HU228583B1 - Stabilized interferon compositions - Google Patents

Description

Stabilizált interferon összetételek

A jelen találmány általánosságban gyógyszerészeti összetételekre vonatkozik, részletesebben stabilizált vagy llofilezett fehérje kiszerelésekre, beleértve az interferon-β és más fehérjék

Az interferonok a glikoproteinek családjába tartoznak, melyek szekréciója a sejtekből számos jel hatására indukálódik, beleértve a vírusokat, a kettősszáiú RNS-eket és más polínukleotidokat, antigéneket, valamint autogéneket. Az interferonok többféle biológiai aktivitással rendelkeznek, mint például antivirális, antíproliferatív és immunmódosító aktivitásokkal. Legalább három különböző humán interferon típust különítünk el, így α , S, és γ interferonokat, mely felosztás különböző tényezőkön alapul, beleértve az anti-virális és anti-proliferatív aktivitásokat.

Az interferon-β (IFN-β) a szklerözis multiplex (MS) kezelésében az első azonosított hatékony anyag, melyről kimutatták, hogy' a betegek rohamainak számát csökkenti az MS visszaesés és visszatérés mérséklésével. Az IFN-β összetét € fertőzések kezelésében ís hasznosnak.

Ugyanúgy, ahogy az összes többi fehérje alapú gyógyszerészeti készítmény esetében, a fő akadály, melyet le kell küzdeni az IFH-B terápiás szerként történő használatában, a gyógyszerészeti használhatóság elvesztése, mely ezen gyógyszerészeti összetétees tényezői a következők, melyek a poiipeptid aktivitását, és a gyógyszerészeti összetételben való hatékonyságát fenyegetik: denaturálő-dás és az oldható- és oldhatatlan aggregátumok képződése, míg a kémia instabilitás okai az imidképződés, az oxidálődás, a racemízácíö és a vízmentes deammálődás. E változások közül néhány a kérdéses fehérje gyógyszerészeti aktivitásának elvesztéséhez vagy csökkenéséhez vezet. Más esetekben a fenti változások pontos hatása ismeretlen, de bomlásterméket eredményeznek, ami győgyszerészetileg elfogadhatatlan, mivel ezek. nem kívánt mellékhatásokat, eredményezhetnek.

A gyógyszerészeti készítményekben a polipeptidek instabilitása közvetlenül, befolyásolja azok gyógyszerészt! használhatósá gát, így irányelveket állítottak fel a fehérje alapú gyógyszerekre, mely hangsúlyozza, hogy? a polípeptid aktivitásában és molekuláris jellemzőiben bekövetkező változásokat minimalizálni kell. Lásd például a szakirodalmat [Bioteehnologjcal/Biological products, International Conference on Harmonization of Technieal Recjuírements fór Registratíon of Phannaceuticals fór Humán Use, (1995.. november 30) j, melyben a háromoldalú szervezet (Európai Unió, Japán és az Amerikai Egyesült Államok) beszámolt a stabilitási vizsgálatokról, és a gyógyszerforgalmazás ajánlásairól, és megállapították: ahol a hosszú idejű, felgyorsított és/vagy stressz stabilitási vizsgálatokban a jelentős minőségi vagy mennyiségi változás a bomlástermék kialakulását jelzi, ott a potenciális veszélyek vizsgálatát és a bomlástermékek jellemzését, valamint mennyiségi meghatározását, hosszú időtartamú stabilitási programok beiktatásával, meg kell fontolni.

Ennek megfelelően szükség van további gyógyszerészeti összetételekre, beleértve az l'FN-S összetételeket, melyek fiziológiásán. kompatíbilis stabilizálőkat tartalmaznak, melyek redukáló * * * « *44» *» szennyeződésektől lényegében mentesek, ezzel stabilizálva a fe~ bérjét és fokozva ezen gyógyszerek használhatóságát.

így a jelen találmány olyan Összetételekről gondoskodik.

ként nagymértékben tisztított mannitot tartalmaznak. Az összetételeket tárolás során .javult .stabilitásúnak jellemeztük, szemben a szintén mannitot tartalmazó összetételekkel, ahol viszont a mannit nem nagy tisztaságú. Az ilyen összetételeket előállító eljárásokat szintén biztosítjuk.

Ezek után röviden, ismertetjük az ábrákat.

Az 1. ábra a nagytömegű, dextrózzal kiszerelt. INF δ és az °C-on egy hétig inkubált liofílezett por RP-HPLC kromatogrammjainak összehasonlítását mutatja he. A kiszerelésben a glükozllezett IFN-S adduktok kialakulása 50 °Con a BI csúcsban jelentkezik (hozzávetőleg a 48. frakcióban) megelőzve a fő 1FN-8 csúcsot (hozzávetőleg 49-50. frakciók) . Lásd

A 2. ábra a nagytömegű, dextrózzal kiszerelt ~1S te

t. mutatja be. Az IFN-S fő csúcsán kívül több kis csúcs mutatható ki .19878 amu-nál. Lásd az 1. példát.

hétig inkubált dextrózzal kiszerelt IFN-S tömegspektrumát mutatja be. A 2. ábrával szemben a túlsúlyban lévő csúcsok megfelelnek az ÍPN--S adduktoknak. Lásd az 1. példát.

A 4. ábra a nagytömegű, USP manmttal kiszerelt INF S és az 50 »€~on egy hétig inkubált liofílezett por RP-HPLC kromatogrammjaínak összehasonlítását mutatja be. A kiszerelésben a glükozllezett I.PN-S adduktok kialakulása 50 «C-on a 81 csúcsban nem jelentkezett. Lásd az 1. példát.

X*

Az 5, ábra a nagytömegű, mannittaí kiszerelt IFN-β tömegspektrumát mutatja be. Az 1FN-S lb csúcsát 19880 amu-nál mutattuk ki, Lásd az 1. példát,

A 6. ábra az USP manníttal kiszerelt INF β tömegspektrumát mutatja be, amit líofileztünk és 50 ^cC-on egy hétig inkubáltünk. A spektrumban további csúcsok képződése figyelhető meg (ezek az addutokra utalnak). Lásd az X. példát,

A 7, ábra a nem tisztított mamuttal kiszerelt INF β tömegspektrumát mutatja be. Ebben a spektrumban számos további csúcs képződése figyelhető meg (ezek az addutokra utalnak). Lásd az 1. példát.

A 8. ábra a metanollal kivonatolt mannittaí kiszerelt INF β tőmegspektrumát mutatja be, azonos kiindulási anyagot használtunk mint a 7. ábránál, Az addukt csúcsok mérete és száma jelentősen csökkent, Lásd az 1. példát.

A 9. ábra az IFN-β kiszerelés tőmegspektrumát mutatja be, mely nagymértékben tisztított mannitot tartalmaz (metanol kivonatolt, szénkezelt, ultraszürt és átkristályosított). A módosítatlan XFN-S-t képviselő fő csúcson kívül csak három kis csúcs látható. Lásd az 1, példát,

A 10. ábra a mannitol. hiányában kiszerelt IFN-β tömegspektrumát mutatja be. Ebből a spektrumhői az látható, hogy a

9. ábrán látható második legnagyobb csúcs nem jelenik meg a nagymértékben tisztított mamiit kölcsönhatás révén, míg a kötőanyag hiányában megjelenik. Lásd az 1. példát.

All, ábra az USP mannittaí kiszerelt INF-β tömegspektrumát mutatja be; azonos napon futtattuk mint a 9, ábra anyagát. Ez a spektrum megerősíti, hogy az USP mannittaí kiszelt IFN-β kiszerelés további csúcsokat eredményez (adduktok), melyek a •nagymértékben tisztított mannítot tartalmazó. I.FN-S kiszerelésben nincsenek jelen. Lásd az 1. példát,

A 12, ábra a 2, példában leírt í.FN-S dextrőz kiszerelések stabilitását mutatja be.

A 13, ábra a 2. példában leirt IPN-S nagymértékben tisztított mannitos kiszerelések stabilitását mutatja be.

A 1.4, ábra a Lót 006 kiszerelés stabilitását mutatja be, melyet a 3, példában leírt nagymértékben tisztított mamuttal állítottunk elő,

A 15. ábra a Lót 008 IFN-S kiszerelés stabilitását mutatja be, melyet a 3. példában leírt nagymértékben tisztított mannittal állítottunk elő,

A 16, ábra a Lót <309 IPN-S kiszerelés stabilitását mutatja be, melyet a 3. példában leírt nagymértékben tisztított mannittal állítottunk elő.

A 17. ábra a különböző mannit minták aktivitás csökkenését mutatja be.

Az 1-3, minták USP mamuttal készültek, amit metanollal nem kivonatoltunk, szénnel nem kezeltünk vagy ultraszűrésnek nem vetettük .alá; a 4-6. minták metanollal kivonatolt mannittal készült kiszerelések, és a 7-9. mintáit metanollal kivonatolt, szénnel kezelt, ultraszűrt és rekristályosított mannittal készültek.

A jelen találmány javított stabilitású ÍFN-S gyógyszerészeti összetételekre és ezek előállítási eljárásaira irányuk Az összetételek IFN-L-t és nagymértékben tisztított mannítot tartalmaznak, A nagymértékben tisztított mannit a kiszerelések stabilitását növeli, csökkentve a lebomlási termékek kialakulását. A stabilizált IFN-β kiszerelés előnyösebb, mivel biztonságosabb (a

X Φ

ΦΦ φ károsító mellékhatások csökkentése miatt) és gazdaságosabb (mivel így a kiszerelés életideje nő).

A közzétett összetételek megnövelt stabilitása a mannit használatából származik, amit nagymértékben tisztítottunk. A jelen találmány újdonsága az, hogy a mamiit, melyet nagymértékben nem tisztítanak, redukáló aktivitást tartalmaz, mely az 1FNβ-val kölcsönhatva nem kívánt adduktokat termel (bomlástermékek), míg az a mannit, melyet nagymértékben tisztítanak ezt a redukáló aktivitást már nem tartalmazza, és ezért az ΙΡΝ-β kiszereléseiben az ilyen adduktok képződését nem okozzák. Az itt bemutatott kísérleti eredmények (1, példa) arra utalnak, hogy a nem tisztított mannitban lévő redukáló aktivitás, mely az IPN-& adduktok képződéséért felelős, nem. redukáló cukor aktivitás, mivel a nem nagyon tisztított mamiit jelenlétében keletkező adduktok tisztán elkülöníthetők azoktól, melyek ismert redukáló cukrokat tartalmazó kötőanyagok jelenlétében keletkeznek (például dextróz).

Ahogy azt itt használjuk a nagymértékben tisztított mannit” szakkifejezés az alacsony redukáló aktivitású akra vonatkozik.. A nagymértékben tisztított mannit redukáló aktivitása kevesebb mint milliónként 20 USP rész, ahogy azt a máshol leírt aktivitási vizsgálatokkal megmérhetjük. A különböző megvalósítási formákban a nagymértékben tisztított mannit redukáló aktivitása kevesebb mint milliónként 19 rész, kevesebb mint. 18 rész, kevesebb mint 17 rész, kevesebb mint 16 rész, kevesebb mint 15 rész, kevesebb mint 14 rész vagy kevesebb mint 13 rész. Az egyik megvalósítási formában a nagymértékben tisztított mannit USP (United States Pharmaeopeía) vagy ÁCS (American Chemical Socíety) minőségű,, mely további tisztítási lépéseken ment keresztül: 11 metanolom kivonatolás; 2) szénkezelés; 3) ultraszűrés; és 4} átkristályositás. A nagymértékben tisztított mannit koncentrációja elegendő a kiszerelés stabilizálásához. A jelen találmány tárgykörébe tartozó kiszerelések körülbelül legalább 0,1 %. míg maximum 7,5 % nagymértékben tisztított mannitot tartalmazhatnak (tömeg/térfogat). A különböző megvalósítási formákban a mannit koncentrációja körülbelül 0,2-7,0%, körülbelül 0,25-2,5 %, és körülbelül 1,25 %.

Közzétettünk terápiásán aktív komponensként IFN-fi-t és kötőanyagként nagymértékben tisztított mannitot tartalmazó mind folyadék, mind liofílezett gyógyszerészeti összetételeket. A en találmány szándékának megteiemen a gyógyszerészeti.

solatban használt

folyadék” szakkifejezés szándékunknak megfelelően a vizes” szakkifejezést felöleli. A liofilez szakkifejezés az IFN-β gyógyszerészeti. kiszerelésekkel kapcsolatban szándékunknak megfelelően a gyors fagyasztva szárításra vonatkozik, amit csökkent nyomáson több edényben végzünk, amelyek a jelen találmány interferon kiszerelésének dózisegyéségeit tartalmazzák. A liofílezők, melyben a fentiekben leírt liofílezést végezzük, kereskedelemben vásárolhatók és a szakirodalomban jártas szakemberek számára könnyen kezelhetők.

A jelen találmány -egyik megvalósítási formájában a folyékony összetétel liofílezett. A. jelen találmány folyékony vagy líofílezett IFN-β kiszerelései stabilizáltak. Az összetételek vagy készítmények stabilizálása” alatt megnövelt stabilitást vagy javított stabilitást értünk, így szándékunknak megfelelően a tárolási stabilitás a nem nagymértékben tisztított mannit kiszerelésű IFN-β összetételekhez képest jobb. Ez a megnövelt stabilitás a

X * * 4 » »

4*4 4 « χ ♦ * * 4

94 »4<.

tárolás során a nem nagymértékben tisztított manníttal kiszerelt készítményekhez képest az IFN-δ adduktok vagy a lebomlási termékek csökkenésében nyilvánul meg. Az adduktok vagy a lebomlási termékek kialakulása az itt leírt tömegspektrográfiás módszerrel mérhető. A jelen találmány stabilizált nagymértékben tisztított manníttal kiszerelt 1FN-S összetétele nem jellemezhető további olyan csúcsok megjelenésével, melyek az USP manníttal kiszerelt ÍFN-S készítményeknél figyelhetők meg, ha a mannit nélkül kiszerelt IFN-& összetétellel hasonlítjuk össze, amit az itt leirt tömegspektrográfiás vizsgálattal határozunk meg. Lásd például a nagymértékben tisztított manníttal kiszerelt IFN-& tömegspektrumát, melyet a 9. ábrán mutattunk be, mely további csúcsokat nem mutat, szemben a mamiit nélkül kiszerelt IFN-β tömegspektrum avat amit a 10. ábrán mutattunk be. Ezzel ábra) számos további csúcsot (adduktok) ad meg, összevetve a mannit nélkül kiszerelt IFN-S tömegspektrum ával. A jelen találmány stabilizált. IFN-B gyógyszerészeti kiszerelései potenciájukat megtartják, és kevesebb mint 0,02 mg/ml glükozilezett IFN-S-t tartalmaznak körülbelül két éves vizsgálat után, amikor 30 °C-on tároltuk és kevesebb mint 2 év, amikor 25 ^öC-on tároltuk.

A jelen találmány stabilizált gyógyszerészeti kiszerelései IFN-b-t és annak variánsait tartalmazzák. Ahogy azt itt használjuk az ”1FN-E^!! szakkifejezés az l'FN-b-ra. vagy változataira vonatkozik és néha az IFN-E-szerü pofipeptídekre.

A humán IFN-S változatok lehetnek természetben előfordulók (például allélikus változatok, melyek az IFN-B lokuszban fordulnak elő) vagy rekombínánsan előállított formák, melyek amiφφ » * *» * < X ♦ ΦΦ

Φ » Χχ* Λ * _ν * * » * Φ χ ♦*** ·Μ >φ nosav szekvenciája azonos vagy hasonlít, vagy lényegében egyezik az érett natív IPH-S szekvenciájával. Az IFN-S fragmense! vagy csonkított formái, melyek aktivitásukat megtartják, szintén ide tartoznak. Az 1FN-S ezen biológiailag aktív fragxnenseit vagy csonkított formált ügy· alakíthatjuk ki, hogy a teljes hosszúságú IFN--S aminosav szekvenciából aminosavakat távolítunk el, ismert technikákat. Az IFN-S polipeptidek lehetnek glíkozilezettek vagy .nem glíkozilezettek, ahogy erről a szakirodalomban beszámoltak, amikor is mind a glikozilezett, mind a nem glikozilezett IFN-S-k minőségileg hasonló specifikus aktivitásokat mutatnak, ezért a glikozilezett csoportok az IFN-& biológiai aktivitásában nem vesz rész, vagy biológiai aktivitásához nem járul hozzá.

Az itt szereplő IFN-S változatok közé tartoznak az érett natív IFN-fe szekvenciák műfemjei (5,814,485 számú Amerikai

egészében hivatkozásként építettünk bej, amelyekben egy vagy több eiszteint, melyek a biológiai aktivitásban nem lényegesek, szándékosan eltávolítunk, kicserélünk más aminosawal, az intermolekuláris keresztkötés vagy a hibás inb'amolekuláris díszülfídhíd kötések kialakulásának megakadályozására.. Az ilyen típusú IFN-S változatok közé azok tartoznak, melyekhez glieint, valint, alanínt, lencint, izolendnt, tirozint, fenílalanint, bísztídínt, tríptoíánt. szerint, treonint vagy metíonint használnak fel a cisztein helyettesítésére, ahol a felsorolt 17 aminosav az érett natív aminosav szekvencia része. A legelőnyösebb a szerin és a treonln kicserélése, mivel ezek a cisztein kémiai analógjai, Különösen előnyben részesítjük a szerin helyettesítéseket. Lásd például azt az 1FH-S változatot, melyben a cisztein az érett natív szekvencia *··· <

* * »s < ♦ t * * 4

17. helyén található, amit szerinnel helyettesítettek (5,814,485 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés]. A 17. helyzetű eiszteint a. szakirodalomban ismert eljárásokkal el is lehet távolítani [4,588,584 számú Amerikai' Egyesült Allamok-beli szabadalmi bejelentés, amelyet itt teljes egészében hivatkozásként építettünk be], eredményül egy olyan érett IFN-b mntein.t kapunk, mely egy amínosavval rővidehb mint az érett natív IFN-B [4,530,787; 4,572,798 és 4,588,585 számú Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi bejelentések].. így az egy vagy több mutációval megváltoztatott IFN-b változatok, melyek például a gyógyszerészeti alkalmasságot javítják, szintén a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak.

ló, hogy az IFN-íS-t kódoló nukleotíd szekvenciában mutációval további változások eszkőzalhetők, ami az 1FN-& aminosav szekvenciájának megváltozásához vezet, anélkül, hogy az interferon biológiai aktivitása megváltozna. így az IFN-S változatot kódoló Izolált nukleinsav molekulák, melyek aminosav szekvenciája az érett natív ΙΡΝ-β aminosav szekvenciájától eltér egy vagy több nukleotíd szubsztitúcióval, hozzáadással vagy elvétellel létrehozható az itt közzétett nukleotíd szekvenciánál, úgy hogy a kódolt !FN-£-ban egy vagy több aminosav helyettesítés, hozzáadás vagy elvétel keletkezik. A mutációk standard technikákkal megvalósíthatók, mint például helyspeeifikus mutagenezíssel és PCR közvetített mutagenezíssel Az ilyen IPN-& változatok szintén, a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak.

Például a konzervatív aminosav helyettesítések egy vagy több kiszámított, előnyösen nem esszenciális aminosavnál végezhetők. A nem esszenciális aminosavak azok, melyek a vad*'ί*.

típusú IFN~S~ban úgy változtathatók meg, hogy azzal a biológiai aktivitás nem változik meg, míg az esszenciális aminosavak a biológiai aktivitáshoz nélkülözhetetlenek. A konzervatív amínosav helyettesítések-néi az aminosavat egy olyan aminosavra. cseréljük ki, mely hasonló oldallánccal rendelkezik. .Az aminosav családokat, melyek azonos oldalláncokkal rendelkeznek, a szak irodalomban meghatározták. Ezek közé a családok közé a bázisos oldalláneűak (például lizin, arginin, hisztidin), a savas oldalláncűak (például a.szpa.ra.ginsav, glutammsav), a töltetlen poláros oldalláneűak (például glicin, aszparagin, glutamin, szerin, treonin, tirozín, cisztein), a nempoláros oldalláneűak (például alanin, valin, leucín, izoleucin, prolin., fenilalanin, metionin, triptoíán), a béta-elágazó oldalláncúnk (például treonin, valin, ízoleucín), és az aromás oldalláneűak (például tirozín, fenilalanin, triptoíán, bisztídin) tartoznak. Az ilyen a megőrződött, aminosavaknál vagy a megőrzött aminosavaknál nem végezhetők el.

Alternatívaként a változat IFN-S nukleotid szekvenciák az

IFN-S-t kódoló szekvencia egészébe vagy egy részébe random beépíthetők, például szaturációs mutagenezissel, és az eredményül kapott mutánsok az aktivitással rendelkező mutánsok azonosításához az IFN-β biológiai aktivitásra szűrhetők, A mutagenezist. kővetően a kódolt fehérje rekombináns módon kifejezhető, és a fehérje aktivitása az itt leírt standard technikákkal meghatározAz IFN-β biológiailag aktív változatainak aminosav szekvenciája általában legalább -80 %-ban, előnyösen körülbelül 90-95 %-ban, vagy előnyösebben körülbelül 96-99 %-ban a referencia IFN-& polipeptid szekvenciájával azonos, mely összehasonlításra szolgál, ilyen lehet például a natív humán JFH-β. A szekvencia azonosság” megállapításakor a változat polipeptidben és polipeptid molekulában található szándékosan megváltoztatott azonos aminosavakat, melyek referenciaként szolgálnak, ha azt úgy specifikálják, a változat aminosav szekvenciájának folyamatos szegmensénél a hivatkozási molekula aminosav szekvenciájához renA szekvencia azonosság megállapításánál a két szekvencia optimális elrendezéséhez a változat aminosav szekvenciájának folyamatos szegmensében a hivatkozási szekvenciához képest egy vagy több további aminosav lehet, vagy egy vagy több aminosav hiányozhat. A hivatkozási szekvenciával történő összehasonlításkor használt folyamatos szegmens legalább 20 folytonos aminosavat tartalmaz:. A változat aminosav szekvenciákban a rések figyelembevételekor a szekvencia azonosság növelése a réshibák felsorolásával érhető el, A -szekvencia elrendezések módszerei a szakirodalomban jártas szakemberek számára jói ismertek.. így két bármilyen szekvencia között a százalékos azonosság meghatározása matematikai algoritmusokkal végrehajtható, Az egyik előnyben részesített, nem korlátozó jellegű példa, melyet a szekvenciák azonosságának matematikai algoritmussal történő vizsgálatára használnak, az un. Myers és Miller-féle algoritmus [Myers és Miller: Comput. Appl. Biosci., 4, 11-17 (1988)1. Ilyen algoritmust alkalmaznak az ALIGN programban (verziószám: 2.0), mely a GCG elrendezési programcsomag része. Amikor az aminosav szekvenciákat hasonlítjuk össze az AL1GN programmal, akkor a PAM120 súlyozott maradék táblázat, ahol a réshiba hossza 12, és a réshiba 4. Egy másik nem korlátozó jellegű előnyben részesített példa a szekvenciák ő-sszehasoníitását végző matematikai algoritmusra a Katiin és Altschul-féle algoritmus fKariin és Altsehul: Froceédings of the National Aeademy of Sciences,. USA 90, 5873-5877 (199G)|, amit később módosítottak [Karlin és Altshcul: Proceedíngs of the National Aeademy of Sciences, USA 90, 5873-5877 (1993)]. Ilyen algoritmusokat építettek be az N.B.LAST és XBLAST programokba is (Altsehul és mtsai: J. MoL Bioi., 215, 403-410(1990)]. A BLAST aminosav keresés az XBLAST programmal végrehajtható, a pontszám ~ 50, szóbosszúság ~ 3 értékeknél a kérdéses polipeptid aminosav szekvencia azonosságát megkapjuk. Összehasonlításnál a réses elrendezések nyeréséhez a réses BLAST programot használjuk (Altsehul. és mtsai: Nucleic Aeids Rés., 25, 3339-3402(1997)], Alternatívaként a keresésnél PSÍ-BLAST program használható, mely a molekulák közötti távoli kölcsönhatásokat mutatja ki (Altsehul és mtsai: Nucleic Aeids Rés., 25, 3339-3402(1997)]. A BLAST, gapped BLAST, vagy PSÍ-BLAST programok használatakor az alapbeállítási értékeket használhatjuk (http://n^,vvvv.nchi..nlmmih,gov.]. A következő programok ís alkalmazhatok: AL1GN program (Dayhoff: Atlas of Protein Sequence and Structure 5(3), National Bíomediea! Research Foundation, Washington, D.C., (1973)] és Wisconsin Sequence Anaiysís Package, Version 8 (ami rendelkezésre áll a Genetics Computer Group-föl, Madison, Wisconsin), például a GAP program, ahol az aiaperteímezett Amikor az aminosav szíÁ lCí.\ χ százalékos azonosságát tekintjük, néhány aminosav helyzete a konzervatív aminosav helyettesítések miatt eltérhet, melyek a fehérje tulajdonságait nem befolyásolják. E példákban a százalékos azonosságot mega konzervafivan helyettesített aminosavak hason« *· lósága miatt. Az ilyen állítások a szakirodalomban jól ismertek [Myers és Miller: Comput. Appl. Biosci., 4, 11-17 (1988)},

A jelen találmány körébe tartozó, biológiailag aktív IFN-β változatok közé azok az IFN-β poiipeptidek is Levehetők, melyek kovalensen kapcsoltak, például polietilén--glíkoIla! (PEG) vagy albuminnal. Ezek a kovalens hibrid ÍFN-β molekulák, mintán a be tegbe beadták, bizonyos kívánt gyógyszerészeti tulajdonságokkal rendelkeznek, mint amilyen például megnövelt szérum féléleüdő. A PBG-1FN adduktok képzési eljárásai közé a monometoxípoli (etilén-glikol) módosítás tartozik, ezzel olyan aktív vegyületet hozunk létre, mely az IPN-S--vaI reagál. A PEG-gel kapcsolt polipeptidek előállítási és alkalmazási eljárásait a szakirodalomban leírták (Delgado és mtsai: Crit. Rév. Ther. Drug, Carrier Syst.., 9, 249-304 (1992)]. Az albumínnal fuzionált polipeptid előállítási eljárásait, mely a kérdéses polipeptid (például IFN-S) és az album-in kódoló szekvenciájának fúzióját foglalja magában, a szakirodalomban leírták 15,876,969 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés, amelyet itt teljes egészében hivatkozásként építettünk be).. Ezek a hibrid IFN-β molekulák az ÖSP mannában lévő szennyeződésekkel reagálnak és sokkal stabilabbak lesznek, ha nagymértékben tisztított mamuttal

Imány biológiailag aktív IFN-β változatainak az IFN-β aktivitásokat fenn kell tartaniuk, különösen az IFN-β receptorhoz való kötődési képességüket. Néhány megvalósítási formában az IFN-β változat legalább 25 %, körülbelül 50- %, körülbelül 75%, körülbelül 85 %, körülbelül 90 %, körülbelül 95 %, körülbelül 98 %, körülbelül 99 % mértékben a hivatkozási IFN-β polipeptid aktivitását megtartja, például a natív humán IFN-β hí15 vatkozási fehérjéhez viszonyítva. Az 1FN-8 változatok, melyek aktivitása a referencia IFN-S polípeptídhez képest megnőtt, szintén, a jelen találmány körébe tartoznak. Az IFN-β változatok biológiai aktivitása a szakirodalomban ismert, eljárások bármelyikével megmérhető [Fellous és mtsai: Proceedlngs of the National Academy of Sciences, USA 79, 3082-3086 (1982); Czerniedd és mtsai: J. Virot, 49(2), 490-496(1984); Mark és mtsai:

Proceedlngs of the National Academy of Sciences, USA 81, 56625666 (1984); Branca és mtsai: Natúré, 277, 221-223 (1981); Williams és mtsai: Natúré, 282, 582-586(1979); Herberman és mtsai: Natúré, 277, 221 ••223(1979); Anderson és mtsai: Journal of Bioiogical Chemistry 257(:19), 11301-11304 (1982)]; és az ΪΡΝB erősségének vizsgálatát itt is leírtuk, (lásd a 2. példát) .

A jelen találmány kiszereléseihez az 1FN-B bármely fajból származhat, beleértve, anélkül, hogy erre korlátoznánk magunkat, a következőket: madár, kutya, tehén, sertés, ló és ember. Előnyösen az 1FN-& emlős fájókból származik, amikor a kiszere lést emlős 1FN-S betegség kezelésére használjuk, és előnyösebben olyan emlős fajokból származhat, melyet azonos faj kezelésére használunk.

A jelen találmány IFN-B polipeptideinek és az íFN-β változat polipeptideinek nem korlátozó példáit közzétették (Nagata és mtsai: Natúré 284, 316-320(1980); Goeddel és mtsai: Natúré, 287, 411-416(1980); Yelverton és mtsai: Nucleic Acids Rés., 9, 731-741(198.1); Streuli és mtsai: Proceedíngs of the National Academy of Sciences, USA 78, 2848-2852(1981)·, EF 028033B1, és EP109748B1 számú szabadalmi bejelentések, valamint a kővetkező számú Amerikai Egyesült Államok-beii szabadalmi bejelentések: 4,518,584; 4,569,908; 4,588,585; 4,738,844;

4,753,795; 4,769,233; 4,793,995; 4,914,033; 4,959,31.4; 5 5,545,723 és 5,814,485, amelyeket itt teljes egészében hivatkozásként építettünk bej.

Ezek a. hivatkozások az IFN-8 poiipeptid azon aminosavainak és régióinak, tekintetében is használhatók, melyek a biológiai aktivitás elvesztése nélkül megváltoztathatok,

A jelen találmány egyik megvalósítási formájában a stabilizált gyógy szeré sze ti összetételben az· IFN-& nem más mint az érett natív IFN-β poiipeptid. Egy másik megvalósítási formában az IFN-β kiszerelésekben az érett IFN-β poiipeptid 17, fentiekben megvitattuk. Viszont a jelen találmány más megvalósítási formáiban, ahol az IFN-S stabilizált gyógyszerészeti kiszerelésben található, bármely biológiailag aktív IFN-β poiipeptid vagy' változat szerepelhet, ahogy azt leírtuk, A jelen találmány néhány megvalósítási formájában az IFN-S-t rekombináns

A rekombináns módszerekkel előállított IFN-S szándékunknak megfelelően az érett natív IFN-S biológiai aktivitásával

DNS technikákkal állítottuk elő. Az IFN-β az IFN-β poíipeptidet kódoló nukleotid szekvenciát tartalmazó expressziós vektorral transzformált gazdasejt tenyésztésével állítható elő. A gazdasejtek a nnkleotid szekvenciát átírják és a kívánt fehérjét előállítják, és ezek lehetnek prokariőta (például Rschenóhín coh) vagy eukarióta eredetűek (például élesztő, rovar vagy emlős sejtek). Az IFN-fá rekombináns termelésének példáit leírták a szakirodalomban [Mantei és mtsai: Natúré, 297, 128(1932); Ohno és mtsai: Nucleic Acíds Rés., 10, 967(1982); Smith és mtsai: Moh Ceil.

Biot, 3, 2156 (1983), és a kővetkező számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentések: 4,462,940, 5,702,699 és

5,814,485; amelyeket itt teljes egészében hivatkozásként építettünk bej. Lásd a 5,795,779 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentést is, ahol az IFN-fi-la-t kínai hörcsög petefészek sejtekkel (CHO) rekomhínánsan állították elő, amelyet itt teljes egészében hivatkozásként építettünk be], A humán interferon géneket rekombináns DNS (rDNS) technológiával klónozták, és Esoherie/ua coléban kifejeztették (Nagola és mtsai: Natúré, 264, 316(1980); Goeddel és mtsai:

Natúré, 287, mtsai: Nucl. Acid Rés.. 9,

731(1981); Streulí és mtsai: Froceedíngs of the National Acaderoy of Sciences, USA. 78, 2848(1981)), Alternatívaként az IFN-S transzgenikus állattal vagy⁷ növénnyel is előállítható, melyet genetikailag a szakirodalomban leírt módszerekkel úgy változtattak meg, hogy az IFN-b-t kifejezzék.

Alternatívaként az lFN-β kémiailag szintetizálható, bármely szakirodalombari ismert eljárással a peptidek szakirodalmában jártas szakemberek által [Li és mtsai; Froceedíngs of the National Aoademy of Sciences, USA 80, 2216-2220(1963), Steward és Young: Solid Phase Peptíde Synthesis (1984) (Fíerce Chemical Company, .Rockford, Illinois), és Baraney és Merrifíeld: The Peptides: Analysis, Synthesis, Bíology, szerkesztők: Gross és Meinhofer, 2, 3-254 (1980) (Academie Press, New York)); az előzőek a szílárdfázísű peptidszintézissel foglalkoznak, míg a kővetkező a hagyományos oldatban végzett szintézisekkel: Bodansky (1984) Frínciples of Pepiidé Synthesis (SpringerVerlag, Berlin) és Gross és Meinhofer, (szerkesztők) (1980) The Peptides: Analysis, Synthesis, Bíology, (Academie Press, New » Α Φ -> « * * * ♦ ♦

Φ 9 9 ♦ 9 9

9 ·, 9

York)]. Az IFN-iS a szimultán többszörös peptid szintézis eljárásával kémiailag is előállítható (Houghten: Proceedíngs of the National Academy of Sciences, USA 82, 5131-5135(1984); és 4,631,211 számú Amerikai Egyesült Államok-belí szabadalmi bejelentés],

A jelen találmány összetételei kevesebb mint körülbelül ö,.öl mg/ml IFN-E-t tartalmazhatnak, de legfeljebb körülbelül 15 mg/ml IFN-E-t (tömeg/térfogat), A különböző megvalősitási formákban az IFN-S körülbelül 0,015-12,5 mg/ml, körülbelül 0,025-10 mg/ml, körülbelül 0,05-8 mg/ml, körülbelül 0,075-6 mg/ml, körülbelül 0,1-4 mg/ml, körülbelül 0,125-2 mg/ml, körülbelül 0,175-1 mg/ml, körülbelül 0,2-0,5 mg/ml, körülbelül 0,225-0,3 mg/ml és körülbelül 0,25 mg/ml. koncentrációban

Néhány megvalősitási formában a. jelen találmány kiszerelései gyógyszerészetileg elfogadható hordozót tartalmaznak. Szándékunknak megfelelően a gyógyszerészetileg elfogadható hordozó” kényelmesen használható a terápiás alkotórészek tárolásának, beadásának és/vagy gyógyító .hatásának elősegítésére. A hordozó az 1FN-8 bármely nem kívánt mellékhatását is csökkentheti. A megfelelő hordozónak stabilnak kell lennie, azaz a kiszerelés többi alkotórészével nem reagálhat. A befogadóban helyi vagy szisztémás károsító hatást nem okozhat a kezeléshez használt dózisokban és az alkalmazott koncentrációkban. Az ilyen hordozók általában a szakirodalomban ismertek, A jelen találmány számára megfelelő hordozók azok a hagyományosan használt nagy stabilitású makromolekulák, melyek felsorolási itt következik: albumin, zselatin, kollagén, poliszaeharid, monoszacharidok, polivínil-pirrolidon, politejsav, poliglikolsav, polimer * φ aminosavak, rögzített olajok, eül-oleat, hposzömak, glukóz, szacharóz, laktóz, mannőz, dextrőz, dextrán, cellulóz, szorbit, poli (etilén-glikol) (PEG) és hasonlók. Az- alacsony kibocsátású hordozók, mint például a hialuronsav, szintén megfelelhetnek fPrisell és mtsai: Int. J. Pharmaceu., 85, 51-56(1992), és 5,166,331 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés). Az összetétel más elfogadható komponensei, anélkül, hogy erre korlátoznánk magunkat, a következők: győgyszerészetileg elfogadható szerek, melyek az izotóniát módosítják, beleértve a. vizet, sókat, cukrokat, poliolokat, smnnosavakat és puffereket. A megfelelő pufferek példái a következők: foszfát, nitrát, szukeínát, acetát és más szerves savak vagy ezek sói és olyan sók, melyek az ionerősséget módosítják, mint például nátríumklorid, nátrium-foszfát, nátrium-szulfát, kálínm-kiorid, és a fentiekben felsorolt, pufferek.

A jelen találmány néhány megvalösitási formájában a gyógy szere szetileg elfogadható hordozó a humán albumin. A humán albumin lehet természetes vagy rekomblnáns formájú, ezt a két formát itt egyaránt humán albumin-nak nevezzük. A jelen találmány ki szerelései legkevesebb mint körülbelül 0,01% humán albumint tartalmazhatnak, míg a legnagyobb mennyiség körülbelül 15 % gat). A különböző megvalósítási formákban a humán albumin koncentrációja körülbelül 0,02512,5 %, körülbelül 0,05-10 %, körülbelül 0,1-9 %, körülbelül

5,25-8 %

0,5-7 %, ül 0,6-2 %,

0,7

1,75 %, körülbelül 0,75-1,5 %, körülbelül. 1,2-.1,3 % és 1,25 %,

A gyógyszerészeti összetételek további szolubilizácíős szert vagy oldékonyság fokozó szert tartalmazhatnak. A guanídinium csoportot tartalmazó vegyűletek, előnyösebben az argínín, az

IFN-β oldékonys-ágának növelésére használhatók, Az ilyen óidékonyságot fokozó szerek példái, közé tartozik az arginin, valamint az arginin aminosav analógjai, melyek az 1FN-S olöékonyságának fokozására képesek. Az ilyen analógok közé, anélkül, hogy erre korlátoznánk magunkat, a kővetkezők tartoznak; dípeptidek és tripeptidek, melyek arginint tartalmaznak. A további megfelelő szoiubiiizáló szereket a szakirodalomban megvitatták [4,816,440; 4,894,330; 5,004,605; 5,183,746; 5,643,566 számú Amerikai Egyesült Áliamok-beli szabadalmi bejelentések; és Wang és mtsai: d. Parenteral Drug Assoc., 34, 452-462(1980); amelyet itt teljes egészében hivatkozásként építettünk bel.

A szoiubiiizáló szerek nem korlátozó jellegű, jelen találmányban alkalmazható példái a felületaktív anyagok (detergensek), melyek az ÍFN-B szolubilizálásához a hídrofil-hidrób egyensúly megteremtésére képesek. Az erős természetes vagy szintetikus anionos felületaktív anyagok használhatók, mint például zsírsavak alkáli fémsői és alkáli fém alkílszulfátok. Az ilven szerek általában 10-14 szénatomot tartalmaznak. A nátriumdodecil-szulfát (SDS) és a nátrium-laurát a különösen előnyben részesített szoiubiiizáló szerek példái. A jelen találmány Összetételeiben. használható szoiubiiizáló szerek további példái, anélkül, hogy erre korlátoznánk magunkat, a. következők: nátrium-dódecik szulíonát, nátrium-deci!-szulfát, nátrium-tetradecíl-szulfát, nátrium-trideeü-szulfonát, nátrium-mirisztát, nátrium-kaproilát, náírium-dodeeíl-N-szarkozinát és nátríum-tetradecíl~N~szarkozi~ nát. A gyógyszerek hagyományos stabilizálását felületaktív anyagokkal vagy emulgeáiö szerekkel a szakirodalomban leírták (L-evine és mtsai: J. Parenteral Sci. Technok, 45(3),. 160165(1991). A további megfelelő felületaktív anyagok megvitatása φ ♦ * ».·

φ Φ Φ κ ♦ '♦ φ ♦ φφφ« ** a szakirodalomban megtalálható (4,507,281; 4,816,440 és 5,183,746 számú Amerikai Egyesült ÁUamok-beli szabadalmi bejelentések; amelyeket itt teljes egészében hivatkozásként építettünk bej.

A fentiekben közzétett szereken kívül más stabilizáló szerek, mint például etíléndiamineietraecetsav (EDTA) vagy ezek sói, mint például dinátrium EDTA, a folyékony gyógyszerészeti összetételek stabilitásának további fokozására adagolhatok. Az EDTA azokat a. fémionokat gyűjti össze, melyek számos oxidativ reakciót katalizálnak, és így mint további stabilizáló szerként szerepelhet.

Ahol az IFH-S kiszerelést emlősbe juttatják be, mint például a megvalósítási formában az IFN-8 injektálható oldatához az összetétel olyan ionerősséget biztosít, mely azonos vagy hasonló a beteg szérumában vagy testfolyadékában találhatóhoz. Az íonerősség eléréséhez a sót, mint amilyen például nátrium-klorid, kálium-klorid, vagy foszfát-pufíer, megfelelő koncentrációban az

A jelen találmány stabilizált IFN-β kiszereléseinek pH~ja. körülbelül 3,0-9,0 tartományban található. A megfelelő pH tartományok a következők; például körülbelül 4,0-8,8, körülbelül 5,08,6, körülbelül 6,0-8,4, körülbelül 6,8-8,2, körülbelül 6,9-8,0, körülbelül 7,0-7,8, körülbelül 7,1-7,7, körülbelül 7,2-7,6 és körül belül 7,3- 7,5.

A stabilizált folyékony 1FN-8 kiszerelés vagy a jelen találmány szerinti helyreállított, stabilizált, líofílezett ΙΡΝ-β gyógyszerészeti összetétel gyógyszerészetileg hatásos mennyiségét a szubjektumba beadjuk. A gyógyszerészetileg hatásos mennyiség” *

« tt ¥ ** φ * * « «♦

Φ»* 9 · ♦ » * * X mr 4*Φ «χχ.

szándékunknak megteieloen a betegség vagy aha megelőzésben vagy diagnózisában hasznos, A tipikus beadási utak közé, anélkül, hogy erre korlátoznánk magunkat, a következők tartoznak; orális beadás, nazális szállítás, pulmonaris szállítás, és parenteráüs beadás, beleértve a következőket: transzdermalis, intravénás, intramuszkuláris, szubkután, intraarteriáüs és

Íntraperitoneális injekció vagy infúzió. Egy ilyen megvalósítási formában a. injekció beadása előnyösen szubkután történik, A jelen találmány összetételeinek formál közé, anélkül.

hogy erre korlátoznánk magunkat, a kővetkezők tartoznak: oldatok, szuszpenziók és emulziók. Tipikusan a terápiásán hatásos IFN-β mennyiség az összetételben körülbelül 0,01 ug/kg-től körülbelül 5 mg/kg-íg terjed, előnyösen körülbelül 0,05 pg/kg-tól körülbelül 1000 pg/kg-ig, előnyösebben körülbelül 0,1 pg/kg-től körülbelül 500 gg/kg~ig, még előnyösebben körülbelül 0,5 pg/kg - 30 pg/kg.

Az egyik megvalősítási formában a stabilizált gyógyszerészeti összetétel, mely IFN-E-t tartalmaz, dőzisegységbe szerelhető Id, és injektálásra vagy infúzióra alkalmas formában lehet, mint például oldatban, szuszpenzíóban vagy emulzióban, Továbbá fagyasztott vagy szárított formában elkészítve tárolható, mint pélemulziővá helyreállítható mielőtt bármely módszerrel beadásra, kerülne, beleértve az orális vagy a parenterális utakat, A stabilizált gyógyszerészeti összetétel membránszűréssel sterilizálható és egységdőzis vagy többszörös dózis edényekben tárolható, mint például lezárt fiola vagy’· ampulla, A gyógyszerészeti összetétel kiszereléséhez a. szakirodalomban általánosan ismert további eljárások felhasználhatók az itt közzétett gyógyszerészeti összetéte23

X Jf Μ * fi » * ♦ #*

9 9 9 9 «»* «3 lek tárolási stabilitásának további fokozása érdekében, feltéve, ha a közzétett nagymértékben tisztított mannit jótékony hatását károsan nem befolyásolják. Az alapos megvitatás és a gyógyszeré szetileg elfogadható hordozók, stabilizálok, stb. kiválasztása a szakirodalomban megtalálható (Remington's Pharmaceutícal Sciences (1990) 18. kiadás, Mack Pub. Co., Eaton, Pennsylvania, amelyet itt teljes egészében hivatkozásként építettünk bej.

Néhány megvalósítási formában a jelen találmány folyadék összetételeit fecskendőbe töltjük (a jelen találmány elötöltótt összetételével előtöltött fecskendőt lefagyasztjuk. Ez a fagyasztott, előtöltött fecskendő megfelel a tároláshoz és a szállításhoz.

A következő példák bemutató jellegűek és a találmány oltalmi körét nem korlátozzák.

1. Példa gyógyszerészén

A kötőanyagként dextrőzt tartalmazó 1FN-& gyógyszerészeti kiszerelések a szakirodalomban megtalálhatók. Amikor az ilyen kiszereléseket 37 ®C-on vagy magasabb hőmérsékleten inkuhálképez az IFN-ü-val, amit RP-HPLC-vel kimutathatunk (fordított, fázisú nagyteljesitményü folyadék kromatográfíával). Az ÜSP mamríttal kiszerelt ÍFN-& azonos körülmények között nem képez kimutatható kovalens adduktot RP-HPLC- vei mérve . Viszont, a szennyeződéseket tartalmazó mannit az IFN -ü -val olyan adduktot képez, mely elektropermet tömegspektográfiával kimutatható. Az USP mamutban lévő szennyezések (vagy lebomlási termékek) milyensége gyógyszerészetileg nem fogadható el, és még ha elfogad24

Φ Φ * Φ β 9 Φ 4 χ· φ » Φ. ΦΦΦ Φ φ <

♦ Φ Φ Φ * β

ΦΦ ί * ΦΦΦ ΦΦ Φ Φ Φ ható lenne, akkor sem felelne meg a polipeptid alapú gyógyszerekre jelenleg, érvényes előírásoknak, ami a kiszerelésekben a lebomlási termékek kialakulásának minimalizálását hangsúlyozza. A lebomlási termékeket azért tekintjük nem kívánatosnak. vagy elfogadhatatlannak, mert megnövelik annak a lehetőségét, hogy a polipeptid alapú gyógyszernél a nem kívánt mellékhatások fellépjenek. A jelen találmány új felfedezése, hogy az 1PN-& megnövekedett stabilitást mutat, amikor nagymértékben tisztított mannittal szerelik ki, miközben redukáló aktivitása kevesebb mint milliónként 20 részre csökken, összevetve a nem nagymértékben tisztított mannittal kiszerelt készítménnyel. A jelen találmány további újdonsága, hogy az VSP mamiit tisztítása métanolos kivonatolással, szénkezeléssel, ulíraszúréssel és átkristáIvositással olyan mannit készítményt eredményez, mely milliónként 20 rész redukáló aktivitással rendelkezik.

Az ezekhez a kísérletekhez használt IFN-E-lb-t Fsehen'chia cofí~ban állítottuk elő, ahogy azt a. szakirodalomban leírták [4,462,940 és 5,702,699 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentések, amelyeket itt teljes egészében hivatkozásként építettünk bej, A nátnum-dodecil-szulfátot és a sókat az IFN-S-ből kromatográíiával eltávolítottuk; és az 1FN-S1b-t humán albumin oldattal kombináltuk (pH - 11,5-12,0); az oldat pH-ját HCl-lel 7,5-re állítottuk he; és a kötőanyagot tartalmazó oldatot (mannit vagy dextróz) 1,25 % végkoncentrációra állítottuk be, A humán albumin végkoncentrációja, a kiszerelésben 1,25 vegves%.

Ezekből a kiszerelésekből az IFN-B-Ib-t a tömegspektrográfiához RP-HPLC-vel állítottuk elő. Ez a módszer a glikozilezett

IFN-S-Ib azonosítását lehetővé teszi, mivel a. kromatogrammon különálló csúcsban jelenik meg (Bl). A glíkozilezett IFN-B-lb kimutatási határa ebben a módszerben 0,02 mg/ml. Amikor ennek a csúcsnak a mennyisége kisebb mint 0,02 mg/ml, akkor a két csúcs alatti területet összegezzük és a nem kiszerelt IFN-β hivatkozási anyaghoz hasonlítjuk, így megkapjuk az Összes IFN&~lb tartalmat. Amikor a csúcs területe nagyobb mint 0,02 mg/ml, akkor a koncentrációt függetlenül határoztuk meg, és adtuk meg.

Az analízishez a következő készüléket alkalmaztuk, és a. gyártó utasításait követtük:

Az oldószerszáliításí rendszer: Waters 626 Gradíent Pump Injektálási rendszer: Waters 717 plus Autosampler, 200 ml injekciós hurokkal, polipropilén autosampler fiolák teflon rekesszel, a hőmérsékletet 4 »C-ra állítottuk be, a tű mosásához 84 % acetonitrílt használtunk, öszlopfütö: Waters 600, melynek hőmérsékletét 40 ^öC-ra állítottuk be.

Oszlop: BAK.ERBÖND Wide-Pore Butyl C4 RP-Coiumn, 300 Angström 5 pm, 4,6 mm (a) 250 mm, J.T. Baker résszáma: 220lö. Az oszlopra az áramló folyadékot a jelzésnek megfelelően rávezettük és az oszlopot behelyeztük az oszlopfűtőbe.

Detektor: Waters 486 LTV Detector.

Hullámhossz: 214 mn-re állítottuk be. Az összes adatot rögzítettük.

Adatrendszer: P.E. Nelson Turhoehrom Data System

A liofílezett IFN-fi kiszerelések mintáit 1,20 ml 0,54 % nátríum-kloriddal helyreállítottuk, gyengén forgatva felkevertük, és környezeti hőmérsékleten 30 ± S percig inkubáltuk. A kalibrációhoz nem kiszerelt IFN-fi referencia anyagot használtunk. A kalibráciős tőrzsoldatot hozzávetőleg 0,5 mg/mhre hígítottuk, és a

mérésével meghatároztuk (pontonként 6 mérés átlaga), A hígított

törzsoldatot ezek után 0,25 mg/mhre hígítottuk, és ezt használtuk kalibrációs oldatnak.

Az automatikus mintavevőt úgy programoztuk, hogy 70 perces időközönként 20 μί-t injektáljon. Az adatrendszer feszültségtartománya 1 volt, a mintavétel 10 másodpercenként történt, és a folyamatot 70 percig végeztük. Az A eluens összetétele 0,1 % TFA (trifluorecetsav, HPLC minőségű), míg a B eluens összetétele: 84 % acetonitrii (HPLC minőségű) és 0,084% TFA (HPLC minőségű), Az eluens áramlási sebességét 1,0 ml/percre állítottuk (70 % A eluens és 30 % B eluens), és az oszlopot egy óráig egyensúlyba hoztuk. Miután a detektor alapvonalát és a rendszert beállítottuk, a blank gradienst analizáltuk. Az analízis akkor kezdődött, amikor a második blank gradiensben jelentős csúcsot nem kaptunk.

Az IFN -S koncentrációját a nem módosított ÍFN-.S-nak (B csúcs), és a glíkozilezett IFN-S-nak (BI csúcs) megfeleled csúcs alatti területeinek összegeként határoztuk meg. Például, ahol a kalibrációs oldat a nem kiszerelt IFN~&~náI 0,25 mg/ml, az IFN-β koncentrációja (mg/ml)~ (teszt minta teljes csúcs területe BI + B/kalibráeiós teljes csúcs területe BI . * Β) x 0,25 mg/ml.

Az elektrospray tömegspektrum (ES-MS) adatokat a, fenti kromatográfíánál kapott frakcióknál megvizsgáltuk. Mindegyik

Κ *4 φ φ fc φ fc 9 fc Φ

Φ fc fc ί φ fc fc* φ A fcfcfc fcfc «* fcfc

Ki csúcs frakcióit összegyűjtöttük és az analízis előtt koncentráltuk. Az elektrospray tőmegspektrumot API 100 single-quadruple tömegspektrométerrel vettük fel (Perkin-Elmer Sciex Instruments, Thornhíll, Ontario, Canada) amihez Harvard fecskendőpumpát használtunk (Harvard Apparátus, South Natick, MA) és Rheodyne 8125 injektálöt, 1ÖO^: pM belső átmérővel, szílíka csővel ellátva. A tömegspektrumot pozitív módban rögzítettük, szűrve a tomeg/töltés arányt (m/z) 140-2500 tartományban szűrésenként 6 másodpercenként, 0,2 Da lépésméretet alkalmazva. Á tömegspektrométert polípropílén-glíkol eleggyel kalibráltuk, ami 3,3 x 10-s M PPG 425-t, 1 x 10 - M PPG 1000-t és 2 χ ΙΟ ⁴ PPG 2000-at tartalmazott (Aldrich Chemical Co.) 50:50:0,1 arányú vízmetmokhangyasav elegyben (térfogatra nézve), kiegészítve 2 mM ammónium-acetáttal. A fehérje oldat mennyiségeit (20-50 pM. 2 ul-ben) bevezettük, a tömegionforrásba 49:40:1 arányú víz:acetonitribecetsav elegyben 20 μΐ-t percenként. Mivel a fehérjéket az ionforrásba alacsony pH-η juttattuk be, a bázikus (például nitrogén) atomok az arginín, lízin és hisztidin oldalláncokban különböző mértékben protonálődtak, melynek eredményeként tóbbtöltésű molekuláris ionok alakultak ki, például ÍMABjú {kR2H]²h a. protonálásra rendelkezésre álló helyek számától függően. A detektor a molekuláris ionok m/z arányát a különböző töltési állapotokban jegyzi, és a tömegspektrum dekonvulálhatö, felhasználva a Bíotoolbox programot (Perkin-Blmer Sciex Instruments) a fehérje molekuláris tömegének megállapításához. A molekuláris tömegmérés pontossága 20 kDa-nál 2 kDa-on belül van.

A mannit redukáló aktivitását módosított U'SP protokollal határoztuk meg. A protokoll a. Cu²* redukciót méri lúgos oldat-

bán, bícinkoninsav jelenlétében (BCA, Kerce, amit a. gyártó utasításainak megfelelően állítottunk elő). A BCA komplexet képez a Car-gyel, mely kék színű, és esücsabszörbaneiája (A) 562 nm.

A két mannit mintát (500 pl 150 mg/ml mannit oldat) az összes körülmények között levizsgáltuk. A standard görbét az ismert redukáló aktivitású, glűkózoldat sorozathígításával vettük fel. Az elkészített 500 pl BCA oldatot mindegyik vizsgálati mintához, a standard mintához és a Mánkhoz hozzáadtuk, és 60 °C~on 40 percig inkubáltuk, A glükóz standardokat lineárisan ábrázoltuk és a vizsgálati mintában a mannit redukáló aktivitását (ppmben) a következőképpen kiszámoltuk: ((mannit minta/standard görbe meredeksége Asss-önj/(mannit tartalom (mg/ml) (1000)) x lOti

Az eredmények és azok megvitatása.

A tömegspektrometriával vizsgált dextróz kiszerelésben glikoziiezést mutattunk ki, mivel az IFH-fi-lb molekuláris tömegéhez a 162 dákon többszöröse adódott hozzá. Az IFN-ti -lh pepiidek vizsgálata arra utal, hogy ezek az adduktok a cukor és a fehérje lizinje között végbemenő reakcióinak köszönhetők (Amadori reakciók). Az 1. ábra a nagymennyiségű, dextrózzal létrehozott kiszerelés és a fagyasztva szárított és 1 hétig 50 °C-on tárolt kiszerelés kromatogram.mja.it hasonlítja össze. Az ábra azt. mutatja, hogy az IFN-S~lb a. dextróz kiszerelésben 50 °C~on könnyen reagál kialakítva a Bl csúcsot a fagyasztott szárított állapotban. A nagymennyiségű kiszerelés ES--.MS analízisekor glükóz adduktokra utaló csúcsokat (plusz .162) nem tudtunk kimutatni (2. ábra), Ezzel szemben az inkúfoáJt fagyasztva szárított dextróz kisze29

Λ

Ό*» · relés tömegspektrumában (3.. ábra)· több módosítást tudtunk megfigyelni. így a glükóz a IFN-S-lb-vel reagál, és RP-TíPLC-vel kimutatható olyan formákat hoz létre, melyek struktúráját az ES-MS- megerősíti.

Ezzel szemben az IFN-E-lh kiszerelések, melyeket USP mannittal alakítottunk ki, olyan csúcsot nem eredményeznek, mint. amilyet a RP-HPLC-vei Bl-kénf kaptunk. A 4, ábra a man nittal kiszerelt és a 7 napig 50 °C~on tartott fagyasztva szárított kiszereléseket hasonlítja össze. Tisztán kivehető, hogy Bl csúcs nem alakult ki. Viszont a nagymennyíségben kiszerelt tömegspektrumában (5. ábra) 20040-néI csúcs található, és az inkubált. fagyasztva szárított mannítos kiszerelés tőmegspektrumában (6. ábra) pedig 20201 -női új csúcs jelent meg. A képződött adduktok mennyisége BS-MS~mel mennyiségileg nem határozható meg; viszont az adduktok jelei gyakran a készülék kimutatási határán vannak. E csúcsok kialakulásának mechanizmusa nem ismert. A mannit reakciója az IFN-S-lb-vel olyan formák kialakulásához nem vezet, melyek a dextrőzzal vagy a glükózzal előfordulnak: Bl csúcs nem alakult ki. így az adatok arra utalnak,, hogy a mannit tisztább formái szükségesek az IFN-E- lh adduktok kialakulásának megakadályozásához.

A mannitot, melyet metanollal kivonatoltunk, a szennyeződések csökkentése érdekében, ezek után az IFN-fi-Ib stabilitására gyakorolt hatására nézve levizsgáltuk. Az IFN-S-rb-t a metanol kivonatolt mannit három különböző adagjával kiszerelt, és a nagymennyiségben kiszerelt, valamint a végső tartály teszt mintákat RP-HPLC és ES-MS megvizsgáltuk, ahogy azt a fentiekben leírtuk. A 7. ábra az JFN-S-lb tömegspektrumát mutatja be, melyet nem kezelt mannittal szereltünk ki, míg a 3. ábra a. metanol30 iái tisztított mamuttal kiszerelt IFN-B-lb tömegspektrumát mutatja be. Mind a három eltérő rnannít készítmény hasonló mintázatot adott. A 17. ábra azt mutatja he, hogy a metanolos kezelés a redukáló aktivitás majdnem felét, eltávolítja. Világosan megállapítható, hogy a metanol kezelés az IFN-S-lb komplexekből a szennyeződéseket eltávolítja, de ezzel a kezeléssel az összes nem távolítható el

A mannitban lévő további szennyeződések csökkentésére három további lépést adtunk a tisztítási folyamathoz. Ezek a következők: szénkezelés, ultraszűrés és rekristályosítás, A metanollal kivonatolt, szénnel kezelt, ultraszűrt, és re kristályosított m anvizsgáltuk. A kolorimetriás redukáló aktivitást vizsgáló módszer azt mutatta, hogy a további tisztítási lépések a redukáló aktivitást körülbelül 10 ppm-re csökkentették (lásd a 17. ábra 7~9. mintái), A készítményeket nagymértékben tisztított mamuttal állítottuk elő. A nagymértékben tisztított mann.ii.tal készített kiszerelések tömegspektruma további olyan csúcsokat nem adott (9. ábra), melyek a marmit nélkül nagymennyiségben kiszerelt esetében ne lettek volna, és amelyek azonos napon futottak mint a negatív kontroll (lö. ábra). Az USP manníttal készített kiszerelések tömegspektrumai (11. ábra) szintén azon a napon futottak mint a pozitív kontroll. így a rnannít további kezelése olyan termékhez vezet, melynek redukáló aktivitása kicsi és az IPN-E-lb-val ES-MS analízissel vizsgálva nem reagál.

A nagymértékben tisztított mamutot tartalmazó lFJM-β kiszerelések stabilitása .Rövid idejű gyorsított vizsgálat

Az IFN-B-lb kísérleti, kiszereléseit dextrózzal és mannittal állítottuk elő, ahogy azt. a fentiekben leírtuk, és e kiszerelések összehasonlítására gyorsított stabilitási vizsgálatokat végeztünk. A kiszerelések stabilitását két eltérő állapotban vizsgálatuk. Az elsőben a kiszereléseket magas hőmérsékletnek tettük ki, míg a másodikban a stabilitást szobahőmérsékleten hosszú ideig vizsgálatuk.. A nagymértékben tisztított mannitot tartalmazó kiszerelésben változást nem tudtunk kimutatni miután 25 °C~on 3 hónapig tároltuk, és a kiszerelés képessége lényegében változatlan maradt 37 °€~on 3 hónapos vagy 50 °C-on 1 hónapos tárolás után.

A kiszerelések minden egyes mintáját 8 °C-on, 25 C-on, vagy 37 °C-on 3 hónapig tároltuk. Továbbá két hónap után a két ν· egy hónapig 50 °C~on tároltunk. A 50 °C-ra történő áthelyezés a potenciális változások felgyorsítására szolgált, melyek az első két hónapban bekövetkeztek, és így jobban meg lehet határozni a 2. hónapos 25 °C~on és 37 °C-on végzett inkübálások eredményeit, mivel a már bekövetkező lebomlásokat jobban felgyorsíthatjuk, mintha az eredeti 8 Óra helyeznénk vissza.

Az IFN-S-lb specifikus aktivitását a. következőképpen vizs gáltuk. Az A549 humán tüdő karcinóma sejteket (ATCC CCL 185) és az egét' eneephalomyocarditis vírust (EMC törzs (ATCC VR129B)) az American Type Culíure Collectíon-től szereztük be. A kiszerelés mintáit 1,2 ml oldattal (0.54 % NaCl) hígítottuk, a sorozat hígítást Growth/Assay Media-ban végeztük, és az 1FN-S1b standarddal együtt hozzáadtuk a 96-lyukú lemezhez. Mindegyik lyukban a. IFN-B-t 100 pl-re hígítottuk. Az A549 sejteket *

Growth/Assay Médium-bán (Eagle-féle MÉM Earle-féle sókkal és 2,2 g/1 náírium-bikarbonátal, 8,9 % foetálls boijü szérummal, 1,79 mM L-glutaminnal, 89 egység/ml penicillinnel, és 89 pg/ml streptomicinnel kiegészítve) 1 x IO⁴ sejt/lyuk koncentrációban alkalmaztuk. Á lemezeket párában 37 °C-on (± 2°C), S ± 1 % CO2ben inkubáltuk. Az inkubáció végén a sejteket EMC vírussal fertőztük, ahol a fertőzés sokszorozási tényezője 5-16 között volt. Ezek után a lemezeket 24 ± 1 óráig párában 37 ± 2 °C-on, 5 ± 1 % CO2 inkubátorban tartottuk. A sejteket előmelegített (37 ®C). MTT-tel (3-(4,5-dímetíItíazol-2-íI)-2,5-dífeníltetrazölium-bromíd) festettük (5 mg/ml, 50 μί/lyuk), és az előző körülmények között további 3.,5-4,5 óráig inkubáltuk. A táptalajt a sejtekről leszívtuk, és mindegyik lyukhoz 100 μΐ festékoldő oldatot hozzáadtuk (81 térfogat% 2-propanol, 15 vegyes% nátrium-dodecil-szulfát, 0,04 N HCI). Ezek után. a lemezeket 30-60 percig környezeti hőmérsékleten sötétben inkubáltuk.. Majd a lemezeket 8 ± 3 percig mikrolemez rázőra helyeztük. Végül mindegyik lyuk abszorbanciáját 570 nm-en mikro lemez spektrométerrel megmértük. Az IFN-β standard sorozat aktivitását lineáris regressziós görbén ábrázoltuk, és a vizsgálati minták aktivitását ebből a görbéből meghatároztuk. Mindegyik minta specifikus aktivitását a minta, tömegét figyelembe véve kiszámoltuk.

Az IFN-β- 1b koncentrációk RP-HPLC analízisét a fentiekben leírtaknak megfelelően végeztük. Az adduktképződést redukált SDS-PAGE Western lenyomatolással követtük nyomon az IFN-β1b csík molekulatömének növekedését figyelve.

Az eredmények és megvitatása ♦ >

♦ » » v y « Φ ♦ * « * » « * * «« ** **

A mannitos kiszerelések potenciája (specifikus aktivitása) a vizsgálatok során lényegében változatlan maradt, míg a dextrózos kiszereléseké nőtt. Az egy hónapig tartó 37 °C~on végzett tárolás a potenciára nem hatott (lásd a 14. és a 15. ábrát), A mamiit ikN-js-lQ Kxszereíesnel a gtikozdezett tbN-b-ib a vizsgalatok ideje alatt a kimutatási határ alatt maradt, még 50 ^öC-on ís. Ezzel szemben glíkozilezest figyelhettünk, meg a dextrózos kiszerelésben két hónap után 37 ^€1C~on, és 3 bét után 50 °C-on. A kiterjedt glíkozilezés a kromatogrammot nagymértékben megváltoztatta, így az összes iFN--8-lh-t nem tudtuk megmérni. A dextróznál az addukt kialakulást szintén kimutattuk redukált

Western lenyomatolással miután a kiszerelést 2 hónapig 37 °Con vagy 1 hónapig 50 °C-on tároltuk. Ezzel szemben SDS-PAGE Western lenyomatolással egyik tárolási körülmény között sem

3. Példa

Az IFN-β kiszerelések hosszűidejű stabilitása, melyek nagymértékben tisztított mannitot tartalmaznak

A nagymértékben tisztított mannitot tartalmazó IFN-β-1b kiszerelés három készítményét (NOQő-os sarzs, NOOS-os sarzs és NOÖO-os sarzs) 4 °C-on, 25 °C-on vagy 30 ^öC~on tároltuk, és egy éven keresztül a stabilitást három hónaponként vizsgáltuk, majd további egy évig hat hónaponként. A stabilitást a fentiekben leírt

Mindhárom készítmény huszonnégy hónapig 4 °C-on és 30 °C~on. potenciáját fenntartotta. Az adatokat a 16-18, ábrákon mutattuk be. Ráadásuk az összes vizsgálati hőmérsékleten és időpontban mindhárom készítmény nem nagyobb mint 0,.02 mg/ml Bl csúcsot adott (ez a glikozilezett IFN-β fajtákra jellemző).

A szakirodalomban jártas szakemberek számára nyilvánvaló, hogy bizonyos rutin kísérletek elvégzésével a jelen találmány számos specifikus megvalósítási formája .kivitelezhető az itt leírt

IFN-β vonatkozásában. Ráadásul, a. -szakirodalomban jártas szakemberek felismerik, hogy egyszerű kísérletek beiktatásával a csolatban végeztünk, számos más fehérjére és különösen fehérje alapú gyógyszerekre általánosan kiterjeszthetők. A gyógyszer fehérjék közé, anélkül, hogy erre korlátoznánk magunkat, a kővetkezők tartoznak: humán növekedési hormon, az összes interferon, az összes interleukin, a kolóniastimuláló faktorok (GM-CSF, G-CSF, M-CSP), a béta-glükocerebrozidáz, a tirotropí.nok, etanercept, monoklonális ellenanyagok (például abcbdmab, basübdmab, palivízumab, rituximab és transiuzumab), a vérfaktorok (például fakor VÍIa és fakor Vili), az enzimek (például egyenértékű megvalósításokat szándékunknak megfelelően a következő igénypontok felölelik.

Az összes itt említett közlemény és szabadalmi bejelentés a szakirodalomban jártas szakemberek számára útmutató a jelen találmány tárgykörével kapcsolatban. Az itt beépített összes közlemény és szabadalmi bejelentés hivatkozásként szolgál,

Claims (23)

1. összetétel, amely biológiailag aktív iFN-S-t és nagymértékben tisztított mannitof tartalmaz, ahol az említett, nagymértékben tisztított mannától redukáló aktivitása kisebb mint 20 ppm.

2. Az 1. igénypont szerinti összetétel, amelyben a szóban forgó nagymértékben tisztított mannit koncentrációja körülbelül 0,25-5 vegyesig.

3, Az 1. igénypont szerinti Összetétel· amelyben a s IFN--8 vagy változat koncentrációja 0,01-15 m

-zöban forgó

4. Az 1. igénypont szerinti összetétel, amelyben, a szóban forgó kiszerelés pH-ja a 3,0-9,0 tartományba esik.

5. Az 1. igénypont szerinti összetétel, amely humán albumínt is te

6. Az 5. igénypont szerinti összetétel, amelyben a szóban forgó humán, albumin koncentrációja, .körülbelül 0,01-15 vegyes%.

7. Az 1. igénypont szerinti összetétel, amelyben a szóban forgó IFN-S rekombínánsan előállított, ahol. a szóban forgó rekombináns IFN-S humán 1FN~&, amelynek koncentrációja 0,01-15 mg/mi, ahol a szóban forgó nagymértékben tisztított mannit koncentrációja 0,25-5 vegyes%, ahol az összetétel pH-ja. 3,0-9,0, és ahol az összetétel a fentieken kívül humán albumint tartalmaz, amelynek koncentrációja 0,0115 vegyes%.

♦ » * «

X **«*

8. Az 1. igénypont szerinti összetétel, amelyben a szóban forgó IFN-β rekombinánsan előállított, -ahol a szóban forgó rekombináns 1FN-S humán IFM--8, amelynek koncentrációja 0,05-1 mg/ml, ahol a szóban forgó nagymértékben tisztított mannit koncentrációja (3,25-2,5 vegyes%, ahol az összetétel pH*ja 6,8-8,2, és ahol az összetétel a. fentieken kívül humán albumint tartalmaz, amelynek koncentráeiöia (3,252,5 vegyes'

9. Az 1. igénypont szerinti, összetétel, amelyben a szóban forgó IFN-8 rekomhínánsan előállított, ahol a szóban forgó rekombináns

IFN-S humán 1FN-S, amelynek koncentrációja 0,25 mg/ml, ahol a szóban forgó nagymértékben tisztított mannit koncentrációja 1,25 vegyesét

A8-7,5, és ahol az összetétel a íentie-

10, A 8. igénypont szerinti összetétel, amely a fentieken kívül az összetétel izotóniássá tételéhez elegendő mennyiségben nátriumkloridot tartalmaz.

11. A 7-9. igénypontok bármelyike szerinti összetétel, amelyben a. szóban forgó összetétel folyadék, vagy ahol a szóban forgó összetétel vagy “to

12, Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti kompozíció, ahol az említett biológiailag aktív IFN-& egy olyan polipeptid, amely az érett természetes humán IFN-S aminosav-szekvenciájávsl rendelkezik vagy egy olyan polipeptid, amely egy olyan érett természetes humán IFN-B aminosav-szekvencíáiával rendelkezik, amelynél az érett természetes « Φ tr * Φ 9 9 * * φ 9 * « » « « φ φ » « Φ Μ ♦Μ«φ * χ « 9X94 ♦ *** * V * « V « * Φ humán IFN-S 17-es található, ciszteín-esoport helyett szerin-esoport

13. A 12. igénypont szerinti összetétel, amelyben a vagy nem glikozilezett.

forgó

-8^

14. Az 1-13. ig a szóban forgó IFN-B-t bármelyike szerinti összetétel, amelyisan állítjuk elő.

15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti összetétel, amelynél az említett nagymértékben tisztított mannát redukáló aktivitása kisebb mint 15 ppm.

lő. Az 1-15, igénypontok bármelyike szerinti összetétel, amelynél az említett nagymértékben tisztított mamiit redukáló aktivitása kisebb mint 13 ppm.

tott. fecskendő.

18. A 17. igénypont szerinti előre megtöltött fecskendő-, ahol az említett (összetétel fogyasztott

19. Eljárás biológiailag aktív, javított stabilitással rendelkező S készítmény előállítására, amelynek során egy IFN-β-1 és az IFN-b stabilizálásához elegendő mennyiségű, nagymértékben tisztított mannítot tartalmazó készítményt állítunk elő, ahol az említett mértékben tisztított mann.it redukáló aktivitása. kisebb mint 20 • * * ♦ «β ♦ * φ » ♦ φ ♦ χ * »«»» ΦΦ

Φ» κβφ »

20. Α 19. igénypont szerinti eljárás, amely az alábbi lépéseket ímazza:

a) az IFN-S-~ból kromatográfiával eltávolítjuk a dodecíl-szulfátot és a

b) az említett ΙΕΝ-β-t 11,5-12.0 pH-érték mellett humán albuminnal egyesítjük,

c) az oldat pri-ját HCl-al 7,5-re állítjuk be, és

d) az oldathoz nagymértékben tisztított mannit oldatát adjuk.

21. A 20, igénypont szerinti eljárás, amelynek során további lépésként a készítmény izotóniássá. tételéhez megfelelő mennyiségű nátrium-kloi.

22. A 20. igénypont szerinti eljárás, amelynek során további lé

23. A 19-22. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az említett nagymértékben tisztított mannit. redukáló aktivitása kisebb mint 15 ppm,

24. A 19-23. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az említett nagymértékben. tisztított mannit redukáló aktivitása kisebb mint 13 ppm.

25. A 19-24. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított esős