препарати на база протеини, наблягат на факта, че промените в активността и молекулярните характеристики на полипептида би трябвало да бъдат минимални. Виж например, Доклада • ♦ • · • · ···· върху изследването на • · · · · стабилността на биотехнологични/биологични продукти от 30 ноември 1995 , четен на International Conference on Harmonization of

Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use /тристранна организация, която създава рекомендациите за свързаната с фармацевтичните препарати, политика, осъществявана в European Union, Japan, and the USA/, в който пише, че “ по време на продължителни, ускорени и/или натоварени изследвания на стабилността са установени значителни качествени или количествени промени, сочещи образуването на разпаден продукт, трябва да се отдаде значение на потенциалните случаи и на необходимостта от охарактеризиране и количествено определяне на продуктите на разграждане в програми за продължително изследване на стабилността”. Следователно, съществува необходимостта от подобрени фармацевтични състави на база протеин, включително

съдържащи интерферон-β състави, включващи физиологично съвместими стабилизатори, които да бъдат в значителна степен свободни от редуциращи онечиствания, да стабилизират протеина и да подобряват неговата фармацевтична полезност.

СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Осигурени са състави, съдържащи интерферон-β като терапевтично активен компонент и високо пречистен манитол като носител. Съставите се характеризират с подобрена стабилност по време на съхранение в • · • · ·· ·· ·· ·· ·· ·· сравнение със съставите, съдържащи интерферон-β и манитол, който не е високо пречистен. Осигурени са и методи за получаване на тези състави.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ЧЕРТЕЖИТЕ

Фигура 1 илюстрира сравнение на RP-HPLC хроматограми на смесен с декстроза- интерферон-β маса и лиофилизиран прах, държан при 50°С в продължение на една седмица. Образуването на гликозилирани интерферон-β адукти във формите, държани при 50°С се вижда като появата на втори / В1/ пик / при приблизително 48 фракция/, предшестващ основният интерферон-β пик / при приблизително фракции 49-50/. Виж Пример 1.

фигура 2 илюстрира мас спектъра на смесения с декстроза- интерферон-β. В допълнение на основния пик на интерферон-β при 19878 amu се откриват няколко малки пикове. Виж Пример 1.

фигура 3 илюстрира мас спектъра на смесен с декстрозаинтерферон-β, лиофилизиран от насипния състав и съхраняван при 50°С в продължение на една седмица. Обратно на фигура 2, преобладаващите пикове съответстват на интерферон-β адуктите. Виж Пример 1. фигура 4 илюстрира хроматограми на смесен с USP манитол- интерферон-β маса и лиофилизиран прах, държан при 50°С в продължение на една седмица. Образуването на гликозилирани интерферон-β адукти във • · • « • · · ·· * • ···· ····· • · ♦ ····· * · · · ·· · формата, държана при 50°С /появата наВ1 пик? не*се” вижда . Виж Пример 1.

Фигура 5 илюстрира мас спектъра на смесен с USP манитол- интерферон-β, насипен състав. Интерферон-β се открива като пик при 19880 amu. Виж Пример 1.

Фигура 6 илюстрира мас спектъра на смесен с USP манитол- интерферон-β, който е лиофилизиран от насипния състав и е държан при 50°С в продължение на една седмица. В спектъра може да се види образуването на допълнителни пикове / илюстриращи адукти/. Виж Пример 1.

фигура 7 илюстрира мас спектъра на смесен с непречистен манитол- интерферон-β. На този спектър може да се види образуването на редица допълнителни пикове / илюстриращи адукти/. Виж Пример 1.

фигура 8 люстрира мас спектъра на смесен с екстрахиран с метанол манитол-интерферон -бета, от същата проба, езпалзвана при фигура 7. Големината и броя на пиковете на адуктите е значително намален. Виж Пример 1.

фигура 9 илюстрира мас спектъра на интерферон-β състав, съдържащ високо пречистен манитол / екстрахиран с метанол, пречистен с въглен, ултрафилтриран и прекристализиран/. В допълнение на преобладаващия пик , илюстриращ непроменения интерферон-бета, се виждат само три малки пика. Виж” Пример 1.

Фигура 10 илюстрира мас спектъра на интерферон-β в отсъствие на манитол .От този спектър е видно, че преобладаващите вторични пикове, присъстващи на фигура 9, не са образувани от взаимодействието с високо пречистения манитол, тъй като те се появяват също в отсъствието на носителя. Виж Пример 1.

фигура 11 илюстрира мас спектъра на интерферон-β състав, съдържащ USP манитол, получен същия ден, както и този от фигура 9 по-горе. Този спектър потвърждава, че съставът на интерферон-бета с USP манитол образува допълнителни пикове / адукти/, които не присъстват в спектъра на състава на интерферон -бета, съдържащ високо пречистен манитол. Виж Пример 1. фигура 12 илюстрира данните за стабилността на състави на интерферон-бета с декстроза, описани в Пример 2. фигура 13 илюстрира данните за стабилността на състави на интерферон-бета с високо пречистен манитол, описани в Пример 2.

фигура 14 илюстрира данните за стабилността за Lot 006 на състави на интерферон-бета с високо пречистен манитол, описани в Пример 3.

Фигура 15 илюстрира данните за стабилността за Lot 008 на състави на интерферон-бета с високо пречистен манитол, описани в Пример 3.

• · •с ····

Фигура 16 илюстрира данните за стабилността за Lot 009* на състави на интерферон-бета с високо пречистен манитол, описани в Пример 3.

фигура 17 илюстрира редуциращата активност , налична в различни проби манитол. Проби 1-3 са с USP манитол, който не е бил естрахиран с метанол, обработен с въглен или ултрафилтриран; проби 4-6 са с USP манитол, който е бил екстрахиран с метанол, и проби 7-9 са с манитол, който е бил екстрахиран с метанол, обработен с въглен, © ултрафилтриран и прекристализиран.

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Изобретението се отнася до фармацевтични състави на INF-β с повишена стабилност и до методите за тяхното получаване. Съставите включват INF-β и високо пречистен манитол. Високо пречистеният манитол повишава стабилността на състава посредством понижаване образуването на разпадни продукти. Стабилизираният INF-β състав има преимуществото, че е по-безопасен / благодарение на понижаване на потенциалните вредни странични ефекти/ и по -икономичен / благодарение на повишаване на полуживота на състава/.

Повишената стабилност на описаните състави е резултат от използването на манитол, който е високо пречистен. Установи се, съгласно изобретението, че не добре пречистеният манитол притежава редуцираща активност, която взаимодейства с INF-β до получаване на нежелани ···· адукти / разградни продукт/, докато манитолът, ’който е” високо пречистен не притежава тази редуцшраща активност и не причинява образуването на тези адукти в INF-β съставите. Опитните резултати, представени тук / виж Пример 1 в Опитната част/ показва, че редуциращата активност, налична в непречистения манитол, която е отговорна за образуването на INF-β адукт, не е редуцираща захарна активност, защото адуктите, образуване в присъствието на манитол, който не е високо пречистен, могат да бъдат ясно разграничени от адуктите, образувани в присъствието на носители с известна редуцираща захарна активност / например, декстроза/.

“Високо пречистен манитол”, както е използван тук , се отнася до манитол, който има ниска степен на редуцираща активност. Редуциращата активност на високо пречистеният манитол е по-ниска от 20 части на милион USP, измерена посредством анализа на редуциращата активност, описан тук. При различни изпълнения, редуциращата активност на високо пречистения манитол е по-ниска от 19 части на милион, по-ниска от 18 части на милион, по-ниска от 17 части на милион, по-ниска от 16 части на милион, по-ниска от 15 части на милион, по-ниска от 14 части на милион, по-ниска от 13 части на милион. Пр едно от изпълненията, високо пречистеният манитол е с USP / United States Pharmacopeia/ или ACS /American Chemical Society/степен ·· • · · · · • · »·· · · • · · · · · · • · · · · · ·· ·· ·· ·* ·· на чистота, който манитол е бил подложен на с(допълнителни етапи на : 1/ екстракция с метанол; 2/ обработка с въглен; 3/ ултрафилтриране; и 4/ прекристализация. Високо пречистеният менитол присъства в концентрации, достатъчни за стабилизиране на състава. Съставите, включени в изобретението, могат да имат от порядъка на 0.1% високо пречистен манитол или до около 7.5 % високо пречистен манитол / тегло/ обем/. При различни изпълнения, манитолът присъства в © концентрация от около 0.2 % до около 7.0 %, около 0.25 до около 2.5% и около 1.25%.

Описани са както течни, така и лиофилизирани фармацевтични състави включващи INF-β като терапевтично активен компонент и високо пречистен манитол като носител. За целите на изобретението, терминът “ течен” по отношение на фармацевтичните състави или форми, е предназначен да включва термина “ _ воден”. Терминът “ лиофилизиран” по отношение на INF-β фармацевтичните състави е предназначен да се отнася до бързо сушене чрез замразяване при понижено налягане на множество стъкленици, всяка съдържаща единична доза интерферонов състав, съгласно изобретението. Лиофилизаторите, които се използват за описаната погоре лиофилизация, са търговски достъпни и лесни за работа за специалистите в дадената област на техниката. При едно изпълнение на изобретението, течният състав е лиофилизиран.

• · ·· ·< ···» • ·· · · · · · ... . • · · · * * · · ...

·· ·· ·· ·· ·· ··

Течните или лиофилизирани INF-β състави, съгласно изобретението, са “ стабилизирани”. Под “ стабилизирани” състави или под състави с “повишена стабилност” или “ подобрена стабилност”, се имат предвид състави, които имат повишена устойчивост на съхранение в сравнение с INF-β състави, получени при смесване с не високо пречистен манитол. Това повишаване на стабилността се проявява чрез понижаване образуването на INF-β адукти или разпадни продукти, по време на съхранение в сравнение със съставите с манитол, който не е високо пречистен. Образуването на адукти или разпадни продукти може да бъде измерено при използване на мас спектрометричния анализ, описан тук. Състав на INF-β, приготвен с високо пречистен манитол, съгласно изобретението, се характеризира с отсъствието на допълнителните пикове, които се наблюдават при състав на INF-β, приготвен с USP манитол, когато се сравнява със спектъра на INF-β състав, приготвен без манитол, както е определено с помощта на мас спектрометричния анализ, описан тук. Виж например, спектъра на състава на INF-β, приготвен с високо пречистен манитол, показан на фигура 9, който няма допълнителни пикове в сравнение с мас спектъра на състава на INF-β, приготвен без манитол, показан на фигура 10. Обратно, мас спектърът на състава на INF-β, приготвен с USP манитол, показан на фигура 11, има редица допълнителни пикове / адукти/ в • ·

-- ·· 99 ·· ·· _al сравнение c мас спектъра на състава на INF-β, приготвен без манитол. Стабилизираните фармацевтични състави на INF-β, съгласно изобретението, запазват тяхната активност и съдържат по-малко от 0.02 мг/мл гликозилиран INF-β за период до около две години, когато са съхранявани при 30°С и за поне две години, когато са съхранявани при 25°С.

Стабилизираните фармацевтични състави, съгласно изобретението , съдържат INF-β и негови варианти. Терминът “INF-β “, както е използван тук се отнася до INFβ и негови варианти, отнасяни понякога като INF-β подобни полипептиди. Вариантите на човешкия INF-β , които могат да бъдат от естествен произход / например, алелични варианти, които се срещат на INF-β мястото/ или получени с рекомбинантна технология, имат амино киселинни последователности, които са същите като, подобни на или съществено подобни на естествената С зряла INF-β последователност, фрагменти на INF-β или срязани форми на INF-β , които запазват тяхната активност, също са включени. Тези биологично активни фрагменти или срязани форми на INF-β са създадени посредством отстраняване на амино киселинни остатъци от пълната дължина на амино киселинната последователност на INF-β при използване на рекомбинантни DNA технологии, добре познати в тази област на техниката. INF-β полипептиди могат да бъдат ·♦· ··♦ · ф * ··«· · · · · · · _t• ·· ··· ·· · · · · ···· · · · · « · · ♦· ·· ·· ·· ·· · гликозилирани или негликозилирани, както е описано в литературата и гликозилираните и негликозилираните INFβ форми показват количествено подобни специфични активности и, затова гликозилните части не са включени и не допринасят за биологичната активност на INF-β.

INF-β варианти, обхванати тук, включват мутеини на последователността на зрелия естествен INF-β / виж, например, патент на САЩ N2 5,814,485, включен тук за справка/, където един или повече цистеинови остатъци, които не са съществени за биологичната активност, са съзнателно заличени или заместени с други амино киселини, за да елиминират места било за интермолекулярно свързване или за неправилно образуване на интермолекулярна дисулфидна връзка. INFβ вариантите на този тип включват тези, които съдържат глицин, валин, аланин, левцин, изолевцин, тирозин, фенидаланин, хистидин, триптофан, серин, треонин или метиониново заместване на цистеина, намиращ се при амино киселина 17 на зрялата естествена амино киселинна последователност. Серинът и треонина са попредпочитаните субституции поради тяхната химическа аналогия с цистеина. Сериновите субституции са найпредпочитаните. Виж, например , INF-β варианта, където цистеинът, намиращ се при амино киселина 17 на зрялата естествена амино киселинна последователност, е заместен със серин / патент на САЩ N2 5,814,485/.

·· ·« ·· ·· • · ♦ · · * ·♦♦ · · ··· • · · · · « · • · · · · · ·· ·· ·· ·· ·»

Цистеин 17 може също да бъде заличен при използване на методи, известни в тази област на техниката / виж например, патент на САЩ N2 4,588,584, включен тук за справка/, което води до получаване на зрял INF-β мутеин, който е с една амино киселина по-кис от зрелия естествен

INF-β. Виж също, например, патенти на САЩ 4,530, 787;

»··♦

4,572,798; и 4,588,585. Така, INF-β вариантите с една или повече мутации, които подобряват, например, тяхната фармацевтична полезност, също са обхванати от настоящето изобретение.

Специалистът в дадената област може да прецени, че допълнителни промени могат да бъдат въведени посредством мутация в нуклеотидните последователности, кодиращи INF-β, водещи до промени в амино киселинната последователност на INF-β, без да се промени биологичната активност на интерферона. Така, една изолирана молекула на нуклеинова киселина, кодираща INF-β вариант, който има последователност, която се отличава от амино киселинната последователност за зрелия естествен INF-β, може да бъде създадена посредством въвеждане на една или повече нуклеотидни субституции, добавяния или заличавания в съответната нуклеотидна последователност, описана тук, така че една или повече субституции, добавяния или заличавания на амино киселини, да бъдат внесени в кодирания INF-β.Мутации ···· ·· ·» »· ·« • · · · · · · • · ·<· · · ··· · • · · · » * ·· «·· ···’ »··» е ·· ·· ·· »· ·· ·· могат да бъдат внесени посредством стандартните методики, такива като място-директна мутагенеза и PCRопосредствена мутагенеза. Такива INF-β варианти също са обхванати в настоящето изобретение.

Например, кансервативни амино киселинни субституции могат да бъдат направени при един или повече предварително определени, за предпочитане неесенциални амино киселинни остатъци. “Неесенциален” амино киселинен остатък е остатък, който може да бедъ © променен от дивия-тип последователност на INF-β без да се промени биологичната му активност, докато “есенциален” амино киселинен остатък е остатък, необходим за биологичната активност. “Консервативна субституция на амино киселина” е такава, при която амино киселинният остатък е заместен с амино киселинен остатък, който има подобна странична верига, фамилии на амино киселинни остатъци, които имат подобни странични вериги са определени в тази област на техниката. Тези фамилии включват амино киселини с базични странични вериги / например, лизин, аргинин, хистидин/, киселинни странични вериги / например, аспартанова киселина, глутаминова киселина /, ненатоварени поларни странични вериги / например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин/, неполарни странични вериги / например, аланин, валин, левцин, изолевцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан/ и ароматни странични вериги / например, ··«· • · 9 · · * · ·· • · ··· · 9 ··· · «· ···· 9 9 9 9 9 9 99 ·· ·♦ ·· 99 999· тирозин, фенилаланин, триптофан, хистидин/. Такива субституции не биха били направени за запазени амино киселинни остатъци или за амино киселинни остатъци, присъстващи в запазен мотив.

Съответно, вариантни INF-β нуклеотидни последоватебности могат да бъдат създадени посредством въвеждане на мутации по дължината или на част от INF-β кодираща последователност, например чрез сатурираща мутагенеза, и получените в резултат мутанти С могат да бъдат подложени на скрининг за INF-β биологична активност за идентифициране на мутанти, които запазват активността. След мутагенезата, кодираният протеин може да бъде експресиран рекомбинантно, и активността на протеина може да бъде определена при използване на стандартните методики за анализ, описани тук.

Биологично активните варианти на INF-β ще имат С обикновено поне 80%, за предпочитане около 90% до около 95% или повече, и най-вече около 96% до около 99% или повече амино киселинна последователност, идентична на INF-β полипептида, който служи за база за сравнение, например естествен човешки INF-β. Под “ идентичност на последователността” се разбира, че същите амино киселинни остатъци са намерени във вариантния полипептид и полипептидната молекула, която служи като сравнение, когато се сравнява с определен, близък • · • · • · • · · · ·· ·· ·· ·· ·· ·· сегмент на амино киселинната последователност на

варианта се изравнява и сравнява с амино киселинанната последователност на молекулата за сравнение.

За целите на оптимално изравняване на две последователности за целите на дефиницията на идентичност на последователност, близкият сегмент на амино киселинната последователност на варианта, може да има допълнителни амино киселинни остатъци или заличени амино киселинни остатъци по отношение на амино киселинната последователност на молекулата за сравнение. Близкият сегмент .използван за сравнение с амино киселинната последователност на молекулата за сравнение, включва най-малко 20 близки амино киселинни остатъци. Корекцци за повишаване идентичността на последователността на варианта , сварзани с включване на празнини в амино киселинната последователност на варианта, могат да бъдат направени посредсвом определяне на санкции за празнина.Методи за изравняване на последователността са добре известни в тази област на техниката.

Така, определянето на процент на идентичност между всеки две последователности може да бъде осъществено при използване на математически алгоритим. Един предпочитан, неограничаващ пример на математически алгоритъм, използван за сравняване на последователности е алгоритъма на Myers and Miller /1998/ Comput. Appl. Biosci. 4:11-7. Такъв един алгоритъм е • β · · ·· ·· ·· ·· ·· ·· ·· използван в ALIGN програмата I версия 2.0/, която е част от GCG софтуерния пакет за изравняване.А РАМ120 таблица за тегло на остатък, санкция за дължина на празнина 12, и санкция за празнина 4 могат да бъдат използвани с ALIGN програмата, когато се сравняват амино киселинни последователности.Друг предпочитан, неограничаващ пример на математически алгоритъм за използване при сравняване на две последователности е алгоритъма на Karlin and Alschul /1990/ Proc. Natl. Acad. © Sci USA 90:5873-5877, модифициран от Karlin and Altschul /1993/ Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:5873-5877. Един такъв алгоритъм е включен в NBLAST и XBLAST програмите на Altschul et al. /1990/ J. Mol. Biol. 215:403-410. BLAST изследвания на амино киселинни последователности могат да бъдат осъществени с XBLAST програмата, резултат=50, дължина на вълната=3, до получаване на амино киселинна последователност, подобна на представляващия интерес, полипептид. За получаване на изравнявания за целите на сравнение, може да бъде използван BLAST, както е описан в Altschul et al. /1997/Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Съответно, PSIBLAST може да бъде използван за обсъществяване на проучване, което открива далечни отношения между молекулите. Виж Altschul et al. /1997/supra. Когато се използват BLAST, gapped BLAST или PSIBLASTnporpaMHTe ,могат да бъдат използвани липсващите параметри. Виж http://www.ncbi.nlm.nlh.gov.

• · • · • · · • · · · · • · · • · · • · · ·

Виж също ALIGN програмата /Dayhoff /1978/ Protein Sequence and Structure 5: Suppl. 3, Biomedical Research Foundation, Washinton, програмите в Wisconsin Sequence Analysis

Version 8 /достъпни от Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin/, например, GAP програмата, където са • · · ·· <

• · · · ·· • ···· · ·« • · · ·· • · · ·· • · · ·

Atlas of

National

D.C/ и

Package,

F**

използвани липсващите параметри на програмата.

Когато се отчита процента на идентичност на амино киселинната последователност, положенията на някои амино киселинни остатъци могта да се отличават като резултат на консервативните амино киселинни субституции, което не повлиява свойствата на протеиновата функция. При тези случаи , процентът на идентичност на последователността може да бъде нагласен нагоре за балансиране на подобието при консервативно субституираните амино киселини. Тези нагласявания са добре познати в тази област на техниката. Виж, например, Myers and Miller /1988/ Comput. Appl. Biosci. 4:11-17.

Биологично активните IFN-β варианти, обхванати от изобретението, също включват IFN-β полипептиди, които имат ковалентна връзка с, например, полиетилен гликол /PEG/ или албумин. Тези ковалентни хибридни IFN-β молекули притежават някои желани фармацевтични свойства, такива като удължен полуживот на серума след даването му на пациента. Методите за създаване на PEG19

IFN-β адукти включват химическа модификация на монометоксиполиетилен гликол до създаване на активирано съединение, което да реагира с IFN-β. Методите за получаване и за използване на PEGсвързани полипептиди са описани, например в Delgado et al. /1992/ Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst. 9: 249-304. Методите за създаване на албумин-слепени полипептиди включват слепване на кодиращите последователности за полипептида, който представлява интерес / например IFNβ / и на албумина и са описани в U.S.P.No 5,876,969, включен тук за справка. Тези хибридни IFN-β молекули взаимодействат с онечистванията, присъстващи в USP манитола и са по-стабилни, когато се приготвят с високо пречистен манитол.

Биологично активните варианти на IFN-β, обхванати в изобретението, трябва да запазват IFN-β активностите, особено способността да се свързват към IFN-β рецепторите. При някои изпълнения, IFN-β вариантът запазва най-малко около 25%, около 50%, около 75%, около 85%, около 90%, около 95%, около 98%, около 99% или повече от биологичната активност на използвания за сравнение IFN-β полипептид, например естествен човешки IFN-β. IFN-β варианти, чията активност е увеличена в сравнение с активността на използвания за сравнение IFN-β полипептид, също са включени в обхвата на изобретението. Биологичната активност на IFN-β • ·

-- - w · a .

ϊ · · · ··a • · ··· · ···· a ·· • ·· · · · ·· ··· ·.

·..· ·.........

·· ·· ·· ·· ·· ·· вариантите може да бъде измерена по който и да е известен за целта метод от тази област на техниката. Примери на такива анализи могат да бъдат намерени във Fellous et al. /1982/ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:3082-3086; Czerniecki et al., /1984/ J. Virol. 49/2/:490-496; Mark et al. /1984/ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5662-5666; Branca et al. /1981/ Nature 277:221-223; Williams et al. /1979/ Nature 282:582-586; Herberman et al. /1979/ Nature 277:221-223; Anderson et al. /1982/ J.Biol. Chem. 257/19/: 11301-11304; и C анализа на ефективността HalFN-β, описан тек / виж

Пример 2/.

IFN-β от съставите, съгласно изобретението, може да бъде от всеки животински вид включително, но без да е ограничен до, птичи, кучешки, говежди, свински, конски и човешки. За предпочитане, е IFN-β от бозайници, когато съставът се използва за лечение на IFN-β разстройства у бозайници, и по-специално за предпочитане е от бозайник Сот същия вид, от който е бозайника, подложен на лечение за такова разстройство.

Неограничаващи примери на IFN-β полипептиди и IFN-β вариантни полипептиди, обхванати от изобретението, са изброени от Nagata et al. /1980/ Nature 284:316-320; Goeddel et al. /1980/ Nature 287:411-416; Yelverton et al. /1981/ Nucleic Acids Res. 9:731-741; Streuli et al. /1981/ Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 2848-2852; EP028033B1, EP109748B1. Виж също U.S. NOs. 4,518,584; 4,569,908;

4,769,233;

4,793,995;

4,588,585; 4,738,844;

4,753,795;

4,914,033; 4,959,314; 5,545,723; 5,814,485. Тези описания са включени тук за справка. Тези източници също осигуряват ръководство по отношение на остатъци и области на IFN-β полипептида, които могат да бъдат променяни без да се загуби биологичната активност.

При едно изпълнение на изобретинето, IFN-β в стабилизираните фармацевтични състави, е зрелия естествен IFN-β полипептид. При друго изпълнение, IFN-β в тези състави е зрелия IFN-β полипептид, при който цистеинът, намиращ се при амино киселина 17 на зрялата естествена последователност е заменен със серин, както е описано по-горе. Обаче, изобретението обхваща други изпълнения, където IFN-β в стабилизираните фармацевтични състави е който и да е биологично активен IFN-β полипептид или вариант, както е описано тук.

При някои изпълнение на изобретението, IFN-β е рекомбинантно получен. Под “ рекомбинантно получен” се има предвид IFN-β, който притежава биологична активност, сравнима с тази на зрелия естествен IFN-β и който е получен посредством рекомбинантна DNA технология. IFN-β може да бъде получен посредством култивиране на клетка приемник, трансформирана с експресионен вектор, включващ нуклеотидна последователност, която кодира IFN-β полипептид. Клетката приемник е такава, че може да транскрибира ♦ ' · · · · ·· ·· ·· ·· ·· ·· нуклеотидната последователност и да продуцира желания протеин, и може да бъде прокариотна / например, Е.coli / или еукариотна / например дрожди, инсект или клетка от бозайник/ Примери на рекомбинантно получаване на IFN-β са дадени от Mantei et al. /1982/ Nature 297:128; Ohno et al. /1982/ Nucleic Acids Res. 10:967; Smith et al./1983/ Mol.Cell.Biol. 3:2156 U.S. NOs 4,462,940; 5,702,699,

5,814,485; включени тук за справка. Виж също патент на САЩ 5,795,779, където IFN-β-Ι е получен чрез С рекомбинантна технология в клетки от яйчник на

Китайски хамстер / СНО/; включен тук за справка. Човешки интерферонови гени са били клонирани при използване на рекомбинантна ДНК /’’rDNA”/ технология и са експресирани в Е.coli /Nagola et al. /1980/ Nature 284:316; Goeddel et al., /1980/ Nature 287:411; Yelverton et al. /1981/ Nuc. Acid. Res. 9:731; Streuli et al. /1981/ Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:2848/. Съответно IFN-β може да бъде продуциран посредством трансгенно животно или растение, което е обработено чрез генна инженерна технология, да експресира IFN-β протеин, който представлява интерес, съгласно методите , познати в тази област на техниката.

Съответно IFN-β може да бъде синтезиран по химичен път, по която и да е от известните на специалистите в дадената област на техниката, методи за получаване на пептиди. Виж например, Li et al. /1983/ Proc. Natl. Acad. Sci.USA

80:2216-2220; Steward and Young /1984/ Solid Phase Peptide Synthesis / Pierce Chemical Company, Rockford, llinois/, и Baraney and Merrifield /1980/ The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, ed. Gross and Meinhofer, vol. 2 /Academic Press, New York, 1980/, стр. 3-254, разглеждащата методики за синтез на пептиди в твърда фаза; и Bodansky /1984/ Principles of Peptide Synthesis /Springer-Verlag, Berlin/ Gross and Meinhofer, eds. /1980/ The Peptides: : Analysis, Synthesis, Biology, vol. 1 /Academic Press, New York, /, C разглеждаща класическите синтези в разтвор. Виж също, например, Houghten /1984/ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131-5135; и U.S. N0. 4,631,211.

Съставите, включени в изобретението, могат да съдържат минимално количество от порядъка на около 0.01 мг/мл IFN-β до около 15мг/мл IFN-β /тегло/обем/. При различни изпълнения, IFN-β присъства в концентрации от около 0.015 мг/мл до около 12.5 мг/мл, около 0.025 мг/мл до около 10 мг/мл, около 0.05 мг/мл до около 8 мг/ мл, около

О

0.075 мг/мл до около 6 мг/мл, около 0.1 мг/мл до около 4 мг/мл, около 0.125 мг/мл до около 2 мг/ мл, около 0.175 мг/ мл до около 1 мг/мл, около 0.2 мг/мл до около 0.5 мг/ мл, около 0.225 мг/ мл до около 0.3 мг/мл и около 0.25 мг/мл.

При някои изпълнения, съставите, съгласно изобретението, включват фармацевтично приемлив носител. Под “фармацевтично приемлив носител” се разбира носител, който обикновено се използва в тази област на техниката, за да улесни съхранението, ♦ · · · · · въвеждането и/или лечебния ефект на терапевтичните инградиенти. Носителят може също да понижава някои нежелани странични ефекти на IFN-β. Подходящият носител би трябвало да е устойчив, т.е. да не е способен да взаимодейства с други инградиенти в състава. Би трябвало да не произвежда значителни локални или системни неблагоприятни ефекти в реципиентите при дозите и концентрациите, които се използват за лечението. Такива носители обикновено са известни в С тази област на техниката. Подходящи носители, съгласно изобретението, са онези обичайно използвани устойчиви високомолекулни носители, като албумин, желатин, колаген, полизахарид, монозахариди, пиливинилпиролидон, полимлечна киселина, полигликолова киселина, полимерни амино киселини, фиксирани масла, етил олеат, липозоми, глюкоза, захароза, лактоза, маноза, декстроза, декстран, целулоза, сорбитол, полиетилен гликол / PEG/, и други подобни. Носители за С бавно освобождаване, такива като хиалуронова киселина, също могат да бъдат подходящи. Виж по-специално Prisell et al. /1992/ Int. J. Pharmaceu. 85:51-56, и US NO. 5,166,331. Други подходящи компоненти в състава включват, без да се ограничават до, фармацевтично приемливи средства, които модифицират изотоничността, включително вода, соли, захари, полиоли, амино киселини, и буфери. Примери за подходящи буфери включват фосфат, цитрат, сукцинат, ацетат, и други органични киселини или техни ·· ···· ♦ ♦ ·· ·· • · · · • · · · · · • · · · ♦ · • · · · · ·· ·· ·· ·· ·· ,* соли и соли, които модифицират тоничността, такива като натриев хлорид, натриев фосфат, натриев сулфат, калиев хлорид и могат също да включват и изброените по-горе буфери.

При някои изпълнения на изобретението, фармацевтично приемливият носител е човешки албумин. Човешкият албумин може да бъде естествен човешки албумин или рекомбинантно получен човешки албумин; тези две форми общо се обозначават тук като “ човешки албумин”. С Съставите, обхванати в изобретението, могат да съдържат минимално количество от порядъка на 0.01 % човешки албумин до около 15% човешки албумин /тегло/обем/. При различни изпълнения, човешкият албумин присъства в концентрации от около 0.025% до около 12.5%, около 0.05% до около 10%, около 0.1% до около 9%, около 0.25% до около 8%, около 0.5% до около 7%, около 0.6% до около 2%, около 0.7% до около 1.75%, около 0.75% до около 1.5%, около 1.2% до около 1.3% и около 1.25%.

фармацевтичните състави могат допълнително да съдържат солюбилизиращо средство или средство, което повишава солюбилизацията. Съединения, съдържащи гванидинова група, за предпочитане аргинин, са подходящи средства за повишаване солюбилизацията за IFN-β. Примуери за такива средства, които повишават солюбилизацията, включват амино киселината аргинин, както и амино киселинни аналози на аргинина, които ···· • ’ ·· ·· ♦ · ·· ·· запазват способността да повишават солюбилизацията на IFN-β. Такива аналози включват, без ограничение, дипептиди и трипептиди, които съдържат аргинин. Допълнително подходящи солюбилизиращи средства са описани в патенти на САЩ 4,816,440; 4,894,330; 5,004,605; 5,183,746; 5,643,566; от Wang et al. /1980/ J. Paremteral Drug Assoc. 34:452-462; включени тук за справка.

Неограничаващи примери на солюбилизиращи средства, обхванати от изобретението, включват повърхностноС активни средства / детергенти/, които имат подходящ хидрофобен-хидрофилен аланс за солюбилизиране на IFNβ. Силни естествени или синтетични анйонни повърхностно-активни средства, такива като соли на алкални метали с мастни киселини и алкало метални алкил сулфати могат да бъдат използвани. Такива средства обикновено съдържат 10 до 14 въглеродни атома. Натриевият додецил сулфат /SDS/ и натриевият лаурат са особено предпочитани солюбилизиращи средства. Примери на други солюбилизиращи средства, които могат да бъдат използвани в съставите, съгласно изобретението, включват, но без да се ограничават до, натриев додецил сулфонат, натриев децил сулфат, натриев тетрадецил сулфат, натриев тридецил сулфонат, натриев миристат, натриев капроилат, натриев додецил Νсаркозинат, и натриев тетрадецил N-саркозинат. Класическа стабилизация на фармацевтични състави посредством повърхностно-активни средства или ·· ·· ·· ·· • · · 9 9 9 • «··· · ···· • ·· · · * · · ♦ ♦ · · · · · ·· ·· ·· it _е< емулгатори е описана, например, от Levine et al. /1991/ J.

Parenteral Sci. Technol. 45/3/: 160-165. Допълнително подходящи повърхностно-активни средства са описани в U.S. No. 4,507,281; 4,816,440] 5,183,746; включени тук за справка.

В допълнение на тези средства, описани по-горе, други стабилизиращи средства, такива като етилендиаминтетраоцетна киселина /EDTA/ или една от нейните соли, такава като динатриева EDTA , могат да С бъдат прибавени за допълнително повишаване устойчивостта на течни фармацевтични състави.EDTA действа като акцептор на метални йони, известни че катализират много окислителни реакции, осигурявайки по този начин допълнително стабилизиращ ефект.

Където съставът с IFN-β се използва за третиране на бозайници, такива като човек, изотоничността на състава също трябва да се вземе под внимание. Така, при едно изпълнение, съставът на разтвор за инжектиране на IFN-β , ще осигурява изотоничност, същата или подобна на тази на родствения серум или телесните флуиди.За да се постигне изотоничност, сол, такава като натриев хлорид, калиев хлорид или фосфорен буфер, може да бъде добавена към разтвора в подходяща концентрация.

Трябва да се има предвид и pH на състава. Стабилните IFN-β състави, съгласно изобретението, имат pH в границите от около 3.0 до около 9.0. Подходящите граници на pH включват, например, около 4.0 до около 8.8, около ♦ ♦··

·· ·· ·· ·· ·· ·· 5.0 до около 8.6, около 6.0 до около 8.4, около 6.8 до около

8.2, около 6.9 до около 8.0, около 7.0 до около 7.8, около

7.1 до около 7.7, около 7.2 до око 7.6 и около 7.3 до около

7.5.

Фармацевтично ефективно количество от стабилизиран IFN-β състав, или възстановен стабилизиран лиофилизиран IFN-β фармацевтичен състав, съгласно изобретението, се дава на субекта. Под “ фармацевтично ефективно количество” се разбира количество, което е полезно за лечението, профилактиката или диагностиката на заболяване или състояние. Типичните начини на приемане включват, но без да се ограничават до, приемане през устата, приемане през носа, приемане чрез белите дробове и парентерално приложение, включващо трансдермално, венозно, мускулно, подкожно, артериално и интраперитонеални инжекции или инфузии. При едно такова изпълнение, приложението е посредством инжекция, за предпочитане подкожна инжекция. формите на съставите, съгласно изобретението, които могат да се инжектират, включват, но без да се ограничават до, разтвори, суспензии, и емулсии. Обикновено, терапевтично ефективното количество IFN-β включва около 0.01 цд/кг до около 5 мг/ кг от състава, за предпочитане около 0.05цд/кг до около 1000цд/кг, по-специално около 0.1 цд/кг до около 500цд/кг , още по за предпочитане около 0.5цд/кг до около 30цд/кг.

·*♦· • ·· • ···· • · ·· • · «· ··»· ····

При едно изпълнение на изобретението, стабилизираният фармацевтичен състав, съдържащ IFN-β се приготвя под формата на дозирана единична форма и може да бъде във вид, удобен за прилагане чрез инжекция или инфузия, такъв като разтвор, суспензия, или емулсия. Понататък, той може да се съхранява замразен или да бъде приготвен в суха форма, такава като лиофилизиран прах, който може да бъде възстановен в течен разтвор, суспензия или емулсия, преди приложението му по който и да е от различните методи, включващи орален или парентерален път на приложение.Стабилизираният фармацевтичен състав може да бъде стерилизиран посредством филтруване приз мембрана и съхранен в единчна доза или в много-дозови контейнери, такива като запечатани стъкленици или ампули. Други методи за приготвяне на фармацевтичен състав, обикновено известни в тази

област на техниката, могат да бъдат използвани за понататъшно повишаване на устойчивостта при съхранение на фармацевтичните състави, описани тук, при условие, че нямат неблагоприятен ефект върху благоприятните качества на високо пречистения манитол, описан тук. Подбробна дискусия за приготвяне на фармацевтични състави и за избора на фармацевтично приемливи носители, стабилизатори и т.н. може да бъде намерена в Remington’s Pharmaceutical Sciences /1990/ /18^th ed., Mack Pub. Co., Eaton, Pennsylvania/, включен тук за справка.

• · • · • · · ·

При някои изпълнения, течните състави, съгласно изобретението, са опаковани в спринцовки / “предварително напълнени” спринцовки, съгласно изобретението/. При едно изпълнение, предварително напълнената спринцовка, съдържаща състав, съгласно изобретението, може да бъде замразена. Замразената предварително напълнена спринцовка се използва за

целите на съхраняване или транспортиране.

Следните примери са предложени с илюстративна цел и по никакъв начин не ограничават изобретението.

ОПИТНА ЧАСТ

Пример 1: Получаване на IFN-β фармацевтичен състав с повишена стабилност

I. Въведение

IFN-β фармацевтични състави, съдържащи декстроза като носител са известни в тази област на техниката. Когато тъкива състави са инкубирани при температура 37°С или по-висока, декстрозата в тези състави образува ковалентни адукти с IFN-β , които могат да бъдат установени с помощта на RP-HPLC / обратна-фаза, високо ефективна течна хроматография/. IFN-β , приготвен с USP манитол не образува откриваеми с RP-HPLC ковалентни адукти при същите условия. Обаче, USP манитолът съдържа онечиствания, които комбинирани с IFN-β образуват адукти, които могат да бъдат открити с помощта на електроспрей мас спектрометрия. Природата • · • · · · на онечистванията в USP манитола е неизвестна.

Образуването на тези адукти / или продукти от разграждане/се счита нежелано от фармацевтична гледна точка, дори неприемливо от фармацевтична гледна точка, тъй като съвременните ръководства за фармацевтични продукти на база полипептиди, подчертават значението на минимизирането на образуване на разградни продукти в съставите. Счита се нежелателно или неприемливо в тези състави да присъстват продукти от разграждане, тъй като те повишават риска , фармацевтичните препарати на база полипептиди, да причиняват нежелани странични ефекти.Това, което бе сега установено е, че IFN-β показва повишена стабилност, когато е смесен с манитол, който е

високо пречистен, така че неговата редуцилаща активност да е по-малка от 20 части на милион, в сравнение със фармацевтичния състав, при който се използва не високо пречистен манитол.Това, което допълнително бе установено сега е, че пречистването на USP манитола посредством екстракция с метанол, третиране с въглен, ултрафилтруване и прекристализация води до получаването на манитол, чията редуцираща активност е по-ниска от 20 части на милион.

II. Методи

IFN-β -1Ь , който се използва при тези опити, е получен в

Е.coli, по същество както е описано в U.S. Nos. 4, 462,940 и 5,702,699; включени тук за справка.Натриев додецил сулфат и солите се отстраняват от IFN-β с помощта на • · • · • ♦ · ·

хроматография; и IFN-β се комбинира с разтвор на човешки албумин при pH 11.5-12.0; pH на разтвора се нагласява на 7.5 със солна киселина; и се прибавя разтвор, съдържащ носителя / манитол или декстроза/ до получаване на крайна концентрация 1.25 % тегло/обем.

IFN-β -1Ь от тези състави се приготвя за мас спектрометрия чрез RP-HPLC. Този метод позволява количественото определение на IFN-β -1Ь след като е разделен като отделен пик / В1/ на хроматограмата.

Границата на откриване на гликозилиран IFN-β -1Ь с този метод , е 0.02 мг/мл. Когато количеството, определено благодарение на пика, е по-малко от 0.02мг/мл, площта на двата пика се сумира и се сравнява със сравнителна проба IFN-β , за да се определи общото съдържание на

IFN-β -1Ь. Когато площта на пика е по-голяма от 0.02 мг/мл, неговата концентрация се определя отделно и се записва.

За анализа са използвани следното устройство и съответните инструкции на производителите за действието му.

Система за доставяне на разтворител: Waters 626 Gradient Pump

Инжекционна система:Waters 717 plus Autosampler

200 мл инжекционен контур полипропиленови autosampler флакони с Teflon septa охлаждащ температурен контрол, нагласен на 4°С • · • · · · · · · · · · · · използва се 84%-ен ацетонитрил за промивка на иглата.

Нагревател на колоната: Waters 600

Нагревателят на колоната е нагласен до 40°С.

Колона: BAKERBOND Wide-Pore Butyl С4 RP-Column, 300А δμίτι, 4.6 mm /ID/ 250 mm, J.T.Baker part number 22010. Колоната е свързана в посоката на потока разтворител, както е посочено върху етикета на колоната, и е поставена в нагревателя на колоната.

fleTekTop:Waters 486 UV Detector.

Дължината на вълната е нагласена на 214 nm.

Данните на системата за количество подаван материал не са занижени.

Система за данни:Р.Е. Nelson Turbochrom Data System. Лиофилизирани проби от състав на IFN-β се възстановяват с 1.20 мл 0.54% натриев хлорид, внимателно се завъртат до смесване, и се инкубират при стайна температура в продължение на 30± 5 минути. Калибраторът е несмесен IFN-β за сравнение. Калибриращият щоков разтвор се разрежда до приблизително 0.5 мг/мл, и концентрацията на разредения калибриращ разтвор се определя посредством УВ абсорбция / средно 6 повторения/. Крайната концентрация на разредения калибриращ разтвор е средната стойност на отчитанията за УВ абсорбцията, разделена на 1.7 /IFN-β -1Ь екстинкционен коефициент/. Концентрацията на разредения калибриращ разтвор е • · • · • ·· ··· ·· ··· · · ···· ···· ···· определена от абсорбцията на 3 значими фигури. Калибриращият разтвор след това се разрежда до 0.25 мг/мл за използване като работен калибриращ разтвор. Автоматичният уред за вземане на проби е програмиран да инжектира 20 микролитра при инжектиране на интервали от 70 минути. Границата на напрежение на системата за данни е 1 волт, скоростта на снемане на данни е една точка за секунда и времето за получаване е 70 минути. Елуентът А е 0.1 TFA /трифлуорооцетна С киселина, качество HPLC/,и Елуент В е 84% ацетонитрил /HPLC качество / и 0.084% TFA /HPLC качество /. Скоростта на потока на елуента е нагласена на 1.0 мл/минута / 7-% Елуент А и 30% Елуент В/, и колоната е еквилибрирана за един час. След като детекторната основна линия и системата са еквилибрирани, се анализира празна проба. Анализът започва след като не се окриват значителни пикове във втората празна проба. Концентрацията на IFN-β се определя от сумата на площта на пиковете, съответстващи на немодифициран IFN-β / пик “В7 и на гликозилиран IFN-β / пик “ВГ/. Например, когато калибриращият разтвор е несмесен IFN-β 0.25 мг/мл, концентрацията на IFN-β /мг/мл/=/площта на пика В1 на опитната проба + В/площта на пика В1 на калибриращия +В/ х 0.25 мг/мл. Данните от електроспрей мас сектъра / ES-MS/ са получени при използване на фракции от тази хроматография. фракции на всеки пик се събират и • · ··· · · · · ·· • ···· · · ··· · ·· • ·· ··· ·· * · · ·· ···· · · · ····· концентрират преди анализа. Електроспрей мас спектърът се получава при използване на API 100 единичен-учетворен мас спектометър /Perkin-Elmer Sciex Inetuments, Thornhill, Ontario, Canada/, интерфейс към Harvard инжекционна помпа /Harvard Apparatus, South Natick, МА/ и Rheodyne 8125 инжектор c тръбопровод със 100μΜ вътр.диам. Мас спектърът се записва по позитивен начин чрез сканиране на отношение маса/товар /т/z/ в граници от 140 до 2500 при 6 сек/скан., при използване на С размер на стъпка 0.2 Da. Мас спектрометърът се калибрира при използване на полипропилен гликолова смес, съдържаща 3.3 х ¹⁰⁵ М PPG 425,1 х 10⁴ MPPG 1000 и 2 х 10’⁴ PPG 2000/Aldrich Chemical Co./ в 50:50:0.1 вода:метанол:мравчена киселина / обем:обем:обем/, съдържащ 2тМ амониев ацетат.Аликвотна част от протеинов разтвор /20-50 рМ в 2μ L/ се внася в мас спектрометърния йонен източник в 49:40:1 вода:ацетонитрил:оцетна киселина при 20ц1_/мин. След като протеините се въведени в йонния източник при ниско pH, базичните места / например, азотните атоми в страничните вериги на аргининовите, лизиновите и хистидиновите остатъци / се протонират до вариращи степени водещи до множествени състояния на заряда на молекулните йони , например [М+Н]⁺, [М+2Н]²⁺, в зависимост от броя на местата, достъпни за протониране. Детекторът записва m/z отношенията на молекулярните йони в различните състояния на зарядаи мас спектърът • ·

може да бъде разгънат при използване на Biotoolbox софтуер /Perkin-Elmer Sciex Instilments/ до получаване на протеиновата молекулна маса. Масовата точност на измерването на молекулната маса при 20 kDa е 2kDa.

Редуциращата активност на манитола се определя чрез модификация на USP протокола. Протоколните измервания на редукцията на Си²⁺ в алкален разтвор в присъствието на бицинхонинова киселина /ВСА, Pierce, приготвена съгласно инструкциите за производство/. ВСА

С комплексите с Си¹⁺, и този комплекс имат син цвят с пик на абсорбция /А/ при 562 nm.

Две проби манитол /500μΙ от 150 мг/мл манитолов разтвор/ се анализират за всяко условие. Стандартната крива се създава при използване на серийни разреждания с известна редуцираща активност. 500μΙ от приготвения ВСА разтвор се прибавят към всяка тестова проба, стандартна проба и празна проба и се инкубира при 60° С в продължение на 40 минути. Глюкозните стандарти се нагласяват към линейна крива и редуциращата активност на манитоловите опитни проби / в ррт/ се изчислява като (( А₅₆₂ на манитолова проба/ градиент на стандартна крива)/ (съдържание на манитол в мг/мл ) (1000)) х 10⁶.

III. Резултати и Дискусии

Гликозилирането се открива в декстрозна формация при използване на мас спектрометрия като кратни на 162

Далтона, прибавени към молекулната маса на INF- β-lb.

·· • · • * ·· • · · • · • · ··· · · ··· ·· • · · · · · · · · · · ·· • · · · · · · · · · ♦♦ ·· ·· »· ·· ·· ·· Анализът на INF- β-1 b пептиди предполага, че тези адукти са в резултат на реакция на редуциращи захари с лизиновите остатъци на протеина / реакции на Амадори/. фигура 1 сравнява RP-HPLC хроматограма на насипна маса на състав с декстроза със състав, изсушен чрез замразяване, съхраняван при 50°С в продължение на 1 седмица, фигурата илюстрира, че INF- β-1 b в декстрозния състав реагира лесно при 50°С до продуциране на пика В1 в изсушения чрез замразяване състав . ES-MS на насипния състав / фигура 2/ няма пикове, свързани с глюкозни адукти / плюс 162/. Обратно, мас спектърът на инкубирания изсушен чрез замразяване състав / фигура 3/ показва обширна модификация. Така, глюкозата реагира с INF- β-lb до образуване на видове, което се откриват с помощта на RP-HPLC, чията структура е потвърдена с ES-MS.

Обратно, INF- β-lb състав, приготвен с USP манитол, не образува видове, които могат да бъдат открити като пик В1 в RP-HPLC. фигура 4 сравнява насипна маса на състав, приготвен с манитол, със състав, изсушен чрез замразяване, държан 7 дни при 50°С. Ясно, не се е образувал пик В1. Обаче, мас спектърът на насипната маса на състава на фигура 5 показва присъствието на пик при 200040, и мас спектърът на инкубирания, изсушен чрез замразяване състав с манитол, на фигура 6 има нов пик при 20201. Количеството на адуктите, образувани с ·· ♦· ·· ·· » ·*»· • · · 9 * * · ·· · ··» 9 · 999 · ·· • · · · 9 · · · ··« ·· • 9 · · ♦♦·· · · ·· »· ·· · · · · »· манитол, не може да бъде определено с помощта на ESMS; обаче, сигналите за адуктите често са близо до границите на детекция за устройството. Механизмът на образуване на тези пикове не е известен. Реакцията на манитола с INF- β-lb не образува видове, подобни на видовете, образувани с декстроза или глюкоза; не се образува пик В1. Така, данните показват, че по-чиста форма на манитол е необходима за да се предотврати образуването на адукти на INF- β-lb.

Манитол, който е екстрахиран с метанол за намаляване на онечистванията, след това е изследван за въздействието му върху стабилността на INF- β-lb. INF- β-lb се смесва с три различни проби манитол, екстрахиран с метанол, и тестови проби от масата на състава и на крайния контейнер са анализирани при използване на

RP-HPLC и ES-MS, описани по-горе, фигура 7 илюстрира мас спектъра на INF- β-lb, смесен с нетретирен метанол, и Фигура 8 илюстрира мас спектъра на INF- β-lb, смесен със същата проба манитол, който е пречистен с метанол. Всичките три проби манитол показват подобна структура. Фигура 17 показва, че пречистването с метанол отстранява повече от половината от редуциращата активност. Ясно, третирането с метанол отстранява онечиствания от комплекси с INF- β-lb, но някои не могат да бъдат напълно отстранени с това третиране.

За намаляване • * • · · ·

на останалите онечиствания в манитола към процеса на пречистване са добавени три допълнителни етапа. Тези допълнителни етапа са пречистване с въглен, ултрафилтриране и прекристализация. Три партиди от естрахиран с метанол, третиран с въглен, ултрафилтриран и прекристализиран

манитол са изследвани по описания по-горе начин. Колориметричният анализ на редуциращата активност показва, че допълнителните етапи на пречистване снижават съдържанието на редуциращата активност до около 10 ppm / виж фигура 17, проби 7-9/. Приготвя се състав с високо пречистен манитол. Мас спектърът на състава, приготвен с високо пречистен манитол / фигура 9/ не показва допълнителни пикове, които не присъстват в масата на състава, приготвен без манитол и същия ден и използван като негативна контрола / фигура 10/. Мас спектърът на състава, приготвен с USP манитол / фигура 11/ , също е приготвен същия ден като позитивна контрола. Тази допълнителна обработка на манитола води до получаване на продукт, който е с ниска редуцираща активност и изглежда не реагира с INF- β-lb, въз основа на данните от ES-MS.

Пример 2: Стабилнрост на INF- β състави, съдържащи високо пречистен манитол: Ускорено изследване

L Въведение

Приготвят се опитни състави на INF- β с декстроза и манитол, както е описано по-горе, и за сравняването на • · • · · · 4 ·

...... ·· .. ..

тези състави се провежда ускорено изследване. Стабилността на състава се изследва при две различни условия. Първото е да се подложат съставите на високо температурен стрес и второто е да се измери стабилността при продължително съхранение при стайна температура. Не се наблюдават промени в състава, съдържащ високо пречистен манитол след съхранение при 25° С в продължение на 3 месеца, и активността на състава остава по същество непроменена след С съхранение при 37° С в продължение на 3 месеца или при 50° С в продължение на 1 месец.

II. Методи

Проби от всеки състав се съхраняват при 8°С, 25°С или при 37°С в продължение на 3 месеца. В допълнение, след втория месец от изследването се вземат проби от пробите, съхранявани при различните температури, и се съхраняват при 50°С в продължение на още един месец. Целта на това повишаване на температурата до 50° С е да ^v се ускорят потенциалните промени, които могат да се появят през първите два месеца на съхранение и така да се позволи по-добро определяне дали съхранението при 25°С и при 37°С в продължение на 2 месеца предразполага продукта към по-бързо разграждане, когато се върне при нормалната температура за съхранение при 8°С.

Специфичната активност на INF- β-lb се анализира както следва. Карциномни клетки А549 от човешки бял дроб /АТСС CCL185/и миши енцефаломиокардитен вирус, вид .··..·* ............

ЕМС /АТСС VR-129B/ са получени от American Type Culture Collection. Съставите на пробите се възстановяват с 1.2 мл разредител /0.54% NaCI/, серийно се разреждат в Growth/ Assay Media, и се прибавят към 96-ямково блюдо заедно с INF- β-1 b стандарти. Обемът на разредения INF-

β-Ιό във всяка ямка е 100μΙ. А 549 клетки в Grows /Asaay Medium /Eagle’s MEM c Earle’s соли и 2.2 г/л натриев бикарбонат, 8.9% Fetal Bovine Serum, 1.79 mM L-глутамин , 89 U/ml пеницилин, и 89 цд стрептомицин /мл / се прибавят при концентрация 1 х 10⁴ клетки/ямка. След това блюдото се инкубира при овлажнен 37°±2°С, 5±1 % СО₂ инкубатор. В края на това инкубиране, клетките се инфектират с ЕМС вирус при множественост на инфекцията между 5 и 16. Блюдата след това се инкубират в продължение на 24+1 часа в овлажнен 37°±2°С, 5±1 % СО₂ инкубатор. Клетките се оцветяват с преварително затоплен / 37°С / МТТ /3-[4,5-диметилтиазол -2- ил]-2,5дифенилтетразолов бромид, 5мг/мл, 50μΙ/ ямка/, и се инкубират ,както е описано по-горе в продължение на три и половина до четири и половина часа. Средата се аспирира от клетките, и 10ΟμΙ оцветен солюбилизиращ разтвор / 81 % обем/обем на 2-пропанол, 3% тегло/обем натриев додецил сулфат, 0.04 N HCI/ се прибавя към всяка ямка. След това блюдата се инкубират в продължение на 30-60 минути при стайна температура на тъмно. Активността на INF- β-lb стандартите се • · , ........ ·..··..· нагласява към линейна регресионна крива, и активностите на опитните проби се определя от тази крива. Специфичната активност на всяка проба се изчислява на база масата на използваната проба.

RP-HPLC анализът на концентрацията на INF- β-lb се осъществява както е описано по-горе. Образуването на адукт също се наблюдава в понижаване на SDS-PAGE Western blots като очевидно повишаване в молекулното тегло на INF- β-lb ивицата.

III. Резултати и дискусия

Активността / специфичната активност/ на съставите с манитол остава по същество непроменена по време на изследването, докато тази на съставите с декстроза се повишава. Излагането на въздействие на температури от 37°С в продължение на 1 месец няма ефект върху специфичната активност / виж Фигури 14 и 15/. За състава на INF- β-lb с манитол, количеството на гликозилиран INFβ-1 b остава под границата на откриване в продъвлжение на изследването, дори при 50°С. Обратно, гликозилирането се открива в състава с декстроза след 2 масеца при 37°С и след 2 седмици при 50°С. Повишеното гликозилиране модифицира твърде много хроматограмата за измерване общото съдържание на INF- β-lb. Образуването на адукт в състава с декстроза също се открива в понижената SDS-PAGE Western blots след 2 месеца съхранение при 37°С или 1 месец съхранение при • · • · • · • · ··

50^иС, но не и след 3 месеца съхранение при 25°С. Обратно, няма наблюдавани промени в SDS-PAGE Western blot за състав с манитол при каквито и да е условия на съхранение.

Пример 3: Стабилност при продължително съхранение на INF- β-lb състави, съдържащи високо пречистен манитол Три партиди / N006, N008 , N009/ на INF- β-lb състави, съдържащи високо пречистен манитол се съхраняват при 4°С, 25°С или при 30°С и на тримесечен интервал се анализира тяхната стабилност в продължение на една година, и на шестмесечен интервал в продължение на още една допълнителна година. Стабилността се анализира с помощта на методите, описани по-горе.

Всичките три партиди запазват специфичната активност в продължение на 24 месеца при 4°С и при 30°С. Данните са представени на фигури 16-18. В допълнение, всичките три партиди показват не повече от 0.02 мг/мл пик В1/ гликозилирани INF- β видове/ при всички температури на съхранение и при всяка точка от времето на теста.

За специалиста в дадената област на техниката е разбираемо, или той е способен при използване само на рутинни експерименти, да достигне до много еквиваленти на специфичните изпълнения на изобретението, описано тук за INF- β.Β допълнение, специалистите в дадената област на техниката, могат да разберат или са способни при използване само на рутинни експерименти, да • · ·· ·· ·· ·· .. ..

достигнат до извода, че описаните по-горе опити и състави, осигурени при използване на INF- β като пример, са приложими към протеините общо, и по-специални към протените за фармацевтично приложение, фармацевтичните протеини включват, без да се ограничават до, следните протеини: човешки растежен хормон, всички интерферони, всички интерлевкини, стимулиращи фактори / GM-CSF, G-CSF, М-CSF/, бетаглюкоцереброзидаза, типотропини, етанерсепт, С моноклонални антитера / например абциксимаб, базиликсимабр паливизумабр ритуксимаб и транстузумаб/, кръвни фактори / напримерр Фактор VII и фактор VIII/, ензими / например урокиназа, аспаргиназа, анистреплаза и алтеплаза/. Такива еквиваленти са предвидени , че са включени в обхвата на следните претенции.

Всички публикации и заявки за патенти, споменати в _ описанието са показателни за нивото на техниката в тази с област, към която принадлежи изобретението. Всички публикации и заявки за патент са включени тук за справка в същата широта в каквата биха били разкрити като отделна публикация или заявка за патент.

Claims

ПРЕТЕНЦИИ .....

1. Състав, характеризиращ се с това, че съдържа INF- β или негов вариант и високо пречистен манитол.
2. Състав,съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че споменатият състав притежава повишена стабилност.
3. Състав,съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че споменатият състав е лиофилизиран.
4. Състав,съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че споменатият състав е течен.
5. Състав,съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че споменатият високо пречистен манитол присъства в концентрация от около 0.25% до около 5% тегло/обем.
6. Състав,съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че споменатият INF- β или негов вариант присъства в концентрация от около 0.01 мг/мл до 15 мг/мл.
7. Състав,съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че споменатият състав има pH в границата от около pH 3.0 до около pH 9.0.
8. Състав,съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че съдържа също човешки албумин.
9. Състав,съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че споменатият човешки албумин присъства в концентрация от около 0.01% до около 15% тегло/обем.
10. Състав, съдържащ INF- β и високо пречистен манитол, характеризиращ се с това, че споменатият INF- β е рекомбинантен човешки INF- β , споменатият рекомбинантен човешки INF- β присъства в концентрация от около 0.01 мг/мл до около 15 мг/мл, споменатият високо пречистен манитол присъства в концентрация от около 0.25% до около 5% тегло/ обем, pH на състава е около 3.0 до около 9.0 и съставът допълнително съдържа човешки албумин в концентрация от около 0.01 % до около 15% тегло/обем.
11. Състав,съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че споменатият състав е лиофилизиран.
12. Състав,съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че споменатият състав е течен или замразен.
13. Състав, съдържащ INF- β и високо пречистен манитол, характеризиращ се с това, че споменатият INF- β е рекомбинантен човешки INF- β , споменатият рекомбинантен човешки INF- β присъства в концентрация от около 0.01 мг/мл до около 15 мг/мл, споменатият високо пречистен манитол присъства в концентрация от около 0.25% до около 5% тегло/ обем, pH на състава е около 3.0 до около 9.0 и съставът допълнително съдържа човешки албумин в концентрация от около 0.01 % до около 15% тегло/обем и достатъчно натриев хлорид, за да стане съставът изотоничен.

• · » · . _л _ ·· ......
14. Състав.съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че споменатият състав е лиофилизиран.
15. Състав.съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че споменатият състав е течен или замразен.
16. Състав, съдържащ INF- β и високо пречистен манитол, характеризиращ се с това, че споменатият INF- β е рекомбинантен човешки INF- β , споменатият рекомбинантен човешки INF- β присъства в концентрация от около 0.05 мг/мл до около 1 мг/мл, споменатият високо пречистен манитол присъства в концентрация от около 0.25% до около 2.5% тегло/ обем, pH на състава е около 6.8 до около 8.2 и съставът допълнително съдържа човешки албумин в концентрация от около 0.25 % до около 2.5% тегло/обем.
17. Състав.съгласно претенция 16, характеризиращ се с това, че съдържа допълнително достатъчно натриев хлорид, за да стане съставът изотоничен.
18. Състав.съгласно претенция 16, характеризиращ се с това, че споменатият състав е течен като споменатата течност е замразена или лиофилизирана.
19. Състав.съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че споменатият състав е течен като споменатата течност е замразена или лиофилизирана.
20. Състав, съдържащ INF- β и високо пречистен манитол, характеризиращ се с това, че споменатият INF- β е рекомбинантен човешки INF- β , споменатият ·· • · • »·· • · * · · • · · · · .

• ···· * · . ; · : ...... ·

-- ··..* · ·· · рекомбинантен човешки INF- β присъства в концентрация от около 0.25 мг/мл, споменатият високо пречистен манитол присъства в концентрация от около 1.25% тегло/ обем, pH на състава е около 7.3 до около 7.5 и съставът допълнително съдържа човешки албумин в концентрация от около 1.25 % тегло/обем.
21. Състав,съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че съдържа допълнително достатъчно натриев хлорид, за да стане съставът изотоничен.
22. Състав,съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че споменатият състав е течен като споменатата течност е замразена или лиофилизирана.
23. Състав,съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че споменатият състав е течен като споменатата течност е замразена или лиофилизирана.
24. Състав, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че споменатият INF- β е полипептид с амино киселинната последователност на зрелия естествен човешки INF- β.
25. Състав, съгласно претенция 24, характеризиращ се с това, че споменатият INF- β е гликозилиран или негликозилиран.
26. Състав, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че споменатият INF- β е получен чрез рекомбинантна технология.

• ·
27. Предварително напълнена спринцовка, характеризираща се с това ,че съдържа състава, съгласно пертенция 1.
28. Предварително напълнена спринцовка, съгласно претенция 27, характеризираща се с това ,че споменатият състав е замразен.
29. Състав, съдържащ INF- β или негов вариант и манитол, характеризиращ се с това, че споменатият манитол има редуцираща активност по-малка от 20 части на милион.

© ЗО.Състав, характеризиращ се с това, че съдържа фармацевтичен полипептид и високо пречистен манитол.
31. Състав, съгласно претенция 30, характеризиращ се с това, че споменатит фармацевтичен полипептид е избран от групата, състояща се от човешки растежен хормон, интерферон, интерлевкин, гранулоцит- макрофаг колони стимулиращ фактор, гранулоцит колони стимулиращ фактор, макрофаг колони стимулиращ фактор, бетаглюкоцереброзидаза, тиротропини, етанерцепт, ** моноклонални антитела, фактор Vila, фактор VIII, урокиназа, аспаргиназа, анистреплаза и алтеплаза.
32. Метод за получаване на състав на INF- β или негов биологично активен вариант с подобрена стабилност, характеризиращ се с това, че споменатият метод включва получаване на състав на INF- β или негов биологично активен вариант и високо пречистен манитол в количество • ft • ft • ••ft .достатъчно да стабилизира споменатия INF- β или неговия вариант.
33. Състав, характеризиращ се с това, че е получен по метода, съгласно претенция 32.
34. Метод за получаване на състав на INF- β или негов биологично активен вариант, характеризиращ се с това, че включва етапите на:

а/ отстраняване на натриевия додецил сулфат и солите от INF- β посредством хроматография;

б/ комбиниране на споменатия INF- β с разтвор на човешки албумин при pH около 11.5 до около 12.0;

в/ нагласяване на pH на разтвора на 7.5 със солна киселина; и г/ прибавяне на разтвор на високо пречистен манитол.
35. Състав, характеризиращ се с това, че е получен по метода, съгласно претенция 34
36. Метод, съгласно претенция 34, характеризиращ се с това, че допълнително включва етап на лиофилизиране на състава.
37. Метод за повишаване стабилността на INF- β или негов вариант във фармацевтичен състав , характеризиращ се с това, че споменатият метод включва въвеждане в споменатия състав на високо пречистен манитол в количество, достатъчно да стабилизира споменатия INF- β или негов вариант.

• 9 ·φ»· ·· ·· ·· _е • · · « · · * ·>

• · ··· · ♦ ··· · ·· • ··? ·· · · ί J·
38. Метод, съгласно претенция 34, характеризиращ се с това, че допълнително включва етап на прибавяне на достатъчно натриев хлорид, за да стане състава изотоничен.
39. Състав, характеризиращ се с това, че е получен по метода, съгласно претенция 38.
40. Метод, съгласно претенция 38, характеризиращ се с това, че допълнително включва етап на лиофилизиране на състава.