PL206428B1 - Sposób otrzymywania kompozycji zawierającej interferon beta (IFN-β) - Google Patents

Description

Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 365896 (22) Data zgłoszenia: 26.10.2001 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

26.10.2001, PCT/US01/051038 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

02.05.2002, WO02/34791 (11) 206428 (13) B1 (51) Int.Cl.

C07K 1/30 (2006.01)

A61K 38/21 (2006.01) C07K 14/565 (2006.01) (54) Sposób otrzymywania kompozycji zawierającej interferon beta (IFN-β)

	(73) Uprawniony z patentu:
(30) Pierwszeństwo:	Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc.,
27.10.2000, US, 60/243,965	Emeryville, US
09.04.2001, US, 60/282,607 18.10.2001, US, 60/330,375
25.10.2001, US, 10/035,420	(72) Twórca(y) wynalazku: SID WOLFE, Emeryville, US IRINA ESIKOVA, Emeryville, US
(43) Zgłoszenie ogłoszono:	SUSAN BABUKA, Emeryville, US
10.01.2005 BUP 01/05	BRET A. SHIRLEY, Emeryville, US DENNIS FORDHAM, Emeryville, US
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
31.08.2010 WUP 08/10	(74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Marta Kawczyńska

PL 206 428 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania kompozycji zawierającej interferon beta (IFN-β) w postaci monomerowej.

Dziedzina wynalazku

Wynalazek dotyczy dziedziny inżynierii biochemicznej, zwłaszcza poprawionego sposobu odzyskiwania biochemicznego, w którym zrekombinowany interferon beta może być ponownie zwijany i odzyskiwany w zasadniczo czystej i monomerowej postaci. Tę kompozycję można stosować w preparatach farmaceutycznych.

Opis stanu techniki

Występujące w naturze interferony są białkami gatunkowo-specyficznymi wytwarzanymi przez różne komórki podczas indukowania wirusami, dwuniciowymi RNA, innymi polinukleotydami, antygenami i mitogenami. Interferony wykazują się różnorodną aktywnością biologiczną, włączając aktywność przeciwwirusową, przeciwproliferacyjną, immunomodulującą i przeciwkomórkową. Badanie tych typów aktywności doprowadziło do zidentyfikowania i scharakteryzowania co najmniej trzech odrębnych typów ludzkich interferonów, które podaje się za różne białka kodowane przez odrębne geny strukturalne. Interferony, które często są glikoproteinami, klasyfikowano pierwotnie na podstawie ich źródła komórkowego i później reklasyfikowano jako alfa, beta (β) i gamma.

Interferon beta (IFN-β) wytwarzany jest przez komórki fibroblastów i nabłonka. Natywny interferon beta wytwarzano przez superindukowanie kultur ludzkich fibroblastów kwasem poliryboinozynowym i kwasem polirybocytydylowym oraz oddzielenie i oczyszczenie tak wytworzonego (wytworzonych) interferonu (interferonów) za pomocą technik chromatograficznych i elektroforezy. Koszt i trudność oczyszczania interferonów tym sposobem wykluczały obszerne badania kliniczne i ocenę terapeutycznej wartości interferonów. Izolacja interferonów z naturalnych źródeł pozostaje stosunkowo trudna i kosztowna.

Ostatnio sklonowano szereg genów ludzkiego interferonu z użyciem technologii rekombinowanego DNA (rDNA) i wyrażano w E. coli (Nagola i in., Nature 284, 316 (1980); Goeddel i in., Nature 287, 411 (1980); Yelverton i in., Nucleic Acids Res. 9, 731 (1981); Streuli i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2848 (1981). Białka i polipeptydy, które wykazują własności podobne do własności interferonu beta można również wytwarzać z użyciem technologii rDNA przez ekstrakcję informacyjnego RNA 12S bogatego w poli-A z komórek ludzkich indukowanych wirusem, syntetyzując dwuniciowy cDNA z użyciem mRNA jako matrycy, wprowadzając cDNA do odpowiedniego wektora do klonowania, transformując odpowiednie mikroorganizmy za pomocą wektora, zbierając mikroorganizmy i ekstrahując z nich interferon beta. Patrz na przykład europejskie zgłoszenia patentowe nr 28033 (opublikowane 6 maja 1981); 32134 (opublikowane 15 lipca 1981) i 34307 (opublikowane 26 sierpnia 1981), które przedstawiają różne sposoby wytwarzania interferonu beta przy pomocy technik rDNA. Wyrażane białka albo polipeptydy z klonów rekombinowanego DNA oczyszczano, badano i stwierdzono, że wykazują własności podobne do własności natywnych interferonów. Tak więc interferony wytwarzane drogą bakteryjną mają potężne działanie terapeutyczne jako środki przeciwwirusowe i przeciwnowotworowe. Wytwarzanie interferonów za pomocą takich fermentacji bakteryjnych daje duże ilości interferonu przy względnie niskich kosztach, co czyni interferon bardziej dostępnym dla wielu zastosowań, takich jak badania kliniczne.

Interferon beta do stosowania w badaniach klinicznych musi być stosunkowo wysokiej czystości i zasadniczo niezanieczyszczony toksycznymi składnikami komórkowymi gospodarza, szczątkami komórek i innymi obcymi chemikaliami wprowadzonymi podczas etapów ekstrakcji i oczyszczania. Istnieje szereg dostępnych obecnie sposobów otrzymywania, odzyskiwania i oczyszczania IFN-β.

Sposoby oczyszczania i odzyskiwania IFN-β ujawnione w amerykańskich opisach patentowych nr 4,462,940 i 5,702,699 i podobne sposoby dają czystą postać IFN-β, która ma tendencję do agregowania w nieobecności silnych solubilizatorów, np. siarczanu dodecylu sodu (SDS). Ponadto w takich sposobach (1) poddaje się białko działaniu warunków wysokiego pH, co może wpływać szkodliwie na biologiczne właściwości białek, oraz (2) otrzymuje się kompozycje zawierające resztkowe ilości SDS stosowanego do rozpuszczania białka podczas oczyszczania.

Dlatego istnieje zapotrzebowanie na poprawiony proces odzyskiwania i oczyszczania, w którym IFN-β nie jest poddawany działaniu środowiska o wysokiej alkaliczności, preparat jest wolny albo praktycznie wolny od SDS i białko jest rozpuszczalne przy pH odpowiednim do podawania pozajelitowego.

PL 206 428 B1

Celem wynalazku jest uzyskanie farmaceutycznie dopuszczalnej próbki IFN-β o stosunkowo wysokiej czystości i łatwo ponownie zwijanej w procesie oczyszczania i odzyskiwania.

Streszczenie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania kompozycji zawierającej monomerowy interferon beta (IFN-β), polegający na tym, że:

a) otrzymuje się próbkę zawierającą oczyszczony IFN-β;

b) miesza się tę próbkę z chlorowodorkiem guanidyny w celu otrzymania pierwszego roztworu zawierającego solubilizowany denaturowany IFN-β; i

c) renaturuje się IFN-eprzez rozcieńczenie pierwszego roztworu pierwszym buforem, przy czym pierwszy bufor ma pH 3,0 do 5,0, i przy czym otrzymuje się roztwór renaturowanego IFN-β zawierający monomerowy IFN-β i pozostały chlorowodorek guanidyny.

Korzystnie pozostały chlorowodorek guanidyny zawarty jest w roztworze renaturowanego IFN-β w stężeniu 1,6 M albo mniejszym.

Korzystnie pozostały chlorowodorek guanidyny zawarty jest w roztworze renaturowanego IFN-β w stężeniu 0,8 M albo mniejszym.

Korzystnie pozostały chlorowodorek guanidyny zawarty jest w roztworze renaturowanego IFN-β w stężeniu 0,1 M albo mniejszym.

Korzystnie sposób ten obejmuje ponadto etap, w którym usuwa się pozostały chlorowodorek guaninidyny z roztworu renaturowanego IFN-β przez diafiltrację lub dializę renaturowanego roztworu IFN-β do drugiego buforu, przy czym drugi bufor ma pH 3,0 do 5,0 i wybrany jest z grupy składającej się z glicyny, kwasu asparaginowego i bursztynianu sodu.

Korzystnie stosuje się IFN-β glikozylowany albo nieglikozylowany.

Korzystnie stosuje się IFN-β otrzymany rekombinacyjnie.

Korzystnie jako IFN-β stosuje się dojrzały ludzki IFN-β lub jego wariant, przy czym wariant wykazuje co najmniej 80% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową dojrzałego ludzkiego IFN-β.

Korzystniej wariant ma sekwencję aminokwasową dojrzałego ludzkiego IFN-β z podstawieniem reszty seryny za resztę cysteiny w pozycji 17 sekwencji dojrzałego ludzkiego IFN-β.

Zgodnie z wynalazkiem opisano poprawione sposoby użyteczne przy otrzymywaniu preparatów farmaceutycznych IFN-β. Sposoby te pozwalają na otrzymanie ciekłych kompozycji zawierających monomerowy IFN-β. Sposoby te obejmują warunki zwiększające ponowne zwijanie białka podczas procesu odzyskiwania.

Dla osiągnięcia powyższej opisanego celu, zgodnie z celem wynalazku w postaci rozwiązania szerzej tu opisanego, wynalazek dostarcza poprawione sposoby oczyszczania i odzyskiwania IFN-β.

W innym rozwiązaniu poprawiony sposób oczyszczania i odzyskiwania IFN-β obejmuje otrzymywanie próbki zasadniczo oczyszczonego IFN-β i mieszanie tej próbki z chlorowodorkiem guanidyny w celu utworzenia roztworu zawierającego solubilizowany denaturowany IFN-β. Roztwór ten, zawierający solubilizowany denaturowany IFN-β, rozcieńcza się następnie właściwym pierwszym buforem w celu otrzymania roztworu zawierającego solubilizowany renaturowany IFN-β. Otrzymany roztwór solubilizowanego renaturowanego IFN-β poddaje się następnie diafiltracji albo dializie do buforu odpowiedniego do celów farmaceutycznych. Jak wyżej wspomniano w ostatnim stadium usuwa się pozostały chlorowodorek guanidyny, otrzymując preparat farmaceutyczny zawierający monomerowy IFN-βodpowiedni do podawania pozajelitowego.

Krótki opis rysunków

Figura 1 przedstawia dane z chromatografii HPLC różnicującej ze względu na wielkość zebrane po rozcieńczeniu IFN-β w różnych buforach następującym po etapie solubilizacji w chlorowodorku guanidyny.

Figura 2 przedstawia wpływ soli i pH na odzyskiwanie IFN-β z buforu 0,4 M chlorowodorku guanidyny, 10 mM NaPO4, pH 7,0.

Figura 3 przedstawia wpływ Tween 80 na agregację renaturowanego IFN-β otrzymanego sposobem tu opisanym.

Opis szczegółowy wynalazku

Zgodnie z wynalazkiem opisano nowe sposoby otrzymywania IFN-β w postaci monomerowej. Przez określenie monomerowa rozumie się, że większość zawartego w preparacie albo kompozycji IFN-β (wagowo) jest raczej monomerowa niż zagregowana. Przez zagregowana rozumie się wzajemne oddziaływanie fizyczne między cząsteczkami polipeptydu, które powoduje utworzenie niekowa4

PL 206 428 B1 lentnych multimerów, które mogą pozostać rozpuszczalne albo mogą być wytrącone z roztworu. Zawartość procentowa (wagowo) monomerowego IFN-β w monomerowej kompozycji albo preparacie może być różna od 51% albo wyższa. Wynalazek dostarcza sposoby otrzymywania kompozycji zawierających monomerowy IFN-β, realizowanych bez zastosowania tradycyjnego stabilizatora HSA, oraz wolnych albo praktycznie wolnych od siarczanu dodecylu sodu (SDS) (np. zawierających mniej niż 10 mikrogramów SDS na miligram IFN-β). Kompozycje te, zawierające monomerowy IFN-β, są dlatego odpowiednie do zastosowania w preparatach farmaceutycznych albo terapeutycznych. Monomerowa postać polipeptydu IFN-β jest rozpuszczalna i stąd określana jest jako solubilizowana w kompozycjach farmaceutycznych tu opisanych. Tak więc obecny wynalazek pozwala na otrzymanie wolnych od HSA i SDS kompozycji farmaceutycznych IFN-β, które zawierają co najmniej 51% IFN-β w postaci monomerowej, i jako odmiennej od postaci zagregowanej, zwłaszcza co najmniej 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, w szczególności co najmniej 90% albo więcej IFN-β w postaci monomerowej.

W jednym przykładzie przedstawionym dla lepszego zrozumienia wynalazku, który nie jest jednak jego realizacją, kompozycję zawierającą monomerowy IFN-β otrzymuje się przez wytrącenie zasadniczo oczyszczonego IFN-β z roztworu, ponowne zawieszanie osadu przez rozpuszczenie w chlorowodorku (HCl) guanidyny, usunięcie całego pozostałego SDS przez filtrację w przypadku, kiedy wyjściowa próbka IFN-β zawiera SDS i następnie renaturację IFN-β przez rozcieńczenie otrzymanego roztworu chlorowodorku guanidyny-IFN-β roztworem odpowiedniego buforu. Przez zasadniczo oczyszczony rozumie się, że IFN-β w wyjściowym materiale jest w zasadzie wolny od składników, które normalnie towarzyszą białku albo oddziałują z białkami, jak stwierdzono w ich naturalnie występującym środowisku tj. natywnej komórce albo komórce gospodarza w przypadku IFN-β wytworzonego przez rekombinację. Polipeptyd IFN-β wolny od materiału komórkowego obejmuje preparaty białek zawierających mniej niż 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% albo 1% (suchej masy) białek zanieczyszczających. Kiedy polipeptyd IFN-β albo jego biologicznie czynny wariant wytwarzany jest przez rekombinację, dogodnie pożywka hodowlana reprezentuje mniej niż 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% albo 1% (suchej masy) prekursorów chemicznych albo środków chemicznych nie stanowiących białka będącego przedmiotem zainteresowania. Tak więc uważa się, że zasadniczo oczyszczony IFN-β do zastosowania w sposobach według wynalazku posiada stopień czystości co najmniej 70%, zwłaszcza poziom czystości co najmniej 75%, 80%, 85%, w szczególności poziom czystości co najmniej 90% albo większy zgodnie z oznaczeniem za pomocą analizy SDS/PAGE.

W innym rozwiązaniu kompozycja zawierająca monomerowy IFN-β otrzymywana jest z pominięciem wspomnianego wyżej etapu wytrącania. W tym sposobie próbkę zawierającą zasadniczo oczyszczony IFN-β miesza się z chlorowodorkiem guanidyny w celu otrzymania roztworu zawierającego solubilizowany denaturowany IFN-β; następnie IFN-β jest renaturowany przez rozcieńczenie otrzymanego roztworu IFN-β w chlorowodorku guanidyny we właściwym buforze. Implikacje tych etapów wytwarzania są podstawą sposobów według wynalazku otrzymywania preparatów do iniekcji zawierających monomerowy IFN-β, które są użyteczne w terapii IFN-β skierowanej na choroby odpowiadające na IFN-β.

Użyte tu określenie IFN-beta albo IFN-β odnosi się do IFN-β albo jego wariantów, czasem określanych tu jako polipeptydy podobne do IFN-β. Tak na przykład warianty ludzkiego IFN-β, które mogą występować w naturze (np. warianty alleliczne występujące w lokus IFN-β) lub które mogą być wytworzone przez rekombinację, posiadają takie same sekwencje aminokwasowe, podobne albo zasadniczo podobne do sekwencji dojrzałego natywnego IFN-β człowieka. Określenie IFN-β albo IFN-beta również obejmuje fragmenty IFN-β albo skrócone postaci IFN-β, które zachowują aktywność. Te aktywne biologicznie fragmenty albo skrócone postaci IFN-β powstają przez usunięcie reszt aminokwasowych z pełnej długości sekwencji aminokwasowe j IFN-β z użyciem dobrze znanych specjalistom technik rekombinacji DNA. Polipeptydy IFN-β mogą być glikozylowane (^^β-^) albo nieglikozylowane (IFN-β-^) i jak opisano w literaturze IFN-β zarówno glikozylowane jak i nieglikozyliwane IFN-β wykazują jakościowo podobne specyficzne aktywności i dlatego ugrupowania glikozylowe nie są zaangażowane ani nie przyczyniają się do biologicznej aktywności IFN-β.

Do wariantów IFN-β tym objętych należą muteiny sekwencji dojrzałego natywnego IFN-β (patrz na przykład amerykański patent nr 5,814,485), w których jedna albo więcej reszt cysteinowych, które nie są niezbędne dla aktywności biologicznej, zostało rozmyślnie usuniętych albo zastąpionych innymi aminokwasami w celu wyeliminowania albo miejsc do sieciowania międzycząsteczkowego albo tworzenia nieprawidłowego wiązania disiarczkowego. Warianty IFN-β tego typu obejmują warianty zawierające glicynę, walinę, alaninę, leucynę, izoleucynę, tyrozynę, fenyloalaninę, histydynę, tryptofan, sePL 206 428 B1 rynę, treoninę albo metioninę podstawione za cysteinę znajdującą się przy aminokwasie 17 dojrzałej natywnej sekwencji aminokwasowej. Seryna i treonina są bardziej zalecanymi zamiennikami z powodu ich podobieństwa chemicznego do cysteiny. Zastąpienia seryną są korzystne. Patrz na przykład wariant IFN-β, w którym cysteina znajdująca się przy aminokwasie 17 dojrzałej natywnej sekwencji zastąpiona jest seryną (amerykański patent nr 5,814,485). Cysteinę 17 można również usunąć stosując sposoby znane w dziedzinie (patrz na przykład amerykański patent nr 4,518,584), otrzymując muteinę dojrzałego IFN-β, która jest o jeden aminokwas krótsza od dojrzałego natywnego IFN-β. Patrz również, jako przykłady, amerykańskie patenty nr 4,530,787; 4,572,798 i 4,588,585. Tak więc warianty IFN-β z jedną albo większą ilością mutacji, które poprawiają na przykład ich użyteczność farmaceutyczną, są również objęte obecnym wynalazkiem.

Specjalista w dziedzinie uzna, że dodatkowe zmiany można wprowadzić przez mutację w sekwencjach nukleotydowych kodujących IFN-β, prowadząc w ten sposób do zmian w sekwencji aminokwasowej IFN-β bez zmiany aktywności biologicznej interferonu. Zatem wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca wariant IFN-β posiadający sekwencję, która różni się od sekwencji aminokwasowej natywnego IFN-β, może powstać przez wprowadzenie jednego albo większej ilości podstawień, addycji albo delecji nukleotydowych do odpowiedniej sekwencji nukleotydowej kodującej natywny IFN-β, tak że do zakodowanego IFN-β wprowadza się jedno albo więcej podstawień, addycji albo delecji aminokwasowych. Mutacje można wprowadzić za pomocą technik standardowych, takich jak mutageneza ukierunkowana i mutageneza za pośrednictwem PCR. Takie warianty IFN-β są również objęte obecnym wynalazkiem.

Na przykład konserwatywne podstawienia aminokwasowe można wykonać przy jednym albo większej ilości przewidzianych, dogodnie nie - zasadniczych reszt aminokwasowych. Nie-zasadniczą resztą aminokwasową jest reszta, która może być zmieniona w sekwencji IFN-β typu dzikiego bez zmiany jej biologicznej aktywności, podczas gdy zasadnicza reszta aminokwasowa jest niezbędna dla aktywności biologicznej. Konserwatywne podstawienie aminokwasowe jest tym, w którym reszta aminokwasowa jest zastąpiona resztą aminokwasową posiadającą podobny łańcuch boczny. Rodziny reszt aminokwasowych posiadające podobne łańcuchy boczne zostały określone przez w dziedzinie. Rodziny te obejmują aminokwasy z zasadowymi łańcuchami bocznymi (np. lizyna, arginina, histydyna), kwasowymi łańcuchami bocznymi (np. kwas asparaginowy, kwas glutaminowy), nie naładowanymi polarnymi łańcuchami bocznymi (np. glicyna, asparagina, glutamina, seryna, treonina, tyrozyna, cysteina), niepolarnymi łańcuchami bocznymi (np. alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina, tryptofan), beta-rozgałęzionymi łańcuchami bocznymi (np. treonina, walina, izoleucyna) i aromatycznymi łańcuchami bocznymi (np. tyrozyna, fenyloalanina, tryptofan, histydyna). Takie podstawienia nie będą wykonywane dla konserwowanych reszt aminokwasowych albo dla reszt aminokwasowych umiejscowionych wewnątrz konserwowanego motywu.

Alternatywnie sekwencje nukleotydowe wariantu IFN-β można wykonać przez wprowadzenie mutacji przypadkowych wzdłuż całości lub części sekwencji kodującej IFN-β, na przykład mutagenezę nasycenia, i otrzymane mutanty można przeszukiwać ze względu na ich aktywność biologiczną IFN-β w celu zidentyfikowania mutantów, które utrzymują aktywność. Następnie po mutagenezie, kodowane białko można wyrażać rekombinacyjnie, a aktywność białka można oznaczyć stosując opisane tu standardowe techniki oznaczania.

Biologicznie aktywne warianty IFN-β mają się na ogół co najmniej 80%, zwłaszcza 90 do 95% albo więcej a w szczególności 99% identycznością sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową cząsteczki IFN-β stanowiącej odniesienie, na przykład natywnego ludzkiego IFN-β służącego jako podstawa do porównania. Przez identyczność sekwencji rozumie się, że te same reszty aminokwasowe znajdują się w polipeptydzie wariantu i cząsteczce polipeptydu, który służy jako odniesienie, kiedy określony sąsiadujący segment sekwencji aminokwasowej wariantu dopasowuje się i porównuje z sekwencją aminokwasową cząsteczki odniesienia.

W celu optymalnego dopasowania dwóch sekwencji dla oznaczenia identyczności sekwencji, sąsiadujący segment sekwencji aminokwasowej wariantu może posiadać dodatkowe reszty aminokwasowe albo usunięte reszty aminokwasowe w porównaniu do sekwencji aminokwasowej cząsteczki odniesienia. Sąsiadujący segment stosowany dla porównania z sekwencją aminokwasową stanowiącą odniesienie będzie zawierał co najmniej 20 kolejnych reszt aminokwasowych. Poprawki za zwiększoną identyczność sekwencji związaną z wstawieniem przerw w sekwencji aminokwasowej wariantu można wprowadzić poprzez przypisanie kar za przerwy. Sposoby dopasowywania sekwencji są dobrze znane w dziedzinie.

PL 206 428 B1

Oznaczenie procentu identyczności między dowolnymi dwiema sekwencjami można wykonać stosując algorytm matematyczny. Jednym zalecanym, nieograniczającym przykładem algorytmu matematycznego stosowanego do porównywania sekwencji jest algorytm Myersa i Millera, Comput. Appl. Biosci. 4, 11-7 (1988). Taki algorytm stosuje się w programie ALIGN (wersja 2.0), który jest częścią pakietu oprogramowania GCG do tworzenia dopasowań. Porównując sekwencje aminokwasowe za pomocą programu ALIGN można stosować macierz podstawień aminokwasów PAM120, karę za długość przerwy 12 albo karę za przerwę 4. Innym zalecanym, nie ograniczającym przykładem algorytmu matematycznego do stosowania przy porównywaniu dwóch sekwencji jest algorytm Karlina i Altschula, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873-5877 (1990), modyfikowany według Karlina i Altschula, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90, 5873-5877 (1993). Taki algorytm wprowadza się do programów NBLAST i XBLAST Altschula i in., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990). Badanie sekwencji aminokwasów metodą BLAST można prowadzić za pomocą programu XBLAST, wynik = 50, długość słowa = 3, aby otrzymać sekwencję aminokwasową podobną do polipeptydu będącego przedmiotem zainteresowania. W celu otrzymania dopasowania z przerwami do celów porównawczych moż na wykorzystać BLAST z uwzglę dnieniem przerw zgodnie z opisem Altschula i in., Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402 (1997). Alternatywnie, do prowadzenia zintegrowanego badania, które wykrywa odległe powiązania między cząsteczkami można stosować PSI-BLAST. Patrz Altschul i in. jak wyżej (1997). Kiedy stosuje się programy BLAST, BLAST z uwzględnieniem przerw albo PSI-BLAST, można stosować parametry standardowe. Patrz strona internetowa ncbi.nlm.nih.gov. Patrz również program ALIGN (Dayhoff, Atlas of protein Sequence and Structure, 5, Suppl. 3, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., 1978) oraz programy w Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (dostępne w Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin), na przykł ad program GAP, gdzie stosuje się standardowe parametry programów.

Rozważając procent identyczności sekwencji aminokwasowej, niektóre pozycje reszt aminokwasowych mogą różnić się w wyniku konserwatywnych podstawień aminokwasowych, które nie mają wpływu na właściwości funkcjonalne białka. W tych przypadkach procent identyczności sekwencji można podnieść wliczając podobieństwo konserwatywnie podstawionych aminokwasów. Takie regulacje są dobrze znane w dziedzinie. Patrz na przykład Myers i Miller, Comput. Appl. Biosci. 4, 11-17 (1988).

Biologicznie aktywne warianty IFN-β objęte wynalazkiem powinny zachować aktywności IFN-β, szczególnie zdolność wiązania receptorów IFN-β. Aktywność biologiczną wariantów IFN-β można mierzyć każdą metodą znaną w dziedzinie. Przykłady takich badań można znaleźć w publikacjach: Fellous i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 3082-3086 (1982); Czerniecki i in., J.Virol., 49(2), 490-496 (1984); Mark i in., Proc. Natl Acad. Sci., 81, 5662-5666 (1984); Branca i in., Nature, 277, 221-223 (1981); Williams i in., Nature, 282, 582-586 (1979); Herberman i in., Nature, 277, 221-223 (1979) oraz Anderson i in., J. Biol. Chem., 257(19), 11301-11304 (1982).

Przykłady polipeptydów IFN-β oraz polipeptydów wariantów IFN-β objęte wynalazkiem zostały przedstawione w publikacjach: Nagata i in., Nature, 284, 316-320 (1980); Goeddel i in., Nature, 287, 411-416 (1980); Yelverton i in., Nucleic Acids Res, 9, 731-741 (1981); Streuli i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2848-2852 (1981); EP 028033B1 i EP109748B1. Patrz również amerykańskie pateny nr 4,518,584; 4,569,908; 4,588,585; 4,738,844; 4,753,795; 4,769,233; 4,793,995; 4,914,033; 4,959,314; 5,545,723 i 5,814,485. Przytoczone publikacje dają również wskazówki dotyczące reszt i regionów polipeptydu IFN-β, które mogą być zamienione bez utraty aktywności biologicznej.

Przez IFN-β wytworzony przez rekombinację rozumie się IFN-β posiadający aktywność biologiczną porównywalną z natywnym IFN-β i wytworzony za pomocą technik rekombinacji DNA. IFN-β można wytworzyć poprzez hodowlę komórki gospodarza transformowanej wektorem ekspresyjnym zawierającym sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd IFN-β. Komórka gospodarza jest tą, która transkrybuje sekwencję nukleotydową i wytwarza pożądane białko, i może być ona prokariotyczna (na przykład E. coli) albo eukariotyczna (na przykład komórka drożdży, owada albo ssaka). Przykłady wytwarzania rekombinacyjnego IFN-β podają publikacje: Mantei i in., Nature 297, 128 (1982); Ohno i in., Nucleic Acids Res., 10, 967 (1982); Smith i in., Mol. Cell. Biol., 3, 2156 (1983) oraz amerykańskie patenty nr 4,462,940; 5,702,699 i 5,814,485. Patrz również amerykański patent nr 5,795,779, zgodnie z którym IFN^-1a wytwarza się przez rekombinację w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO). Geny ludzkiego interferonu klonowano stosując technologię rekombinacji DNA (rDNA) i wyrażano w E. coli (Nagola i in., Nature 284, 316 (1980); Goeddel i in., Nature, 287, 411 (1980); Yelverton i in., Nuc. Acid. Res., 9, 731 (1981); Streuli i in., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78, 2848 (1981). Alternatywnie IFN-β może być wytwarzany przez zwierzęta albo rośliny transgeniczne, które zmodyfikowano

PL 206 428 B1 z użyciem inżynierii genetycznej aby wyrażały białko IFN-β będące przedmiotem zainteresowania, zgodnie ze sposobami znanymi specjalistom.

Białka albo polipeptydy, które wykazują własności podobne do własności natywnego interferonu beta mogą również być wytwarzane za pomocą technologii rDNA przez ekstrakcję informacyjnego RNA 12S bogatego w poli-A z komórek ludzkich indukowanych przez wirusa, syntezę dwuniciowego cDNA z zastosowaniem mRNA jako matrycy, wprowadzenie cDNA do odpowiedniego wektora do klonowania, transformowanie odpowiednich mikroorganizmów wektorem, zebranie mikroorganizmów i wyekstrahowanie z nich interferonu beta. Patrz na przykład europejskie zgłoszenia patentowe nr 28033 (opublikowane 6 maja 1981); 32134 (opublikowane 15 lipca 1981) i 34307 (opublikowane 26 sierpnia 1981), które opisują różne sposoby wytwarzania IFN-β z zastosowaniem technik rDNA.

Alternatywnie IFN-β można syntetyzować chemicznie za pomocą każdej z technik znanych specjalistom w dziedzinie peptydów. Patrz na przykład Li i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 22162220 (1983), Steward i Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, 1984) oraz Baraney i Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, wyd. Gross i Meinhofer, Vol. 2 (Academic Press, New York 1980), str. 3-254, omawiające techniki syntezy peptydów w fazie stałej oraz Bodansky, Principles of Peptide Synthesis (Springer-Verlag, Berlin 1984) oraz Gross i Meinhofer, red., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol.1 (Acadamic Press, New York 1980), omawiające klasyczne syntezy w roztworze. IFN-β można również otrzymywać chemicznie metodą równoczesnej złożonej syntezy peptydu. Patrz na przykład Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 5131-5135 (1984) i amerykański patent nr 4,632,211.

Otrzymywanie kompozycji zawierających monomerowy IFN-β dogodnie prowadzi się zgodnie z jednym z dwóch sposobów oczyszczania. Pierwszy z tych sposobów oczyszczania, który przedstawiony jest tu dla lepszego zrozumienia wynalazku, ale nie stanowi jego realizacji, obejmuje trzy podstawowe etapy: (1) wytrącania IFN-β z roztworu zawierającego zasadniczo oczyszczony IFN-β; (2) rozpuszczania wytrąconego IFN-β w chlorowodorku guanidyny (HCl) w celu osiągnięcia resolubilizacji IFN-β; oraz (3) renaturacji IFN-β, dogodnie przez rozcieńczenie albo dializę z użyciem dopuszczalnego buforu. Tym sposobem oczyszczania otrzymuje się IFN-β, który jest rozpuszczalny, trwały i w postaci raonomerowej. Otrzymaną kompozycję można preparować jako kompozycję farmaceutyczną przez następną diafiltrację albo dializę tej kompozycji z użyciem farmaceutycznie dopuszczalnego buforu. W tym końcowym etapie usuwa się pozostałości chlorowodorku guanidyny z roztworu zawierającego renaturowany IFN-β i uzyskuje preparat o pH dopuszczalnym do podawania pozajelitowego.

Przy stosowaniu sposobu oczyszczania według wynalazku najpierw otrzymuje się precypitat IFN-β przez wytrącenie zasadniczo oczyszczonego IFN-β z roztworu. Wytrącenie można osiągnąć przez obniżenie rozpuszczalności IFN-β. Obniżenie rozpuszczalności i wytrącenie IFN-β można uzyskać stosując alkohol, na przykład alkohol alifatyczny, taki jak etanol. W przypadku niektórych białek wytrącenie występujące w wyniku reakcji denaturacji i/lub agregacji jest nieodwracalne, prowadząc do inaktywacji białka, lecz w przypadku IFN-β wytrąconego według niniejszego wynalazku, reakcja wytrącania jest odwracalna. Tak więc rozpuszczalny IFN-β odzyskiwany w następnych etapach tego sposobu oczyszczania zachowuje swoją aktywność biologiczną.

Otrzymany precypitat rozpuszcza się następnie w chlorowodorku guanidyny w celu otrzymania roztworu zawierającego resolubilizowany denaturowany IFN-β i chlorowodorek guanidyny. W przypadkach, kiedy zasadniczo oczyszczony IFN-β otrzymano stosując początkowy etap oczyszczania obejmujący zastosowanie SDS jako solubilizatora, SDS pozostaje jako precypitat po rozpuszczaniu chlorowodorkiem guanidyny. Ten wytrącony SDS usuwa się przez filtrację stosując standardowe techniki filtracji znane w dziedzinie, dogodnie przed prowadzeniem następnych etapów tego poprawionego sposobu oczyszczania. Ilość chlorowodorku guanidyny do zmieszania z precypitatem IFN-β jest ilością dostateczną do solubilizacji wytrąconego IFN-β w otrzymanym roztworze chlorowodorku guanidynyIFN-β, tj. 6 M do 10 M chlorowodorku guanidyny, zwłaszcza 6 M do 9 M, w szczególności 6 M do 8 M chlorowodorku guanidyny w tym otrzymanym roztworze chlorowodorku guanidyny-IFN-β. Jednak solubilizowany IFN-β w tym roztworze jest również denaturowany. Renaturację białek uzyskuje się przez rozcieńczenie roztworu chlorowodorku guanidyny-IFN-β roztworem buforu, przy czym otrzymuje się roztwór zawierający resolubilizowany renaturowany IFN-β i pozostały chlorowodorek guanidyny. IFN-β w otrzymanym roztworze jest monomerowy, tj. co najmniej 51% jest w postaci monomerowej, zwłaszcza co najmniej 70%, 75%, 80%, 85%, w szczególności co najmniej 90% albo więcej w jego postaci monomerowej, jak oznaczono na przykład za pomocą różnicującej ze względu na wielkość HPLC.

PL 206 428 B1

W etapach resolubilizacji i renaturacji chlorowodorek guanidyny sł u ż y jako ś rodek solubilizują cy w celu zwiększenia rozpuszczalności IFN-β. Przez zwiększenie rozpuszczalności IFN-β rozumie się wzrost ilości IFN-β, którą można rozpuścić w roztworze przy pH 3,0 do pH 9,0 w obecności chlorowodorku guanidyny w porównaniu do ilości IFN-β, którą można rozpuścić przy tym samym pH w roztworze o tych samych składnikach, ale przy braku chlorowodorku guanidyny. Zdolność chlorowodorku guanidyny do zwiększenia rozpuszczalności IFN-β można oznaczyć stosując sposoby dobrze znane w dziedzinie, z ujawnionymi tutaj włącznie.

W etapie rozcieńczania tego sposobu oczyszczania według wynalazku można stosować każdy bufor odpowiedni do przeprowadzenia renaturacji IFN-β. Bufory odpowiednie do zastosowania w tym etapie obejmują ujawnione poniżej, takie jak octan, cytrynian, fosforan i Tris HCl, których wybór zależy od pożądanego pH roztworu otrzymanego w następstwie etapu rozcieńczania. Kiedy sposób oczyszczania obejmuje etap wytrącania, dogodnie bufor stosowany do rozcieńczania ma pH od 4,0 do 8,0, włączając 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 i 8,0, zwłaszcza pH od 5,0 do 7,0. Po etapie rozcieńczania ilość resztkowego chlorowodorku guanidyny pozostałego w roztworze resolubilizowanego renaturowanego IFN-β wynosi 1,6 M albo mniej, zwłaszcza 0,8 M albo mniej.

Otrzymany roztwór resolubilizowanego renaturowanego IFN-β zawiera IFN-β w postaci monomerowej (tj. powyżej 51% jest monomerem). Ponadto roztwór resolubilizowanego renaturowanego IFN-β zawiera pozostałą ilość chlorowodorku guanidyny. Kompozycję tę można stosować do sporządzania preparatów farmaceutycznych odpowiednich do podawania pozajelitowego. W ten sposób pozostałą substancję zwiększającą rozpuszczalność chlorowodorku guanidyny można usunąć z roztworu resolubilizowanego renaturowanego IFN-β przez dializę albo diafiltrację tego roztworu z użyciem farmaceutycznie dopuszczalnego buforu. Przez usunięcie pozostałego chlorowodorku guanidyny rozumie się, że preparat farmaceutyczny zawierający monomerowy IFN-β otrzymany z zastosowaniem etapów tego sposobu oczyszczania zawiera chlorowodorek guanidyny o stężeniu 10 mM albo mniejszym, zwłaszcza 5 mM albo mniejszym. Do sporządzania preparatów farmaceutycznych można stosować dowolny farmaceutycznie dopuszczalny bufor pod warunkiem, że IFN-β pozostaje solubilizowany i w postaci monomerowej. W jednym z rozwiązań farmaceutycznie dopuszczalny bufor zawiera argininę albo chlorek sodu w ilości wystarczającej do podniesienia wydajności uzyskiwania monomerowej postaci IFN-β w porównaniu do wydajności uzyskanej w przypadku nieobecności argininy albo chlorku sodu w farmaceutycznie dopuszczalnym buforze. Dla argininy ilość wystarczająca do podniesienia wydajności wynosi 0,2 M do 1,0 M, zwłaszcza 0,4 M do 0,8 M, włączając 0,4 M, 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M i 0,8 M. W jednym z rozwiązań ilość argininy obecnej w farmaceutycznie dopuszczalnym buforze wynosi 0,5 M. Dla chlorku sodu ilość wystarczająca do podniesienia wydajności wynosi 0,2 M do 1,0 M, zwłaszcza od 0,2 M do 1,2 M, w szczególności od 0,5 M do 1,0 M. W jednym z rozwiązań ilość chlorku sodu obecna w farmaceutycznie dopuszczalnym buforze wynosi 1,0 M.

Drugi sposób oczyszczania do otrzymywania kompozycji zawierającej monomerowy IFN-β jest podobny do sposobu pierwszego, ale zapewnia środki do otrzymywania tej kompozycji bez etapu wytrącania. Ten drugi sposób obejmuje dwa podstawowe etapy: (1) mieszania próbki zawierającej zasadniczo oczyszczony IFN-β z chlorowodorkiem (HCl) guanidyny w celu otrzymania roztworu zawierającego solubilizowany denaturowany IFN-β; oraz (2) renaturacji IFN-β, dogodnie przez rozcieńczenie za pomocą dopuszczonego buforu. Chlorowodorek guanidyny służy, jak wyżej wspomniano, jako środek zwiększający rozpuszczalność i stosowany jest w ilościach podobnych do ilości podanych wyżej dla pierwszego sposobu oczyszczania. Tak więc ilość chlorowodorku guanidyny w roztworze zawierającym solubilizowany denaturowany IFN-β po pierwszym etapie wynosi od 6 M do 10 M chlorowodorku guanidyny, zwłaszcza od 6 M do 9 M, w szczególności od 6 M do 8 M chlorowodorku guanidyny. Jak wyżej podano, kiedy wyjściowy zasadniczo oczyszczony IFN-β zawiera SDS, to w tym etapie SDS wytrąca się i może być odfiltrowany z roztworu z użyciem standardowych technik filtracyjnych znanych w dziedzinie.

Tak jak w pierwszym sposobie oczyszczania IFN-β w tym roztworze chlorowodorku guanidyny-IFN-β jest denaturowany. Renaturację uzyskuje się przez rozcieńczenie za pomocą dopuszczalnego buforu o pH w zakresie od 3,0 do 5,0, zwłaszcza 3,0 do 4,0, w szczególności 3,0. Bufory odpowiednie do tego etapu rozcieńczania w celu uzyskania renaturacji IFN-β zawierają glicynę, kwas asparaginowy, kwas glutaminowy oraz bursztynian, octan, fosforan, mrówczan i cytrynian, jak również ich dowolne sole. Po przeprowadzeniu tego etapu rozcieńczania dogodnie resztkowa ilość chlorowodorku guanidyny pozostającego w roztworze solubilizowanego renaturowanego IFN-β wynosi 1,6 M albo mniej, zwłaszcza 0,8 albo mniej, w szczególności 0,1 albo mniej. Po renaturacji otrzymana kompozycja zaPL 206 428 B1 wiera monomerowy IFN-β, tj. co najmniej 51%, zwłaszcza co najmniej 70% jest w postaci monomerowej, zgodnie z oznaczeniem za pomocą na przykład różnicującej pod względem wielkości HPLC, dogodnie za pomocą ultrawirowania analitycznego (patrz na przykład Liu i Shire, J. Pharm. Sci. 88, 1237-1241 (1999)). Chlorowodorek guanidyny pozostały w roztworze renaturowanego IFN-β można usunąć w sposób podobny do sposobu podanego dla pierwszego sposobu dla otrzymania preparatu farmaceutycznego zawierającego monomerowy IFN-β.

Jak tu podano można stosować dowolny farmaceutycznie dopuszczalny bufor, pod warunkiem, że IFN-β pozostaje solubilizowany i w postaci monomerowej. W jednym z rozwiązań farmaceutycznie dopuszczalny bufor wybrany jest z grupy składającej się z glicyny, kwasu asparaginowego i bursztynianu sodu, dogodnie glicyny, tak aby pH preparatu farmaceutycznego wynosiło 3,0 do 5,0, zwłaszcza 3,0 do 4,0, w szczególności 3,0.

Zatem monomerowa postać IFN-β uzyskana z zastosowaniem sposobów według wynalazku posiada szereg zastosowań ujawnionych w niniejszym wynalazku. Na przykład tę postać IFN-β można stosować bezpośrednio do preparowania kompozycji farmaceutycznych odpowiednich do podawania pozajelitowego, jak wyżej podano. Po etapie diafiltracji albo dializy z zastosowaniem farmaceutycznie dopuszczalnego wybranego buforu w celu usunięcia pozostałego chlorowodorku guanidyny, otrzymane kompozycje farmaceutyczne można stabilizować przeciw denaturacji i utracie aktywności biologicznej poprzez włączenie do kompozycji farmaceutycznej stabilizatora, który obejmuje białka albo węglowodany, wybrane zwłaszcza z grupy składającej się z mannitolu, sorbitolu, glicerolu, dekstrozy, sacharozy i trelahozy albo ich mieszanin. Preparat IFN-β otrzymany w etapach diafiltracji (albo dializy) i stabilizacji można liofilizować albo odtworzyć w obojętnym, nietoksycznym, fizjologicznie zgodnym podłożu nośnikowym do zastosowań terapeutycznych i fizjologicznych.

Kompozycje farmaceutyczne preparuje się zachowując znane stężenia monomerowej postaci IFN-β takie że podawanie poszczególnej dawki wzmacnia pożądaną reakcję terapeutyczną pod względem szczegółowych warunków reakcyjnych IFN-β prowadzonej terapii. Przez pożądaną reakcję terapeutyczną rozumie się poprawę stanu albo objawów towarzyszących stanowi.

Kompozycje farmaceutyczne zawierające IFN-β są przydatne w terapii skierowanej na stany odpowiadające na IFN-β. Przez terapię rozumie się leczenie w istniejącym stanie prawidłowym, który nasila się przez terapię IFN-β, leczenie terapeutyczne stanu nieprawidłowego wrażliwego na IFN-β i zapobiegawczą albo profilaktyczną procedurę obejmującą leczenie IFN-β w celu zapobieżenia albo zmniejszenia zagrożenia wystąpienia stanu nieprawidłowego. Przez stan odpowiadający na IFN-β rozumie się każdy stan, który odpowiada na IFN-β albo pozytywnie albo negatywnie. Taki stan wrażliwy na IFN-β może być stanem prawidłowym. Na przykład ssak może być poddany terapii IFN-β w celu podniesienia wrażliwości i/lub siły reakcji odpornościowej. Takie terapie obejmują leczenie mające na celu uzyskanie ochrony przed infekcjami wirusowymi albo modulowanie ciężkości infekcji wirusowych, na przykład infekcji wirusem Dengue albo wirusem Sindbis. Przeciwnie stan odpowiadający na IFN-β może być stanem nieprawidłowym, takim jak czerniak złośliwy. Takie nieprawidłowe stany mogą być chroniczne i występować w sposób bardziej albo mniej ciągły albo też takie stany nieprawidłowe mogą być ostre. Stan odpowiadający na IFN-β może być stanem, który może być scharakteryzowany jako zarówno chroniczny jak i ostry, taki jak łagodne nawracające stwardnienie rozsiane. Korzyść z podawania farmaceutycznych kompozycji tu opisanych można uzyskać w każdym zaburzeniu odpowiadającym na IFN-β. Stany odpowiadające na IFN-β mogą również obejmować zaburzenia immunologiczne, takie jak niedobory odpornościowe, w tym obniżoną tolerancję immunologiczną jako wynik choroby albo infekcji albo zaburzenia odpowiedzi immunologicznej przez wpływy środowiska albo inne, takie jak chemoterapia albo wystawienie na działanie toksycznych substancji chemicznych. Następujące przykłady przedstawione są jako ilustracja a nie jako ograniczenie.

Część doświadczalna

P r z y k ł ad y I i VII oraz figurę 3 przedstawiono dla lepszego zrozumienia wynalazku, nie stanowią one jednak realizacji wynalazku.

P r z y k ł a d I. Otrzymywanie IFN-β

IFN-β do zastosowania w tych doświadczeniach wytwarzano w E. coli zasadniczo jak opisano w pierwszych kilku etapach oczyszczania podanych w amerykańskich patentach nr 4,462,940 i/lub 4,816,400. To jest do wytworzenia IFN-β stosowano transformowane bakterie; komórki gospodarza zatężano i rozrywano ich ściany komórkowe. IFN-β otrzymywano następnie zgodnie ze sposobami według wynalazku po otrzymaniu puli oczyszczonego IFN-β.

PL 206 428 B1

Podstawowa procedura była następująca:

1. Wytrącanie IFN-β z puli oczyszczonego IFN-β za pomocą etanolu. Stosuje się sześć części puli oczyszczonego IFN-β na cztery części etanolu. Wydajność tego etapu wynosi powyżej 80% interferonu w postaci osadu, który można odwirować.

2. Osad następnie rozpuszcza się w 8 M chlorowodorku guanidyny do otrzymania roztworu białka o stężeniu 10 mg/ml.

Solubilizacja ta jest szybka; występująca niewielka ilość SDS nie ulega solubilizacji i usuwa się ją przez filtrację.

3. Otrzymany roztwór chlorowodorku guanidyny rozcieńcza się następnie w 10 ml buforu.

P r z y k ł a d II: Parametry rozcieńczania chlorowodorkiem guanidyny

Początkowe doświadczenia prowadzono w celu określenia optymalnych parametrów etapu rozcieńczania chlorowodorkiem guanidyny. Eksperyment w małej skali z pomiarami względnych wydajności prowadzono tak jak przedstawiono w tabeli 1; najlepsze wyniki otrzymano przy pH powyżej 4,0 oraz ilości chlorowodorku guanidyny po rozcieńczeniu poniżej 8 M. Stężenie monomeru interferonu beta oznaczono przy pomocy różnicującej ze względu na wielkość HPLC stosując jako bufor 400 mM glicyny o pH 3,0. Wyniki w tabeli 2 oraz zestaw typowych chromatogramów na figurze 1 pokazują, że chociaż multimery niekowalentne otrzymywano przy niższych wartościach pH, monomerowy interferon beta otrzymywano przy pH 5,0 i wyższym.

T a b e l a 1

Wydajność względna po rozcieńczeniu IFN (~10 mg/ml) chlorowodorkiem guanidyny (8 M) oznaczona za pomocą HPLC

		Stężenie chlorowodorku guanidyny po rozcieńczeniu
10 mM buforu	pH	0,2 M	0,4 M	0,8 M	1,6 M
Glicyna	3	2	2,1	1	1
Octan sodu	4	13	12,7	6	2
Octan sodu	5	68	68	33	30
Cytrynian sodu	6	79	62	43	42
Fosforan sodu	7	82	71	41	48
Tris HCl	8	99	83	40	38

T a b e l a 2

Zawartość procentowa agregatów po rozcieńczeniu IFN (~10 mg/ml) w chlorowodorku guanidyny (8 M) oznaczona za pomocą HPLC

		Stężenie chlorowodorku guanidyny po rozcieńczeniu
10 mM buforu	pH	0,2 M	0,4 M	0,8 M	1,6 M
Glicyna	3	78	51	35	39
Octan sodu	4	<1	3	4	11
Octan sodu	5	1	1	1	2
Cytrynian sodu	6	1	1	1	2
Fosforan sodu	7	1	1	1	3
Tris HCl	8	1	2	1	2

P r z y k ł a d III. Wydajność etapu rozcieńczania guanidyną

W czasie procesu prowadzono pomiary dla oznaczenia wydajności etapu rozcieńczania guanidyną. Wyniki w tabeli 3 pokazują, że wydajność 41% do 57% można uzyskać przy 40-krotnym rozcieńczeniu przy pH 6 do 8 z końcowym stężeniem białka około 0,15 mg/ml. Stężenia SDS w badanych próbkach wynosiły poniżej 10 mikrogramów na miligram IFN.

PL 206 428 B1

T a b e l a 3

Odzyskiwanie ponownego zwinięcia z 8 M chlorowodorku guanidyny (rozcieńczenie 40x)

10 mM buforu	pH	[IFN] mg/ml	% wydajności
Cytrynian sodu	6	0,12	41
Fosforan sodu	7	0,17	57
Tris HCl	8	0,15	52

P r z y k ł a d IV. Usuwanie za pomocą dializy pozostałości chlorowodorku guanidyny obecnych po rozcieńczaniu

Dializę stosowano w celu usunięcia pozostałości chlorowodorku guanidyny obecnych po rozcieńczaniu. Przy pH 5 najwyższą wydajność, 83%, uzyskiwano bez dodatkowej obecności NaCl; przy pH 7,0 najwyższą wydajność, 70%, uzyskiwano przy zawartości 1000 mM NaCl, co pokazuje figura 2. We wszystkich przypadkach po dializie następowało wytrącenie, chociaż frakcje rozpuszczalne były monomerowe, co zostało ocenione za pomocą różnicującej ze względu na wielkość HPLC.

P r z y k ł a d V. Wpływ wytrząsania na materiał: chlorowodorek guanidyny-renaturowany IFN-β

Niewielką objętość IFN-β w buforze zawierającym 10 mM fosforanu (przy pH 7,0) i 100 mM NaCl umieszczano w probówce w wytrząsarce (typu end-over-end). Po około 3 godzinach wytrącało się około 50% materiału IFN-β. To sugeruje, że stabilizację można zwiększyć za pomocą odpowiedniego środka powierzchniowo czynnego, takiego jak Tween 80. Dodanie Tween 80 stabilizuje interferon i dlatego wzrasta wydajność etapu dializy. Jednak Tween 80 może również powodować agregację w sposób zależny od stężenia, co pokazano na figurze 3. Agregaty te są rozpuszczalne. Inne środki powierzchniowo czynne mogą działać bardziej optymalnie.

P r z y k ł a d VI. Optymalizacja renaturacji i preparowania białek za pomocą projektowanego badania czynnikowego

Analizowano serię doświadczeń w celu oznaczenia odzysku IFN-β podczas (1) denaturacji IFN-β w 8 M chlorowodorku guanidyny; (2) ponownego zwijania IFN-β przez szybkie rozcieńczenie buforem; oraz (3) dializy w celu usunięcia pozostałego chlorowodorku guanidyny w obecności argininy albo bez niej w celu otrzymania preparatu końcowego. Skład preparatu i warunki etapów 1-3 optymalizowano stosując projektowany eksperyment półczynnikowy. Stosowanymi czynnikami były stężenie białka, stężenie chlorowodorku guanidyny, pH, temperatura i stężenie argininy.

Okazało się, że pH, stężenie IFN-β stężenie chlorowodorku guanidyny po rozcieńczaniu i stężenie argininy były ważnymi warunkami modelowymi. Najwięcej korzyści z modelu otrzymano ze stężenia IFN-β i argininy. Interakcje między argininą i pH odgrywały ważną rolę. Najlepsze wyniki otrzymano przy zastosowaniu 10 mM buforu NaPO4 o pH 7,0 zawierającego w końcowym buforze argininę. Całkowita wydajność etapów 1-2 wynosiła do 80-100%, a wydajność etapu 3 wynosiła 70-80%.

P r z y k ł a d VII. Usuwanie SDS i preparowanie IFN-β bez stosowania wytrącania etanolem

Oczyszczony IFN^-W (1 litr o stężeniu 1,91 mg/ml z 0,4% SDS, 5 0 mM buforu octanowego, pH 5,5) przechowywano w temperaturze 5°C. Podczas przechowywania wytrącała się część obecnego SDS. 250 ml tego materiału (477,5 mg) mieszano z 229 g chlorowodorku guanidyny (6 M, całkowita objętość 400 ml) i mieszano w temperaturze pokojowej przez 15 minut z użyciem mieszadła magnetycznego. Następnie roztwór 6 M chlorowodorku guanidyny/białka filtrowano stosując

Sartobran® P Capsule (wymiar porów 0,45 μm) w celu usunięcia wytrąconego SDS. Stężenie białka oznaczone za pomocą UV przy 280 nm wynosiło 1,02 mg/ml. Wydajność uzyskiwania białka wynosiła 406 mg albo 85%.

400 ml materiału traktowanego chlorowodorkiem guanidyny zatężano stosując układ diafiltracyjny Milipore® Labscale® TFF (Millipore, Inc.) z dwiema membranami polisulfonowymi 0,1 cm² 10 kD Pellicone® XL Biomax® (Milipore, Inc.). Objętość po etapie zatężania wynosiła 37 ml przy stężeniu białka 10,3 mg/ml oraz wydajności po zatężaniu 381 mg albo 93%.

Do roztworu 590 ml roztworu 5 mM glicyny o pH 3,2 dodawano stopniowo 10 ml (103 mg) stężonego roztworu chlorowodorku guanidyny/białka stosując pipetę transferową.

Podczas szybkiego mieszania buforu mieszadłem magnetycznym dodawano roztwór białka bezpośrednio do worteksu. To 60-krotne rozcieńczenie 6 M roztworu chlorowodorku guanidyny/białka dawało 0,1 M roztworu chlorowodorku guanidyny/białka o stężeniu 0,17 mg/ml. Te 600 ml przenoszono do urządzenia diafiltracyjnego o skali 500 ml wyposażonego w dwie membrany polisulfonowe 0,1 m², 10 kD, typu Pellicon® II. Roztwór ten zatężano początkowo do ~ 400 ml do stężenia białka 0,23 mg/ml

PL 206 428 B1 i następnie poddawano diafiltracji przy 9 zmianach objętości (3,6 litra) 5 mM glicyny przy pH 3,2. Końcowy diafiltrat (402 ml) poddawano pomiarowi za pomocą UV przy 280 nm dla końcowego stężenia białka 0,23 mg/ml przy wydajności etapu diafiltracji 92,46 mg/ml albo 90% i ogólnej wydajności uzyskiwania rozpuszczalnego białka dla procesu oczyszczania 72%.

Claims (9)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania kompozycji zawierającej monomerowy interferon beta (IFN-β), znamienny tym, że:

   a) otrzymuje się próbkę zawierającą oczyszczony IFN-β;

   b) miesza się tę próbkę z chlorowodorkiem guanidyny w celu otrzymania pierwszego roztworu zawierającego solubilizowany denaturowany IFN-β; i

   c) renaturuje się IFN-β przez rozcieńczenie pierwszego roztworu pierwszym buforem, przy czym pierwszy bufor ma pH 3,0 do 5,0, i przy czym otrzymuje się roztwór renaturowanego IFN-β zawierający monomerowy IFN-β i pozostały chlorowodorek guanidyny.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pozostały chlorowodorek guanidyny zawarty jest w roztworze renaturowanego IFN-β w stężeniu 1,6 M albo mniejszym.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pozostały chlorowodorek guanidyny zawarty jest w roztworze renaturowanego IFN-β w stężeniu 0, 8 M albo mniejszym.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pozostały chlorowodorek guanidyny zawarty jest w roztworze renaturowanego IFN-β w stężeniu 0,1 M albo mniejszym.
5. 5. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 4, znamienny tym, że ponadto obejmuje etap, w którym usuwa się pozostały chlorowodorek guaninidyny z roztworu renaturowanego IFN-β przez diafiltrację lub dializę renaturowanego roztworu IFN-β do drugiego buforu, przy czym drugi bufor ma pH 3,0 do 5,0 i wybrany jest z grupy składającej się z glicyny, kwasu asparaginowego i bursztynianu sodu.
6. 6. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 5, znamienny tym, że stosuje się IFN-β glikozylowany albo nieglikozylowany.
7. 7. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 6, znamienny tym, że stosuje się IFN-β otrzymany rekombinacyjnie.
8. 8. Sposób według jednego z zastrz. 1 do 7, znamienny tym, że jako IFN-β stosuje się dojrzały ludzki I FN-β lub jego wariant, przy czym wariant wykazuje co najmniej 80% identyczności sekwencji aminokwasowej z sekwencją aminokwasową dojrzałego ludzkiego IFN-β.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że wariant ma sekwencję aminokwasową dojrzałego ludzkiego IFN-β z podstawieniem reszty seryny za resztę cysteiny w pozycji 17 sekwencji dojrzałego ludzkiego IFN-β.

   PL 206 428 B1

   Rysunki

   Chromatogramy z HPLC z rozdziałem ze względu na wielkość rozcieńczenia chlorku guanidyny (8 M) IFN (~ 10 mg/ml) do 0,2 M guanidyny w różnych buforach

   FIG.1

   600:

   550:

   500:

   450:

   400™

   350:

   300:

   250:

   20014

   PL 206 428 B1

   Wpływ soli i pH na odzysk IFN z 0,4 M chlorowodorku guanidyny, 10 mM NaPO4, pH 7,0

   PL 206 428 B1