CN1481252A - 稳定的干扰素组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了含有IFN-β和高纯度的甘露醇的稳定药物配方。和利用非高纯度甘露醇配制的IFN-β相比,高纯度的甘露醇通过减少IFN-β加合物的形成稳定了组合物。文中也提供了提高在液体或冻干的组合物中的IFN-β或其变体的稳定性的方法以及提高这样的组合物储存稳定性的方法。
Description
发明的技术领域
本发明一般是涉及药物的组合物,更具体涉及蛋白质的稳定的液体或冻干的制剂,包括干扰素-β等制剂。
发明的背景
干扰素是一个糖蛋白家族,它们自细胞的分泌由许多信号所诱导,这些信号包括病毒,双链RNA,其他的多核苷酸,抗原和有丝分裂原。干扰素呈现出各种各样的生物学活性,包括抗病毒,抗增殖以及免疫调节活性。至少已经有三种不同类型的人类干扰素α,β和γ,依据许多因素被区分开来,包括抗病毒和抗增殖活性。
干扰素-β(IFN-β)第一个被确认对于治疗多发性硬化症(MS)有效,并证实能减少那些复发和缓解型MS病人的发作次数。IFN-β组合物在乙型和丙型肝炎感染的治疗中也十分有用。
和所有以蛋白质为基础的药物一样,在把IFN-β当作治疗药物的使用过程中必须克服的主要障碍之一就是由于它的药物制剂的不稳定性所导致的药物作用的丧失。威胁到药物制剂中多肽的活性和疗效的物理不稳定性包括变性,可溶以及不可溶的聚集物的形成,化学的不稳定性包括水解、形成酰亚胺、氧化、消旋和脱酰胺作用。已经知道这些变化中的一些变化能导致感兴趣的蛋白质的药物活性的降低或丧失。在其他的情况下,这些变化的确切效应还不为人知,但是所产生的降解产物由于它的潜在的不良副作用而不能被作为药物接受。
药物制剂中多肽的不稳定性直接影响它们的药理作用,正如为批准以蛋白质为基础的药物而提出的标准强调多肽的活性和分子特征的改变必须最小。例如,1995年11月30号,国际人用药物注册技术要求协调会议(一个欧盟、日本和美国三方组织,从事制订与药物相关的政策建议供实施)提出的关于生物技术/生物产品稳定性试验的报告中指出:无论什么地方经过长期的、加速的、和/或应激的稳定性研究而发现有意义的质或量的改变,这种改变表明有降解产物形成,就应该讨论潜在的危险以及考虑在长期稳定性方案中鉴定和定量降解产物。
结果是需要另外的蛋白质药物组合物,包括IFN-β组合物,包含生理上相容的稳定剂,能够大大的减少杂质,以达到稳定蛋白质和提高药理作用的目的。
发明的概述
提供了包含作为治疗活性成份的IFN-β和作为赋形剂的高度提纯的甘露醇的组合物,与包含非高纯度甘露醇的IFN-β组合物相比,它以在储存过程中稳定性提高为特征。还提供了制备这些组合物的方法。
附图的概述
图1是对利用葡萄糖制备的IFN-β粉状物和在50℃下保温一周的冻干粉末的RP-HPLC色谱图的对比。保持50℃的制剂中可以看到糖基化的IFN-β加合物的形成出现在第二个(B1)峰(大约在流份48),在IFN-β主峰(大约在流份49-50)之前。见例1。
图2是利用葡萄糖配制的IFN-β粉状物的质谱图。可以发现除了在19878amu(原子质量单位)有IFN-β的主峰外还有一些小峰。见例1。
图3是将粉状组合物冻干并在50℃下储存一周后的以葡萄糖配制的IFN-β样品的质谱图。和图2对比,几个主要的峰是代表IFN-β加合物的。见例1。
图4是对用USP甘露醇配制的IFN-β粉状物和在50℃下保温一周的冻干粉末的RP-HPLC色谱图的对比。保持在50℃下的制剂未见糖基化IFN-β加合物的形成(出现B1峰)。见例1。
图5是利用USP甘露醇配制的IFN-β粉状物的质谱图。19880amu的峰被检测为IFN-β。见例1。
图6是利用USP甘露醇配制的冻干的IFN-β粉末在50℃下保温一周的质谱图。在图中可看见另外的峰的形成(代表加合物)。见例1。
图7是用未提纯的甘露醇配制的IFN-β的质谱图。在谱中能看见许多另外的峰的形成(代表加合物)。见例1。
图8是以甲醇提取过的甘露醇配制的IFN-β的质谱图,这种甘露醇和图7使用的是同一批。加合物峰的大小和数量都大量减少。见例1。
图9是利用高纯度的甘露醇(经甲醇提取,碳处理,超滤,重结晶)配制的IFN-β制剂的质谱图。除了代表未改变的IFN-β的主峰外只能看到三个小峰。见例1。
图10是不用甘露醇所配制的IFN-β的质谱图。从图中我们可以看出图9中呈现的主要次级峰不是因为与高纯度的甘露醇作用而形成的,它们在没有赋形剂时也会出现。见例1。
图11是和上面图9同一天利用USP甘露醇配制的IFN-β的 质谱图。此谱证实了利用USP甘露醇配制的IFN-β形成了附加的峰(加合物),这在含有高纯度的甘露醇的IFN-β制剂中是不出现的。见例1。
图12给出了利用葡萄糖配制的IFN-β制剂的稳定性评价数据,如例2所描述。
图13给出了含有高纯度甘露醇的IFN-β制剂的稳定性评价数据,如例2所述。
图14给出了含有高纯度甘露醇的IFN-β制剂(批号006)的稳定性评价数据,如例3所述。
图15给出了含有高纯度甘露醇的IFN-β制剂批号(008)的稳定性评价数据,如例3所述。
图16给出了含有高纯度甘露醇的IFN-β制剂(批号009)的稳定性评价数据,如例3所述。
图17表示各种甘露醇样品呈现的还原活性。样品1-3是没有经过甲醇提取,碳过滤,或超滤的USP甘露醇;样品4-6是经过甲醇提取的USP甘露醇,样品7-9是经甲醇提取、碳处理、超滤、重结晶的甘露醇。
发明详述
本发明涉及稳定性提高的IFN-β药物组合物及其制备方法。这样的组合物包含IFN-β和高纯度的甘露醇。高纯度的甘露醇通过减少降解产物的形成来提高配方的稳定性。稳定的IFN-β配方优点在于它更安全(由于减少了潜在的有害的副作用)且更经济(由于提高了制剂的保存期)。
由于使用了高度提纯的甘露醇故而提高了所揭示组合物的稳定性。本发明有个新的发现就是未经高度提纯的甘露醇拥有还原的活性,它能够和IFN-β作用而产生不希望有的加合物(降解的产物),然而高度提纯的甘露醇没有这种还原活性,在IFN-β配方中不能促使这些加合物形成。这里所提供的实验结果(见实验部分的实施例1)表明导致IFN-β中加合物形成的不纯甘露醇所呈现出的还原的活性不是还原性糖的活性,这是因为由于未高度纯化的甘露醇的存在而形成的加合物可以与由于拥有还原性糖的活性的赋形剂(如葡萄糖)存在的而形成的加合物清楚的区分开来。
这里所使用的“高纯度的甘露醇”指的是还原活性较低的甘露醇。高度提纯的甘露醇的还原活性要比USP甘露醇的百万分之二十还要小,它由这里其他地方所述的还原活性的测定法所测定。在各种各样的实施方案中,高纯度的甘露醇的还原活性低于百万分之十九,低于百万分之十八,低于百万分之十七,低于百万分之十六,低于百万分之十五,低于百万分之十四,或低于百万分之十三。在一种实施的方案中,高度提纯的甘露醇是经下列步骤处理的USP(美国药典)或ACS(美国化学会)级别的甘露醇:1)甲醇提取,2)碳处理,3)超滤和4)重结晶。高纯度的甘露醇达到足以稳定配方的浓度。本发明中的配方可以有少到约的0.1%的高纯度的甘露醇或多达约7.5%的高纯度的甘露醇(重量/体积)。在各种各样的实施方案中,甘露醇的浓度约为0.2%到7.0%,约0.25%到2.5%,和约1.25%。
揭示了含有作为治疗活性成分的IFN-β和作为赋形剂的高纯度甘露醇的液体和冻干的药物组合物。对本发明来说,关于药物组合物或配方的“液体”这个词意思包括“含水的”一词。关于IFN-β的药物配方的“冻干”这词指的是许多小瓶在减压条件下迅速冻干,这些小瓶各自装有在此提出的单位剂量的本发明的干扰素配方。在上面所描述的冻干中使用的冻干机在商业上是可得到的,并容易被本专业的技术人员们所使用。在本发明的一种实施方案中,液体组合物是冻干的。
本发明提出的液体或冻干的IFN-β制剂是“稳定的”。“稳定的”组合物或拥有“提高了的稳定性”或“改善了的稳定性”的组合物是所需的组合物,与用未经高度提纯的甘露醇配制的IFN-β组合物相比拥有提高了的储存稳定性。这种稳定性的提高的表现是,与用未经高度提纯的甘露醇配制所得的配方相比,储存时IFN-β加合物或降解产物减少。加合物或降解产物的形成可以使用这里所提到的质谱测定来测量。本发明中用高纯度甘露醇配制的稳定的IFN-β组合物的特征是,与不用甘露醇配制的IFN-β组合物相比,没有附加的峰,这些峰能在利用USP甘露醇配制的IFN-β中观察到,这是通过这里提到的质谱测定所发现的。例如图9中所呈现的利用高纯度的甘露醇配制的IFN-β的质谱图,它和图10中所呈现的不利用甘露醇配制的IFN-β的质谱图相对比没有附加的峰。相比之下,图11所呈现的利用USP甘露醇配制的IFN-β的质谱图,它和不利用甘露醇配制的IFN-β的质谱图对比就有许多的附加的峰(加合物)。该项发明中的稳定的IFN-β药物组合物保持了它们的效价,并且在30℃下储存可包含少于0.02mg/ml的糖基化的IFN-β大概可达两年时间,如果在25℃下存储可以至少两年。
本发明的稳定的药物制剂包含IFN-β及其变体。这里使用的“IFN-β”指的是IFN-β及其变体,有时指IFN-β样的多肽。人IFN-β的变体,也许是天然存在的(例如在IFN-β基因座存在的等位基因变体)或是重组产生的,它们与成熟的天然IFN-β序列有相同、相似或是基本相似的氨基酸序列。保留其活性的IFN-β片段或IFN-β的截短形式也包括在内。这些有生物学活性的IFN-β片段或截短的形式是利用本领域熟知的DNA重组技术从全长的IFN-β氨基酸序列除去氨基酸残基而得到的。IFN-β多肽可以是糖基化的也可以是未糖基化的,就象文献中报导的那样,糖基化的以及未糖基化的IFN-β都表现出质相似的特异性活性,因此糖基部分与IFN-β的生物学活性无关,对IFN-β的生物学活性也不起作用。
这里提到的IFN-β变体包括成熟的天然IFN-β序列的变异蛋白质(muteins)(例如美国专利第5,814,485号,在此并入以供参考),在那里对于生物学活性并不必要的一个或多个半胱氨酸残基被故意剔除或用其他氨基酸代替以消除分子间交联或形成不正确的分子内二硫键的位点。这一类型IFN-β的变体包括那些序列,它们含有甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸或甲硫氨酸替代了成熟的天然氨基酸序列第17个氨基酸位点上的半胱氨酸。丝氨酸和苏氨酸是更优越的取代物,因为它们和半胱氨酸化学结构相似。丝氨酸取代最为优选。例如IFN-β的变体,其在成熟的天然序列中的第17个氨基酸半胱氨酸被丝氨酸替代(美国专利第5,814,485号)。第17位的半胱氨酸也可以使用该领域已知的方法剔除(例如美国专利第4,588,584号,在此并入以供参考),导致成熟的IFN-β变异蛋白质,它比成熟的天然IFN-β短一个氨基酸。例如美国专利第4,530,787;4,572,798和4,588,585号。因此,本发明也包含有一处或多处突变的IFN-β变体,这些突变例如可以改善它们的药理作用。
熟练的技术人员将意识到可通过突变在编码IFN-β的核苷酸序列中引入其它的变化,从而改变IFN-β的氨基酸序列,而不改变干扰素的生物学活性。这样,通过将一个或多个核苷酸取代、加成或缺失引入这里所揭示的相应的核苷酸序列,就可以产生编码与成熟的天然IFN-β氨基酸序列不同的IFN-β变体的分离的核酸分子,这样就可以在编码的IFN-β中引入一个或多个氨基酸取代、加成或缺失。突变可以通过标准技术引入,例如定点诱变和以PCR介导的诱变。本发明也包括这种IFN-β变体。
例如,可以在一个或多个预定的,最好是非必需的氨基酸残基上进行保守性氨基酸取代。“非必需的”氨基酸残基是可以从野生型IFN-β序列改变而不改变其生物学活性的残基,而“必需的”氨基酸残基是生物学活性所必需的。“保守性氨基酸取代”是指用带有相似侧链的氨基酸残基替代一个氨基酸残基。在本技术中已经定义了有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸),有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸),有不带电荷的极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸),有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸),有β-分枝侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及有芳香侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。保守性氨基酸残基或存在于保守性基元中的氨基酸残基都不作这样的取代。
或者,IFN-β变体核苷酸序列可通过随机导入沿着整个或部分IFN-β的编码序列导入突变而得到,例如通过饱和诱变,可就IFN-β生物学活性筛选所得突变体以鉴别保留活性的突变体。诱变后,编码蛋白可重组表达,并可用这里描述的标准测量技术来测定蛋白质的生物学活性。
通常,IFN-β的生物学活性变体与作为对比基础的参考IFN-β多肽(如天然的人IFN-β)至少有80%,更好是约90%-95%或更多,最好是约96%-99%或更多的氨基酸序列同一性。“序列同一性”是指当一变体特定的连续氨基酸序列片段与参考分子的氨基酸序列比对时,在变体多肽和作为参考的多肽分子中发现相同的氨基酸残基。
为使两个序列最佳比对以确定序列同一性,变体的氨基酸序列的连续片段跟参考分子氨基酸序列相比可能有附加的或被删除的氨基酸残基。用于和参考氨基酸序列相比较的连续片段将至少含有20个连续的氨基酸残基。通过排布缺口障碍可以进行校纠正,以增加和变体氨基酸序列中包括缺口相关的序列同一性。序列比对方法在此领域是为人熟知的。
因此,两个序列之间的同一性百分率测定可以使用数学算法来完成。一个较好的用于序列比较的数学算法的非限制性例子就是Myers和Miller算法(1988)Comput.Appl.Biosci.4:11-7。这样的一种算法在ALIGN程序(version2.0)中使用,它是GCG排列软件包的一部分。PAM120权重残基表,当作氨基酸序列比较时,缺口长度障碍为12和缺口障碍为4的就可以与ALIGN程序一起使用。另外一个较好的用于作序列比较的数学算法的非限制性例子是Karlin和Altschul算法(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877,经修改的Karlin和Altschul算法(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877。这样的种算法被包括在NBLAST和XBLAST程序中,Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410。BLAST氨基酸序列可以用XBLAST程序来搜索,评分=50,字长=3,以此来获得和感兴趣的多肽相似的氨基酸序列。为了获得用于比较的有缺口的排列,有缺口的BLAST可以被使用,如Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402所述。或者,PIS-BLAST可用来进行交互搜索,这种研究可以发现分子间的远缘联系。见Altschul etal.(1997)supra.当使用BLAST,有缺口的BLAST或PSI-BLAST程序时,可使用缺省参数。见
http://www.ncbi.nlm.nih.gov。也见ALIGN程序(Dayhoff(1978)Atlas ofProtein sequence and Structure 5:Suppl.3,国家生物医学研究基金会,华盛顿,哥伦比亚特区)以及威斯康辛序列分析包程序,Version 8(从遗传学计算机集团,麦迪逊,威斯康辛,可得),例如GAP程序,在此程序中使用了缺省参数。
当考虑氨基酸序列同一性的百分率时,由于保守性氨基酸取代,一些氨基酸残基位置可以不同,这种保守以氨基酸取代并不影响蛋白质功能的特性。在这些例子中,序列同一性百分率可上调,从而说明了保守性置换的氨基酸的相似性。这样的调节在本技术中为人熟知。例如见Myers和Miller(1988)Comput.Appl.Biosci.4:11-17。
本发明所包括的生物学活性IFN-β变体也包括这样的IFN-β多肽,这些多肽链和例如聚乙二醇(PEG)或白蛋白共价联结。这些共价杂交的IFN-β分子拥有某些所希望的药理特性,例如在病人给药后,它会有延长的血清半衰期。创制PEG-干扰素加合物的方法有对单甲氧基聚乙二醇进行化学修饰以得出和IFN-β反应的活性化合物。制备和使用PEG-联结的多肽的方法已经被描述了,例如在Delgado etal.(1992)Crit.Rev.Ther.Drug.Carrier.Syst.9:249-304。创制白蛋白结合多肽的方法包括为感兴趣的多肽(例如IFN-β)与白蛋白的编码序列的结合,这种方法已在美国专利第5,876,969号中描述了,这里引入作参考。这些杂交的IFN-β分子将和USP甘露醇中存在的杂质起反应,并且在用高纯度的甘露醇配制时会变得更加稳定。
本发明所包括的具有生物学活性的IFN-β变异体应该保留IFN-β的活性,尤其是结合IFN-β受体的能力。在一些实施方案中,IFN-β变体保留至少大约25%、50%、75%、85%、90%、95%、98%、99%或更多的参考IFN-β多肽,例如天然的人IFN-β的生物学活性。与参考IFN-β多肽相比活性有所提高的IFN-β变体也包括在内。IFN-β变体的生物学活性可以用本技术已知的任何方法来测定。这样的测定方法的例子见于
Fellous等(198)Proc.Natl.Acad.Sci USA 79:3082-3086;
Czerniecki等(1984)J.Virol.49(2):490-496;
Mark等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:5662-5666;
Branca等(1981)Nature 277:221-223;
Williams等(1979)Nature 282:582-586;
Herberman等(1979)Nature 277:221-223;
Anderson等(1982)J.Biol.Chem.257(19):11301-11304;
以及这里所描述的IFN-β效价测定(见例2)。
本发明制剂的干扰素可以来源于任何一种动物物种,包括但不局限于鸟、犬、牛、猪、马和人。当制剂要用于治疗哺乳动物的IFN-β失调时,优选使用来源于哺乳动物物种的干扰素-β;更优选是来源于和接受这种失调的治疗的相同种类的哺乳动物。
本发明所包括的IFN-β多肽和变体多肽的非限制性例子提出于Nagata等(1980)Nature 284:316-320;Goeddel等(1980)Nature 287:411-416;Yelverton等(1981)Nucleic Acids Res.9:731-741;Streuli等(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.78:2848-2852;EP028033B1和EP109748B1。也见美国专利第4,518,584号;第4,569,908号;第4,588,585号;第4,738,844号;第4,753,795号;第4,769,233号;第4,793,995号;第4,914,033号;第4,959,314号;第5,545,723号;第5,814,485号。在此并入以供参考。这些引用也为IFN-β多肽哪些残基和区域可以被改变而不丧失生物学活性提供指导。
在本发明的一个实施方案中,稳定的药物组合物中的IFN-β是成熟的天然IFN-β多肽。在另外的一个实施方案中,这些组合物中的IFN-β是成熟的IFN-β多肽,但它在第17号位点由丝氨酸代替了上面讨论的成熟天然序列同一位点的半胱氨酸。然而,本发明包括了另外的实施方案,在这些实施方案中稳定的药物组合物中的IFN-β就是指任何有生物学活性的IFN-β多肽或变体,正如本文其他地方所述。
在本发明的一些实施方案中,IFN-β是重组产生的。“重组产生的IFN-β”是指和成熟的天然IFN-β相比具有相似的生物学活性,并且是依靠DNA重组技术来制备的。可以通过培养被包含一个编码IFN-β多肽的核苷酸序列的表达载体转化的宿主细胞,来制得IFN-β。宿主细胞能够转录核苷酸序列并产生所需的蛋白质,它可以是原核的(如大肠杆菌),也可以是真核的(例如酵母菌、昆虫或哺乳动物细胞)。IFN-β的重组生产的例子见于Mantei等(1982)Nature 297:128;Ohno等(1982)Nucleic Acids Res.10:967;Smith等(1983)Mol.Cell.Biol.3:2156以及美国专利第4,462,940号;第5,702,699号;第5,814,485号,在此并入以供参考。又见美国专利第5,795,779号,它在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中利用重组技术制得IFN-β-1a;在此并入以供参考。人干扰素基因已经利用重组DNA(“rDNA”)技术克隆,并在大肠杆菌中表达(Nagola等,(1980)Nature 284:316;Goeddel等,(1980)Nature287:411;Yelverton等(1981)Nuc.Acid Res.9:731;Streuli等,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:2848)。或者,IFN-β可以利用本技术已知的方法,用为表达感兴趣的IFN-β蛋白而基因工程化的转基因动物或植物来制造。
或者,IFN-β可以化学合成,可利用那些多肽领域中的技术员熟知的任何技术。例如Li等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:2216-2220,Sterward和Young(1984)Solid Phase Peptide Synthesis(Pierce Chemical Company,Rockford,Illinois),Baraney和Merrifield(1980)The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,Gross和Meinhofer编;第2卷(学术出版社,纽约,1980),第3-254页,它是讨论固相肽合成技术的;Bodansky(1984)Principles of Peptide Synthesis(Springer-Verlag,柏林),Gross和Meinhofer编(1980)The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology,第1卷(学术出版社,纽约),讨论经典的溶液合成。IFN-β也可以利用同时合成多种多肽的方法化学制备。例如,Houghten(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:5131-5135以及美国专利第4,631,211号。
本发明所包括的组合物少则可含有大约0.01mg/ml的IFN-β,多则可含有大约15mg/ml的IFN-β(重量/体积)。在各种实施方案中,IFN-β的浓度是大约0.015mg/ml至12.5mg/ml,大约0.025mg/ml至10mg/ml,大约0.05mg/ml至8mg/ml,大约0.075mg/ml至6mg/ml,大约0.1mg/ml至4mg/ml,大约0.125mg/ml至2mg/ml,大约0.175mg/ml至1mg/ml,大约0.2mg/ml至0.5mg/ml,大约0.225mg/ml至0.3mg/ml,大约0.25mg/ml。
在一些实施方案中,本发明的配方包含药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”是指本技术中通常使用的,能够方便储存、给药、和/或发挥它的治疗成份的治疗效应的载体。载体也会减少IFN-β的任何不良副作用。一种合适的载体应该是稳定的,那就是不会和组合物中其他的成份起反应。当在治疗剂量和浓度时,它不会在接受治疗者中产生出明显的局部或系统的副反应。这样的载体在本技术中普遍为人们所知。本发明合适的载体是那些经常使用的稳定的大分子,诸如白蛋白、明胶、胶原、多糖、单糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、固定油、油酸乙酯、脂质体、葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露糖、右旋糖、右旋糖酐、纤维素、山梨醇、聚乙二醇(PEG)等。缓释载体,诸如透明质酸也是适用的。特别见Prisell等(1992)Int.J.Pharmaceu.85:51-56和美国专利第5,166,311号。组合物其他可接受的成份包括,但不局限于,药学上可接受的等渗性试剂包括水、盐、糖、多元醇、氨基酸、缓冲剂。合适的缓冲剂的例子包括磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、醋酸盐和其他有机酸和它们的盐,以及影响渗透性的盐,诸如氯化钠、磷酸钠、硫酸钠、氯化钾,也可包括上面列出的缓冲剂。
在本发明的一些实施方案中,人白蛋白是药学上可接受的载体。人白蛋白可以是天然存在的或重组制得的;这两种形式这里统称为“人白蛋白”。本发明中的配方可含有少则大约0.01%的人白蛋白,多则大约15%的人白蛋白(重量/体积)。在各种实施方案中人白蛋白浓度大约为0.025%至12.5%,大约0.05%至10%,大约0.1%至9%,大约0.25%至8%,大约0.5%至7%,大约0.6%至2%,大约0.7%至1.75%,大约0.75%至1.5%,大约1.2%至1.3%,大约1.25%。
药物组合物可附加的包含一种增溶剂或提高溶解度的试剂。包含胍盐基团的化合物,最理想的是精氨酸,对于IFN-β来说是合适的溶解性提高试剂。这样的提高溶解性试剂的例子有精氨酸以及能保持提高IFN-β溶解度能力的精氨酸类似物。这样的类似物,包括但不限于含有精氨酸的二肽和三肽。其他合适的增溶剂见于美国专利第4,816,440号;第4,894,330号;第5,004,605号;第5,183,46号;第5,643,566号;以及Wang等(1980)J.Parenteral Drug Assoc.34:452-462,在此并入以供参考。
本发明包括的增溶剂的非限制性例子有表面活性剂(清洁剂),它们具有合适的疏水-亲水平衡而能够增溶IFN-β。强效的天然或人工合成的阴离子表面活性剂如脂肪酸碱金属盐和烷基硫酸碱金属盐是可以使用的。这样的试剂通常有10到14个碳原子。十二烷基硫酸钠(SDS)和月桂酸钠是特别理想的增溶剂。能在本发明的组合物中使用的其他增溶剂的例子包括但不局限于十二烷基磺酸钠、癸基硫酸钠、十四烷基硫酸钠、十本烷基磺酸钠、豆蔻酸酸钠、辛酸钠、十二烷基N-肌氨酸钠、十四烷基N-肌氨酸钠。经典的使用表面活性剂或乳化剂使药物具有稳定性的方法,例如见于Levine等(1991)J.Parenteral Sci.Technol.45(3):160-165。另外的合适的表面活性剂见于美国专利第4,507,281号;第4,816,440号;第5,183,746号;在此并入以供参考。
除了以上揭示的那些试剂外,其他的稳定剂,如乙二胺四乙酸(EDTA)或它的一种盐如EDTA二钠,也可以加入液体的药物组合物来进一步提高稳定性。EDTA能充当金属离子的清除剂,而这些金属离子已经知道能催化许多氧化反应,因此EDTA提供了一种额外的稳定剂。
在IFN-β制剂应用于哺乳动物如人类时,组合物的等渗性也是要考虑的问题。因此,在一实施方案中,IFN-β可注射的液体组合物将和病人血清或体液具有相同的或相似的等渗性。为达到等渗性,可以在溶液中以适宜浓度加入一种盐,如氯化钠、氯化钾或磷酸盐缓冲液。
配方的pH值也是要考虑的一个问题。本发明的稳定的IFN-β配方的pH值约3.0-9.0。合适的pH值范围包括例如约4.0-8.8,约5.0-8.6,约6.0-8.4,约6.8-8.2,约6.9-8.0,约7.0-7.8,约7.1-7.7,约7.2-7.6,约7.3-7.5。
将稳定的液态IFN-β制剂或可重新溶解的稳定的冻干IFN-β药物制剂的药物有效剂量给予患者。“药物有效剂量”是指治疗、预防、诊断一种疾病或状况有用的剂量。典型的给药途径包括但不局限于口服给药、鼻腔给药、肺部给药、肠道外给药,它包括经皮肤、静脉内、肌肉内、皮下、动脉内、腹膜内注射或滴注。在一个实施方案中给药方式是注射,优选皮下注射。本发明的组合物的注射液形态包括但不局限于溶液、悬浮液、乳状液。典型的治疗有效剂量的IFN-β约含0.01μg/kg-5mg/kg,较好的是约0.05μg/kg-1000μg/kg,更好的是约0.1μg/kg-500μg/kg,最好的是约0.5μg/kg-30μg/kg组合物。
在一种实施方案中,含有IFN-β的稳定药物组合物配制成一个单位剂量,是可注射或滴注的形式如溶液、悬浮液或乳状液。而且,它可以冻结储存或制备成干燥的形式,如冻干粉末,它可以在给药前通过各种各样的方法转换成液体溶液、悬浮液、或乳剂包括口服或经肠道外给药。稳定的药物组合物可以通过膜过滤灭菌,可以存储在单位剂量或多剂量的容器中,如密封的小瓶或安瓿中。本技术普遍知道的配制药物组合物的另外的方法可以用来进一步提高这里所揭示的药物组合物的储存稳定性,只要它们不负面地影响所揭示的高纯度甘露醇的有益作用。关于药学上可接受的载体、稳定剂等的配方和选择的细致的讨论见于Remington’sPharmaceutical Sciences(1990)(第18版,Mack Pub.Co.,Eaton,宾夕法尼亚),在此并入以供参考。
在一些实施方案中,本发明的液体组合物被装在注射器中(本发明“预充填的”注射器)。在一种实施方案中,装有本发明组合物的预充填的注射器将被冷冻。这种被冷冻的预充填的注射器对于储存和运输是有用的。
以下的例子是用来说明的,而不是用来限制的。
实施例
实施例1:稳定性提高了的IFN-β药物制剂的开发
I.序言
包含作为赋形剂的葡萄糖的IFN-β药物配方在本技术中是已知的。当这样的制剂在37℃或更高的温度下保温时,这些配方中的葡萄糖会形成和IFN-β的共价加合物,它能在RP-HPLC(反相高效液相色谱法)中发现。利用USP甘露醇制备的干扰素-β在相同的条件下不会形成RP-HPLC中可检出的共价加合物。然而,USP甘露醇含有的杂质可与IFN-β形成加合物,它会被电喷雾质谱检出。USP甘露醇中的杂质的本性还不知道。这些加合物(或降解产物)的形成被认为对药物来说是不理想的甚至是不可接受的,因为现在以多肽为基础的药物的指导方针是强调减少制剂中降解产物形成的重要性。降解产物被认为是不理想的或不能接受的,因为它们提高了以多肽为基础的药物引起所不希望的副反应的机会。本发明的新发现是当IFN-β利用高纯度的甘露醇配制时,即甘露醇的还原活性跟未经高度纯化的甘露醇配制相比低于百万分之二十时,配制的干扰素-β的稳定性提高了。本发明的进一步的新发现在于USP甘露醇通过以甲醇提取、碳处理、超滤、重结晶纯化后,它将使得甘露醇制品的还原活性少于百万分之二十。
II.方法
这些实验中所使用的IFN-β-1b本质上是由大肠杆菌生产的,基本如美国专利第4,462,940号和第5,702,699号中所描述的那样;在此并入以供参考。十二烷基硫酸钠和盐类通过色谱法从IFN-β中除去;IFN-β-1b在pH为11.5-12.0的条件下与人白蛋白溶液合并;利用HCl将溶液的pH值调整到7.5;加入含有赋形剂(甘露醇或葡萄糖)的溶液使得最终浓度达到1.25%。人白蛋白在制剂中最终浓度是1.25%w/v。
利用RP-HPLC为质谱测定法制备了来源于这些配方的IFN-β-1b。这个方法可使得糖基化的IFN-β-1b量化,它在色谱图上形成一个单独的峰(B1)。采用这个方法,糖基化的IFN-β-1b的检测限度是0.02mg/ml。当这个峰的数量小于0.02mg/ml时,两个峰的面积就加和,与未经配制的参考IFN-β比较可获得IFN-β-1b的总含量。当峰面积大于0.02mg/ml时,它的浓度是单独测定和报告的。
以下的设备和它们各自厂商的使用指南被用于分析。
溶剂输送系统:Waters 626梯度泵
注射系统:Waters 717+自动进样器
200ml注射环
带有聚四氟乙烯隔片的聚丙烯自动进样器小瓶
温度设定在4℃的冷冻自动进样器
84%的乙腈用作针头的洗涤液
柱加热器:Waters 600
将柱加热器的温度设定在40℃
柱:BAKERBOND宽孔丁基C4 RP-柱,3005μm,4.6mm(ID)250mm,J.T.Baker零件号码22010。
柱在溶剂流的方向上连接,如柱上的标记所示,并放入柱加热器中。
检测器:Waters 486紫外检测器。
波长设定为214nm。
数据系统输入是无衰减的。
数据系统:P.E.Nelson Turbochrom数据系统。
冻干的IFN-β制剂样品加1.20ml的0.54%的氯化钠溶解,轻轻倒转混合,并在室温下保温30±5分钟。校准物是未经配制的IFN-β参比物。校准物储备溶液被稀释到约0.5mg/ml,被稀释的校准物溶液的浓度是由紫外吸光度来测定的(6次的平均值)。被稀释的校准物溶液的最终浓度是紫外吸光度读数的平均值除以1.7(IFN-β-1b的消光系数)。被稀释的校准物溶液的浓度由吸光度测定到3位有效数字。校准物溶液然后被稀释到0.25mg/ml用作工作校准溶液。
自动进样器被设置为间隔70分钟每次注入20μl。数据系统的电压值是1伏,进样速率是每秒一点,收集时间是70分钟。洗脱剂A是0.1%的TFA(三氟乙酸,HPLC级),洗脱剂b分是84%的乙腈(HPLC级)和0.084%TFA(HPLC级)。洗脱剂流速设置为1.0ml/分(70%的洗脱剂A和30%的洗脱剂B),使柱平衡一小时。在检测器基线和系统被平衡之后,分析梯度空白。当在第二个梯度空白没有明显的峰呈现时就开始分析。
IFN-β的浓度由对应于未修饰的IFN-β(“B”峰)和糖基化的IFN-β(“B1”峰)的峰面积的总和测定。例如,当校准物溶液是0.25mg/ml的未配制的IFN-β时,IFN-β的浓度(mg/ml)=(试验样品总的峰面积B1+B/校准物总的峰面积B+B1)×0.25mg/ml。
电喷雾质谱(ES-MS)数据利用色谱图的组分获得。在分析前每一个峰的组分被收集和浓缩。电喷雾质谱的获得是使用API 100单一四极质谱仪(Perkin-Elmer SciexInstruments,Thornhill,Ontario,加拿大),它接至哈佛注射泵(Harvard Apparatus,South Natick,MA)以及Rheodyne 8125注射器(带有内径为100μM的融合的石英管)。质谱通过扫描140-2500范围内的质量/电荷比(m/z),以正的模式记录下来,使用的阶梯大小是0.2道尔顿,扫描速度为6秒/扫描140-2500。质谱仪使用聚丙二醇混合物来进行校准,这种混合物包含3.3×10-5M PPG 425,1×10-4M PPG 1000和2×10-4PPG 2000(Aldrich化学公司),将它们溶于含有2mM醋酸铵的50∶50∶0.1的水∶甲醇∶蚁酸(v∶v∶v)混合液中。一份蛋白质在49∶40∶1的水∶乙腈∶乙酸中的溶液(2μL,20-50pM)以20μml/分钟的速度引入质谱仪的离子源。由于蛋白质是在低pH值时引入离子源的,碱性部位(例如精氨酸、赖氨酸、组氨酸残基侧链的氮原子)被不同程度的质子化,导致分子离子带有多种电荷状态,例如[M+H]+、[M+2H]2+,这依赖于可以被质子化的部位的数量。检测器记录下各种电荷状态的分子离子的m/z比值,通过使用Biotoolbox软件(Perkin-Elmer Sciex Instruments)可使质谱解卷积而获得蛋白质的分子量。在20kDa之内分子量测量的准确性在2kDa内。
甘露醇的还原活性按USP方案的改良法测定。该方案测定在碱溶液中有二辛可宁酸(BCA,Pierce,根据制造商的指导制备)存在时的Cu2+的还原。BCA与Cu1+终合时,此终合物呈蓝色,在562nm时有吸收峰(A)。
两个甘露醇样品(500μl的150mg/ml甘露醇溶液)在各自条件下进行测定,使用具有已知的还原活性的葡萄糖溶液连续稀释时,标准曲线就产生了。在每一试验样品,标准样品,和空白中加入预先制备的BCA溶液500μl,并在60℃条件下保温40分钟。葡萄糖标准品是符合线性曲线的,甘露醇试验样品的还原活性(百万分率)的计算是((甘露醇样品的A562/标准曲线的斜率)/(以mg/ml为单位的甘露醇含量)(1000))×106。
III.结果和讨论
使用质谱仪在葡萄糖配方中检测到糖基化,就是使IFN-β-1b分子量增加162道尔顿的倍数处。IFN-β-1b多肽的分析表明这些加合物是由于还原性糖和蛋白质赖氨酸残基发生反应而产生的(Amadori反应)。图1对葡萄糖制剂的配方粉末和在50℃下储存一周的冻干制剂的RP-HPLC色谱图进行对比。这张图表明在冻干状态时葡萄糖配方中的IFN-β-1b在50℃时容易发生反应而得出B1峰。配制的粉末(图2)的ES-MS没有和葡萄糖加合物相关的峰出现(加162)。作为对比,保温的冻干葡萄糖制剂(图3)的质谱图显示出广泛的修饰。因此,葡萄糖就和IFN-β-1b发生反应而形成可被RP-HPLC检出的产物,它的结构是靠ES-MS证实的。
相反,用USP甘露醇制备的IFN-β-1b制剂不会形成在RP-HPLC中可检出的B1峰的物质。图4是把利用甘露醇配制的粉末和在50℃保持一周的冻干制剂作比较。明显地,没有B1峰的形成。然而,图5中配制的粉末的质谱图在20040处出现了峰,而图6中的经保温的冻干甘露醇制剂的质谱图在20201处出现新的峰。甘露醇形成的加合物的数量不能用ES-MS来定量;然而,加合物的信号经常接近仪器的检测限。这些峰的形成机制还不知道。甘露醇和IFN-β-1b发生反应不会形成葡萄糖或右旋糖和IFN-β-1b发生反应所形成的物质;B1峰没有形成。因此,数据显示需要较纯的甘露醇,以阻止IFN-β-1b加合物的形成。
为了降低甘露醇的杂质,将它以甲醇提取,然后测试它对IFN-β-1b稳定性的影响。利用三批不同的经甲醇提取过的甘露醇来配制IFN-β-1b,将配制的粉末和最终容器中的测试样品用上面描过述的RP-HPLC和ES-MS方法来测定。图7是利用未经处理的甘露醇配制的IFN-β-1b的质谱图,图8是用经过甲醇提取的同一批的甘露醇配制的IFN-β-1b的质谱图。所有三批都表现出相似的图谱。图17表示甲醇处理会除去超过一半的还原活性。明显地,甲醇处理除去了和IFN-β-1b络合的杂质,但一些杂质经过该处理不能完全除去。
为了减少甘露醇中留下的杂质,另三个步骤加入了提纯过程。这些步骤是碳处理、超滤、重结晶。三批经过甲醇提取、碳处理、超滤和重结晶的甘露醇如上面一样被测试了。比色法还原活性的测定证明了附加的纯化步骤降低了还原活性含量至大概10ppm(见图17,样品7-9)。一种制剂是利用高纯度的甘露醇制备的。利用高纯度的甘露醇所配制的制剂的质谱图(图9)没有发现附加的峰,这些峰不存在于不利用甘露醇制备的制剂粉末的质谱图中,它在同一天进行测定作为阴性对照(图10)。利用USP甘露醇制备的制剂也在同一天进行质谱测定作为阳性对照(图11)。这样对于甘露醇的附加处理就产生了一种还原性低的产物,并且通过ES-MS看来它不会和IFN-β-1b发生反应。
例2:包含高纯度甘露醇的IFN-β配方的稳定性:短期加速研究
I.序言
正如上面所述IFN-β-1b的实验性制剂是利用葡萄糖和甘露醇来制备的,并且进行了加速稳定性研究来对比这些配方。在两种不同的条件下对配方的稳定性进行测试。第一种是将制剂处于高温应激下进行测试,而第二种是将制剂处于室温下长期储存进行稳定性测试。在25℃下储存3个月后,含高纯度甘露醇的制剂没有发现变化,并且在37℃下储存3个月或在50℃储存1个月后,制剂的效价没有发生变化。
II.方法
每一配方的样品在8℃、25℃或37℃下储存三个月。并且,在两个月时,将每种温度条件下的样品取出,并在50℃下存储一个月。转移到50℃条件下的目的是为了加剧也许已经在储存的前两个月中发生的潜在的变化,这样就可以更好地测定是否在25℃和37℃下储存两个月会使得产物回到原来的8℃储存条件时加速降解。
下面测定了IFN-β-1b的比活性。A549人肺癌细胞(ATCC CCL 185)和鼠脑心肌炎病毒株EMC(ATTC VR-129B)自美国标准菌库获得。利用1.2ml稀释液(0.54%NaCl)重配制剂样品,将它用生长/试验培养基连续稀释,和IFN-β-1b的标准品一起加入到96孔的测定板上。每一孔中稀释了的IFN-β的体积是100μl。在生长/试验培养基(加Earle盐和2.2g/L的重碳酸钠,8.9%的胎牛血清,1.79mM的L-谷氨酰胺,89U/ml的青霉素以及89μg链霉素/ml的Eagle MEM)中的A549细胞以1×104细胞/孔的浓度加入。测定板然后在增湿的37℃±2℃,5±1%CO2的培养箱中温育。在温育结束时,细胞被EMC病毒感染,复感染率在5和16之间。测定板然后在增湿的37±2℃,5±1%CO2的培养箱中温育24±1个小时。细胞被预先温热的(37℃)MTT(溴化3-[4,5-位二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑,5mg/ml,50μl/孔)所染色,象前面一样温育3.5到4.5小时。从细胞中吸出培养基,将100μl染色增溶溶液(81%v/v 2-丙醇,3%w/v十二烷基硫酸钠,0.04N HCl)加入每一孔。测定板然后在环境温度于黑暗中温育30-60分钟。接着在微量测定板振荡器上振荡8±3分钟。最后,在微量测定板分光光度计上测量每一孔在570nm处的吸光度。IFN-β活性标准品的活性符合线性回归曲线,试验样品的活性就根据该曲线来测定。每个样品的比活性根据所用样品的质量来计算。
IFN-β-1b浓度的RP-HPLC分析如上述进行。通过还原的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)Western印迹法来监测加合物的形成,表现为IFN-β-1b带的分子量有明显的上升。
III.结果和讨论
在研究中甘露醇制剂的效价(比活性)基本上保持不变,然而葡萄糖制剂的效价却提高了。暴露在37℃条件下一个月对效价没有影响(见图14和15)。对于甘露醇IFN-β-1b配方来说,糖基化的IFN-β-1b的量仍低于在研究时的检测限,即使是在50℃条件下。相对地,在37℃条件下2个月和在50℃条件下2周后检测到葡萄糖制剂中的糖基化。广泛的糖基化使得色谱图改变太多而不能测定出IFN-β-1b的总含量。葡萄糖制剂在37℃下储存2个月或在50℃下储存一个月后,所形成的加合物也可以通过还原的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的Western印迹法来检出,但在25℃条件下储存3个月后不能检出。相对地,对于甘露醇制剂来说,在任何储存条件下都不会观察到还原的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的Western印迹的改变。
例3:含有高纯度甘露醇的IFN-β配方的长期稳定性。
三批(N006,N008,N009)含有高纯度甘露醇的IFN-β-1b制剂在4℃、25℃、30℃条件下储存,一年中每隔三个月测定一次稳定性,第二年每隔六个月测定一次。利用上面描述过的方法测定稳定性。
所有的三批在4℃和30℃下经过24个月后都保持了效价。图16-18给出了数据。另外,在所有的温度和时间测试点三批都显示不高于0.02mgs/ml的峰B1(糖基化的IFN-β)。
本领域技术人员将会仅仅利用传统的实验方法,认识或是能弄清这里所描述的关于IFN-β的本发明的具体实施方案的等价方法。另外,本领域技术人员将会仅仅利用传统的实验方法认识或能弄清,上面用干扰素-β作为例子所提供的实验和配方,在总体上对于蛋白质尤其是药用蛋白质来讲是适用的。药用蛋白包括但不局限于以下蛋白质:人生长激素、所有干扰素、所有白细胞介素、集落刺激因子(GM-CSF、G-CSF、M-CSF)、β-葡糖脑苷脂酶、促甲状腺素、依那西普(etanercept)、单克隆抗体(如阿昔单抗、巴利昔单抗、帕利珠单抗、利妥昔单托和transtuzumab)、凝血因子(例如第VIIa因子和第VIII因子)、酶(例如尿激酶、天(门)冬酰胺酶、阿尼普酶、阿替普酶)。这样的等价物将包含在下面的权利要求书中。
所有在本说明书中提到的出版物和专利申请体现了本发明所属领域中技术人员的水平。这里所有的出版物和专利申请在相同程度上被引用供作参考,就像每一出版物或专利申请是专门和各自被引证而包括在说明书中一样。
Claims (40)
1.含有IFN-β或其变体和高度纯化的甘露醇的组合物。
2.如权利要求1所述的组合物,其中,所述组合物以提高的稳定性为特征。
3.如权利要求1所述的组合物,其中,所述组合物是冻干的。
4.如权利要求1所述的组合物,其中,所述组合物是液体。
5.如权利要求1所述的组合物,其中,所述高度纯化的甘露醇的浓度为0.25%-5%重量/体积。
6.如权利要求1所述的组合物,其中,所述IFN-β或其变体的浓度为0.01mg/ml-15mg/ml。
7.如权利要求1所述的组合物,其中,所述制剂的pH在3.0-9.0的范围内。
8.如权利要求1所述的组合物,它还包含人白蛋白。
9.如权利要求8所述的组合物,其中,所述人白蛋白的浓度为0.01%-15%重量/体积。
10.含有IFN-β和高度纯化的甘露醇的组合物,其特征在于,所述IFN-β是重组人IFN-β,所述重组人IFN-β的浓度为0.01mg/ml-15mg/ml,所述高度纯化的甘露醇的浓度为0.25%-5%重量/体积,所述组合物的pH为3.0-9.0,所述组合物还含有浓度为0.01%-15%重量/体积的人白蛋白。
11.如权利要求10所述的组合物,其中,所述组合物是冻干的。
12.如权利要求10所述的组合物,其中,所述组合物是液体或冷冻的。
13.含有IFN-β和高度纯化的甘露醇的组合物,其特征在于,所述IFN-β是重组人IFN-β,所述重组人IFN-β的浓度为0.01mg/ml-15mg/ml,所述高度纯化的甘露醇的浓度为0.25%-5%重量/体积,所述组合物的pH为3.0-9.0,所述组合物还含有浓度为0.01%-15%重量/体积的人白蛋白和使此组合物等渗的足量的氯化钠。
14.如权利要求13所述的组合物,其中,所述组合物是冻干的。
15.如权利要求13所述的组合物,其中,所述组合物是液体或冷冻的。
16.含有IFN-β和高度纯化的甘露醇的组合物,其特征在于,所述IFN-β是重组人IFN-β,所述重组人IFN-β的浓度为0.05mg/ml-1mg/ml,所述高度纯化的甘露醇的浓度为0.25%-2.5%重量/体积,所述组合物的pH为6.8-8.2,所述组合物还含有浓度为0.25%-2.5%重量/体积的人白蛋白。
17.如权利要求16所述的组合物,其中,所述组合物是冻干的。
18.如权利要求16所述的组合物,其中,所述组合物是液体或冷冻的。
19.如权利要求17所述的组合物,其中,所述组合物是液体,所述液体是冷冻或冻干的。
20.含有IFN-β和高度纯化的甘露醇的组合物,其特征在于,所述IFN-β是重组人IFN-β,所述重组人IFN-β的浓度为0.25mg/ml,所述高度纯化的甘露醇的浓度为1.25%重量/体积,所述组合物的pH为7.3-7.5,所述组合物还含有浓度为1.25%重量/体积的人白蛋白。
21.如权利要求20所述的组合物,它还含有使此组合物等渗的足量的氯化钠。
22.如权利要求20所述的组合物,其中,所述组合物是液体,所述液体是冷冻或冻干的。
23.如权利要求21所述的组合物,其中,所述组合物是液体,所述液体是冷冻或冻干的。
24.如权利要求1所述的组合物,其中,所述IFN-β是含有成熟的天然人IFN-β氨基酸序列的多肽。
25.如权利要求24所述的组合物,其中,所述IFN-β是糖基化或非糖基化的。
26.如权利要求1所述的组合物,其中,所述IFN-β是重组制造的。
27.含有如权利要求1所述组合物的预充填注射器。
28.如权利要求27所述的预充填注射器,其中所述组合物是冷冻的。
29.含有IFN-β或其变体和甘露醇的组合物,其特征在于,所述甘露醇的活性降低不到百万分之二十。
30.含有药用多肽和高度纯化的甘露醇的组合物。
31.如权利要求30所述的组合物,其中,所述药用多肽选自人生长激素、干扰素、白细胞介素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、β-葡糖脑苷脂酶、促甲状腺素、依那西普(etanercept)、单克隆抗体、第VIIa因子、第VIII因子、尿激酶、天(门)冬酰胺酶、阿尼普酶和阿替普酶。
32.一种制造以增加的稳定性为特征的IFN-β或其生物学活性变体制剂的方法,其特征在于,所述方法包括制造含有IFN-β或其生物学活性变体以及含量足以稳定所述IFN-β或其变体的高度纯化的甘露醇的制剂。
33.采用如权利要求32所述方法制造的制剂。
34.一种制造IFN-β或其生物学活性变体制剂的方法,其特征在于,它包括以下步骤:
a)通过色谱法从IFN-β中除去十二烷基硫酸钠和盐类;
b)在pH约为11.5-12.0的条件下将所述IFN-β和人白蛋白溶液混合;
c)用HCl调节溶液的pH值至7.5;以及
d)加入高度纯化的甘露醇溶液。
35.采用如权利要求34所述方法制造的制剂。
36.如权利要求34所述的方法,它还包括冻干所述制剂的步骤。
37.一种提高药物组合物中IFN-β或其变体稳定性的方法,其特征在于,所述方法包括在所述组合物中加入含量足以稳定所述IFN-β或其变体的高度纯化的甘露醇。
38.如权利要求34所述的方法,它还包括加入使此组合物等渗的足量的氯化钠的步骤。
39.采用如权利要求38所述方法制造的制剂。
40.如权利要求38所述的方法,它还包括冻干所述制剂的步骤。
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Cited By (2)
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CN102585011A (zh) * | 2012-02-10 | 2012-07-18 | 中国农业大学 | 一种犬α干扰素衍生物的制备方法与应用 |
CN113797318A (zh) * | 2021-10-26 | 2021-12-17 | 深圳科兴药业有限公司 | 一种干扰素组合物及其制备方法和应用 |
Families Citing this family (15)
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US20040002451A1 (en) * | 2002-06-20 | 2004-01-01 | Bruce Kerwin | Compositions of pegylated soluble tumor necrosis factor receptors and methods of preparing |
US7119061B2 (en) * | 2002-11-18 | 2006-10-10 | Vicuron Pharmaceuticals, Inc. | Dalbavancin compositions for treatment of bacterial infections |
WO2005011605A2 (en) * | 2003-08-01 | 2005-02-10 | Medarex, Inc. | Combination therapies for multiple sclerosis |
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JP5139275B2 (ja) * | 2005-06-21 | 2013-02-06 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | (r)−(−)−2−[5−(4−フルオロフェニル)−3−ピリジルメチルアミノメチル]クロマンを含有する固体医薬組成物 |
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CN101190329B (zh) * | 2006-11-29 | 2013-03-06 | 信谊药厂 | 一种重组人p43蛋白的药物组合物及其在医药上的应用 |
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Family Cites Families (34)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US4439181A (en) | 1981-01-26 | 1984-03-27 | Regents Of The University Of Minnesota | Polyol-hormone mixture for use in chronic parenteral hormone administration |
JPS5821691A (ja) * | 1981-07-29 | 1983-02-08 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | α−及びβ−インタ−フェロンの精製方法 |
DE3273597D1 (en) | 1981-11-28 | 1986-11-06 | Sunstar Kk | Pharmaceutical composition containing interferon in stable state |
AU1234383A (en) | 1982-03-17 | 1983-09-22 | Inter-Yeda Ltd. | Interferon stabilised with polyvinyl-pyrrolidone |
US4462940A (en) | 1982-09-23 | 1984-07-31 | Cetus Corporation | Process for the recovery of human β-interferon-like polypeptides |
US5702699A (en) | 1982-09-23 | 1997-12-30 | Cetus Corporation | Process for the recovery of lipophilic proteins |
US5643566A (en) | 1982-09-23 | 1997-07-01 | Cetus Corporation | Formulation processes for lipophilic proteins |
US4992271A (en) | 1982-09-23 | 1991-02-12 | Cetus Corporation | Formulation for lipophilic IL-2 proteins |
DE3484374D1 (de) | 1983-08-04 | 1991-05-08 | Green Cross Corp | Gamma-interferonzusammensetzung. |
JPS6069037A (ja) | 1983-09-26 | 1985-04-19 | Sunstar Inc | エリテマト−デス治療用外用剤 |
JPS61500439A (ja) | 1983-11-21 | 1986-03-13 | リ−ジエンツ オヴ ザ ユニヴア−シテイ− オヴ ミネソタ | 慢性的非経口ホルモン投与用緩衝化ポリオ−ル−ホルモン混合物 |
US4605555A (en) | 1984-09-20 | 1986-08-12 | Sun Star Kabushiki Kaisha | Composition and method for treating keratosic disorder of skin and mucosa |
US4816440A (en) | 1985-09-26 | 1989-03-28 | Cetus Corporation | Stable formulation of biologically active proteins for parenteral injection |
US5183746A (en) | 1986-10-27 | 1993-02-02 | Schering Aktiengesellschaft | Formulation processes for pharmaceutical compositions of recombinant β- |
CA1294215C (en) | 1986-10-27 | 1992-01-14 | Ze'ev Shaked | Pharmaceutical compositions of recombinant beta-interferon and formulation processes |
US4808705A (en) * | 1986-12-19 | 1989-02-28 | Cetus Corporation | Stable formulations of ricin toxin a chain and of RTA-immunoconjugates and stabilizer screening methods therefor |
US4894330A (en) * | 1986-12-23 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | Purification of recombinant beta-interferon incorporating RP-HPLC |
EP0284249A1 (en) * | 1987-03-13 | 1988-09-28 | Interferon Sciences, Inc. | Lyophilized lymphokine composition |
IT1222427B (it) * | 1987-07-31 | 1990-09-05 | Sclavo Spa | Procedimento per la purificazione di interferone |
US5151265A (en) | 1987-11-03 | 1992-09-29 | Genentech, Inc. | Gamma interferon formulation |
US5004605A (en) | 1987-12-10 | 1991-04-02 | Cetus Corporation | Low pH pharmaceutical compositions of recombinant β-interferon |
US5104651A (en) | 1988-12-16 | 1992-04-14 | Amgen Inc. | Stabilized hydrophobic protein formulations of g-csf |
IL89662A (en) * | 1989-03-19 | 1997-11-20 | Interpharm Lab Ltd Kiryat Weiz | Pharmaceutical compositions comprising interferon-beta |
ATE148165T1 (de) | 1989-07-24 | 1997-02-15 | Bayer Ag | Stabilisierung von hochgereinigten proteinen |
JPH05963A (ja) | 1990-04-13 | 1993-01-08 | Toray Ind Inc | ポリペプチド類組成物 |
TW249202B (zh) | 1993-08-13 | 1995-06-11 | Ciba Gerigy Corp | |
FR2710637B1 (fr) | 1993-09-28 | 1995-12-08 | Roquette Freres | Mannitol pulvérulent de friabilité modérée et son procédé de préparation. |
FR2719479B1 (fr) | 1994-05-04 | 1996-07-26 | Sanofi Elf | Formulation stable lyophilisée comprenant une protéine: kit de dosage. |
US5542303A (en) * | 1994-05-12 | 1996-08-06 | Neuffer; A. Erich | Dual-peak torque measuring apparatus |
IT1272252B (it) | 1994-05-16 | 1997-06-16 | Applied Research Systems | Formulazioni liquide di interferone beta |
AU696387B2 (en) * | 1994-05-18 | 1998-09-10 | Inhale Therapeutic Systems, Inc. | Methods and compositions for the dry powder formulation of interferons |
TW426523B (en) | 1995-04-06 | 2001-03-21 | Hoffmann La Roche | Interferon solution |
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CX01 | Expiry of patent term | ||
CX01 | Expiry of patent term |
Granted publication date: 20070808 |