ES2925992T3 - Formulaciones estables de polipéptidos - Google Patents

Abstract

La invención proporciona una formulación que incluye un tampón que tiene un pH inferior a 6,0, un catión divalente entre aproximadamente 5 y 200 mM, un excipiente que comprende un azúcar o poliol y una cantidad eficaz de un polipéptido terapéutico. También se proporciona un método para estabilizar un polipéptido. El método incluye poner en contacto un polipéptido terapéutico con una concentración de catión divalente entre aproximadamente 5-150 150 mM en un tampón que tiene un pH inferior a 6,0 y un excipiente que comprende un azúcar o poliol. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Formulaciones estables de polipéptidos

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere en general a medicamentos para el tratamiento de enfermedades y, más específicamente, a formulaciones consecuentemente estables para agentes terapéuticos polipeptídicos.

Con el advenimiento de la tecnología de ADN recombinante, los agentes terapéuticos basados en proteínas se han vuelto cada vez más comunes en el repertorio de fármacos disponibles para los médicos para el tratamiento de una amplia gama de enfermedades, desde cáncer hasta enfermedades autoinmunitarias. Junto con los avances científicos y técnicos que se han producido en la producción de proteínas recombinantes, otra razón del éxito de los agentes terapéuticos proteicos es su alta especificidad hacia las dianas y su capacidad para mostrar perfiles de seguridad superiores en comparación con agentes terapéuticos de moléculas pequeñas. La posibilidad de emplear moléculas biológicas como productos farmacéuticos en el tratamiento de enfermedades ha hecho avanzar significativamente la atención médica y la calidad de vida durante el último cuarto de siglo.

Actualmente se pueden producir en grandes cantidades proteínas conocidas por mostrar diversas acciones farmacológicas in vivo para diversas aplicaciones farmacéuticas. La estabilidad a largo plazo de una proteína terapéutica es un criterio particularmente beneficioso para tratamientos seguros, coherentes y eficaces. La pérdida de funcionalidad del agente terapéutico dentro de una preparación disminuirá su concentración eficaz para una administración dada. De forma similar, las modificaciones no deseadas de un agente terapéutico pueden afectar a la actividad y/o la seguridad de una preparación, lo que da lugar a una pérdida de eficacia y al riesgo de sufrir efectos secundarios adversos.

Las proteínas son moléculas complejas con estructuras definidas primaria, secundaria, terciaria y, en algunos casos, cuaternaria, todas las cuales desempeñan un papel a la hora de impartir funciones biológicas específicas. La complejidad estructural de productos farmacéuticos biológicos tales como proteínas los hace susceptibles a diversos procesos que dan como resultado inestabilidad estructural y funcional, así como pérdida de seguridad. Con respecto a estos procesos de inestabilidad o rutas de degradación, una proteína puede experimentar una diversidad de reacciones covalentes y no covalentes o modificaciones en solución. Por ejemplo, las rutas de degradación de proteínas se pueden clasificar generalmente en dos categorías principales: (i) rutas de degradación física o no covalentes, y (ii) rutas de degradación química o covalente.

Los fármacos proteicos son susceptibles al proceso de degradación física de agregación irreversible. La agregación de proteínas es de particular interés en la producción de polipéptidos ya que a menudo da como resultado una bioactividad disminuida que afecta a la potencia del fármaco y también puede provocar reacciones inmunológicas o antigénicas graves en los pacientes. La degradación química de un agente terapéutico proteico, incluida la degradación de su estructura química mediante, por ejemplo, modificación química, también se ha implicado en el aumento de su potencial inmunogénico. Por lo tanto, las formulaciones estables de proteínas requieren que se minimicen las rutas de degradación física y química del fármaco.

Las proteínas pueden degradarse, por ejemplo, por medio de procesos físicos tales como adsorción interfacial y agregación. La adsorción puede afectar significativamente a la potencia y la estabilidad de un fármaco proteico. Puede provocar una pérdida apreciable de potencia de las formas de dosificación de baja concentración. Una segunda consecuencia es que la adsorción mediada por el desplegamiento en las interfaces a menudo puede constituir una etapa inicial de la agregación irreversible en solución. A este respecto, las proteínas tienden a adsorberse en interfaces líquido-sólido, líquido-aire y líquido-líquido. La exposición suficiente del núcleo de una proteína en una superficie hidrófoba puede producir como resultado una adsorción como consecuencia de tensiones inducidas por agitación, la temperatura o el pH. Además, las proteínas también son sensibles a, por ejemplo, el pH, la fuerza iónica, tensiones térmicas, tensiones por cizallamiento e interfaciales, todo lo cual puede dar lugar a agregación y provocar inestabilidad. Otra consecuencia de la agregación es la formación de partículas, una consideración importante en productos farmacéuticos proteicos líquidos y liofilizados.

Las proteínas también son objeto de una diversidad de reacciones químicas de modificación y/o degradación tales como desamidación, isomerización, hidrólisis, intercambio de disulfuro, eliminación beta, oxidación y formación de aductos. Los principales mecanismos hidrolíticos de degradación incluyen hidrólisis de enlaces peptídicos, desaminación de asparagina y glutamina, isomerización de ácido aspártico y ciclación de ácido glutámico que da lugar al ácido piroglutámico. Una característica común de las rutas de degradación hidrolítica es que una variable de formulación significativa, con respecto a las velocidades de las reacciones, es el pH de la solución.

Por ejemplo, la hidrólisis de enlaces peptídicos puede estar catalizada por ácidos o bases. La desamidación de la asparagina y la glutamina también está catalizada por ácidos a un pH inferior a aproximadamente 4. La desamidación de asparagina a pH neutro se produce a través de un intermedio de succinimidilo que está catalizado por bases. La isomerización y la racemización de los residuos de ácido aspártico puede ser rápida en pH de ligeramente ácido a neutro (pH 4 - 8). Además de los efectos generalizados del pH, las sales tampón y otros excipientes pueden afectar a las velocidades de las reacciones hidrolíticas.

Otros ejemplos de rutas de degradación incluyen reacciones de eliminación beta, que pueden producirse en condiciones de pH alcalino y dar lugar a la racemización o la pérdida de parte de la cadena lateral para determinados aminoácidos. Las oxidaciones de residuos de metionina, cisteína, histidina, tirosina y triptófano son ejemplos de rutas de degradación covalente para proteínas.

Debido a la cantidad y la diversidad de reacciones diferentes que pueden producir como consecuencia la inestabilidad de las proteínas, la composición de los componentes de una formulación puede afectar significativamente al grado de degradación de las proteínas y, en consecuencia, a la seguridad y la eficacia del agente terapéutico. La formulación de un polipéptido también puede afectar a la facilidad y la frecuencia de la administración y al dolor tras la inyección. Por ejemplo, las reacciones inmunogénicas no solo se han atribuido a agregados de proteínas, sino también a agregados mixtos de la proteína terapéutica con un componente inactivo contenido en la formulación (Schellekens, H., Nat. Rev. Drug Discov. 1:457-62(2002); Hesmeling, et al., Pharm. Res. 22:1997-2006 (2005)).

Wang Wei, Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals, International Journal of Pharmaceutics, 1999, 185, páginas 129-188, revisa avances en la preparación de productos farmacéuticos proteicos estables.

El documento WO 2004/039826 A1 se refiere a preparaciones de anticuerpos anti-IL-6 que incluyen auxiliares tales como tampones y conservantes.

El documento US 2004/191243 A1 se refiere a formulaciones de anticuerpos estabilizadas que contienen histidina y a procedimientos para estabilizar formulaciones de anticuerpos líquidos utilizando histidina.

El documento WO 03/039485 A2 enseña formulaciones farmacéuticas líquidas estabilizadas que comprenden un anticuerpo, tal como daclizumab, un tampón de succinato o de histidina, polisorbato y un modificador de la tonicidad. El documento WO 2006/096461 A2 se refiere a formulaciones farmacéuticas de anticuerpos anti-M-CSF que comprenden un agente quelante y/o histidina.

El documento WO 2006/107854 A2 se refiere a formulaciones de agentes de unión anti-EGFR que comprenden tampones y polioles.

El documento WO 2007/145862 A2 enseña formulaciones de pertuzumab.

El documento WO 02/096457 A2 proporciona formulaciones líquidas estables basadas en soluciones acuosas que tienen altas concentraciones de anticuerpos terapéuticos.

Sin embargo, a pesar de los avances producidos en la utilización de proteínas en tratamientos terapéuticos y el conocimiento del proceso de inestabilidad que pueden sufrir, aún existe la necesidad de desarrollar formulaciones con características de estabilidad a largo plazo mejoradas. Una formulación que conserve la estabilidad a largo plazo en una diversidad de condiciones proporcionaría un medio eficaz para administrar una cantidad eficaz y segura del polipéptido. La conservación de la estabilidad a largo plazo en una formulación también reduciría los costes de producción y tratamiento. Numerosas proteínas recombinantes o naturales podrían beneficiarse de dichas formulaciones consecuentemente estables y, por lo tanto, proporcionar resultados clínicos más eficaces.

Por lo tanto, existe la necesidad de formulaciones que conserven la estabilidad a largo plazo en una diversidad de diferentes condiciones de fabricación y almacenamiento. La presente invención satisface esta necesidad y también proporciona ventajas relacionadas.

Sumario de la invención

La invención se define en las reivindicaciones.

La invención se refiere a una formulación que comprende un tampón que tiene un pH de aproximadamente 4,0 a menos de 6,0, un catión divalente seleccionado de entre cloruro de calcio, cloruro de zinc, cloruro de manganeso o cloruro de magnesio entre aproximadamente 5-150 mM, un excipiente que comprende un azúcar o un poliol y una cantidad eficaz de panitumumab, en la que el panitumumab conserva al menos aproximadamente el 80% de actividad de unión a EGFR durante un periodo de hasta dos meses en solución.

Además, la invención se refiere a un procedimiento para estabilizar panitumumab, que comprende poner en contacto panitumumab con una concentración de catión divalente seleccionado de entre cloruro de calcio, cloruro de zinc, cloruro de manganeso o cloruro de magnesio entre aproximadamente 5-150 mM en un tampón que tiene un pH de aproximadamente 4,0 a menos de 6,0 y un excipiente que comprende un azúcar o un poliol, en el que el panitumumab conserva al menos aproximadamente el 80% de actividad de unión a EGFR durante un periodo de hasta dos meses en solución.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra los resultados de SE-HPLC para la estabilidad del pH de una formulación de anticuerpo almacenada a 37°C durante un periodo de hasta 2 meses. Los conjuntos de histogramas para cada pH medido corresponden de izquierda a derecha a los periodos de almacenamiento de ningún almacenamiento (0); 1 semana (1 s); 2 semanas (2s); 1 mes (1m) y 2 meses (2m). Para cada punto temporal, los valores de pH correspondieron a 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0 y 7,5.

La figura 2 muestra los resultados de la cromatografía de intercambio catiónico de un anticuerpo formulado a varios pH después de un almacenamiento a 37°C durante un periodo de hasta 2 meses. Las condiciones de almacenamiento correspondieron a ningún almacenamiento (0, rombos); 1 semana (1s, cuadrados); 2 semanas (2s, triángulos); 1 mes (1m, X) y 2 meses (2m, estrellas).

La figura 3 muestra los recuentos de partículas de un anticuerpo formulado a varios pH después de agitarlo en vórtice durante 15 minutos a 4°C. Los conjuntos de histogramas para cada tamaño de partícula indicado corresponden de izquierda a derecha a 5 pm (5); 7,5 pm (7,5); 10 pm (10); 20 pm (20) y 25 pm (25).

La figura 4 muestra los resultados de la cromatografía de exclusión por tamaño de un anticuerpo en diferentes formulaciones después de un almacenamiento a 37°C durante un periodo de hasta 4 meses. Los conjuntos de histogramas para cada formulación corresponden de izquierda a derecha a los periodos de almacenamiento de ningún almacenamiento (0); 2 semanas (2s); 1 mes (1m); 2 meses (2m); 3 meses (3m) y 4 meses (4m).

La figura 5 muestra la cromatografía de intercambio catiónico de un anticuerpo en diferentes formulaciones después de un almacenamiento a 29°C durante un periodo de hasta 6 meses. Los conjuntos de histogramas para cada formulación corresponden de izquierda a derecha a los periodos de almacenamiento de ningún almacenamiento (0); 2 semanas (2s); 1 mes (1m); 2 meses (2m); 3 meses (3m) y 6 meses (6m).

La figura 6 muestra el recuento de partículas subvisibles por HIAC de un anticuerpo en diferentes formulaciones después de un almacenamiento a 4°C durante 6 meses. Los conjuntos de histogramas para cada tamaño de partícula indicado corresponden de izquierda a derecha a 2 pm (2); 5 pm (5); 7,5 pm (7,5); 10 pm (10); 20 pm (20) y 25 pm (25).

La figura 7 muestra mediciones de cromatografía de intercambio de tamaño (SEC)-HPLC del contenido de monómero de anticuerpo resultante de varias formulaciones que contienen diferentes excipientes. Los conjuntos de histogramas para cada formulación corresponden de izquierda a derecha a los periodos de almacenamiento de ningún almacenamiento (0); 2 semanas (2s); 1 mes (1m); 2 meses (2m); 3 meses (3m); 6 meses (6m) y 1 año (1a).

La figura 8 muestra mediciones de partículas subvisibles por HIAC mayores de 10 pm de diferentes formulaciones de anticuerpos almacenadas a 4°C durante 1 año. Los conjuntos de histogramas para cada tamaño de partícula indicado corresponden de izquierda a derecha a 10 pm (10); 20 pm (20) y 25 pm (25).

La figura 9 muestra las mediciones de SE-HPLC del contenido de monómero de anticuerpo después de un almacenamiento a -30°C durante un periodo de hasta 3 meses en diversas formulaciones que tienen un pH que varía de 5,0 a 7,0 y que contienen diferentes excipientes. Los conjuntos de histogramas para cada formulación corresponden de izquierda a derecha a condiciones de tensión y a los periodos de almacenamiento de ningún almacenamiento (0); 5 veces congelación y descongelación sin meses o semanas de almacenamiento a -30°C (C5); 6 semanas (6s) y 3 meses (3m).

La figura 10 muestra las mediciones de SE-HPLC del contenido de monómero de anticuerpo después de un almacenamiento a -30°C durante un periodo de hasta 1 año en tampón de acetato o de fosfato en diversas formulaciones que tienen un pH que varía de 5,0 a 6,0 y que contienen diferentes estabilizantes. Los conjuntos de histogramas para cada formulación corresponden de izquierda a derecha a condiciones de tensión y a los periodos de almacenamiento de ningún almacenamiento (0); 5 veces congelación y descongelación sin meses o semanas de almacenamiento a -30°C (C5); 3 meses (3m); 6 meses (6m) y 12 meses (12m).

La figura 11 muestra las mediciones de SE-HPLC del contenido de monómero de anticuerpo de diferentes formulaciones después de un almacenamiento a -30°C durante un periodo de hasta 1 año en recipientes de acero inoxidable o polipropileno. Los conjuntos de histogramas para cada formulación corresponden de izquierda a derecha a condiciones de tensión y a los periodos de almacenamiento de ningún almacenamiento (0); 5 veces congelación y descongelación sin meses o semanas de almacenamiento a -302C (C5); 1 mes (1m); 3 meses (3m); 6 meses (6m) y 12 meses (12m).

La figura 12 muestra el efecto de congelación/descongelación y almacenamiento a -30°C sobre la formación de partículas de varias formulaciones de anticuerpos. Los conjuntos de histogramas para cada formulación corresponden de izquierda a derecha a condiciones de tensión y a los periodos de almacenamiento de ningún almacenamiento (t=0); 5 veces congelación y descongelación sin meses o semanas de almacenamiento a -30°C (t=c5); 1 mes (t=1m), y 3 meses (t=3m).

La figura 13 es un diagrama esquemático que muestra la ruta de degradación mediada por succinimida de residuos de asparagina y aspartilo mediante isomerización en ácido isoaspártico.

La figura 14 muestra la cuantificación de isoaspartilo en una cadena ligera de anticuerpo mediante cromatograma de fase inversa de anticuerpo reducido y alquilado después de la degradación en un tampón de pH 5,0.

La figura 15 muestra la correlación entre el porcentaje de cadena ligera isomerizada (isoLC) de un anticuerpo en función del tiempo de incubación a 37°C en soluciones con diferentes concentraciones de cloruro de calcio (CaCl2) a pH 5,0.

La figura 16 muestra la correlación entre el porcentaje de cadena ligera isomerizada (isoLC) de un anticuerpo que contiene un residuo de ácido aspártico susceptible a la isomerización en función del tiempo de incubación a 4°C (figura 16A), 29°C (figura 16B) y a 37°C (figura 16C) en soluciones con diferentes concentraciones de cloruro de calcio (CaCL) a pH 5,0. Los conjuntos de histogramas para cada periodo de tiempo corresponden de izquierda a derecha a A5G, A5G25CA, A5G50CA, A5G75CA, A5G100CA y A5G150CA.

La figura 17 muestra los efectos del CaCl2 sobre la pérdida de potencia del anticuerpo utilizando mediciones de ensayo de proliferación celular de la potencia del anticuerpo con concentraciones variables de CaCl2.

La Figura 18 muestra el perfil SE-HPLC de un anticuerpo formulado en CaCl2 0-150 mM después de un almacenamiento de 4 meses a 4°C (figura 18A) o 29°C (figura 18B).

Descripción detallada

La presente divulgación se refiere a una formulación que puede estabilizar soluciones polipeptídicas acuosas y en otros líquidos que no sean agua, así como formulaciones liofilizadas. La formulación es útil con polipéptidos susceptibles a la isomerización de ácido aspártico (Asp o D) o asparagina (Asn o N) porque previene o reduce la velocidad o el grado de formación de ácido isoaspártico. Los polipéptidos susceptibles incluyen aquellos que tienen Asp o Asn expuestos al disolvente ya que tienden a formar intermedios de succinimida por medio de reacciones de hidrólisis o de desaminación promovidas por el disolvente y forman residuos de isoaspartilo desestabilizantes. La reducción de la velocidad o el grado de formación de ácido isoaspártico se efectúa mediante la inclusión de uno o más cationes divalentes, o una forma de sal de los mismos, junto con el polipéptido y/u otros componentes de la formulación.

En una forma de realización específica de la divulgación, los polipéptidos estabilizados por una formulación de la invención son anticuerpos que contienen ácido aspártico o asparagina expuestos al disolvente. En esta forma de realización específica, la cinética de la reacción de hidrólisis o de desaminación se puede ralentizar con la adición de CaCl2 entre aproximadamente 10-150 mM. Dichos anticuerpos incluyen aquellos que tienen residuos Asp o Asn en una o más CDR (región determinante complementaria) de sus regiones variables de cadena pesada o ligera. Las formulaciones estabilizantes de cationes divalentes son particularmente útiles con dichos tipos de anticuerpos ya que la formación de isoaspartilo en una región CDR puede afectar a la actividad y/o la potencia de unión del anticuerpo. Los polipéptidos terapéuticos solubilizados o incluidos en una formulación de la divulgación muestran estabilidad durante largos periodos de tiempo, lo que permite la administración de cantidades seguras y eficaces de un polipéptido terapéutico, tal como un anticuerpo u otro polipéptido.

La formulación puede incluir un polipéptido terapéutico, tal como un anticuerpo, a una concentración en el intervalo de aproximadamente 1 -150 mg/ml, un tampón tal como acetato de sodio 5 mM-50 mM a un pH superior a 4,0 e inferior a 6,0, aproximadamente el 1-3% de glicerol o otro excipiente, aproximadamente el 0,004-0,1% de polisorbato 80 u otro tensioactivo, y CaCl2 aproximadamente 10-150 mM para mejorar la estabilidad del polipéptido terapéutico mediante la reducción de la isomerización. En otras formas de realización específicas, un pH del tampón particularmente útil es inferior al pl del polipéptido terapéutico para reducir o prevenir la precipitación del polipéptido que puede estar provocada por iones metálicos o sales cuando el pH del tampón se aproxima al valor de pl del polipéptido.

En formas de realización específicas adicionales, pueden incluirse cationes divalentes en otras formulaciones polipeptídicas que muestren una capacidad estabilizante óptima de polipéptidos. Dichas otras formulaciones que se pueden usar junto con los cationes divalentes o las formulaciones que contienen cationes divalentes de la presente divulgación incluyen, por ejemplo, formulaciones que contienen sistemas tampón de acetato, glutamato, succinato o propionato que tienen valores de pH entre aproximadamente 4,0-7,5 o dichos sistemas tampón que tienen un pH inferior a 6,0.

Un producto biofarmacéutico se refiere a una macromolécula o un biopolímero tal como un polipéptido, un ácido nucleico, un carbohidrato o un lípido, o a un elemento constitutivo del mismo, que está destinado a su uso como producto farmacéutico. Una formulación biofarmacéutica se refiere a un medio farmacéuticamente aceptable que es compatible con un producto biofarmacéutico y es seguro y no tóxico cuando se administra a seres humanos.

Tal como se utiliza en el presente documento, por el término "anticuerpo" debe entenderse un producto polipeptídico de células B dentro de la clase de inmunoglobulina de polipéptidos que está compuesto por cadenas pesadas y ligeras y es capaz de unirse a una diana molecular o antígeno específico. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que es el producto de un clon de una sola célula o un hibridoma. También se pretende que el término se refiera a un anticuerpo producido mediante procedimientos recombinantes a partir de la cadena pesada y ligera que codifica genes de inmunoglobulina para producir una sola especie de inmunoglobulina molecular. Las secuencias de aminoácidos para anticuerpos dentro de una preparación de anticuerpos monoclonales son sustancialmente homogéneas y la actividad de unión de los anticuerpos dentro de dicha preparación muestra sustancialmente la misma actividad de unión al antígeno. Tal como se describe más adelante, las características del anticuerpo y del anticuerpo monoclonal son bien conocidas en la técnica.

Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando una amplia diversidad de procedimientos conocidos en la técnica, incluido el uso de metodologías de hibridoma, recombinantes, de presentación en fagos y de biblioteca de anticuerpos combinatoria, o una combinación de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden producir utilizando técnicas de hibridoma, incluidas las conocidas en la técnica y que se enseñan, por ejemplo, en Harlow y Lane., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Hammerling, et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, Elsevier, N.Y. (1981); Harlow et al., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999), y Antibody Engineering: A Practical Guide, C.A.K. Borrebaeck, Ed., W.H. Freeman and Co., Publishers, Nueva York, páginas 103-120 (1991). Ejemplos de procedimientos conocidos para producir anticuerpos monoclonales mediante procedimientos recombinantes, de presentación en fagos y de biblioteca de anticuerpos combinatoria, incluidas bibliotecas derivadas de animales inmunizados y no inmunizados, se pueden encontrar descritos en Antibody Engineering: A Practical Guide, C.A.K. Borrebaeck, Ed., anteriormente. El término "anticuerpo monoclonal", tal como se utiliza en el presente documento, no se limita a los anticuerpos producidos por medio de la tecnología de hibridomas. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de un solo clon, incluido cualquier clon eucariota, procariota o fago, y no al procedimiento con el que se produce.

Tal como se utiliza en el presente documento, por el término "fragmento funcional", cuando se utiliza con referencia a un anticuerpo, debe entenderse una porción de un anticuerpo que aún conserva parte o la totalidad de su actividad específica de unión a antígeno. Dichos fragmentos funcionales pueden incluir, por ejemplo, fragmentos funcionales de anticuerpos tales como Fd, Fv, Fab, F(ab'), F(ab)2, F(ab')2, Fv monocatenario (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y minicuerpos. Otros fragmentos funcionales pueden incluir, por ejemplo, polipéptidos de cadena pesada (H) o ligera (L), polipéptidos de región de cadena pesada variable (Vh) y ligera variable (V^l), polipéptidos de región determinante de la complementariedad (CDR), anticuerpos de un solo dominio y polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conservar su actividad de unión específica. Dichos fragmentos de unión a anticuerpos se pueden encontrar descritos, por ejemplo, en Harlow y Lane, anteriormente; Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers, R.A. (ed.), Nueva York: V^c H Publisher, Inc.); Huston et al., Cell Biophysics, 22:189-224 (1993); Plückthun y Skerra, Meth. Enzymol., 178:497-515 (1989) y en Day, E.D., Advanced Immunochemistry, segunda edición, Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY (1990).

Con respecto a los anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos, son bien conocidas en la técnica diversas formas, alteraciones y modificaciones. Los anticuerpos monoclonales de la invención pueden incluir cualquiera de dichas diversas formas, alteraciones y modificaciones de anticuerpos monoclonales. A continuación se exponen ejemplos de las diversas formas y términos tal como se conocen en la técnica.

Un fragmento Fab se refiere a un fragmento monovalente que consiste en los dominios Vl, Vh, Cl y Ch1 ; un fragmento F(ab')2 es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd consiste en los dominios V^h y C^h1; un fragmento Fv consiste en los dominios V^l y V^h de un solo brazo de un anticuerpo; y un fragmento dAb (Ward et al., Nature 341:544-546, (1989)) consiste en un dominio Vh.

Un anticuerpo puede tener uno o más sitios de unión. Si hay más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina natural tiene dos sitios de unión idénticos, un anticuerpo monocatenario o fragmento Fab tiene un sitio de unión, mientras que un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" tiene dos sitios de unión diferentes.

Un anticuerpo monocatenario (scFv) se refiere a un anticuerpo en el que una región V^l y una región V^h están unidas por medio de un enlazador (por ejemplo, una secuencia sintética de residuos de aminoácidos) para formar una cadena polipeptídica continua en la que el enlazador es lo suficientemente largo como para permitir que la cadena proteica se pliegue sobre sí misma y forme un sitio de unión al antígeno monovalente (véase, por ejemplo, Bird et al., Science 242:423-26 (1988) y Houston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83 (1988)). Diacuerpos se refiere a anticuerpos bivalentes que comprenden dos cadenas polipeptídicas, en los que cada cadena polipeptídica comprende dominios V^h y V^l unidos por un enlazador que es demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre dos dominios de la misma cadena, permitiendo así que cada dominio se empareje con un dominio complementario de otra cadena polipeptídica (véase, por ejemplo, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48 (1993), y Poljak et al., Structure 2:1121-23 (1994)). Si las dos cadenas polipeptídicas de un diacuerpo son idénticas, el diacuerpo resultante de su emparejamiento tendrá dos sitios de unión a antígeno idénticos. Se pueden usar cadenas polipeptídicas que tienen diferentes secuencias para producir un diacuerpo con dos sitios de unión a antígeno diferentes. De forma similar, los tricuerpos y tetracuerpos son anticuerpos que comprenden tres y cuatro cadenas polipeptídicas, respectivamente, y que forman tres y cuatro sitios de unión a antígeno, respectivamente, que pueden ser iguales o diferentes.

Una CDR se refiere a una región que contiene uno de los tres bucles hipervariables (H1, H2 o H3) dentro de la región no marco del marco de lámina p de V^h de la inmunoglobulina (Ig o anticuerpo), o una región que contiene uno de los tres bucles hipervariables (L1, L2 o L3) dentro de la región no marco del marco de lámina p de V^l del anticuerpo. Por consiguiente, las CDR son secuencias de regiones variables intercaladas dentro de las secuencias de regiones marco. Las regiones CDR son bien conocidas por los expertos en la técnica y se han definido, por ejemplo, por Kabat como las regiones de mayor hipervariabilidad dentro de los dominios variables (V) del anticuerpo (Kabat et al., J. Biol. Chem.

252:6609-6616 (1977); Kabat, Adv. Prot. Chem. 32:1-75 (1978)). Las secuencias de regiones CDR también se han definido estructuralmente por Chothia como aquellos residuos que no forman parte del marco de lámina p conservado y, por lo tanto, son capaces de adaptarse a diferentes conformaciones (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Ambas terminologías están bien reconocidas en la técnica. Las posiciones de las CDR dentro de un dominio variable de anticuerpo canónico se han determinado mediante la comparación de numerosas estructuras (Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); Morea et al., Methods 20:267-279 (2000)). Debido a que el número de residuos dentro de un bucle varía en diferentes anticuerpos, los residuos de bucle adicionales con respecto a las posiciones canónicas se numeran convencionalmente con a, b, c y así sucesivamente junto al número de residuos en el esquema de numeración de dominio variable canónico (Al-Lazikani et al., anteriormente (1997). Dicha nomenclatura es asimismo bien conocida por los expertos en la técnica.

Por ejemplo, en la tabla siguiente se exponen CDR definidas según las designaciones de Kabat (hipervariable) o de Chothia (estructural).

Tabla: Definiciones de CDR

Kabat1 Chothia2 Ubicación del bucle

Vh CDR1 31-35 26-32 Unión de las cadenas B y C

Vh CDR2 50-65 53-55 Unión de las cadenas C' y C

Vh CDR3 95-102 96-101 Unión de las cadenas F y G

VL CDR1 24-34 26-32 Unión de las cadenas B y C

VL CDR2 50-56 50-52 Unión de las cadenas C' y C

VL CDR3 89-97 91-96 Unión de las cadenas F y G

1 La numeración de residuos sigue la nomenclatura de Kabat et al., anteriormente

2 La numeración de residuos sigue la nomenclatura de Chlothia et al., anteriormente

Un anticuerpo quimérico se refiere a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un anticuerpo y una o más regiones de uno o más de otros anticuerpos. En un ejemplo específico, una o más de las CDR se derivan de un anticuerpo de donante no humano que tiene actividad específica hacia EGFR y el marco de la región variable se deriva de un anticuerpo receptor humano. En otro ejemplo específico, todas las CDR se derivan de un anticuerpo de donante no humano que tiene actividad específica hacia EGFR y el marco de la región variable se deriva de un anticuerpo receptor humano. En otro ejemplo específico más, las ^c D^r de más de un anticuerpo específico de EGFR no humano se mezclan y se emparejan dando un anticuerpo quimérico. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede incluir una CDR1 de la cadena ligera de un primer anticuerpo específico de EGFR no humano, una CDR2 y una CDR3 de la cadena ligera de un segundo anticuerpo específico de EGFR no humano y las CDR de la cadena pesada de un tercer anticuerpo específico de EGFR. Además, las regiones marco pueden derivarse de uno de los mismos o de uno o más anticuerpos humanos diferentes o de un anticuerpo humanizado. Pueden producirse anticuerpos quiméricos cuando tanto el donante como el receptor sean humanos

Un anticuerpo humanizado o un anticuerpo injertado tiene una secuencia que difiere de la secuencia de un anticuerpo de una especie no humana en una o más sustituciones, eliminaciones y/o adiciones de aminoácidos, de modo que es menos probable que el anticuerpo humanizado induzca una respuesta inmunitaria, y/o induce una respuesta inmunitaria menos grave, en comparación con el anticuerpo de especies no humanas, cuando se administra a un sujeto humano. En un ejemplo específico, determinados aminoácidos en el marco y los dominios constantes de las cadenas pesada y/o ligera del anticuerpo de especies no humanas se cambian para producir el anticuerpo humanizado. En otro ejemplo específico, el o los dominios constantes de un anticuerpo humano se fusionan con el o los dominios variables de una especie no humana. Se pueden encontrar ejemplos de cómo producir anticuerpos humanizados en las patentes de Estados Unidos N° 6.054.297, 5.886.152 y 5.877.293. Los anticuerpos humanizados también incluyen anticuerpos producidos utilizando procedimientos de renovación de la superficie de los anticuerpos y similares.

Un anticuerpo humano se refiere a anticuerpos que tienen una o más regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, un anticuerpo totalmente humano incluye un anticuerpo en el que todos los dominios variables y constantes se derivan de secuencias de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos humanos se pueden preparar utilizando una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica. Un ejemplo específico de un anticuerpo humano es el panitumumab, que es el objeto del anticuerpo anti-EGFR humano descrito en la patente de Estados Unidos N° 6.235.883. El panitumumab también se conoce en la técnica como VectibixTm (Amgen, Thousand Oaks, California) y es útil para el tratamiento de estados patológicos tales como el cáncer colorrectal metastásico, por ejemplo.

También se pueden incorporar una o más CDR en una molécula tanto de forma covalente como no covalente para convertirla en una inmunoadhesina. Una inmunoadhesina puede incorporar la o las CDR como parte de una cadena polipeptídica más larga, puede unir covalentemente la o las CDR a otra cadena polipeptídica, o puede incorporar la o las CDR de forma no covalente. Las CDR permiten que la inmunoadhesina se una específicamente a un antígeno particular de interés.

Un anticuerpo neutralizante o un anticuerpo inhibidor, cuando se usa con referencia a un anticuerpo formulado de la presente divulgación, se refiere a un anticuerpo que inhibe la unión del receptor al ligando. En el ejemplo específico de un anticuerpo monoclonal específico de EGFR, un anticuerpo inhibidor se refiere a un anticuerpo monoclonal que inhibe la unión de EGFR a EGF cuando un exceso del anticuerpo específico de EGFR reduce la cantidad de EGF unido a EGFR. La inhibición de la unión puede tener lugar en al menos un 10%, particularmente en al menos aproximadamente un 20%. En varios ejemplos específicos, el anticuerpo monoclonal puede reducir la cantidad de EGF unido a EGFR en, por ejemplo, al menos un 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% y 99,9%. La reducción de la unión se puede medir por cualquier medio conocido por un experto en la técnica, por ejemplo mediante medición en un ensayo de unión competitiva in vitro.

Un anticuerpo "antagonista" se refiere a un anticuerpo que inhibe una respuesta de actividad de su antígeno. En el ejemplo específico de un anticuerpo monoclonal específico de EGFR, un anticuerpo antagonista se refiere a un anticuerpo que inhibe la actividad de EGFR cuando se añade a una célula, tejido u organismo que expresa EGFR. La disminución de la actividad puede ser de al menos aproximadamente un 5%, particularmente de al menos aproximadamente un 10%, más particularmente de al menos aproximadamente un 15% o más, en comparación con el nivel de actividad de EGFR en presencia de EGF solo. En varios ejemplos específicos, los anticuerpos monoclonales específicos de EGFR de la presente divulgación pueden inhibir la actividad de EGFR en al menos aproximadamente un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100%.

Un anticuerpo agonista se refiere a un anticuerpo que activa una respuesta de actividad de su antígeno. En el ejemplo específico de un anticuerpo monoclonal específico de EGFR, un anticuerpo agonista se refiere a un anticuerpo que activa EGFR en al menos aproximadamente un 5%, particularmente en al menos aproximadamente un 10%, más particularmente en al menos aproximadamente un 15% cuando se añade a una célula, tejido u organismo que expresa EGFR, siendo "el 100% de activación" el nivel de activación logrado en condiciones fisiológicas por la misma cantidad molar de EGF. En varios ejemplos específicos, los anticuerpos monoclonales específicos de KGFR de la presente divulgación pueden activar la actividad de EGFR en al menos aproximadamente un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 750% o 1000%.

Un epítopo se refiere a una parte de una molécula, por ejemplo, una porción de un polipéptido, que se une específicamente a uno o más anticuerpos dentro del sitio de unión a antígeno del anticuerpo. Los determinantes epitópicos pueden incluir regiones continuas o no continuas de la molécula que se une a un anticuerpo. Los determinantes epitópicos también pueden incluir agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas.

Tal como se utiliza en el presente documento, por el término "específico" cuando se utiliza con referencia a la actividad de unión de un anticuerpo monoclonal debe entenderse que el anticuerpo monoclonal al que se hace referencia muestra una unión preferencial por su antígeno en comparación con otros antígenos similares. En el ejemplo específico de un anticuerpo monoclonal específico de EGFR, por actividad de unión específica debe entenderse que el anticuerpo monoclonal de EGFR al que se hace referencia muestra una unión preferencial por EGFR en comparación con otros receptores relacionados con el factor de crecimiento epidérmico. La unión preferencial incluye un anticuerpo monoclonal de la invención que muestra una unión detectable a EGFR mientras que muestra una unión reducida o no detectable a otro receptor de factor de crecimiento relacionado.

Tal como se utiliza en el presente documento, por el término "receptor del factor de crecimiento epidérmico" o "EGFR" debe entenderse el receptor de la técnica que se puede encontrar expresado en la superficie de células epidérmicas y que se une al factor de crecimiento epidérmico (EGF) y/o al factor de crecimiento transformante alfa (TGFa). Este receptor es bien conocido en la técnica y se puede encontrar descrito en, por ejemplo, Yarden, Y., y Sliwkowski, M. X., Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 127-37 (2001), y Mendelsohn, J. y Baselga, J., J Clin Oncol 21,2787-99 (2003). El ^eG^f R también es el antígeno para el anticuerpo humano panitumumab, que es el objeto de la patente de Estados Unidos N° 6.235.883.

Tal como se utiliza en el presente documento, por el término "catión divalente"debe entenderse un elemento, un átomo o una molécula con carga positiva que tiene una valencia de más 2. El término incluye iones metálicos tales como Ca⁺² , Zn⁺² , Mn⁺² , Mg⁺² , Fe⁺² , Co⁺² , Ni⁺² y/o Cu⁺². Los cationes divalentes de la invención también incluyen formas de sal de los iones. Los ejemplos específicos de formas de sal divalentes incluyen CaCl² , ZnCl² , MnSO⁴ , MnCl² y MgCl² y otras combinaciones de los ejemplos de cationes divalentes anteriores en forma de sal con, por ejemplo, cloruro (Cl), sulfato (SO⁴), acetato (Ac) y/o fosfato (P). Los cationes divalentes y las formas de sal distintas de las ejemplificadas anteriormente son bien conocidos en la técnica y se incluyen en el significado del término tal como se utiliza en el presente documento.

Tal como se utiliza en el presente documento, por el término "tampón" debe entenderse una sustancia que estabiliza el pH de un líquido, ya sea su acidez o su alcalinidad. El término, tal como se utiliza en el presente documento, se pretende que se refiera a una solución que tiene una sustancia tamponadora, tal como un ácido, en equilibrio con su base conjugada. Los ejemplos de tampones útiles en una formulación de la invención incluyen un tampón de ácido acético o acetato, un tampón de ácido glutámico o glutamato, un tampón de ácido succínico o succinato, o un tampón de ácido propiónico o propionato. Estos tampones, los términos que se ejemplifican y se utilizan en el presente documento, se refieren a un tampón que contiene ácido acético, ácido glutámico, ácido succínico o ácido propiónico en equilibrio con su base conjugada respectiva. Cada uno de estos tampones puede proporcionar una capacidad tamponadora óptima en la región de su pK^a , refiriéndose la capacidad tamponadora a una resistencia al cambio de pH cuando se altera con ácidos o bases añadidos a la solución.

El ácido acético se refiere a un ácido que tiene la fórmula CH³COOH, un punto de fusión de 16,7°C y un punto de ebullición de 118,0°C. La pK^a del ácido acético es 4,75. El ácido glutámico se refiere a un aminoácido ácido que tiene la fórmula C⁵H⁹NO⁴ e incluye las formas L y D del aminoácido. La pK^a de la cadena lateral del ácidô glutámico es 4,07 mientras que la pK^a del ácido succínico es 4,19 y 5,57 para sus dos restos de ácido carboxílico. Ácido succínico se refiere â un ácido dicarboxílico que tiene la fórmula C⁴H⁶O⁴ , un punto de fusión de 185°C y un punto de ebullición de 235°C. Ácido propiónico se refiere a un ácido líquido que tiene la fórmula CH³CH²COOH, un punto de fusión de -21 °C y un punto de ebullición de 141°C. La forma de ácido acético de un tampón de ácido acético de la invención puede incluir, por ejemplo, ácido acético, ion acetato y/o formas de sal de ácido acético que incluyen acetato. De modo similar, la forma de ácido glutámico de un tampón de ácido glutámico de la invención puede incluir, por ejemplo, ácido glutámico, ion glutamato y/o formas de sal de ácido glutámico que incluyen glutamato. La forma de ácido succínico de un tampón de ácido succínico de la invención puede incluir, por ejemplo, ácido succínico, ión succinato y/o formas de sal de ácido succínico que incluyen succinato. Además, la forma de ácido propiónico de un tampón de ácido propiónico de la invención puede incluir, por ejemplo, ácido propiónico, ion propionato que tiene la fórmula C²H⁵CO^2- y/o formas de sal de ácido propiónico que incluyen propionato.

Los ejemplos de formas de sal de tampones que se pueden incluir en un tampón de la invención incluyen, por ejemplo, sal de sodio, de potasio, de calcio, de amino orgánico o de magnesio. El ácido acético, los tampones de ácido acético, el ácido glutámico, los tampones de ácido glutámico, el ácido succínico, los tampones de ácido succínico, el ácido propiónico y los tampones de ácido propiónico son bien conocidos por los expertos en la técnica. El término "tampón", tal como se utiliza en el presente documento, también se pretende que incluya todos los tampones distintos de los ejemplificados anteriormente bien conocidos por los expertos en la técnica y que pueden utilizarse con productos biofarmacéuticos tales como polipéptidos terapéuticos. Dadas las enseñanzas y la orientación proporcionadas en el presente documento, los expertos en la técnica comprenderán que pueden sustituirse igualmente en las formulaciones de la invención tampones distintos del acetato, glutamato y/o succinato para mantener o mejorar la estabilidad de un polipéptido terapéutico.

Tal como se utiliza en el presente documento, por el término "excipiente" debe entenderse una sustancia terapéuticamente inactiva. Los excipientes se pueden incluir en una formulación para una amplia diversidad de propósitos, incluidos, por ejemplo, como diluyente, vehículo, tampón, estabilizante, agente de tonicidad, agente de carga, tensioactivo, crioprotector, lioprotector, antioxidante, fuente de iones metálicos, agente quelante y/o conservante. Los excipientes incluyen, por ejemplo, polioles tales como sorbitol o manitol; azúcares tales como sacarosa, lactosa o dextrosa; polímeros tales como polietilenglicol; sales tales como NaCl, KCl o fosfato cálcico, aminoácidos tales como glicina, metionina o ácido glutámico, tensioactivos, iones metálicos, sales tampón tales como propionato, acetato o succinato, conservantes y polipéptidos tales como albúmina sérica humana, así como solución salina y agua. Los excipientes particularmente útiles de la invención incluyen azúcares que incluyen alcoholes de azúcar, azúcares reductores, azúcares no reductores y ácidos de azúcar. Los excipientes son bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar descritos en, por ejemplo, Wang W., Int. J. Pharm. 185:129-88 (1999) y Wang W., Int. J. Pharm. 203: 1-60 (2000).

Brevemente, los alcoholes de azúcar, también conocidos como polioles, alcoholes polihidroxílicos o polialcoholes, son formas hidrogenadas de carbohidratos que tienen un grupo carbonilo reducido a un grupo hidroxilo primario o secundario. Los polioles se pueden utilizar como excipientes estabilizantes y/o agentes de isotonicidad tanto en formulaciones líquidas como liofilizadas. Los polioles pueden proteger a los polipéptidos de las vías de degradación tanto físicas como químicas. Los codisolventes preferentemente excluidos aumentan la tensión superficial eficaz del disolvente en la interfaz de la proteína, por lo que las conformaciones estructurales energéticamente más favorables son aquellas con las áreas superficiales más pequeñas. Los ejemplos específicos de alcoholes de azúcar incluyen sorbitol, glicerol, manitol, xilitol, maltitol, lactitol, eritritol y treitol.

Los azúcares reductores incluyen, por ejemplo, azúcares con un grupo cetona o aldehído y contienen un grupo hemiacetal reactivo, que permite que el azúcar actúe como agente reductor. Los ejemplos específicos de azúcares reductores incluyen fructosa, glucosa, gliceraldehído, lactosa, arabinosa, manosa, xilosa, ribosa, ramnosa, galactosa y maltosa.

Los azúcares no reductores contienen un carbono anomérico que es un acetal y no es sustancialmente reactivo con aminoácidos o polipéptidos para iniciar una reacción de Maillard. Los azúcares que reducen la solución de Fehling o el reactivo de Tollen también se conocen como azúcares reductores. Los ejemplos específicos de azúcares no reductores incluyen sacarosa, trehalosa, sorbosa, sucralosa, melecitosa y rafinosa.

Los ácidos de azúcar incluyen, por ejemplo, ácidos sacáricos, gluconato y otros azúcares polihidroxílicos y sales de los mismos.

Los excipientes tampón mantienen el pH de las formulaciones líquidas durante la vida útil del producto y mantienen el pH de las formulaciones liofilizadas durante el proceso de liofilización y tras su reconstitución, por ejemplo.

Los agentes de tonicidad y/o estabilizantes incluidos en las formulaciones líquidas se pueden usar, por ejemplo, para proporcionar isotonicidad, hipotonicidad o hipertonicidad a una formulación de forma que sea adecuada para administración. Dichos excipientes también se pueden usar, por ejemplo, para facilitar el mantenimiento de la estructura de un polipéptido y/o para minimizar las interacciones electrostáticas proteína-proteína en solución. Los ejemplos específicos de agentes de tonicidad y/o estabilizantes incluyen polioles, sales y/o aminoácidos. Los agentes de tonicidad y/o estabilizantes incluidos en las formulaciones liofilizadas se pueden usar, por ejemplo, como crioprotectores para proteger a los polipéptidos de tensiones por congelación o como lioprotectores para estabilizar los polipéptidos en estado liofilizado. Los ejemplos específicos de dichos crioprotectores y lioprotectores incluyen polioles, azúcares y polímeros.

Los agentes de carga o apelmazamiento son útiles en las formulaciones liofilizadas para, por ejemplo, mejorar la elegancia del producto y evitar que revienten. Los agentes de carga proporcionan resistencia estructural a la torta liofilizada e incluyen, por ejemplo, manitol y glicina.

Los antioxidantes son útiles en formulaciones líquidas para controlar la oxidación de proteínas y también pueden usarse en formulaciones liofilizadas para retardar las reacciones de oxidación.

Se pueden incluir iones metálicos en una formulación líquida, por ejemplo, como cofactor, y se pueden utilizar cationes divalentes, tales como calcio, zinc, manganeso y magnesio, en formulaciones en suspensión como, por ejemplo, estabilizante contra la formación de ácido isoaspártico tal como se describe en el presente documento. Los agentes quelantes incluidos en las formulaciones líquidas se pueden usar, por ejemplo, para inhibir reacciones catalizadas por iones metálicos. Con respecto a las formulaciones liofilizadas, también se pueden incluir iones metálicos, por ejemplo, como cofactor o como estabilizante contra la formación de ácido isoaspártico tal como se describe en el presente documento. Aunque los agentes quelantes generalmente se omiten en las formulaciones liofilizadas, también se pueden incluir si se desea para reducir las reacciones catalíticas durante el proceso de liofilización y tras la reconstitución.

Los conservantes incluidos en formulaciones líquidas y/o liofilizadas se pueden usar, por ejemplo, para proteger contra el crecimiento microbiano y son particularmente beneficiosos en formulaciones multidosis. En las formulaciones liofilizadas, generalmente se incluyen conservantes en el diluyente de reconstitución. El alcohol bencílico es un ejemplo específico de conservante útil en una formulación de la invención.

Tal como se utiliza en el presente documento, por el término "tensioactivo" debe entenderse una sustancia que actúa reduciendo la tensión superficial del líquido en el que se disuelve. Los tensioactivos se pueden incluir en una formulación para una diversidad de propósitos que incluyen, por ejemplo, prevenir o controlar la agregación, la formación de partículas y/o la adsorción superficial en formulaciones líquidas o prevenir o controlar estos fenómenos durante el proceso de liofilización y/o reconstitución en formulaciones liofilizadas. Los tensioactivos incluyen, por ejemplo, compuestos orgánicos anfipáticos que muestran una solubilidad parcial tanto en disolventes orgánicos como en soluciones acuosas. Las características generales de los tensioactivos incluyen su capacidad para reducir la tensión superficial del agua, reducir la tensión interfacial entre el aceite y el agua y también formar micelas. Los tensioactivos de la invención incluyen tensioactivos iónicos y no iónicos. Los tensioactivos son bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar descritos, por ejemplo, en Randolph T. W. y Jones L.S., Surfactant-protein interactions. Pharm Biotechnol. 13: 159-75 (2002).

Brevemente, los tensioactivos no iónicos incluyen, por ejemplo, alquil-poli(óxido de etileno), poliglucósidos de alquilo tales como glucósido de octilo y maltósido de decilo, alcoholes grasos tales como alcohol cetílico y alcohol oleílico, cocamida MEA, cocamida DEA y cocamida TEA. Los ejemplos específicos de tensioactivos no iónicos incluyen los polisorbatos, que incluyen, por ejemplo, polisorbato 20, polisorbato 28, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 65, polisorbato 80, polisorbato 81, polisorbato 85 y similares; los poloxámeros, que incluyen, por ejemplo, poloxámero 188, también conocido como poloxalcol o poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno), poloxámero 407 o polietilenpolipropilenglicol y similares, y polietilenglicol (PEG). Polisorbato 20 es sinónimo de TWEEN 20, monolaurato de sorbitán y monolaurato de polioxietilensorbitán.

Los tensioactivos iónicos incluyen, por ejemplo, tensioactivos aniónicos, catiónicos y iónicos dipolares. Los tensioactivos aniónicos incluyen, por ejemplo, tensioactivos basados en sulfonato o carboxilato tales como jabones, sales de ácidos grasos, dodecilsulfato de sodio (SDS), laurilsulfato de amonio y otras sales de alquilsulfato. Los tensioactivos catiónicos incluyen, por ejemplo, tensioactivos basados en amonio cuaternario tales como bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), otras sales de alquiltrimetilamonio, cloruro de cetilpiridinio, amina de sebo polietoxilada (POEA) y cloruro de benzalconio. Los tensioactivos iónicos dipolares o anfóteros incluyen, por ejemplo, dodecil-betaína, óxido de dodecil-dimetilamina, cocamidopropil-betaína y cocoanfoglicinato.

Tal como se utiliza en el presente documento, por el término "terapéutico" cuando se usa con referencia a un polipéptido de la divulgación, incluido un anticuerpo de la presente divulgación, debe entenderse que el polipéptido está destinado a usarse en la cura, la mitigación, el tratamiento o la prevención de enfermedades en un ser humano u otro animal. En consecuencia, un polipéptido terapéutico es un tipo específico de producto farmacéutico y puede incluir un solo polipéptido o dos o más subunidades de polipéptido. Un polipéptido terapéutico incluye un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo funcional del mismo, un pepticuerpo o un fragmento funcional del mismo, factores de crecimiento, citocinas, moléculas de señalización celular y hormonas. Una amplia diversidad de polipéptidos terapéuticos son bien conocidos en la técnica, estando todos los mismos incluidos dentro del significado del término tal como se utiliza en el presente documento. Los ejemplos de polipéptidos terapéuticos que se pueden utilizar en una formulación de la presente divulgación incluyen, por ejemplo, anticuerpos tales como panitumumab (VectibixTm) y epratuzumab® (Emab), así como fragmentos funcionales para una amplia diversidad de antígenos, interleucinas, G-CSF, GM-CSF, quinasas, ligandos de TNF y TNFR, ciclinas y eritropoyetina. El panitumumab está incluido en la formulación de la invención tal como se reivindica.

Tal como se utiliza en el presente documento, por el término "cantidad eficaz", cuando se utiliza con referencia a una macromolécula terapéutica tal como un polipéptido terapéutico, debe entenderse una cantidad de la molécula terapéutica suficiente para mejorar al menos un síntoma asociado con una enfermedad o condición fisiológica diana.

La presente divulgación proporciona una formulación que incluye un tampón que tiene un pH inferior a 6,0, un catión divalente entre aproximadamente 5-150 mM, un excipiente que comprende un azúcar o un poliol y una cantidad eficaz de un polipéptido terapéutico. El polipéptido terapéutico puede ser un anticuerpo terapéutico, incluido un anticuerpo que tiene actividad de unión específica al receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (EGFR).

En una forma de realización, se proporciona una formulación de la presente divulgación que inhibe o reduce la velocidad o el grado de formación de ácido isoaspártico en polipéptidos que contienen ácido aspártico (Asp o D) y/o asparagina (Asn o N). La figura 13 es un diagrama esquemático de la ruta de isomerización de Asp o Asn a ácido isoaspártico a través de un intermedio de succinimida. La formación de ácido isoaspártico puede dar como resultado la descomposición y la inestabilidad del polipéptido, así como la reducción de su actividad biológica.

Los polipéptidos que contienen Asp o Asn son más propensos o susceptibles a la isomerización cuando, por ejemplo, las cadenas laterales de estos aminoácidos se exponen a un disolvente. Otras características de los polipéptidos que son susceptibles a la isomerización incluyen, por ejemplo, Asp o Asn en la proximidad inmediata de otra cadena lateral de aminoácido cargada o polar, tal como ácido glutámico (Glu o E), histidina (His o H), lisina (Lys o K), serina (Ser o S) o teonina (Thr o T). La susceptibilidad a la isomerización a través de un intermedio de succinimida, por ejemplo, también puede suceder cuando aminoácidos neutros tales como la glicina (Gly o G) se encuentran en proximidad inmediata debido a la mayor flexibilidad de la estructura principal y una mayor exposición al disolvente. En general, cuanto más expuesto al disolvente o cuanto más cerca está un residuo de Asp, por ejemplo, del disolvente u otra cadena lateral cargada positivamente, más susceptible es ese residuo a la isomerización. Por ejemplo, Asp o Asn pueden exponerse a disolvente en las CDR de anticuerpos, en los giros p de polipéptidos que contienen dominios de inmunoglobulina o en otras regiones que tienen una estructura no regular. Un ejemplo específico de un anticuerpo que tiene un resto Asp en su CDR que se isomeriza a ácido isoaspártico es el anticuerpo panitumumab. Además, por ejemplo, los residuos con carga positiva tan cercanos como 1, 2, 3 o 4 o más pueden facilitar la isomerización y la susceptibilidad del polipéptido a la formación de ácido isoaspártico. De forma similar, residuos tales como los ejemplificados anteriormente en la proximidad inmediata de una Asp, por ejemplo, o en proximidad inmediata dentro de la estructura tridimensional del polipéptido también pueden facilitar la formación de ácido isoaspártico.

La inclusión de cationes divalentes en las formulaciones de la presente divulgación reduce la susceptibilidad de los polipéptidos que contienen uno o más residuos de Asp o Asn a la isomerización y la formación de ácido isoaspártico. De forma similar, la inclusión de cationes divalentes en las formulaciones de la presente divulgación reduce la formación de ácido isoaspártico en polipéptidos susceptibles a la isomerización. La inclusión de cationes divalentes es particularmente útil en polipéptidos más grandes que tienen estructuras complejas en las que, por ejemplo, uno o más residuos de Asp o Asn pueden ser susceptibles a la isomerización tal como se describe en el presente documento. Por lo tanto, una formulación estabilizante de cationes divalentes de la presente divulgación se puede usar con polipéptidos que varían de 10 a cientos o más residuos de aminoácidos. En consecuencia, las formulaciones de cationes divalentes se pueden usar con polipéptidos que tienen, por ejemplo, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750 o 1000 o más residuos de aminoácidos. Todos los tamaños de polipéptidos entre estos ejemplos de números también son para su uso en las formulaciones que contienen cationes divalentes de la presente divulgación.

Una formulación de catión divalente de la presente divulgación es útil para estabilizar y reducir la isomerización de un polipéptido que tiene 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más residuos de Asp y/o Asn. De forma similar, una formulación de catión divalente de la presente divulgación también es particularmente útil para estabilizar y reducir la isomerización de un polipéptido que tiene 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más residuos de Asp y/o Asn en proximidad inmediata a, por ejemplo, Glu, His, Lys, Ser, Thr y/o Gly. Dichos residuos pueden encontrarse, por ejemplo, adyacentes entre sí, como en los ejemplos de motivos DD, DE, D^h , DK, DS, DT o D^g , (o ND, NN, NE, N^h , NK y similares) o pueden estar, por ejemplo, separados por 2, 3 o 4 o más residuos tal como se ejemplificó anteriormente. De forma similar, múltiples residuos pueden encontrarse adyacentes o en proximidad inmediata, como en los motivos DDD, DDE, DED, DXD o DXE, en los que X representa cualquier aminoácido. Además, todas las combinaciones y permutaciones de los motivos ejemplificados anteriormente también pueden provocar susceptibilidad a la isomerización de Asp o Asn. Un ejemplo específico de un polipéptido que tiene uno de los motivos ejemplificados anteriormente es el anticuerpo panitumumab, que contiene una His adyacente a Asp 92 en CDR 3 que puede isomerizarse dando ácido isoaspártico. Las formulaciones de cationes divalentes de la presente divulgación son útiles para estabilizar polipéptidos que contienen cualquiera de estos motivos, combinaciones y/o permutaciones.

Una formulación de la presente divulgación que inhibe o reduce la velocidad o el grado de formación de ácido isoaspártico en polipéptidos que contienen Asp o Asn incluye una cantidad de catión divalente suficiente para reducir la isomerización y la formación de ácido isoaspártico. Las formulaciones de la presente divulgación que contienen una cantidad de catión divalente suficiente para reducir la isomerización y la formación de ácido isoaspártico son particularmente útiles con polipéptidos que contienen Asp o Asn que son susceptibles a la isomerización tales como los polipéptidos que tienen un motivo que contiene Asp o Asn ejemplificados anteriormente. Los cationes divalentes pueden, por ejemplo, unirse a residuos de aminoácidos en los que, por ejemplo, los carbonilos de la estructura principal polipeptídica no participan en la formación de estructuras secundarias y, por lo tanto, están disponibles para interactuar con cationes divalentes. La inclusión de cationes divalentes en una formulación de la presente divulgacion también puede, por ejemplo, estabilizar la estructura del polipéptido mediante la reducción de la desamidación de Asn y/o la hidrólisis de Asp. Las cadenas laterales de, por ejemplo, residuos de aspartilo y glutamilo también pueden, por ejemplo, unirse con cationes divalentes para evitar que formen intermedios de succinimida.

Una cantidad de catión divalente, o forma de sal del mismo, suficiente para inhibir o reducir la susceptibilidad a la isomerización y la formación de ácido isoaspártico puede incluir una cantidad entre aproximadamente 5-200 mM. En particular, la conservación de la estabilidad del polipéptido y la reducción de la velocidad o el grado de isomerización de Asp o Asn se pueden lograr incluyendo cationes divalentes a una concentración entre aproximadamente 10-175 mM, 15-150 mM, 20-125 mM, 25-100 mM, 30-80 mM, 35-60 mM o 40-50 mM. Las concentraciones de cationes divalentes particularmente útiles, o formas de sal de los mismos, incluyen, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 o 150 mM. Todas las concentraciones por encima, por debajo y entre estos ejemplos de concentraciones de cationes divalentes también se pueden emplear en una formulación de la presente divulgación para inhibir o reducir la velocidad o el grado de isomerización. Dadas las enseñanzas y la orientación proporcionadas en el presente documento, los expertos en la técnica sabrán cómo seleccionar una concentración de catión divalente particular, o una forma de sal del mismo, para inhibir o reducir la isomerización del polipéptido y, por lo tanto, aumentar la estabilidad del polipéptido en un medio acuoso u otra formulación líquida.

Cualquiera de una diversidad de cationes divalentes, o formas de sal de los mismos, puede usarse en una formulación de la presente divulgación. Los ejemplos de cationes divalentes incluyen, por ejemplo, los ejemplificados anteriormente, tales como Ca⁺² , Zn⁺² , Mn⁺² , Mg⁺² , Fe⁺² , Co⁺² , Ni⁺² y/o Cu⁺². Otros cationes divalentes incluyen, por ejemplo, Sc⁺² , Ti⁺² , V⁺², Cr⁺² , Fe⁺² , Co⁺² , Ni⁺² , Cu⁺² , Ga⁺² , Ge⁺² y/o Se⁺² Las formas de sal de estos ejemplos de cationes divalentes incluyen, por ejemplo, CaCl² , ZnCl² , MnSO⁴ , MnCl² y MgCl² y otras combinaciones de los ejemplos de cationes divalentes anteriores en forma de sal con, por ejemplo, cloruro (Cl), sulfato (SO⁴), acetato y/o fosfato. Dadas las enseñanzas y la orientación proporcionadas en el presente documento, los expertos en la técnica sabrán qué cationes divalentes son útiles para las formulaciones terapéuticas y cuáles se pueden usar, por ejemplo, para aplicaciones de diagnóstico o de investigación. Por ejemplo, los cationes divalentes que pueden ser menos útiles para fines terapéuticos pueden usarse alternativamente para estabilizar polipéptidos en procedimientos de obtención de imágenes, otros procedimientos de diagnóstico y/o para la manipulación o el almacenamiento de polipéptidos utilizados en investigación preclínica.

En otra forma de realización, se tampona una formulación de la presente divulgación para que tenga un pH que sea inferior al punto isoeléctrico (pI) del polipéptido o de los polipéptidos incluidos en la formulación. Una formulación que tenga un pH más bajo que el pI del polipéptido incluido es particularmente útil para prevenir o reducir la precipitación del polipéptido a partir de la solución. Los pH ácidos, incluidos los pH ácidos inferiores al pI de un polipéptido incluido, también son particularmente útiles porque los tampones de pH más bajos promueven adicionalmente la estabilidad del polipéptido mediante la prevención o la reducción de la agregación y otras vías de degradación del polipéptido tal como se describe más adelante. Por ejemplo, y tal como se describe más adelante, en algunos aspectos de la presente divulgación, se utilizan formulaciones de polipéptidos estables que tienen un pH inferior a 6,0 independientemente del pI del polipéptido incluido. En estas formas de realización específicas, el pH puede encontrarse entre aproximadamente 4,0-5,9. Los intervalos de pH particularmente útiles incluyen, por ejemplo, un pH inferior a 5,8 y un pH entre aproximadamente 4,8-5,2.

Las formulaciones que tienen un pH inferior al pI del polipéptido incluido pueden variar de aproximadamente 4,0 a 8,0. Tal como se describe más adelante, los intervalos de pH particularmente útiles, incluidos los intervalos de pH inferiores al pI de un polipéptido, incluyen desde aproximadamente 4,0 hasta menos de 6,0. El polipéptido de la invención es panitumumab, que tiene un pI calculado de 6,63. Un tampón que tiene un pH inferior a aproximadamente 6,6 será inferior al pI de panitumumab y evitará o reducirá la precipitación de este polipéptido en una formulación que contiene cationes divalentes de la presente divulgación. En la presente divulgación, el pI del polipéptido formulado puede ser, por ejemplo, 6,0, 6,5, 7,0 o superior y el pH de la formulación final puede ser, por ejemplo, inferior a 6,0, 6,5 o 7,0. En otros aspectos de la presente divulgación, el pI de polipéptidos en una formulación de la invención puede ser, por ejemplo, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1,7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1,8,2, 8,3, 8,4 u 8,5 y se puede usar el pH de una formulación de la presente divulgación que es inferior a cualquiera de estos ejemplos de valores de pI. Dadas las enseñanzas y la orientación proporcionadas en el presente documento, los expertos en la técnica sabrán cómo seleccionar un valor de pH inferior al pI de un polipéptido incluido en una formulación que contiene cationes divalentes de la invención para facilitar la prevención o la reducción de la precipitación de polipéptidos. Los expertos en la técnica también entenderán que dichas formas de realización que tienen valores de pH inferiores al pI del polipéptido pueden o no ser necesarias para reducir la precipitación y que se encuentra dentro de la experiencia de los expertos en la técnica la formulación de un polipéptido en diferentes valores de pH para determinar si se desean dichas formulaciones de pH más bajo.

Los cationes divalentes, o formas de sal de los mismos, pueden incluirse en cualquier solución, tampón o formulación deseable adecuada para un polipéptido terapéutico y apropiada para su almacenamiento, su manipulación o su administración a un individuo como producto farmacéutico. Dadas las enseñanzas y la orientación proporcionadas en el presente documento, los expertos en la técnica entenderán que la inclusión de cationes divalentes en una solución polipeptídica evitará o reducirá la velocidad o el grado de isomerización de Asp o Asn, la formación de intermedio de succinimida y/o de ácido isoaspártico. A continuación se ejemplifican una diversidad de formulaciones polipeptídicas que confieren estabilidad al polipéptido que son útiles para el almacenamiento, la manipulación o la administración de polipéptidos terapéuticos. La inclusión de cationes divalentes en estos ejemplos de formulaciones a una concentración entre aproximadamente 5-200 mM puede mejorar adicionalmente la estabilidad del polipéptido mediante la prevención o la reducción de la velocidad o el grado de isomerización. Los expertos en la técnica comprenderán que también se pueden usar varias formulaciones distintas de las ejemplificadas a continuación junto con los cationes divalentes, o formas de sal de los mismos, para aumentar adicionalmente la estabilidad del polipéptido mediante la prevención o la reducción de la velocidad o el grado de isomerización de Asp o Asn.

Por ejemplo, un ejemplo de formulación de la invención muestra propiedades óptimas para la administración, el almacenamiento y la manipulación de panitumumab. El polipéptido para su uso en una formulación de la invención es panitumumab. La manipulación incluye, por ejemplo, liofilización, reconstitución, dilución, valoración y similares. El componente tamponador de una formulación de la invención es eficaz para la preparación utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica y puede combinarse fácilmente con un polipéptido deseado utilizando cualquiera de una diversidad de procedimientos bien conocidos en la técnica, evitando etapas preparatorias y/o intermedias engorrosas y, a veces, largas. Además, el componente tampón acuoso se selecciona para que sea compatible con una amplia diversidad de excipientes y tensioactivos que facilitan la estabilidad de un polipéptido. Estos y otros atributos de una formulación de la invención descrita en el presente documento permiten que se preparen y se mantengan formulaciones estables de moléculas bioactivas a lo largo de periodos que superan los 12-18 meses o más.

La estabilidad de una formulación de la invención, incluida una formulación líquida de la invención, se refiere a la conservación de la estructura y/o la función de panitumumab dentro de una formulación. El panitumumab en una formulación de la invención mostrará atributos tales como resistencia al cambio o al deterioro que afectan a la estabilidad o a la función y, por lo tanto, mantienen características funcionales constantes a lo largo del tiempo. En consecuencia, las formulaciones de la invención mostrarán, por ejemplo, fiabilidad y seguridad con respecto a la actividad por volumen o unidades de actividad.

En una forma de realización, la estabilidad de panitumumab dentro de una formulación que contiene cationes divalentes de la invención mostrará la prevención o la reducción de la isomerización de Asp a ácido isoaspártico, reduciendo así la velocidad o el grado de degradación posterior. La reducción en la velocidad o el grado de isomerización incluye, por ejemplo, la inhibición entre aproximadamente el 20-100%, 40-95%, 50-90%, 60-85% o 70-80% de la formación de ácido isoaspártico en presencia de un catión divalente en comparación con la ausencia de un catión divalente. En consecuencia, la estabilidad de panitumumab dentro de una formulación que contiene un catión divalente de la invención incluye la inhibición de la formación de ácido isoaspártico en presencia de un catión divalente superior al 99,5%, al menos de aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81% o el 80% en comparación con la ausencia de un catión divalente. El grado de inhibición puede determinarse mediante una diversidad de procedimientos bien conocidos en la técnica y que se describen más adelante. Los ejemplos específicos de dichas medidas se ejemplifican en el ejemplo II.

En otra forma de realización, la estabilidad de panitumumab dentro de una formulación de la invención incluye, por ejemplo, la conservación de la estabilidad física y/o química. La estabilidad de panitumumab se puede evaluar, por ejemplo, determinando si panitumumab se ha sometido a una ruta de degradación física y/o de degradación química tal como las descritas anteriormente, incluida la modificación química de su estructura. La conservación de la estabilidad de panitumumab en una formulación de la invención incluye, por ejemplo, la conservación de la estabilidad física o química entre aproximadamente el 80-100%, 85-99%, 90-98%, 92-96% o 94-95% en comparación con la estabilidad de panitumumab en un punto temporal inicial. En consecuencia, la estabilidad de panitumumab dentro de una formulación de la invención incluye una conservación de la estabilidad superior al 99,5%, al menos de aproximadamente el 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81% o el 80% en comparación con la estabilidad de panitumumab en un punto temporal inicial.

En otra forma de realización, la estabilidad de panitumumab dentro de una formulación de la invención incluye, por ejemplo, la conservación de la actividad. La actividad de panitumumab se puede evaluar mediante, por ejemplo, un ensayo in vitro, in vivo y/o in situ indicativo de la función de panitumumab. La conservación de la estabilidad de panitumumab en una formulación de la invención incluye, por ejemplo, la conservación de la actividad entre aproximadamente el 50-100% o más, dependiendo de la variabilidad del ensayo. Por ejemplo, la conservación de la estabilidad puede incluir la conservación de la actividad entre aproximadamente el 60-90% o 70-80% en comparación con la actividad de panitumumab en un punto temporal inicial. En consecuencia, la estabilidad de panitumumab dentro de una formulación de la invención incluye la conservación de la actividad de al menos aproximadamente el 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% y puede incluir mediciones de la actividad superiores al 100% tales como el 105%, 110%, 115%, 120%, 125% o 150% o más en comparación con la actividad del polipéptido en un punto temporal inicial. En general, se selecciona un punto temporal inicial de modo que sea el momento en el que se preparó el panitumumab por primera vez en una formulación de la invención o se examinó por primera vez para comprobar su calidad (es decir, cumple con las especificaciones de liberación). Un punto temporal inicial también puede incluir el momento en que se reformula panitumumab en una formulación de la invención. La reformulación puede ser, por ejemplo, a mayor concentración, menor concentración o a la misma concentración de una preparación inicial.

Se puede preparar una formulación de la invención de modo que sea isotónica con una solución o fluido de referencia (es decir, suero sanguíneo). Una solución isotónica tiene una cantidad sustancialmente similar de soluto disuelto en comparación con lo que le rodea de modo que sea osmóticamente estable. A menos que se compare expresamente con una solución o fluido específico, isotónico o isotonicidad se utiliza en el presente documento en forma de ejemplo con referencia al suero sanguíneo humano (por ejemplo, 300 mOsmol/kg). Por lo tanto, una formulación isotónica de la invención contendrá una concentración de solutos sustancialmente similar o presentará una presión osmótica sustancialmente similar a la de la sangre humana. En general, una solución isotónica contiene aproximadamente la misma concentración de solutos que la solución salina normal para seres humanos y muchos otros mamíferos, que es aproximadamente el 0,9 por ciento en peso (0,009 g/ml) de sal en solución acuosa (por ejemplo, 0,009 g/ml de NaCl). Las formulaciones de la invención también pueden incluir preparaciones de soluciones hipotónicas o hipertónicas.

Una formulación de la invención se puede preparar en cualquiera de una diversidad de formas bien conocidas en la técnica. La capacidad tamponadora de una formulación de la invención está suministrada por un ácido o base débil en equilibrio con su base o ácido conjugado, respectivamente. Los componentes tampón muestran una fuerte capacidad tamponadora en el intervalo de pH que se encuentra dentro de aproximadamente 1 unidad de pH de sus respectivas pK^as. En formas de realización específicas de la invención en las que se desea un pH ácido, el ácido acético, el ácido glutámico, el ácido succínico o el ácido propiónico tienen pK^as que son óptimas para muchas moléculas biológicas incluidos, por ejemplo, anticuerpos tales como el panitumumab. Estos ejemplos de tampones muestran una fuerte capacidad tamponadora en intervalos de pH entre, por ejemplo, 4,0-6,0, y son particularmente útiles para formulaciones que tienen un pH inferior a 6,0.

Puede utilizarse cualquiera de una amplia diversidad de componentes tampón bien conocidos en la técnica en una formulación de la invención. Dichos componentes tampón incluyen, por ejemplo, ácido acético, ácido glutámico, ácido succínico, ácido propiónico, ácido maleico, gluconato, histidina u otros aminoácidos, citrato, fosfato o formas de sal de los mismos. Una amplia diversidad de otros tampones que incluyen, por ejemplo, otros ácidos orgánicos, son bien conocidos en la técnica y pueden usarse de forma similar como un componente tampón en una formulación de la invención. Dadas las enseñanzas y la orientación proporcionadas en el presente documento, los expertos en la técnica sabrán que pueden seleccionarse cualquiera de los componentes tampón anteriores u otros bien conocidos en la técnica y usarse en una formulación de la invención dado el pH deseado de la formulación y los excipientes, si los hubiera, incluidos en la formulación.

El componente tampón se puede suministrar al sistema tamponador en una diversidad de formas diferentes. Dichos tampones y formas de los mismos se ejemplifican en el presente documento con fines de ilustración con referencia a tampones que contienen ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico. Los tampones de ácido acético, ácido glutámico y ácido succínico son bien conocidos por los expertos en la técnica. Tal como se ha descrito anteriormente, los expertos en la técnica entenderán que cualquiera de una diversidad de otros tampones bien conocidos en la técnica pueden sustituirse igualmente por los tampones de ácido acético, ácido glutámico y/o ácido succínico ejemplificados a continuación. En determinadas formas de realización específicas, los tampones que emplean histidina, ácido cítrico y/o fosfato, o una sal de los mismos, no se seleccionarán en lugar de un tampón que tenga características de tamponamiento más útiles a un pH deseado.

Por ejemplo, el componente de ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico puede suministrarse como su ácido, sal de ácido o cualquier otra forma que esté disponible o que pueda producirse utilizando síntesis química. Las formas de sal de ácido de estos ácidos (acetato, glutamato o succinato) son particularmente útiles para producir un sistema tamponador de una formulación porque están disponibles comercialmente en forma altamente purificada. Las sales de acetato, glutamato y succinato incluyen, por ejemplo, las descritas anteriormente, así como otras conocidas en la técnica. Una forma altamente purificada de un componente de formulación se refiere al nivel de pureza de grado farmacéutico, siendo lo suficientemente puro como para administrarlo a un ser humano en la medida en que carece de contaminantes de modo que sea seguro y no tóxico.

Una formulación de la invención contendrá una concentración de, por ejemplo, un ácido o una sal de ácido de la invención que tenga suficiente capacidad tamponadora como para mantener un pH seleccionado de una formulación a una temperatura seleccionada. Las concentraciones útiles de ácido o sal (por ejemplo, ácido acético o acetato, ácido glutámico o glutamato o ácido succínico o succinato) incluyen, por ejemplo, entre aproximadamente 1 -150 mM y hasta 200 mM o más. Por ejemplo, en algunos casos, puede ser deseable incluir ácido o sal de ácido hasta 1 M para producir una formulación hipertónica de la invención. Dichas soluciones hipertónicas se pueden diluir para producir una formulación isotónica antes de su uso si se desea. A modo de ejemplo, las concentraciones útiles de tampón de ácido o de sal de ácido de la invención incluyen, por ejemplo, entre aproximadamente 1-200 mM, 5-175 mM, 10-150 mM, 15-125 mM, 20-100 mM, 25- 80 mM, 30-75 mM, 35-70 mM, 40-65 mM y 45-60 mM. Otras concentraciones útiles de ácido o sal de ácido incluyen, por ejemplo, entre aproximadamente 1 -50 mM, 2-30 mM, 3-20 mM, 4-10 mM y 5-8 mM. En consecuencia, una concentración de ácido o sal de ácido de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 mM o más también son útiles. Todos los valores por encima y por debajo de estos ejemplos de concentraciones también se pueden usar en una formulación. Por lo tanto, una formulación de la invención puede poseer un ácido o una sal de ácido inferior a una concentración de 1 mM o superior a 20 mM, incluidas, por ejemplo, 21,22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 mM o más de ácido o sal de ácido. Varias formulaciones se ejemplifican en el ejemplo, más adelante, y se muestran en las figuras 1 -13.

Tal como se ha descrito anteriormente, la pK^a de un tampón de ácido acético, ácido glutámico, ácido succinato o ácido propiónico en una formulación de la invención es particularmente adecuada para su uso con polipéptidos ya que estos tienen una fuerte capacidad tamponadora a un pH de entre aproximadamente 4,0-7,0, y particularmente de entre aproximadamente 4,0-6,0, que puede ser óptima para el mantenimiento de la estabilidad del polipéptido. Se puede preparar un componente tampón de una formulación de la presente divulgación de forma que muestre una capacidad tamponadora eficaz dentro de un intervalo de pH de entre aproximadamente 4,0 y 7,0. Los ejemplos de intervalos de pH de un tampón y/o la formulación final que incluye, por ejemplo, un tampón de ácido acético, ácido glutámico, ácido succínico o ácido propiónico pueden incluir intervalos de pH de entre aproximadamente 3,5-6,5, entre aproximadamente 4,0-6,0, entre aproximadamente 4,5-5,5, entre aproximadamente 4,8-5,2 o de aproximadamente 5,0. En consecuencia, se puede preparar un tampón y/o la formulación final para que tenga un pH de aproximadamente 3,0 o inferior, aproximadamente 3,5, 4,0, 4,5, 4,8, 5,0, 5,2, 5,5, 6,0, 6,5 o aproximadamente 7,0 o superior. Todos los valores de pH por encima, por debajo y entre estos ejemplos de valores también se pueden usar en un tampón de ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico y/o la formulación final. Por lo tanto, por ejemplo, se puede preparar un componente tampón y/o la formulación final de la presente divulgación para que tenga un pH inferior a 3,5, superior a 6,5 y todos los valores dentro de estos intervalos. Los expertos en la técnica comprenderán que gran parte de la fuerza de la capacidad tamponadora de un tampón disminuirá más allá de aproximadamente 1 unidad de pH de su pK^a y, dadas las enseñanzas y la orientación proporcionadas en el presente documento, pueden determinar si la inclusión de un tampón de ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico por debajo de un pH de aproximadamente 3,5 o por encima de un pH de aproximadamente 6,5 es útil en una formulación de la presente divulgación.

Los intervalos de pH útiles de una formulación de la invención incluyen valores de pH ácidos. Las formulaciones que tienen valores de pH ácidos confieren características útiles a la formulación tales como mayor estabilidad del polipéptido incluido y reducción de la precipitación del polipéptido en presencia de cationes divalentes tal como se describe y se ejemplifica anteriormente y posteriormente. Los ejemplos de valores de pH ácidos incluyen formulaciones que tienen un pH inferior a 6,0. Dichas formulaciones que tienen pH ácidos también incluyen, por ejemplo, un pH de 5,9 o inferior, 5,8 o inferior, 5,7 o inferior, 5,5 o inferior, 5,4 o inferior, 5,3 o inferior, 5,2 o inferior, 5,1 o inferior, 5,0 o inferior, 4,9 o inferior, 4,8 o inferior, 4,7 o inferior, 4,6 o inferior, 4,5 o inferior, 4,4 o inferior, 4,3 o inferior, 4,2 o inferior, 4,1 o inferior o de 4,0. Dadas las enseñanzas y la orientación proporcionadas en el presente documento, los expertos en la técnica comprenderán que se puede seleccionar un componente tampón apropiado en función, por ejemplo, de su pK^a para mantener una formulación de la presente divulgación en cualquiera de los valores de pH ejemplificados anteriormente u otro pH deseado para la formulación.

Un componente tampón de una formulación de la invención puede incluir uno o más excipientes. Tal como se ha descrito anteriormente, una función de un excipiente incluido es proporcionar estabilización del polipéptido contra tensiones que puede tener lugar durante la fabricación, el transporte y el almacenamiento. Para cumplir este papel, al menos un excipiente puede actuar como tampón, estabilizante, agente de tonicidad, agente de carga, tensioactivo, crioprotector, lioprotector, antioxidante, fuente de iones metálicos, agente quelante y/o conservante. Además, al menos un excipiente también puede actuar como diluyente y/o vehículo o emplearse para reducir la viscosidad en formulaciones de alta concentración para permitir su administración y/o mejorar la comodidad del paciente.

Asimismo, al menos un excipiente adicionalmente puede conferir más de una de las funciones anteriores a una formulación de la invención. Alternativamente, se pueden incluir dos o más excipientes en una formulación de la invención para realizar más de una de las funciones anteriores u otras. Por ejemplo, se puede incluir un excipiente como componente en una formulación de la invención para cambiar, ajustar u optimizar la osmolaridad de la formulación, actuando así como un tonificante. De forma similar, se pueden incluir un agente de tonicidad y un tensioactivo en una formulación de la invención para ajustar la osmolalidad y controlar la agregación. Los excipientes, su uso, formulación y características son bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar descritos, por ejemplo, en Wang W., Int. J. Pharm. 185:129-88 (1999) y Wang W., Int. J. Pharm. 203: 1 -60 (2000).

En general, los excipientes se pueden elegir sobre la base de los mecanismos por los que estabilizan las proteínas frente a diversas tensiones químicas y físicas. Tal como se describe en el presente documento, es beneficioso incluir determinados excipientes para aliviar los efectos de una tensión específica o para regular una susceptibilidad particular de un polipéptido específico. Es beneficioso incluir otros excipientes porque tienen efectos más generales sobre las estabilidades físicas y covalentes de las proteínas. Los excipientes particularmente útiles incluyen aquellos químicamente y funcionalmente inocuos o compatibles con soluciones tampón acuosas y polipéptidos para optimizar las propiedades de estabilidad de una formulación. Varios de dichos excipientes se describen en el presente documento como ejemplos de excipientes que muestran compatibilidad química con las formulaciones acuosas de la invención y compatibilidad funcional con el polipéptido incluido en dichas formulaciones. Los expertos en la técnica comprenderán que las enseñanzas y la orientación proporcionadas en el presente documento con respecto a los excipientes ejemplificados pueden aplicarse igualmente al uso de una amplia gama de otros excipientes bien conocidos en la técnica.

Por ejemplo, los excipientes óptimos elegidos para potenciar o conferir estabilidad a un polipéptido dentro de una formulación incluyen aquellos que son sustancialmente libres de reaccionar con grupos funcionales en el polipéptido. A este respecto, tanto los azúcares reductores como los no reductores pueden usarse como excipiente en una formulación de la invención. No obstante, debido a que los azúcares reductores contienen un grupo hemiacetal, pueden reaccionar y formar aductos u otras modificaciones con grupos amino en las cadenas laterales de aminoácidos de los polipéptidos (es decir, glicosilación). De forma similar, excipientes tales como citrato, succinato o histidina también pueden formar aductos con cadenas laterales de aminoácidos. Dadas las enseñanzas y la orientación proporcionadas en el presente documento, los expertos en la técnica sabrán que se puede lograr una mayor conservación de la estabilidad para un polipéptido dado eligiendo un azúcar no reductor con respecto a un azúcar reductor o con respecto a otros excipientes reactivos con aminoácidos tales como los ejemplificados anteriormente.

Los excipientes óptimos también se eligen para mejorar o proporcionar estabilización con referencia al modo de administración para una formulación acuosa de la invención. Por ejemplo, las vías parenterales de administración intravenosa (IV), subcutánea (SC) o intramuscular (IM) pueden ser más seguras y eficaces cuando todos los componentes de la formulación mantienen la estabilidad física y química durante la fabricación, el almacenamiento y la administración. Los expertos en la técnica sabrán emplear uno o más excipientes que mantengan la máxima estabilidad de la forma activa de un polipéptido dado, por ejemplo, una condición particular de fabricación o almacenamiento o un modo particular de administración. Los excipientes ejemplificados en el presente documento para su uso en una formulación muestran estas y otras características.

La cantidad o la concentración de excipiente que se va a usar en una formulación de la invención variará dependiendo, por ejemplo, de la cantidad de polipéptido incluido en la formulación, la cantidad de otros excipientes incluidos en la formulación deseada, si se desea o se necesita un diluyente, la cantidad o volumen de otros componentes de la formulación, la cantidad total de componentes dentro de una formulación, la actividad específica del polipéptido y la tonicidad u osmolalidad que se desean lograr. Ejemplos específicos para las concentraciones de excipientes se ejemplifican más adelante. Además, se pueden combinar diferentes tipos de excipientes en una sola formulación. En consecuencia, una formulación de la invención puede contener un solo excipiente, dos, tres o cuatro o más tipos diferentes de excipientes. Las combinaciones de excipientes pueden ser particularmente útiles junto con una formulación que contiene dos o más polipéptidos diferentes. Los excipientes pueden mostrar propiedades químicas similares o diferentes.

Dadas las enseñanzas y la orientación proporcionadas en el presente documento, los expertos en la técnica sabrán qué cantidad o intervalo de excipiente se puede incluir en cualquier formulación particular para lograr una formulación de la invención que promueva la conservación de la estabilidad del polipéptido. Por ejemplo, la cantidad y el tipo de una sal que se incluirá en una formulación de la invención se puede seleccionar en función de la osmolalidad deseada (es decir, isotónica, hipotónica o hipertónica) de la solución final, así como las cantidades y la osmolalidad de otros componentes que se van a incluir en la formulación. De forma similar, por ejemplificación con referencia al tipo de poliol o azúcar incluido en una formulación, la cantidad de dicho excipiente dependerá de su osmolalidad. La inclusión de aproximadamente el 5% de sorbitol puede lograr isotonicidad mientras que se necesita aproximadamente el 9% de un excipiente de sacarosa para lograr isotonicidad. La selección de la cantidad o intervalo de concentraciones de uno o más excipientes que pueden incluirse dentro de una formulación de la invención se ha ejemplificado anteriormente con referencia a sales, polioles y azúcares. No obstante, los expertos en la técnica comprenderán que las consideraciones descritas en el presente documento y ejemplificadas adicionalmente con referencia a excipientes específicos pueden aplicarse igualmente a todos los tipos y combinaciones de excipientes, incluidos, por ejemplo, sales, aminoácidos, otros agentes de tonicidad, tensioactivos, estabilizantes, agentes de carga, crioprotectores, lioprotectores, antioxidantes, iones metálicos, agentes quelantes y/o conservantes.

Los excipientes se pueden incluir en una formulación de la invención en intervalos de concentración generalmente de entre aproximadamente el 1-40% (p/v), entre aproximadamente el 5-35% (p/v), entre aproximadamente el 10-30% (p/v), entre aproximadamente el 15-25% (p/v) o aproximadamente el 20% (p/v). En las formulaciones de la invención también pueden emplearse concentraciones tan altas como aproximadamente el 45% (p/v), el 50% (p/v) o más del 50% (p/v) en determinados casos. Por ejemplo, en algunos casos, puede ser deseable incluir concentraciones de hasta el 60% (p/v) o el 75% (p/v) para producir una formulación hipertónica de la invención. Dichas soluciones hipertónicas se pueden diluir para producir una formulación isotónica antes de su uso si se desea. Otros intervalos de concentración útiles incluyen entre aproximadamente el 1 -20%, particularmente entre aproximadamente el 2-18% (p/v), más particularmente entre aproximadamente el 4-16% (p/v), incluso más particularmente entre aproximadamente el 6-14% (p/v) o entre aproximadamente el 8-12% (p/v) o aproximadamente el 10% (p/v). También se pueden utilizar en una formulación de la invención concentraciones y/o cantidades de excipientes inferiores, superiores o comprendidas entre estos intervalos. Por ejemplo, se pueden incluir uno o más excipientes en una formulación que constituyen menos de aproximadamente el 1% (p/v). De forma similar, una formulación puede contener una concentración de uno o más excipientes superior a aproximadamente el 40% (p/v). En consecuencia, se puede producir una formulación de la invención que contenga esencialmente cualquier concentración o cantidad deseada de uno o más excipientes que incluyen, por ejemplo, el 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20% (p/v) o más. Más adelante se proporciona un ejemplo de una formulación de un polipéptido que tiene aproximadamente el 10,0% de excipiente.

Anteriormente se han descrito varios excipientes útiles en una formulación de la invención. En las formulaciones específicas descritas en el ejemplo, los excipientes ejemplificados incluyen glicerol, sacarosa, trehalosa y/o sorbitol, que se emplea como estabilizante. Otro excipiente ejemplificado en las formulaciones descritas en el ejemplo es el polisorbato 80, que se emplea en formulaciones líquidas en comparación con las formulaciones a granel para almacenamiento. Otros excipientes útiles en una formulación líquida o liofilizada de la invención incluyen, por ejemplo, fucosa, celobiosa, maltotriosa, melibiosa, octulosa, ribosa, xilitol, arginina, histidina, glicina, alanina, metionina, ácido glutámico, lisina, imidazol, glicilglicina, manosilglicerato, Triton X-100, Pluoronic F-127, celulosa, ciclodextrina, dextrano (10, 40 y/o 70 kD), polidextrosa, maltodextrina, ficol, gelatina, hidroxipropilmet, fosfato de sodio, fosfato de potasio, ZnCl2, zinc, óxido de zinc, citrato de sodio, citrato trisódico, trometamina, cobre, fibronectina, heparina, albúmina de suero humano, protamina, glicerina, glicerol, EDTA, metacresol, alcohol bencílico y fenol. Los excipientes como estos, así como otros conocidos en la técnica, se pueden encontrar descritos, por ejemplo, en Wang W., anteriormente, (1999) y Wang W., anteriormente, (2000).

Un componente tampón de una formulación de la invención también puede incluir uno o más tensioactivos como excipiente. Tal como se ha descrito anteriormente, una función de los tensioactivos en una formulación de la invención es prevenir o minimizar la agregación y/o la adsorción tal como la degradación inducida por superficie. A concentraciones suficientes, generalmente aproximadamente a la concentración micelar crítica del tensioactivo, una capa superficial de moléculas de tensioactivo sirve para evitar que las moléculas de proteína se adsorban en la interfase. De este modo se minimiza la degradación inducida por superficie. Los tensioactivos, su uso, formulación y características para formulaciones son bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar descritos, por ejemplo, en Randolph y Jones, anteriormente, (2002).

Los tensioactivos óptimos para incluir en una formulación de la invención se pueden elegir, por ejemplo, para mejorar o promover la conservación de la estabilidad del polipéptido mediante la prevención o la reducción de la agregación y/o la adsorción. Por ejemplo, los ésteres de ácidos grasos de sorbitán tales como los polisorbatos son tensioactivos que muestran una amplia gama de características hidrófilas y emulsionantes. Se pueden usar individualmente o en combinación con otros tensioactivos para cubrir una amplia gama de necesidades de estabilización. Dichas características son particularmente adecuadas para su uso con polipéptidos ya que pueden adaptarse para cubrir la amplia gama de características hidrófobas e hidrófilas de los polipéptidos. Las consideraciones para seleccionar un tensioactivo incluyen las descritas anteriormente con referencia a los excipientes en general, así como el carácter hidrófobo y la concentración micelar crítica del tensioactivo. Los tensioactivos ejemplificados en el presente documento, así como muchos otros bien conocidos en la técnica, pueden usarse en una formulación de la invención.

Los intervalos de concentración de tensioactivo para una formulación de la invención incluyen los descritos anteriormente con referencia a los excipientes en general, siendo las concentraciones particularmente útiles inferiores a aproximadamente el 1% (p/v). A este respecto, las concentraciones de tensioactivo generalmente se pueden utilizar en intervalos de entre aproximadamente el 0,001 -0,10% (p/v), particularmente entre aproximadamente el 0,002-0,05% (p/v), más particularmente entre aproximadamente el 0,003-0,01% (p/v) , incluso más particularmente entre aproximadamente el 0,004-0,008% (p/v) o entre aproximadamente el 0,005-0,006% (p/v). Las concentraciones y/o cantidades de tensioactivo inferiores, superiores o comprendidas entre estos intervalos también se pueden utilizar en una formulación de la invención. Por ejemplo, se pueden incluir uno o más tensioactivos en una formulación que constituyan menos de aproximadamente el 0,001% (p/v). De forma similar, una formulación puede contener una concentración de uno o más tensioactivos superior a aproximadamente el 0,10% (p/v). En consecuencia, se puede producir una formulación de la invención que contenga esencialmente cualquier concentración o cantidad deseada de uno o más tensioactivos, incluidos, por ejemplo, el 0,001,0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008, 0,009, 0,010, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09 o 0,10% (p/v) o más.

Anteriormente se han descrito varios tensioactivos útiles como excipiente en una formulación de la invención. Otros tensioactivos útiles en una formulación líquida o liofilizada de la invención incluyen, por ejemplo, ésteres de azúcar tales como ésteres de ácido láurico (C12), ácido palmítico (C16), ácido esteárico (C18), macrogol cetoestearil éteres, macrogol lauril éteres, macrogol oleil éter, oleato de macrogol, estearato de macrogol, ricinoleato de macrogol glicerol, hidroxiestearato de macrogol glicerol; poliglucósidos de alquilo tales como glucósido de octilo y maltósido de decilo; alcoholes grasos tales como alcohol cetílico y alcohol oleílico, y cocamidas tales como cocamida MEA, DEA, TEA, otros tensioactivos no iónicos y otros tensioactivos iónicos.

Por lo tanto, la presente divulgación proporciona una formulación que incluye una solución acuosa que tiene entre aproximadamente 1-100 mM de ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico con un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,0, un poliol o azúcar a entre aproximadamente el 1-20%, polisorbato 80 a entre aproximadamente el 0,001-0,010% y una cantidad eficaz de un anticuerpo terapéutico. La formulación de la divulgación también puede incluir uno o más cationes divalentes a una concentración entre 5-200 mM y/o un pH inferior a 6,0. La formulación de la invención también puede incluir aproximadamente 10 mM de ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico que tiene un pH de aproximadamente 5,0, aproximadamente el 2,6% de glicerol y aproximadamente el 0,004% de polisorbato 80. Varios otros componentes de la formulación, combinaciones de componentes y concentraciones de los mismos también puede incluirse en una formulación de la invención.

Además se proporciona una formulación que tiene un polipéptido terapéutico como componente polipeptídico de la formulación. La formulación puede incluir uno o más cationes divalentes a una concentración de entre 5-200 mM y/o un pH inferior a 6,0. El polipéptido terapéutico incluye un anticuerpo, un fragmento funcional de un anticuerpo, un pepticuerpo, una hormona, un factor de crecimiento o una molécula de señalización celular. En una forma de realización específica, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En otra forma de realización específica, el anticuerpo es específico para EGFR. En otra forma de realización específica más, el anticuerpo es panitumumab.

También se incluye dentro de una formulación de la presente divulgación una amplia diversidad de moléculas terapéuticas. Una molécula terapéutica de la presente divulgación incluye, por ejemplo, una macromolécula o biopolímero tal como un polipéptido, ácido nucleico, lípido, carbohidrato empleado como principio activo farmacéutico o elemento constitutivo del mismo, que puede usarse en el diagnóstico, el tratamiento o la prevención de un estado patológico o como componente de un medicamento. Por ejemplo, las formulaciones de la presente divulgación pueden aplicarse a, y facilitan la conservación de la estabilidad de, polipéptidos, glicopolipéptidos, peptidoglicanos, ADN tal como ADN genómico, ADNc y similares, ARN tal como ARNm, ARNi, SNRPS y similares, carbohidratos contemplados como principio activo farmacéutico que puede incluir monosacáridos, polisacáridos, azúcares enlazados a N, azúcares enlazados a O, leptinas y similares, lípidos tales como fosfolípidos, glicolípidos, ácidos grasos, poliaminas, isoprenoides, aminoácidos, nucleótidos, neurotransmisores y cofactores, así como muchas otras macromoléculas, biopolímeros y elementos constitutivos de los mismos, endógenos a los sistemas fisiológicos de los mamíferos, incluidos los seres humanos. Estos y otros productos biofarmacéuticos son bien conocidos por los expertos en la técnica y pueden incluirse en una formulación de la presente divulgación para su uso en el diagnóstico, el tratamiento o la prevención de un estado patológico o como componente de un medicamento.

Dadas las enseñanzas y la orientación proporcionadas en el presente documento, los expertos en la técnica entenderán que la presente divulgación de una formulación pueden aplicarse igualmente a todos los tipos de moléculas terapéuticas, incluidas las ejemplificadas anteriormente, así como otras bien conocidas en la técnica. Dadas las enseñanzas y la orientación proporcionadas en el presente documento, los expertos en la técnica también comprenderán que la selección de, por ejemplo, tipo(s) y/o cantidad(es) de uno o más excipientes, tensioactivos y/o componentes opcionales puede realizarse basándose en la compatibilidad química y funcional con la molécula terapéutica que se va a formular y/o el modo de administración, así como otros factores químicos, funcionales, fisiológicos y/o médicos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, tal como se ha descrito anteriormente, los azúcares no reductores muestran propiedades de excipiente favorables cuando se usan con agentes terapéuticos polipeptídicos en comparación con los azúcares reductores. En consecuencia, las formulaciones de la presente divulgación se ejemplifican más adelante con referencia a agentes terapéuticos polipeptídicos. No obstante, el intervalo de aplicabilidad, las propiedades químicas y físicas, las consideraciones y la metodología aplicadas a los agentes terapéuticos polipeptídicos pueden aplicarse igualmente a moléculas terapéuticas distintas de los agentes terapéuticos polipeptídicos.

Los ejemplos de tipos de polipéptidos que pueden utilizarse en una formulación de la presente divulgación incluyen todos los tipos de polipéptidos terapéuticos que incluyen, por ejemplo, la superfamilia de polipéptidos de inmunoglobulina, factores de crecimiento, citocinas, moléculas de señalización celular y hormonas. Los ejemplos de polipéptidos que pueden utilizarse en una formulación de la presente divulgación incluyen todos los polipéptidos terapéuticos, incluidos, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos, interleucinas, G-CSF, GM-CSF, quinasas, ligandos de TNF y TNFR que incluyen Fhm, ciclinas, eritropoyetina, factores de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento nervioso regulado por el desarrollo VGF, factores neurotróficos, factor neurotrófico NNT-1, receptor Eph, ligandos del receptor Eph; receptor similar a Eph, ligandos del receptor similar a Eph, inhibidores de proteínas de apoptosis (IAP), proteína específica de Thy-1, ligando de Hek (hek-L), receptor Elk y ligandos de receptores Elk, STAT, inhibidor de colagenasa, osteoprotegerina (OPG), APRIL/G70, a Gp -3/BLYS, Bc Ma , TACI, Her-2/neu, polipéptidos de apolipoproteína, integrinas, inhibidor tisular de metaloproteinasas, receptor del complemento C3b/C4b, proteína de unión a SHC, polipéptidos DKR, polipéptidos de la matriz extracelular, anticuerpos contra los polipéptidos terapéuticos anteriores y fragmentos funcionales de anticuerpo de los mismos, anticuerpos contra receptores para los polipéptidos terapéuticos anteriores y fragmentos funcionales de anticuerpo de los mismos, fragmentos polipeptídicos funcionales de los mismos, polipéptidos de fusión, polipéptidos quiméricos y similares.

Los ejemplos específicos de productos farmacéuticos disponibles en el mercado que pueden utilizarse en una formulación de la presente divulgación incluyen, por ejemplo, ENBREL (Etanercept; una proteína de fusión dimérica expresada en CHO ((Amgen, Inc.)); EPOGEⁿ (Epoetin alfa; una glicoproteína expresada en células de mamífero) (Amgen, Inc.)); INFERGEN® (Interferón alfacón-1; una proteína recombinante expresada en E. coli (Amgen, Inc.)); KINERET® (anakinra; una forma no glicosilada recombinante expresada en E. coli del antagonista del receptor de la interleucina-1 humana (IL-I Ra) (Amgen, Inc.)); ARANESP (darbepoyetina alfa; una proteína estimulante de la eritropoyesis humana recombinante expresada en CHO (Amgen, Inc.)); NEULASTA (pegfilgrastim; conjugado covalente de metionilo humano recombinante G-CSF y PEG de 20 kD (Amgen, Inc.)); NEUPOGEN (filgrastim; un factor estimulante de colonias de granulocitos humano (G-CSF) expresado en E. coli (Amgen, Inc.)), y STEMGEN (Ancestim, factor de células madre; una proteína humana recombinante expresada en E. coli (Amgen, Inc.)). Estos y todos los demás productos farmacéuticos disponibles comercialmente pueden reformularse, por ejemplo, en una formulación de la presente divulgación en el momento de la producción, antes de su uso y/o antes de su almacenamiento a corto o largo plazo.

Los ejemplos específicos de anticuerpos, en particular anticuerpos específicos para EGFR que pueden utilizarse como un anticuerpo terapéutico en una formulación de la presente divulgación incluyen, por ejemplo, cetuximab (ErbituxTm; Imclone Systems, Ciudad de Nueva York); IMC-11F8 (Sistemas Imclone); Humax-EGFR (Genmab, Copenhague, Dinamarca); matuzumab (EMD-7200; Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) y nimotuzumab (TheraCIM hR3; YM Biosciences, Mississauga, Ontario, Canadá). Todos los anticuerpos anteriores son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el panitumumab está disponible comercialmente de Amgen y es el objeto del anticuerpo anti-EGFR humano descrito en la patente de Estados Unidos N° 6.235.883. IMC-11F8 es objeto de la patente de Estados Unidos N° 7,060,808 y Humax-EGFR es objeto de las publicaciones de patente de Estados Unidos 20030091561 y 20030194403.

Como ilustración adicional del intervalo de aplicabilidad de la molécula terapéutica de una formulación de la presente divulgación, la presente divulgación descrita más adelante son ejemplos de tipos de anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos que pueden emplearse como un polipéptido terapéutico en una formulación de la presente divulgación. Tal como se ha descrito anteriormente, las propiedades químicas y físicas, las consideraciones de formulación y la metodología que pueden aplicarse a los anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos, pueden aplicarse igualmente a productos biofarmacéuticos, incluidos otros productos biofarmacéuticos polipeptídicos.

Los anticuerpos monoclonales específicos de la diana para su uso como un polipéptido de la presente divulgación o fragmentos funcionales de los mismos, se pueden producir en cualquiera de las diversas formas de anticuerpos y/o se pueden alterar o modificar en cualquiera de las diversas formas descritas anteriormente mientras se mantiene su actividad de unión a diana específica. Cualquiera de dichas formas de anticuerpos, alteraciones o modificaciones, incluidas sus combinaciones, de un anticuerpo monoclonal específico de la diana, o fragmento funcional del mismo, se incluye dentro de la presente divulgación como un polipéptido. Cualquiera de dichas diversas formas de anticuerpos, alteraciones o modificaciones de un anticuerpo monoclonal específico de la diana para su uso como un polipéptido de la presente divulgación o un fragmento funcional del mismo puede usarse de forma similar en la presente divulgación, los procedimientos, composiciones y/o artículos de fabricación de la presente divulgación, tal como se describen en el presente documento. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales específicos de la diana o fragmentos funcionales de los mismos incluyen Fd, Fv, Fab, F(ab)2, scFv y anticuerpos monoclonales de pepticuerpo injertados específicos de la diana, humanizados, así como todas las demás formas, alteraciones y/o modificaciones descritas anteriormente, incluyendo otras formas bien conocidas por los expertos en la técnica.

Los procedimientos para producir hibridomas y seleccionar anticuerpos monoclonales específicos de la diana usando tecnología de hibridomas son rutinarios y bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los ratones pueden inmunizarse con una molécula diana tal como un polipéptido y una vez que se detecta una respuesta inmunitaria, por ejemplo, se detectan anticuerpos específicos para la molécula diana en el suero del ratón, se recoge el bazo del ratón y se aíslan los esplenocitos. A continuación, los esplenocitos se fusionan mediante procedimientos bien conocidos con cualquier célula de mieloma adecuada, por ejemplo, células de la línea celular SP20 disponible en la ATCC. Los hibridomas se seleccionan y se clonan mediante dilución limitada. A continuación, los clones de hibridoma se analizan mediante procedimientos conocidos en la técnica para detectar células que secretan anticuerpos capaces de unirse a una molécula diana. El líquido de ascitis, que generalmente contiene altos niveles de anticuerpos, puede generarse inmunizando ratones con clones de hibridoma positivos.

Además, la expresión recombinante en huéspedes procarióticos o eucarióticos puede usarse para generar anticuerpos monoclonales específicos de la diana. La expresión recombinante se puede utilizar para producir una sola especie de anticuerpo monoclonal específico de la diana, o fragmentos funcionales de la misma.

Alternativamente, la expresión recombinante se puede utilizar para producir diversas bibliotecas de cadenas pesadas y ligeras, o combinaciones de cadenas ligeras y pesadas variables, y después cribar un anticuerpo monoclonal, o un fragmento funcional del mismo, que muestre actividad de unión específica hacia la molécula diana. Por ejemplo, las cadenas pesadas y ligeras, los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras, o fragmentos funcionales de los mismos, pueden coexpresarse a partir de ácidos nucleicos que codifican anticuerpos monoclonales específicos de la diana utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica para producir especies de anticuerpos monoclonales específicos. Las bibliotecas se pueden producir utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica a partir de poblaciones coexpresadas de ácidos nucleicos que codifican cadenas pesadas y ligeras, dominios variables de cadenas pesadas y ligeras, o fragmentos funcionales de los mismos, y cribarse mediante unión por afinidad a la molécula diana para la identificación de anticuerpos monoclonales específicos de la diana. Dichos procedimientos se pueden encontrar descritos en, por ejemplo, Antibody Engineering: A Practical Guíele, C.A.K. Borrebaeck, Ed., anteriormente; Huse et al., Science 246:1275-81 (1989); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-82 (1991); Kang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363-66 (1991); Plückthun y Skerra, anteriormente; Felici et al., J. Mol. Biol.

222:301-310 (1991); Lerner et al., Science 258:1313-14 (1992), y en la patente de Estados Unidos N° 5.427.908.

La clonación de ácidos nucleicos codificantes se puede lograr usando procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica. De forma similar, la clonación de repertorios de cadenas ligeras y/o pesadas de ácidos nucleicos codificantes, incluyendo ácidos nucleicos que codifican Vh y/o Vl también puede realizarse mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica. Dichos procedimientos incluyen, por ejemplo, clonación de expresión, cribado de hibridación con una sonda complementaria, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando un par de cebadores complementarios o reacción en cadena de la ligasa (LCR) usando un cebador complementario, PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) y similares. Dichos procedimientos se pueden encontrar descritos en, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (2001) y Ansubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999).

Los ácidos nucleicos codificantes también se pueden obtener de cualquiera de varias bases de datos públicas, incluidas las bases de datos de genoma completo, tales como las operadas por el The National Center for Biotechnology Information (NCBI) de los National Institutes of Health (NIH). Un procedimiento particularmente útil para aislar un solo ácido nucleico codificante o un repertorio de ácidos nucleicos codificantes para cadenas pesadas y/o ligeras, o fragmentos funcionales de los mismos, se puede lograr sin un conocimiento específico de la porción de la región codificante ya que los cebadores están disponibles o se pueden diseñar fácilmente utilizando porciones conservadas de porciones de región constante o variable de anticuerpo.

Por ejemplo, se puede clonar un repertorio de ácidos nucleicos codificantes utilizando una pluralidad de cebadores degenerados para dichas regiones junto con PCR. Dichos procedimientos son bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar descritos, por ejemplo, en Huse et al., anteriormente, y Antibody Engineering: A Practical Guide, C.A.K. Borrebaeck, Ed., anteriormente. Cualquiera de los procedimientos anteriores, así como otros conocidos en la técnica, incluidas sus combinaciones, pueden usarse para generar un anticuerpo monoclonal específico de la diana para su uso como un polipéptido de la invención.

Por lo tanto, la presente divulgación proporciona una formulación que tiene un anticuerpo, un fragmento funcional de un anticuerpo como polipéptido terapéutico. La formulación puede incluir uno o más cationes divalentes a una concentración de entre 5-200 mM y/o un pH inferior a 6,0. El polipéptido terapéutico puede incluir un anticuerpo monoclonal, Fd, Fv, Fab, F(ab'), F(ab)2, F(ab')2, Fv monocatenario (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpo o pepticuerpo.

Las concentraciones de panitumumab que se incluirán en una formulación de la invención variarán, por ejemplo, dependiendo de la actividad de panitumumab, la indicación que se va a tratar, el modo de administración, el régimen de tratamiento y si la formulación está destinada al almacenamiento a largo plazo en forma líquida o liofilizada. Los expertos en la técnica sabrán qué concentraciones utilizar dadas estas consideraciones bien conocidas y el estado de la técnica en las ciencias farmacéuticas. Por ejemplo, hay más de 80 polipéptidos aprobados para uso terapéutico en Estados Unidos para una amplia gama de indicaciones médicas, modos de administración y regímenes de tratamiento. Estos polipéptidos aprobados son ejemplos del intervalo de concentraciones de polipéptidos que se pueden usar en una formulación de panitumumab de la presente divulgación.

Generalmente, se incluirán en una formulación de la invención a una concentración de entre aproximadamente 1 -200 mg/ml, aproximadamente 10-200 mg/ml, aproximadamente 20-180 mg/ml, particularmente entre aproximadamente 30-160 mg/ml, más particularmente entre aproximadamente 40-120 mg/ml, incluso más particularmente entre aproximadamente 50-100 mg/ml de panitumumab o aproximadamente 60-80 mg/ml. Las concentraciones y/o cantidades de panitumumab inferiores, superiores o comprendidas entre estos intervalos también se pueden utilizar en una formulación de la invención. Por ejemplo, se pueden incluir uno o más polipéptidos en una formulación que constituyan menos de aproximadamente 1,0 mg/ml. De forma similar, una formulación puede contener una concentración de uno o más polipéptidos superior a aproximadamente 200 mg/ml, particularmente cuando se formula para almacenamiento. En consecuencia, se puede producir una formulación de la invención que contenga esencialmente cualquier concentración o cantidad deseada de panitumumab que incluya, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 mg/ml o más. En el ejemplo siguiente se ejemplifica una formulación para un polipéptido terapéutico que tiene una concentración de aproximadamente 10 mg/ml.

Una formulación de la presente divulgación también puede incluir combinaciones de polipéptidos en la formulación. Por ejemplo, una formulación de la presente divulgación puede incluir un solo polipéptido para el tratamiento de la presente divulgación de una o más afecciones. Una formulación también puede incluir dos o más polipéptidos diferentes. El uso de múltiples polipéptidos en una formulación de la presente divulgación puede estar dirigido, por ejemplo, a las mismas o diferentes indicaciones. De forma similar, los polipéptidos múltiples de la presente divulgación se pueden usar en una formulación de la presente divulgación para tratar, por ejemplo, tanto un estado patológico como uno o más efectos secundarios causados por el tratamiento primario. También pueden incluirse polipéptidos múltiples en una formulación de la presente divulgación para lograr diferentes propósitos médicos que incluyen, por ejemplo, el tratamiento y el control simultáneos de la progresión de un estado patológico. Múltiples terapias concurrentes tales como las ejemplificadas anteriormente, así como otras combinaciones bien conocidas en la técnica, son particularmente útiles para el cumplimiento del paciente, ya que una sola formulación puede ser suficiente para algunos o todos los tratamientos y/o diagnósticos sugeridos. Los expertos en la técnica conocerán los polipéptidos que se pueden mezclar para una amplia gama de politerapias. De forma similar, una formulación de la presente divulgación también se puede usar con productos farmacéuticos de molécula pequeña y combinaciones de uno o más polipéptidos junto con uno o más productos farmacéuticos de molécula pequeña. Por lo tanto, la presente divulgación proporciona una formulación de la invención que contiene 1,2, 3, 4, 5 o 6 o más polipéptidos diferentes, así como uno o más polipéptidos combinados con uno o más productos farmacéuticos de molécula pequeña.

Una formulación de la invención también puede incluir uno o más conservantes y/o aditivos bien conocidos en la técnica. De forma similar, una formulación de la invención se puede formular además en cualquiera de las diversas formulaciones de administración conocidas. Por ejemplo, una formulación de la invención puede incluir agentes lubricantes, agentes emulsionantes, agentes de suspensión, agentes conservantes tales como hidroxibenzoatos de metilo y propilo, agentes edulcorantes y agentes aromatizantes. Dichos componentes opcionales, sus características químicas y funcionales son bien conocidos en la técnica. De forma similar, son bien conocidas en la técnica formulaciones que facilitan la liberación rápida, mantenida o retardada del polipéptido después de la administración. Se puede producir una formulación de la invención de modo que incluya estos u otros componentes de formulación bien conocidos en la técnica.

Una formulación de la invención también se puede producir, por ejemplo, en estados distintos al líquido acuoso de la presente divulgación. Por ejemplo, las formulaciones que incluyen, por ejemplo, formulaciones que contienen uno o más cationes divalentes a una concentración de entre 5-200 mM y/o un pH inferior a 6,0, pueden prepararse, por ejemplo, como una formulación liofilizada. Una formulación liofilizada generalmente contendrá, por ejemplo, un agente de carga o apelmazamiento y un estabilizante amorfo.

Una vez preparada una formulación de la invención tal como se describe en el presente documento, la estabilidad del panitumumab contenido en la formulación se puede evaluar utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica. Varios de dichos procedimientos se ejemplifican más adelante en los ejemplos e incluyen cromatografía de exclusión por tamaño y recuento de partículas. Cualquiera de una diversidad de ensayos funcionales que incluyen, por ejemplo, actividad de unión, otra actividad bioquímica y/o actividad fisiológica, pueden evaluarse en dos o más puntos temporales diferentes para determinar la estabilidad del polipéptido en la formulación tamponada de la invención.

En general, una formulación de la invención se preparará de acuerdo con normas farmacéuticas y utilizando reactivos de grado farmacéutico. De forma similar, una formulación de la invención, en general, se preparará utilizando reactivos estériles en un entorno de fabricación estéril o se esterilizará después de la preparación. Se pueden preparar soluciones inyectables estériles usando procedimientos bien conocidos en la técnica que incluyen, por ejemplo, la incorporación de panitumumab en la cantidad requerida en un tampón o excipiente de ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico de la invención con uno o una combinación de los componentes de la formulación descritos en el presente documento seguida de microfiltración de esterilización. En la forma de realización específica de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación particularmente útiles incluyen, por ejemplo, secado al vacío y secado por congelación (liofilización) tal como se ha descrito anteriormente. Dichos procedimientos de secado producirán un polvo de panitumumab junto con cualquier componente adicional deseado a partir de una solución previamente filtrada de forma estéril del mismo.

Los regímenes de administración y dosificación se pueden ajustar para proporcionar una cantidad eficaz para una respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o se puede reducir o aumentar la dosis proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Puede ser particularmente útil formular una formulación de la invención para inyección intravenosa, parenteral o subcutánea en una forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación al administrar una cantidad eficaz de panitumumab La dosificación unitaria se refiere a una cantidad físicamente discreta de producto farmacéutico adecuado como dosis unitarias para los sujetos que van a tratarse con panitumumab; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de polipéptido activo calculada para producir un efecto terapéutico deseado.

Por ejemplificación adicional, se puede administrar una cantidad eficaz de panitumumab, por ejemplo, más de una vez, a intervalos programados durante un periodo de tiempo. En determinadas formas de realización, el panitumumab se administra durante un periodo de al menos un mes o más que incluye, por ejemplo, uno, dos o tres meses o más. Para el tratamiento de afecciones crónicas, el tratamiento mantenido a largo plazo es generalmente más eficaz. Periodos de administración más cortos pueden ser suficientes cuando se tratan afecciones agudas que incluyen, por ejemplo, de una a seis semanas. En general, el panitumumab se administra hasta que el paciente manifiesta un grado de mejora médicamente relevante con respecto al valor inicial para el indicador o indicadores elegidos.

Según el polipéptido seleccionado y la indicación que se va a tratar, una cantidad terapéuticamente eficaz es suficiente para provocar una reducción de al menos un síntoma del estado patológico diana en al menos el 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% o 60% o más, con respecto a sujetos no tratados. La capacidad de una formulación para reducir o inhibir un síntoma puede evaluarse, por ejemplo, en un sistema de modelo animal predictivo de eficacia para la afección diana en seres humanos. Alternativamente, la capacidad de una formulación para reducir o inhibir un síntoma puede evaluarse, por ejemplo, examinando una función in vitro o la actividad de la formulación indicativa de actividad terapéutica in vivo.

Los niveles de dosificación reales de panitumumab en una formulación de la invención se pueden variar para obtener una cantidad de panitumumab activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, formulación y modo de administración en particular, sin ser tóxico para el paciente. Un experto en la técnica podría determinar las cantidades administradas basándose en factores tales como el tamaño del sujeto, la gravedad de los síntomas del sujeto y el polipéptido seleccionado y/o la vía de administración. El nivel de dosificación seleccionado puede depender, por ejemplo, de una diversidad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de panitumumab empleada, la vía de administración, el momento de la administración, la tasa de excreción, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, la afección, la salud general y los antecedentes médicos previos del paciente que se está tratando, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Algunas formas de realización particulares de la presente invención implican la administración de panitumumab en una formulación de la invención a una dosis de aproximadamente 1 ng de anticuerpo por kg de peso del sujeto por día (1 ng/kg/día) a aproximadamente 10 mg/kg/día, más particularmente de aproximadamente 500 ng/kg/día a aproximadamente 5 mg/kg/día, e incluso más particularmente de aproximadamente 5 gg/kg/día a aproximadamente 2 mg/kg/día, para un sujeto.

Un médico o veterinario experto en la técnica puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz de la formulación farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario puede iniciar dosis de una formulación de la invención a niveles más bajos que los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta lograr el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de una formulación de la invención será aquella cantidad del polipéptido que sea la dosis más baja eficaz para producir un efecto terapéutico. Dicha cantidad eficaz dependerá generalmente de los factores descritos anteriormente. Es particularmente útil que la administración sea intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea. Si se desea, la dosis diaria eficaz para lograr una cantidad eficaz de una formulación se puede administrar como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas por separado a intervalos apropiados a lo largo del día, opcionalmente en cantidades de dosificación unitaria.

Una formulación de la invención se puede administrar, por ejemplo, con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una forma de realización particularmente útil, una formulación de la invención se puede administrar con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tales como los dispositivos descritos en las patentes de Estados Unidos N25.399.163, 5.383.851,5.312.335, 5.064.413, 4.941.880, 4.790.824 o 4.596.556. Los ejemplos de implantes y módulos bien conocidos útiles en la presente invención incluyen: la patente de Estados Unidos N° 4.487.603, que describe una microbomba de infusión implantable para dispensar medicación a un ritmo controlado; la patente de Estados Unidos N° 4.486.194, que describe un dispositivo terapéutico para la administración de medicamentos a través de la piel; la patente de Estados Unidos N° 4.447.233, que describe una bomba de infusión de medicamentos para administrar medicamentos a una velocidad de infusión precisa; la patente de Estados Unidos N° 4.447.224, que describe un aparato de infusión implantable de flujo variable para la administración continua de fármaco; la patente de Estados Unidos N° 4.439.196, que describe un sistema osmótico de administración de fármacos que tiene compartimentos de varias cámaras; y la patente de Estados Unidos N° 4.475.196, que describe un sistema osmótico de administración de fármacos. Los expertos en la técnica conocen muchos otros implantes, sistemas de administración y módulos de este tipo.

En determinadas formas de realización específicas, el panitumumab para su uso en una formulación de la invención puede formularse adicionalmente para facilitar la distribución selectiva in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrófilos. Para facilitar el cruce de la BBB si se desea, una formulación puede incluir adicionalmente, por ejemplo, liposomas para la encapsulación de uno o más polipéptidos. Para procedimientos de fabricación de liposomas, véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N° 4.522.811, 5.374.548 y 5.399.331. Los liposomas pueden contener además uno o más restos que se transportan selectivamente a células u órganos específicos, mejorando así la administración dirigida de un polipéptido seleccionado (véase, por ejemplo, V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Los ejemplos de restos de direccionamiento incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 5.416.016 de Low et al.); manósidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticuerpos (P. G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180) o receptor de la proteína A de tensioactivo (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134).

Por lo tanto, la invención proporciona adicionalmente el procedimiento reivindicado para preparar una formulación. El componente tampón puede incluir ácido acético, ácido glutámico, ácido succínico o ácido priopiónico, o un sal de los mismos. Uno o más de los componentes de la formulación descritos en el presente documento se pueden combinar con una o más cantidades eficaces de panitumumab para producir una amplia gama de formulaciones de la invención.

La presente divulgación proporciona además un procedimiento para estabilizar un polipéptido. El procedimiento incluye poner en contacto un polipéptido terapéutico con una concentración de catión divalente de entre aproximadamente 5­ 150 150 mM en un tampón que tiene un pH inferior a 6,0 y un excipiente que comprende un azúcar o poliol.

Se pueden añadir uno o más cationes divalentes, o una forma de sal de los mismos, a un polipéptido que contiene Asp o Asn para mantener o mejorar la estabilidad de ese polipéptido reduciendo la velocidad o el grado de isomerización y la formación de ácido isoaspártico. Los, uno o más, cationes divalentes, o una forma de sal de los mismos, útiles para estabilizar un polipéptido que contiene Asp o Asn incluyen cualquiera de los ejemplificados anteriormente, así como otros cationes divalentes conocidos en la técnica. De forma similar, al igual que con las formulaciones y el procedimiento para preparar una formulación de la invención, también se pueden incluir combinaciones de cationes divalentes para reducir la velocidad o el grado de isomerización de Asp o Asn. Por ejemplo, pueden usarse combinaciones de dos, tres o más de, por ejemplo, Ca+2, Zn+2, Mn+2 y/o Mg+2 para estabilizar un polipéptido que contiene Asp, que contiene Asn, que contiene Asp y Asn o que contiene cualquiera de los motivos o estructuras descritos anteriormente que hacen que un polipéptido sea susceptible a la formación de ácido isoaspártico. La inclusión de uno o más cationes divalentes a una concentración de entre aproximadamente 5-200 mM evitará o retrasará la isomerización de Asp o Asn. Otras concentraciones útiles de cationes divalentes incluyen las ejemplificadas anteriormente. De forma similar, se pueden emplear uno o más cationes divalentes en el procedimiento de estabilización de un polipéptido poniendo en contacto un polipéptido en una formulación que contiene cualquier combinación de los constituyentes, componentes o valores de pH descritos anteriormente o ejemplificados en el presente documento con uno o más cationes divalentes entre aproximadamente 5-200 mM.

Además, se divulga un recipiente que contiene una formulación que incluye una solución acuosa que tiene una concentración entre aproximadamente 1-10 mM de ácido acético, ácido glutámico, ácido succínico u otro tampón con un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 7,0, glicerol o sorbitol a entre aproximadamente el 1-10%, polisorbato 80 a entre aproximadamente el 0,001-0,010% y una cantidad eficaz de un anticuerpo terapéutico, que incluye, por ejemplo, un anticuerpo específico de EGFR o panitumumab. El recipiente también puede incluir una formulación que contenga los componentes anteriores y uno o más cationes divalentes a una concentración entre 5­ 200 mM y/o formularse con un pH inferior a 6,0. Brevemente, con respecto a las composiciones, kits y/o medicamentos, las cantidades eficaces combinadas de panitumumab dentro de una formulación de la invención pueden incluirse dentro de un único recipiente o medio de recipiente, o incluirse dentro de distintos recipientes o medios de recipiente. Los componentes de imágenes se pueden incluir opcionalmente y el envase también puede incluir instrucciones escritas o accesibles en Internet para usar la formulación. Un recipiente o medio de recipiente incluye, por ejemplo, un vial, una botella, una jeringa o cualquiera de una diversidad de formatos bien conocidos en la técnica para un envasado con multidispensador.

Ejemplo I

Caracterización de la estabilidad de polipéptidos en soluciones tamponadas

Este ejemplo describe la caracterización de varias formulaciones sobre la estabilidad de panitumumab. También se describe la caracterización de varias formulaciones sobre la estabilidad a largo plazo de preparaciones a granel de panitumumab.

A continuación se describen una diversidad de condiciones de formulación que estabilizan el anticuerpo monoclonal IgG2 panitumumab. Estas condiciones de formulación incluyen las que pueden aplicarse para la administración del polipéptido terapéutico así como para el almacenamiento, el mantenimiento y/o la preparación en lotes del polipéptido terapéutico. Las condiciones de formulación de la invención ejemplificadas a continuación confieren al panitumumab una estabilidad particularmente útil frente a la agregación, la degradación química y la formación de partículas. Se ha demostrado que estas condiciones son particularmente eficaces para prevenir la formación de partículas, lo que permite eliminar cualquier necesidad de un filtro en línea para la administración intravenosa.

Brevemente, se ha descubierto que el panitumumab es estable a un pH que varía de aproximadamente 5,0 a 7,0. Se observó estabilidad óptima a un pH de 5,0 con respecto a la agregación y la formación de partículas. Las formulaciones con un pH de 5,0 también fueron la solución líquida más clara (es decir, la más transparente), lo que indica menos agregación. Los sistemas tampón particularmente útiles incluían ácido acético, ácido L-glutámico y ácido succínico. Estos tres sistemas tampón funcionaron bien cerca de un pH de aproximadamente 5,0 (por ejemplo, de aproximadamente 4,8 a aproximadamente 5,2). Entre estos sistemas tampón, se observó que el ácido L-glutámico era igual de eficaz o mejor que el ácido acético para la estabilidad de panitumumab. Los excipientes particularmente útiles para el panitumumab incluyeron glicerol, sacarosa, trehalosa y sorbitol. Todos mostraron propiedades estabilizantes eficaces con respecto a la agregación y/o la formación de partículas. Los excipientes óptimos incluyeron glicerol y sacarosa.

Los resultados expuestos a continuación muestran una diversidad de formulaciones que mantienen, aumentan u optimizan la estabilidad del panitumumab. En determinadas formulaciones específicas, las formulaciones líquidas particularmente útiles para panitumumab incluían ácido acético 10 mM, glicerol al 2,6%, polisorbato 80 al 0,004% a pH 5,0 y ácido L-glutámico 10 mM, glicerol al 2,6%, polisorbato 80 al 0,004% a pH 5,0. En otras formulaciones específicas, formulaciones particularmente útiles a largo plazo para, por ejemplo, almacenamiento en congelación, mantenimiento y/o preparación de lotes tal como la preparación de sustancias a granel, se incluyeron ácido acético 10 mM, glicerol al 2,6% a pH 5,0 y ácido L-glutámico 10 mM, glicerol al 2,6% a pH 5,0 cuando la formulación de panitumumab se mantiene a -30°C o menos. Además, se descubrió que el glicerol, la sacarosa y la trehalosa eran excipientes particularmente útiles que protegían al panitumumab de la formación de partículas y la agregación inducida por congelación y descongelación.

Los estudios descritos en el presente documento se dirigieron a la caracterización y la selección de formulaciones que aumentan la conservación de la estabilidad de panitumumab. Sobre la base de un análisis preliminar, se eligieron tres sistemas tampón para caracterizar formulaciones líquidas y congeladas estables para el panitumumab. Estos sistemas tampón fueron ácido acético, ácido glutámico y ácido succínico. A continuación se ejemplifica la caracterización de formulaciones derivadas de estos sistemas tampón.

Una caracterización inicial fue la apariencia visual de panitumumab en varias formulaciones de tampón de ácido acético. Brevemente, las siete formulaciones enumeradas a continuación se evaluaron a diferentes valores de pH.

1. pH 5,0: 20 mg/ml de panitumumab, acetato 5 mM, fosfato 5 mM, sorbitol al 5%, pH 5,0

2. pH 5,5: 20 mg/ml de panitumumab, acetato 5 mM, fosfato 5 mM, sorbitol al 5%, pH 5,5

3. pH 6,0: 20 mg/ml de panitumumab, acetato 5 mM, fosfato 5 mM, sorbitol al 5%, pH 6,0

4. pH 6,5: 20 mg/ml de panitumumab, acetato 5 mM, fosfato 5 mM, sorbitol al 5%, pH 6,5

5. pH 7,0: 20 mg/ml de panitumumab, acetato 5 mM, fosfato 5 mM, sorbitol al 5%, pH 7,0

6. pH 7,5: 20 mg/ml de panitumumab, acetato 5 mM, fosfato 5 mM, sorbitol al 5%, pH 7,5

7. A58N : 20 mg/ml de panitumumab, acetato 50 mM, NaCl 100 mM, pH 5,8 (control)

Se evaluó la apariencia visual del panitumumab formulado a los valores de pH anteriores que varían de 5,0 a 7,5. Los resultados indicaron que la solución de proteína era más clara y transparente a valores de pH más bajos. En comparación, las formulaciones se volvieron más turbias a valores de pH más altos.

Se realizaron estudios de estabilidad acelerada para caracterizar la estabilidad de panitumumab en diferentes condiciones de pH. Brevemente, se realizaron estudios de estabilidad acelerada a un pH particular y a, por ejemplo, 37°C en viales de vidrio. Las muestras se dializaron en las formulaciones respectivas que se van a someter a ensayo y se filtraron de forma estéril en recipientes estériles. Se dispusieron cantidades de aproximadamente 2 ml de cada muestra formulada en viales de vidrio estériles de 3 ml en una campana estéril y se taparon. Las muestras designadas para congelación se dispusieron en tubos eppindorf de polipropileno estériles. Todos los viales se etiquetaron y se engarzaron, y a continuación se dispusieron en cajas especificadas para almacenamiento en condiciones de -802C, 2-82C y 37°C. Las muestras se retiraron y se analizaron en los puntos temporales designados. Se utilizó cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) como uno de los procedimientos analíticos. Se utilizó una columna doble TosoHaas G3000SWxl en tándem para llevar a cabo el análisis utilizando una fase móvil que consiste en fosfato 100 mM (pH 7), NaCl 150 mM.

Las diferentes formas de las muestras pudieron evaluarse cuantitativamente y separarse en función de su volumen hidrodinámico. Los ejemplos de resultados se ilustran en la figura 1 y muestran el porcentaje de monómero de panitumumab almacenado a 37°C durante un periodo de hasta 2 meses. Se observaron mayores pérdidas de monómero en condiciones de pH superiores. Las formulaciones ejemplificadas en la figura 1 en cada punto temporal fueron las mismas que las estudiadas anteriormente con respecto a la apariencia visual y están etiquetadas de la forma siguiente en la figura:

1. EGF_20pH 5.0: 20 mg/ml de panitumumab, acetato 5 mM, fosfato 5 mM, sorbitol al 5%, pH 5,0

2. EGF_20pH 5.5: 20 mg/ml de panitumumab, acetato 5 mM, fosfato 5 mM, sorbitol al 5%, pH 5,5

3. EGF_20pH 6.0: 20 mg/ml de panitumumab, acetato 5 mM, fosfato 5 mM, sorbitol al 5%, pH 6,0

4. EGF_20pH 6.5: 20 mg/ml de panitumumab, acetato 5 mM, fosfato 5 mM, sorbitol al 5%, pH 6,5

5. EGF_20pH 7.0: 20 mg/ml de panitumumab, acetato 5 mM, fosfato 5 mM, sorbitol al 5%, pH 7,0

6. EGF_20pH 7.5: 20 mg/ml de panitumumab, acetato 5 mM, fosfato 5 mM, sorbitol al 5%, pH 7,5

7. EGF_20pH A58N: 20 mg/ml de panitumumab, acetato 50 mM, NaCl 100 mM, pH 5,8 (control)

También se determinaron los cambios en la varianza de la carga de las siete soluciones de proteína anteriores mediante cromatografía de intercambio catiónico (CEX) para las muestras almacenadas anteriormente durante un periodo de hasta 2 meses. Brevemente, se evaluó el panitumumab utilizando procedimientos de intercambio catiónico conocidos en la técnica. Este procedimiento separó las isoformas de lisina C-terminal predominantes basándose en las diferencias de carga superficial de la proteína utilizando un gradiente de sal lineal a pH 6,2 y una columna de intercambio catiónico débil Dionex (WCX-10; Sunnyvale, CA) y también la modificación ácida de algunos aminoácidos representados por desamidación.

Los datos de CEX para las siete formulaciones descritas anteriormente que tienen diferentes condiciones de pH y se almacenan durante un periodo de hasta 2 meses a 37°C se presentan en la figura 2 (por ejemplo, EGF_20pH 5,0-7,5 y A58N). El resultado muestra que el porcentaje de variantes de ácido (representadas por el pico 0, que indica productos de desamidación) es mínimo a pH ácido (5,0 y 5,5).

Una característica relacionada con los anticuerpos monoclonales y otros polipéptidos es la aparición de partículas insolubles subvisibles. En este contexto, una partícula polipeptídica se refiere, por ejemplo, a un fragmento o agregado del polipéptido y puede ser soluble y/o insoluble. Además, las partículas pueden estar formadas por materia extraña (es decir, fragmentos de vidrio, pelusa, pequeños trozos de tapón de caucho) y no necesariamente compuestas por el polipéptido. Los agregados/partículas solubles se pueden evaluar usando procedimientos tales como SEC, por ejemplo. Las partículas que son insolubles se pueden evaluar utilizando procedimientos tales como el recuento de partículas de líquido o el enfoque de oscurecimiento de la luz tales como HIAC, por ejemplo. Las partículas gruesas se clasifican generalmente como partículas que tienen tamaños superiores a 1,0 pm y las que se consideran partículas finas son de menor tamaño. Utilizando el sistema láser LD-400 con el instrumento HlAC (Ginebra, Suiza), se pueden medir tamaños de partículas de entre 2 y 400 pm.

También se evaluó la formación de partículas insolubles para las siete ejemplos de formulaciones descritas anteriormente que evalúan diferentes condiciones de pH utilizando el recuento de partículas de líquido. Como referencia, estas formulaciones, tal como se indican en la figura 3, fueron:

1. pH 5,0: 20 mg/ml de panitumumab

acetato 5 mM, fosfato 5 mM, sorbitol al 5%, pH 5,0

2. pH 5,5: 20 mg/ml de panitumumab

acetato 5 mM, fosfato 5 mM, sorbitol al 5%, pH 5,5

3. pH 6,0: 20 mg/ml de panitumumab

acetato 5 mM, fosfato 5 mM, sorbitol al 5%, pH 6,0

4. pH 6,5: 20 mg/ml de panitumumab

acetato 5 mM, fosfato 5 mM, sorbitol al 5%, pH 6,5

5. pH 7,0: 20 mg/ml de panitumumab en acetato 5 mM, fosfato 5 mM, sorbitol al 5%, pH 7,0

6. pH 7,5: 20 mg/ml de panitumumab en acetato 5 mM, fosfato 5 mM, sorbitol al 5%, pH 7,5

7. A58N : 20 mg/ml de panitumumab en acetato 50 mM, NaCl 100 mM, pH 5,8 (control)

El instrumento contador de partículas HIAC estaba equipado con el programa informático PharmSpec, versión 1.4, necesario para medir las partículas de 10 pm y 25 pm presentes en una muestra Emab dada. Los procedimientos empleados siguieron procedimientos que cumplen con los requerimientos de la USP de evaluación y calidad de partículas. Se extrajo agua filtrada (0,22 micrómetros) a través de un tubo de acero inoxidable utilizando volúmenes de 1,0 ml y se enjuagó aproximadamente 10 veces entre mediciones de muestras. Se utilizó el patrón de tamaño de partículas de líquido EZY-CAL de Duke Scientific de 10 pm para verificar la calibración adecuada del instrumento. Las mediciones tanto de la muestra como del patrón se tomaron con un volumen de 0,2 ml, se extrajeron 4 veces, descartando la primera ejecución y promediando las últimas dos o tres. Las muestras se extrajeron de sus viales originales, agitando ligeramente cada muestra antes de la medición para garantizar un mezclado uniforme de la solución. El patrón se agitó vigorosamente antes de la medición.

Los resultados de los recuentos de partículas por HIAC de panitumumab formulado a varios pH después de agitar en vórtice durante 15 minutos a 4°C se muestran en la figura 3. Se contaron partículas con un tamaño que variaba de 5 pm a 25 pm. Los resultados muestran que todas las muestras formuladas a un pH de 5,0 a 7,0 mostraron recuentos de partículas más bajos que las formuladas a un pH de 7,5. Los recuentos de partículas formuladas en el tampón que contenía cloruro de sodio (A58N) fueron significativamente más altos que las formulados en los tampones de sorbitol.

Basándose en los ejemplos de resultados anteriores, se seleccionó un pH de 5,0 para la caracterización de formulaciones adicionales tal como se describe a continuación.

Se empleó cromatografía de exclusión por tamaño tal como se ha descrito anteriormente para evaluar la estabilidad de panitumumab formulado en tampón de ácido acético, tampón de ácido succínico o tampón de ácido glutámico después de un almacenamiento a 37°C durante un periodo de hasta 4 meses. Las formulaciones se exponen a continuación de la forma siguiente:

1. A_2.6%Glycerol_pH5_T80: 20 mg/ml de panitumumab en ácido acético 10 mM, glicerol al 2,6%, pH 5,0, Tween 80 al 0,004%

2. Succ_2.6%Glycerol_pH5_T80: 20 mg/ml de panitumumab en ácido succínico 10 mM, glicerol al 2,6%, pH 5,0, Tween 80 al 0,004%

3. Gluta_2.6Glycerol_pH5_T80: 20 mg/ml de panitumumab en ácido L-glutámico 10 mM, glicerol al 2,6%, pH 5,0, Tween 80 al 0,004%

Los resultados de este estudio se muestran en la figura 4. Brevemente, se observó un contenido de monómero similar para todos los sistemas tampón. Las formulaciones que contenían ácido succínico revelaron un contenido de monómero ligeramente inferior y la formulación que contenía ácido glutámico mantuvo la mayor cantidad de monómero mostrada después de 4 meses de almacenamiento a 37°C.

La estabilidad de las formulaciones de panitumumab en cualquiera de los tres tampones de ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico a pH 5,0 establecidos anteriormente y que se muestran en la figura 4 también se evaluó durante periodos de tiempo más largos y para diferentes temperaturas tal como se describe a continuación (por ejemplo, A_2.6%Glycerol_pH5_T80, Succ_2.6%Glycerol_pH5_T80 y Gluta_2.6Glycerol_pH5_T80). Brevemente, se empleó cromatografía de intercambio catiónico tal como se ha descrito anteriormente para evaluar la estabilidad del panitumumab en estos sistemas tampón después de una incubación a 29°C durante un periodo de hasta 6 meses.

Los resultados se muestran en la figura 5 e indican que el porcentaje de variantes de ácido (representadas por el pico 0, que indica productos de desamidación) es comparable en todas las formulaciones. Se observó una formación mínima de variantes utilizando un sistema tampón de ácido glutámico.

La formación de partículas de panitumumab en ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico también se evaluó mediante el análisis de partículas por HIAC tal como se ha descrito anteriormente. Brevemente, se formuló panitumumab tal como se establece a continuación y se incubó a 4°C durante 6 meses

1. Ace2.6glycerolT80pH5.0: 20 mg/ml de panitumumab en ácido acético 10 mM, glicerol al 2,6%, pH 5,0, Tween 80 al 0,004%

2. Succ2.6glycerolT80pH5.0: 20 mg/ml de panitumumab en ácido succínico 10 mM, glicerol al 2,6%, pH 5,0, Tween 80 al 0,004%

3. Gluta2.6glycerolT80pH5.0: 20 mg/ml de panitumumab en ácido L-glutámico 10 mM, glicerol al 2,6%, pH 5,0, Tween 80 al 0,004%

Los resultados se muestran en la figura 6 e indican recuentos de partículas aceptables en todas las formulaciones. Según las pautas de la USP, hubo muy pocas partículas >10 gm y >25 gm, aunque se observó que los recuentos de partículas de >2 gm de tamaño en el tampón de acetato eran más altos que en los tampones de glutamato o succinato. La figura 7 muestra el contenido de monómero medido por SEC HPLC de varias formulaciones isotónicas que contienen diferentes excipientes. Se realizó la SEC HPLC tal como se ha descrito anteriormente. Los diferentes excipientes caracterizados incluyeron sorbitol (S), glicerol (GLY), arginina (ARG), sacarosa (SUC) y polisorbato 80 (T80). A continuación se muestran formulaciones completas para muestras almacenadas durante un periodo de hasta 2 años a 4°C. El resultado indica que el panitumumab es estable en sorbitol, glicerol, sacarosa y polisorbato 80. Se observó menor estabilidad para argina.

A5S Acetato de Na 10 mM Sorbitol al 5% pH 5,0 20 mg/ml A5ST Acetato de Na 10 mM Sorbitol al 5% pH 5,0 Tween-80 al 0,004% 20 mg/ml GLY5 Acetato de Na 10 mM Glicerol al 2,6% pH 5,0 20 mg/ml GLY5T Acetato de Na 10 mM Glicerol al 2,6% pH 5,0 Tween-80 al 0,004% 20 mg/ml ARG5 Acetato de Na 10 mM Arginina al 2,5% pH 5,0 20 mg/ml ARG5T Acetato de Na 10 mM Arginina al 2,5% pH 5,0 Tween-80 al 0,004% 20 mg/ml SUC5 Acetato de Na 10 mM Sacarosa al 9,3% pH 5,0 20 mg/ml SUC5T Acetato de Na 10 mM Sacarosa al 9,3% pH 5,0 Tween-80 al 0,004% 20 mg/ml A58N Acetato de Na 50 mM NaCl 100 mM pH 5,8 20 mg/ml A58NT Acetato de Na 50 mM NaCl 100 mM pH 5,8 Tween-80 al 0,004% 20 mg/ml

La figura 8 muestra las mediciones del recuento de partículas para las diez formulaciones anteriores que tienen diferentes excipientes para tamaños de partículas >10 gm utilizando el procedimiento HIAC tal como se ha descrito anteriormente. Las formulaciones y la clave para la figura 8 son las mismas que las que se han mostrado anteriormente para la figura 7, pero indicando GLY5 y 2.6GLY5, y GLY5T y 2.6GLY5T80 los mismos tampones entre las figuras 7 y 8, respectivamente. Los resultados indican que el panitumumab es estable en una diversidad de formulaciones que contienen sorbitol, glicerol, sacarosa y sal tanto en presencia como en ausencia de polisorbato cuando se almacena durante 1 año a 4°C.

Además de las formulaciones anteriores, se caracterizó la estabilidad de panitumumab en varios componentes y formulaciones adicionales en condiciones de almacenamiento a largo plazo y con respecto a ciclos de congelación y descongelación. Estas caracterizaciones se describen más adelante. Todos los procedimientos de ensayo se realizaron tal como se ha descrito anteriormente.

Brevemente, la figura 9 muestra el porcentaje de monómero de panitumumab analizado por SE-HPLC en varias formulaciones a un pH que varía de 5,0 a 7,0. Se incluyeron diferentes excipientes tal como se establece a continuación para cada formulación. Las muestras de panitumumab se almacenaron durante un periodo de hasta 3 meses a -30°C. Estas formulaciones se estudiaron con respecto al desarrollo de una formulación congelada o sustancia farmacológica congelada o una solución de sustancia a granel.

1. EGF_p5glycerol2.6: 40 mg/ml de panitumumab en acetato 10 mM, glicerol al 2,6%, pH 5,0

2. EGF_p5glycerol10: 40 mg/ml de panitumumab en acetato 10 mM, glicerol al 10%, pH 5,0

3. EGF_p5suc9.3: 40 mg/ml de panitumumab en acetato 10 mM, sacarosa al 9,3%, pH 5,0

4. EGF_p5suc20: 40 mg/ml de panitumumab en acetato 10 mM, sacarosa al 20%, pH 5,0

5. EGF_p5tre9.3: 40 mg/ml de panitumumab en acetato 10 mM, trehalosa al 9,3%, pH 5,0

6. EGF_p5tre20: 40 mg/ml de panitumumab en acetato 10 mM, trehalosa al 20%, pH 5,0

7. EGF_p5arg2.5: 40 mg/ml de panitumumab en acetato 10 mM, arginina al 2,5%, pH 5,0

8. EGF_p5arg10: 40 mg/ml de panitumumab en acetato 10 mM, arginina al 10%, pH 5,0

9. EGF_p6glycerol2.6: 40 mg/ml de panitumumab en fosfato de potasio 10 mM, glicerol al 2,6%, pH 6,0 10. EGF_p6glicerol10: 40 mg/ml de panitumumab en fosfato de potasio 10 mM, glicerol al 10%, pH 6,0 11. EGF_p6suc9.3: 40 mg/ml de panitumumab en fosfato de potasio 10 mM, sacarosa al 9,3%, pH 6,0 12. EGF_p6suc20: 40 mg/ml de panitumumab en fosfato de potasio 10 mM, sacarosa al 20%, pH 6,0

13. EGF_p6tre9.3: 40 mg/ml de panitumumab en fosfato de potasio 10 mM, trehalosa al 9,3%, pH 6,0

14. EGF_p6tre20: 40 mg/ml de panitumumab en fosfato de potasio 10 mM, trehalosa al 20%, pH 6,0

15. EGF_p6arg2.5: 40 mg/ml de panitumumab en fosfato de potasio 10 mM, arginina al 2,5%, pH 6,0

16. EGF_p6arg10: 40 mg/ml de panitumumab en fosfato de potasio 10 mM, arginina al 10%, pH 6,0

17. EGF_p7glycerol2.6: 40 mg/ml de panitumumab en fosfato de potasio 10 mM, glicerol al 2,6%, pH 7,0 18. EGF_p7glycerol10: 40 mg/ml de panitumumab en fosfato de potasio 10 mM, glicerol al 10%, pH 7,0 19. EGF_p7suc9.3: 40 mg/ml de panitumumab en fosfato de potasio 10 mM, sacarosa al 9,3%, pH 7,0

20. EGF_p7suc20: 40 mg/ml de panitumumab en fosfato de potasio 10 mM, sacarosa al 20%, pH 7,0

21. EGF-p7tre9.3: 40 mg/ml de panitumumab en fosfato de potasio 10 mM, trehalosa al 9,3%, pH 7,0

22. EGF_p7tre20: 40 mg/ml de panitumumab en fosfato de potasio 10 mM, trehalosa al 20%, pH 7,0

23. EGF-p7arg2.5: 40 mg/ml de panitumumab en fosfato de potasio 10 mM, arginina al 2,5%, pH 7,0

24. EGF_p7arg10: 40 mg/ml de panitumumab en fosfato de potasio 10 mM, arginina al 10%, pH 7,0

25. EGF_A58N: acetato 50 mM, cloruro de sodio 100 mM, pH 5,8 (control)

26. EG_A5S: acetato 10 mM, sorbitol al 5%, pH 5,0 (control)

27. EGF_H58Suc: histidina 50 mM, sacarosa al 1%, pH 5,8 (control)

La figura 10 muestra el porcentaje de monómero de panitumumab analizado por SE-HPLC en función del pH (5 a 6) y una diversidad de estabilizantes en tampón de acetato o de fosfato. El resultado indica que cuando panitumumab se almacena a -30°C durante un periodo de hasta un año, el contenido de monómero no cambia significativamente. Se caracterizaron las formulaciones siguientes:

1. EGF_p5gly2.6: Acetato 10 mM, glicerol al 2,6%, pH 5,0

2. EGF_p5gly10: Acetato 10 mM, glicerol al 10%, pH 5,0

3. EGF_p5suc9: Acetato 10 mM, sacarosa al 9,3%, pH 5,0

4. EGF_p5suc20: Acetato 10 mM, sacarosa al 20%, pH 5,0

5. EGF_p5arg2.5: Acetato 10 mM, arginina al 2,5%, pH 5,0

6. EGF_p5A5S: Acetato 10 mM, sorbitol al 5%, pH 5,0

7. EGF_p55gly2.6: Acetato 10 mM, glicerol al 2,6%, pH 5,5

8. EGF_p55gly10: Acetato 10 mM, glicerol al 10%, pH 5,5

9. EGF_p55suc9.3: Acetato 10 mM, sacarosa al 9,3%, pH 5,5

10. EGF_p55suc20: Acetato 10 mM, sacarosa al 20%, pH 5,5

11. EGF_p55arg2.5: Acetato 10 mM, arginina al 2,5%, pH 5,5

12. EGF_p55A5S: Acetato 10 mM, sorbitol al 5%, pH 5,5

13. EGF_p6gly2.6: Fosfato de potasio 10 mM, glicerol al 2,6%, pH 6,0

14. EGF_p6gly10: Fosfato de potasio 10 mM, glicerol al 10%, pH 6,0

15. EGF_p6suc9.3: Fosfato de potasio 10 mM, sacarosa al 9,3%, pH 6,0

16. EGF_p6suc20: Fosfato de potasio10 mM, sacarosa al 20%, pH 6,0

17. EGF_p6arg2.5: Fosfato de potasio 10 mM, arginina al 2,5%, pH 6,0

18. EGF_p6A5S: Fosfato de potasio10 mM, sorbitol al 5%, pH 6,0

La figura 11 muestra el porcentaje de monómero de panitumumab analizado por SE-HPLC. Para esta caracterización, se incluyó panitumumab a 40 mg/ml y se almacenó a -30°C durante un periodo de hasta un año en las diversas formulaciones enumeradas que se muestran a continuación.

Nombre Tampón Excipientes pH

A5G2.6 Acetato de Na 10 mM Glicerol al 2,6% 5,0

S5G2.6 Ácido succínico 10 mM Glicerol al 2,6% 5,0

G5G2.6 Ácido glutámico 10 mM Glicerol al 2,6% 5,0

G2.6 Sin agente tamponador Glicerol al 2,6% ~5,8 A57G2.6 Acetato 10 mM Glicerol al 2,6% 5,7

A58N Acetato de Na 50 mM NaCl 100 mM 5,8

Los resultados indican que el almacenamiento a -30°C durante más de 12 meses no produjo diferencias significativas entre ninguna de las formulaciones anteriores. En este estudio, el efecto del almacenamiento en recipientes de acero inoxidable (S) también se comparó con el almacenamiento en frascos de polipropileno (P), tal como se muestra en la figura 11. No se pudieron determinar diferencias observables entre estos dos recipientes.

La figura 12 muestra el efecto de los ciclos de congelación y descongelación y el almacenamiento a -30°C sobre la formación de partículas de panitumumab en las formulaciones descritas anteriormente para la figura 11. Los resultados indican números de partículas aceptables para cada una de las formulaciones estudiadas.

Ejemplo II

Formulaciones líquidas estables que reducen la formación de ácido isoaspártico

Este ejemplo describe el uso del catión divalente cloruro de calcio (CaCl2) para aumentar la estabilidad de panitumumab en una formulación líquida.

El residuo de ácido aspártico en CDR3 del anticuerpo anti-EGFR panitumumab se encuentra en un giro beta flexible expuesto al disolvente y se usó como un ejemplo de polipéptido para demostrar la inhibición de cationes divalentes de la isomerización del ácido aspártico. Este residuo de aspartilo tampoco parece estar en red con otras estructuras secundarias y está disponible para interactuar con disolventes y iones metálicos divalentes. Tal como se describe más adelante, la inclusión de un metal divalente tal como CaCl2 en una formulación polipeptídica ralentizó la cinética del intermedio de succinimida y estabilizó la estructura polipeptídica. La formulación base utilizada para evaluar cualquier efecto de los cationes divalentes sobre la estabilidad del polipéptido fue acetato de sodio 10 mM, glicerol al 2,6%, polisorbato 80 al 0,004%, pH 5,0 a 20 mg/ml de polipéptido y cantidades variables de catión divalente tal como se indica a continuación (por ejemplo, 0, 25, 50, 75, 100, 150 mM).

Para evaluar el efecto de los cationes divalentes sobre el nivel de degradación del isoaspartilo, el anticuerpo anti-EGFR panitumumab se envejeció en diferentes concentraciones de CaCl2. La degradación del isoaspartilo 92 de la cadena ligera se cuantificó mediante HPLC de fase inversa (RP)/UV del anticuerpo reducido y alquilado.

El panitumumab, un anticuerpo monoclonal anti-EGFR IgG2 kappa, se produjo y se purificó según procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica. El anticuerpo se envejeció en tampones a pH 5,0 que contenían concentraciones de CaCl20-150 mM tanto a 29°C como a 37°C durante un periodo de hasta 3 meses.

Después de la incubación, se realizó la reducción y la alquilación utilizando el anticuerpo en condiciones desnaturalizantes para producir las cadenas pesada y ligera libres para una caracterización analítica adicional. Brevemente, el anticuerpo se diluyó a 2 mg/ml con un tampón que incluía clorhidrato de guanidina 7,5 M (N° de catálogo 7716, Mallinckrodt, Phillpsburg, NJ, Estados Unidos), Tris-HCl 0,1 M (N° de catálogo 93363, Sigma, St. Louis, MO, Estados Unidos), ácido etilendiaminotetraacético 1 mM (EDTA, N° de catálogo 6281-92-6, Sigma) pH 7,5 a un volumen de 0,5 ml. Se añadió una parte alícuota de 5 ml de una solución madre de ditiotreitol 0,5 M (DTT, N° de catálogo D5545, Sigma) para obtener una concentración de DTT 5 mM y la mezcla de reacción se dispuso a 37°C durante 30 minutos.

A continuación, la solución de polipéptido se enfrió a temperatura ambiente y se añadió una parte alícuota de 13 pl de una solución madre de yodoacetamida 0,5 M (IAM, N° de catálogo 111149, Sigma) para alcanzar una concentración de IAM 13 mM. La alquilación se realizó a temperatura ambiente durante 40 minutos mientras se protegía de la luz. Los 0,5 ml de tampón de la proteína reducida y alquilada se intercambiaron por 1 ml de solución de acetato de sodio 10 mM (N° de catálogo 9526-03, J.T. Baker, Philipsburg, NJ, Estados Unidos) a pH 5,0 a una concentración final de 1 mg/ml de proteína. El intercambio de tampón se realizó utilizando una columna de filtración en gel NAP-5 rellena con medio Sephadex G 26 (Amersham Pharmacia Biotech, Orsay, Francia) siguiendo las recomendaciones del fabricante.

La cromatografía RP HPLC/UV se realizó después de la reducción y la alquilación. La reducción y la alquilación del anticuerpo en un tampón de pH 5,0 se realizó tal como se ha descrito anteriormente. La HPLC de fase inversa/EM del anticuerpo reducido y alquilado se realizó en un sistema de HPLC capilar Agilent 1100 equipado con un detector UV, un muestreador automático, una celda de nanoflujo y un compartimento de columna con temperatura controlada (Agilent, Palo Alto, CA, Estados Unidos). La fase móvil incluía ácido trifluoroacético acuoso al 0,1% (TFA, J.T. Baker, Phillipsburg, NJ, Estados Unidos) en disolvente A y N-propanol al 80% (Burdick & Jackson, Muskegon, MI, Estados Unidos), acetonitrilo al 10% (ACN; J.T. Baker), agua al 9,9% con TFA al 0,1% en disolvente B. Para el análisis por HPLC/EM se utilizó una columna Agilent Zorbax SB300 CN con un tamaño de partícula de 3,5 pm, un tamaño de poro de 300 Á, 50 x 1 mm. La columna se operó a 75°C y un caudal de 50 pl/min. El eluato de la columna se analizó mediante el detector UV y después se dirigió a un espectrómetro de masas en línea. El mismo tipo de columna Zorbax en formato de 150 x 4,6 mm a 1 ml/min se usó solo para detección UV. Se utilizó un gradiente lineal de aumento de B del 18% al 26% para la separación de cadenas ligeras y pesadas y sus variantes.

Los resultados del análisis de degradación anterior se muestran en el cromatograma de fase inversa de la figura 14. El azul es una muestra de control que se congeló a -70°C. Las trazas cromatográficas restantes proceden de muestras envejecidas a 37°C durante 1 (rojo), 2 (verde), 3 (lavanda) y 4 (marrón) meses. Las degradaciones se identificaron como la isomerización de la cadena ligera (isoLC), que aumenta con el tiempo, y la formación de ácido piroglutámico en el extremo N-terminal de la cadena pesada (pE-HC), que disminuye con el tiempo. LC corresponde al pico de la cadena ligera del anticuerpo, mientras que Q-HC corresponde al pico de la cadena pesada del anticuerpo.

También se evaluó la correlación entre el porcentaje de cadena ligera isomerizada de isoaspartilo en la posición 92 en función del tiempo de incubación en soluciones con diferentes concentraciones de CaCl² a un pH 5,0 a 37°C. Diferentes concentraciones de CaCl² se introdujeron en la solución de envejecimiento para inhibir la isomerización de aspartilo 92 en la región CDR3 de la cadena ligera de panitumumab. La formación de isoLC se evaluó tal como se ha descrito anteriormente.

Los resultados del trascurso de tiempo de degradación anterior se muestran en la figura 15 y revelan que las muestras envejecidas que contienen CaCl² 150 mM a 37°C durante 3 meses tuvieron una disminución de isoLC del 10%. La incubación en estas condiciones sin iones calcio aumentó la pérdida al 19% (véase también la figura 16C). Estos resultados indican que en presencia de CaCl² a pH 5,0 la pérdida de estabilidad y potencia del anticuerpo debida a la isomerización del residuo de aspartilo 92 se ralentizó notablemente.

La figura 16A-C es un trascurso de tiempo de degradación adicional que evalúa la correlación entre el porcentaje de formación de isoLC en función del tiempo de incubación en soluciones con diferentes concentraciones de CaCl² a pH 5,0 después de una incubación a diferentes temperaturas. Tal como se ha descrito anteriormente, diferentes concentraciones de CaCl² se introdujeron en la solución de envejecimiento para inhibir la isomerización de aspartilo 92 y las muestras se incubaron a 4°C, 29°C o 37°C durante un periodo de hasta 3 meses. Los resultados indican que a las temperaturas más altas la adición de la cantidad de CaCl² añadido a las muestras se correlacionó directamente con la pérdida de formación de isoLC y una mayor estabilidad del polipéptido.

Para evaluar cualquier efecto sobre la actividad del anticuerpo, se realizó un ensayo de proliferación celular de la potencia del anticuerpo en presencia de concentraciones variables de CaCl². Brevemente, el clon 3 de la línea celular 32D dependiente de interleucina-3 murina (mIL-3) (ATCC CRL-11346) se modificó para que expresara el EGFR humano de longitud completa. Las células se cultivaron en RPMI 1640 con GlutaMAX™ y HEPES (Invitrogen), suero fetal bovino inactivado por calor al 10% (HyClone), geneticina (Invitrogen) y 5 ng/ml de mIL-3 recombinante (Amgen). El medio de ensayo fue RPMI 1640 con GlutaMAX™ y HEPES, y el 10% de suero bovino fetal inactivado por calor. Para el ensayo, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato y se dispensaron en placas transparentes Falcon de 96 pocillos a razón de 20.000 células/pocillo. Se añadieron muestras de EGF a 0,85 ng/ml, de control y envejecidas del anticuerpo anti-EGFR de concentraciones variables y se incubaron a 37°C durante aproximadamente 24 horas. Se añadió AlamarBlue™ (Accumed International), un colorante rédox que emite fluorescencia en respuesta a las células vivas y la incubación continuó durante 24 horas adicionales. La fluorescencia relativa se midió utilizando un lector de placas Fusion™ a (Perkin Elmer) a 530 nm de excitación, 590 nm de emisión. Se utilizó un programa de ajuste de curva logístico de 4 parámetros para determinar la concentración inhibidora 50 (CI⁵⁰) de las muestras de anticuerpos. La potencia in vitro comunicada (%) fue con respecto a la CI⁵⁰ del lote de referencia (asignado el 100% de potencia).

Los resultados se muestran en la figura 17 e indican una protección significativa de la pérdida de potencia del anticuerpo en presencia de CaCl² en comparación con la ausencia de catión divalente. Estos resultados muestran además que los cationes divalentes pueden usarse para conservar sustancialmente la totalidad o la mayor parte de la actividad de un anticuerpo, ya que se observó una pequeña disminución de la actividad durante un periodo de 2 meses a 29°C o 37°C.

Se realizó una evaluación adicional de la degradación de anticuerpos de reducción en presencia de CaCl2 utilizando SE-HPLC para caracterizar si la presencia de cationes divalentes tenía un efecto sobre la agregación de polipéptidos o la formación de dímeros. Las muestras de anticuerpos se formularon en varias concentraciones de CaCh en el intervalo de 0-150 mM y se almacenaron a 4°C y 29°C durante 4 meses. Se realizó una SE-HPLC tal como se ha descrito anteriormente en el ejemplo I.

Las figuras 18 A y B muestran los perfiles de SE-HPLC del anticuerpo tras una incubación en las condiciones anteriores. Los resultados tras la incubación después de 4 meses a 4°C no mostraron un aumento detectable en la agregación de polipéptidos o la formación de dímeros con concentraciones crecientes de CaCl2. Los agregados se mantuvieron al 0,05% (figura 18A). Después de la incubación durante 4 meses a 29°C, la agregación aumentó ligeramente al 0,33% en solución de CaCl275 mM y al 1% en solución de CaCl2150 mM (figura 18B).

Los datos combinados con respecto a la isomerización del ácido aspártico D92 y la agregación indican que CaCl275 mM es una concentración de catión divalente particularmente útil para prevenir o reducir la isomerización y preservar la bioactividad del polipéptido, ya que solo se produjeron niveles muy reducidos de agregación del polipéptido a 29°C. Con respecto al ácido isoaspártico, los resultados anteriores demuestran que un amplio intervalo de concentraciones de CaCl2, incluso dentro del intervalo de 25-150 mM, ralentizaron significativamente la isomerización del ácido aspártico. Para controlar aún más la agregación o la formación de partículas en formulaciones que contienen sales divalentes, se pueden incluir adicionalmente tensioactivos tales como polisorbato 20 u 80.

A lo largo de la presente solicitud se ha hecho referencia a varias publicaciones entre paréntesis.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una formulación que comprende un tampón que tiene un pH de aproximadamente 4,0 a menos de 6,0, un catión divalente seleccionado de entre cloruro de calcio, cloruro de zinc, cloruro de manganeso o cloruro de magnesio entre aproximadamente 5-150 mM, un excipiente que comprende un azúcar o poliol, y una cantidad eficaz de panitumumab, en la que el panitumumab conserva al menos aproximadamente el 80% de actividad de unión a EGFR durante un periodo de hasta dos meses en solución.

2. Un procedimiento para estabilizar panitumumab, que comprende poner en contacto panitumumab con una concentración de catión divalente seleccionado de entre cloruro de calcio, cloruro de zinc, cloruro de manganeso o cloruro de magnesio entre aproximadamente 5-150 mM en un tampón que tiene un pH de aproximadamente 4,0 a menos de 6,0 y un excipiente que comprende un azúcar o un poliol, en el que el panitumumab conserva al menos aproximadamente el 80% de actividad de unión a EGFR durante un periodo de hasta dos meses en solución.

3. La formulación de la reivindicación 1 o el procedimiento de la reivindicación 2, en los que la concentración de dicho catión divalente es aproximadamente 25 mM, 50 mM, 75 mM, 100 mM o 125 mM.

4. La formulación o el procedimiento de la reivindicación 3, en los que la concentración de dicho catión divalente es 75 mM.

5. La formulación de la reivindicación 1 o el procedimiento de la reivindicación 2, en los que dicho pH se encuentra entre 4,8-5,2.

6. La formulación de la reivindicación 1 o el procedimiento de la reivindicación 2, en los que dicho tampón es ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico, o una sal de los mismos.

7. La formulación o el procedimiento de la reivindicación 6, en los que la concentración de dicho ácido acético, ácido glutámico o ácido succínico, o una sal de los mismos, es aproximadamente 1-50 mM.

8. La formulación de la reivindicación 1 o el procedimiento de la reivindicación 2, en los que dicho azúcar o poliol es glicerol, sacarosa, trehalosa o sorbitol.

9. La formulación o el procedimiento de la reivindicación 8, en los que dicho glicerol, sacarosa, trehalosa o sorbitol se encuentra a una concentración de aproximadamente el 1-20%.

10. La formulación o el procedimiento de la reivindicación 8, en los que dicho glicerol se encuentra en una concentración de entre aproximadamente el 1-3%.

11. La formulación de la reivindicación 1 o el procedimiento de la reivindicación 2, que comprende además un tensioactivo.

12. La formulación o el procedimiento de la reivindicación 11, en los que dicho tensioactivo comprende un polisorbato.

13. La formulación o el procedimiento de la reivindicación 11, en el que dicho tensioactivo se encuentra a una concentración de aproximadamente el 0,001-0,10% (p/v).

14. La formulación o el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en los que dicho catión divalente es cloruro de calcio.

15. La formulación de la reivindicación 1 o el procedimiento de la reivindicación 2, en los que el panitumumab se encuentra en una concentración seleccionada en el intervalo de aproximadamente 10-200 mg/ml.