ES2299528T3 - Metodo de purificacion de interferon-beta. - Google Patents
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Abstract
Un método para preparar una composición que comprende interferón-beta (IFN-beta) monómero, cuyo método comprende: a) preparar una muestra que comprende IFN-beta purificado; b) mezclar dicha muestra con hidrocloruro (HCl) de guanidina para obtener una primera solución que comprende IFN-beta desnaturalizado solubilizado; y c) renaturalizar dicho IFN-beta por dilución de dicha primera solución con un primer tampón, en el que dicho primer tampón tiene un pH de 3,0 a 5,0, y en el que se obtiene una solución de IFN-beta renaturalizado que comprende IFN-beta monómero e HCl de gunidina residual.
Description
Método de purificación de
interferón-beta.
Esta invención se refiere al campo de la
ingeniería bioquímica. Más particularmente, la invención concierne
a un procedimiento de recuperación bioquímica mejorado en el que
interferón-beta recombinante puede replegarse y
recuperarse en forma sustancialmente pura y monómera. Esta
composición puede usarse en formulaciones farmacéuticas.
Los interferones de origen natural son proteínas
específicas para la especie producidas por diversas células por
inducción con virus, ARNs de doble cadena, otros polinucleótidos,
antígenos y mitógenos. Los interferones presentan múltiples
actividades biológicas, incluyendo actividades antivírica,
antiproliferativa, inmunomoduladora y anticelular. La investigación
de estas actividades ha conducido a la identificación y
caracterización de al menos tres tipos distintos de interferones
humanos, de los que se ha informado que son proteínas diferentes
codificadas por genes estructurales distintos. Los interferones, que
son a menudo glicoproteínas, se clasificaron originalmente en base
a su fuente de células y se reclasificaron más tarde como alfa, beta
("\beta") y gamma.
El interferón-beta
("IFN-\beta") se produce por fibroblastos y
células epiteliales. El interferón-beta nativo se
produjo sobreinduciendo cultivos de fibroblastos humanos con ácido
polirriboinosínico y ácido polirribocitidílico y aislando y
purificando el(los) interferón(es) producido(s)
así por técnicas cromatográficas y electroforéticas. El gasto y
dificultad de purificación de interferones de esta manera
imposibilitó un ensayo clínico dilatado y la evaluación del valor
terapéutico de los interferones. El aislamiento de interferones de
fuentes naturales permanece relativamente difícil y caro.
Más recientemente, se han clonado varios de los
genes de interferones humanos usando tecnología de ADN recombinante
("rADN") y se han expresado en E. coli (Nagola et
al. (1980) Nature 284:316; Goeddel et al. (1980) Nature
287:411; Yelverton et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9:731;
Streuli et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2848).
También pueden producirse proteínas o polipéptidos que presentan
propiedades tipo interferón-beta nativo con
tecnología de rADN extrayendo ARN mensajero 12S rico en poli A de
células humanas inducidas víricamente, sintetizando cADN de doble
cadena usando el mARN como plantilla, introduciendo el cADN en un
vector de clonación apropiado, transformando con el vector
microorganismos adecuados, cosechando los microorganismos y
extrayendo de ellos el interferón-beta. Véanse, por
ejemplo, Solicitudes de Patente Europea Nº 28033 (publicada el 6 de
Mayo de 1981); 32134 (publicada el 15 de Julio de 1981); y 34307
(publicada el 26 de Agosto de 1981), que describen diversos métodos
para la producción de interferón-beta empleando
técnicas de rADN. Las proteínas o polipéptidos expresados a partir
de clones de ADN recombinante se han purificado y ensayado, y se ha
encontrado que presentan propiedades similares a las de los
interferones nativos. Los interferones producidos bacterianamente
tienen así uso terapéutico potencial como agentes antivíricos y
antitumores. La producción de interferones mediante tales
fermentaciones bacterianas produce grandes cantidades de interferón
con un coste relativamente bajo, haciendo por ello al interferón
disponible más extensamente para muchos usos, tales como estudios
clínicos.
El interferón-beta de uso en
estudios clínicos debe ser de pureza relativamente alta y
sustancialmente no contaminado con constituyentes tóxicos de las
células hospedantes, restos de células y otros compuestos químicos
extraños introducidos durante las etapas de extracción y
purificación. Hay varios métodos disponibles actualmente para la
preparación, recuperación y purificación de
IFN-\beta.
Los métodos de recuperación y purificación de
IFN-\beta descritos en las Patentes de los EE.UU.
Nº 4.462.940 y 5.702.699, y métodos similares, producen una forma
pura de IFN-\beta que tiende a formar agregados en
ausencia de solubilizantes fuertes, por ejemplo, dodecilsulfato
sódico ("SDS"). Además, tales métodos (1) exponen la proteína
a condiciones de alto pH que pueden afectar adversamente a las
propiedades biológicas de la proteína, y (2) producen composiciones
que contienen cantidades residuales de SDS usado para solubilizar la
proteína durante la purificación.
Por tanto, hay necesidad de un procedimiento de
recuperación y purificación mejorado en el que el
IFN-\beta no se someta a alta alcalinidad, la
formulación esté libre o virtualmente libre de SDS, y la proteína
sea soluble a un pH adecuado para administración parenteral. Un
objeto de la presente invención es proporcionar una muestra
aceptable farmacéuticamente de IFN-\beta que sea
de pureza relativamente alta y se repliegue fácilmente durante el
procedimiento de purificación y recuperación.
Lee et al., Korean Biochemical Journal,
23(2), 161-171 (1990), describen la
purificación de interferón-beta derivado de
Escherichia coli recombinante por un método que comprende
precipitación, solubilización y dilución de la proteína en tampón de
fosfato sódico que tiene un pH de 7,2.
El documento
EP-A-0 360 937 describe la
purificación de interferón-beta recombinante por un
método que comprende precipitación con sacarosa, solubilización del
precipitado con HCl de guanidina y diálisis de la solución para
separar la guanidina.
Pepinsky, Anal Biochem., 195(1),
177-181 (1991), describe la precipitación selectiva
de proteínas de soluciones que contienen hidrocloruro de guanidina
con etanol.
Van Oss, J. Protein Chem., 8(5),
661-668 (1989), describe un método para precipitar
proteínas de plasma por el procedimiento de etanol frío.
Russel-Harde et al., J.
Interferon Cytokine Res., 15(1), 31-37
(1995), describen un método para la purificación de
intereferón-beta Ser-17 (Betaseron)
recombinante. El Betaseron producido en bacterias se solubiliza con
un detergente no desnaturalizante a pH 12. Después, se separa el
detergente usando intercambio iónico y cromatografía de exclusión
por tamaños. Finalmente, el Betaseron purificado se repliega por
diálisis frente a un tampón no reductor.
El documento WO 98/27211 describe la producción
y purificación de interferón beta-cis humano
recombinante por solubilización del interferón agregado con HCl de
guanidina y subsiguiente cromatografía Ni-NTA.
Se proporcionan métodos mejorados útiles en la
preparación de formulaciones farmacéuticas de
IFN-\beta. Los métodos proporcionan composiciones
farmacéuticas líquidas, monómeras, que comprenden
IFN-\beta. Los métodos incluyen condiciones que
aumentan el repliegue de la proteína durante el procedimiento de
recuperación.
Para conseguir el anterior y otros objetos, y
según el propósito de la presente invención como se realiza y
describe ampliamente aquí, la presente invención proporciona métodos
mejorados para la recuperación y purificación de
IFN-\beta.
IFN-\beta.
En otra realización, el método mejorado de
purificación y recuperación de IFN-\beta comprende
obtener una muestra de IFN-\beta sustancialmente
purificado y mezclar esta muestra con hidrocloruro de guanidina para
formar una solución que comprende IFN-\beta
desnaturalizado solubilizado. Esta solución que comprende
IFN-\beta desnaturalizado solubilizado se diluye
después en un primer tampón apropiado para obtener una solución que
comprende IFN-\beta renaturalizado solubilizado.
La solución de IFN-\beta renaturalizado
solubilizado resultante se diafiltra o dializa después en un tampón
adecuado con fines farmacéuticos. Como se ha indicado antes, esta
última etapa separa el hidrocloruro de guanidina residual,
produciendo una formulación farmacéutica que comprende
IFN-\beta sustancialmente monómero adecuado para
administración parenteral.
La Figura 1 muestra datos de cromatografía HPLC
de dimensionamiento recogidos después de la dilución de
IFN-\beta de la etapa de solubilización con hidrocloruro de guanidina en diversos tampones.
IFN-\beta de la etapa de solubilización con hidrocloruro de guanidina en diversos tampones.
La Figura 2 muestra el efecto de sal y pH en la
recuperación de IFN-\beta de HCl de guanidina 0,4
M, tampón de NaPO_{4} 10 mM, pH 7,0.
La Figura 3 muestra el efecto de Tween 80 en la
agregación de IFN-\beta renaturalizado preparado
según los métodos de la invención.
La presente invención se dirige a nuevos métodos
para preparar una forma sustancialmente monómera de
IFN-\beta. Por "monómera" se quiere decir
que la mayoría del IFN-\beta (en peso) presente en
una preparación o composición es monómera en lugar de agregada. Por
"agregada" se quiere decir una interacción física entre las
moléculas de polipéptido que produce la formación de multímeros no
covalentes que pueden permanecer solubles o que pueden precipitar
de la solución. El porcentaje (en peso) de
IFN-\beta que es monómero en una composición o
formulación monómera puede variar desde el 51% o superior. Los
métodos de la invención proporcionan la preparación de
composiciones que comprenden IFN-\beta monómero
que se hacen sin el uso del estabilizante HSA tradicional y que
están libres o virtualmente libres del solubilizante dodecilsulfato
sódico (SDS) (es decir, que contienen menos de 10 microgramos de
SDS por miligramo de IFN-\beta). Estas
composiciones que comprenden IFN-\beta monómero
son por tanto adecuadas para su uso en preparaciones farmacéuticas o
terapéuticas. La forma monómera del polipéptido
IFN-\beta permanece soluble, y se dice por ello
que está "solubilizada" en las composiciones farmacéuticas de
la presente invención. La presente invención permite así la
preparación de composiciones farmacéuticas de
IFN-\beta libres de HSA y libres de SDS que
comprenden al menos el 51% del IFN-\beta en su
forma monómera, en oposición a su forma agregada, preferiblemente al
menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, más preferiblemente al
menos 90% o más del IFN-\beta en su forma
monómera.
En un ejemplo, que se proporciona para un mejor
entendimiento de la invención y que no se presenta como una
realización de la invención, la composición que comprende
IFN-\beta monómero se prepara precipitando de la
solución IFN-\beta sustancialmente purificado,
resuspendiendo el precipitado por disolución en hidrocloruro (HCl)
de guanidina, separando todo SDS residual por filtración cuando la
muestra de IFN-\beta inicial comprende SDS, y
renaturalizando después el IFN-\beta por dilución
de la solución de HCl de
guanidina-IFN-\beta resultante
con una solución tampón apropiada. Por "sustancialmente
purificado" quiere decirse que el IFN-\beta en
el material de partida es o está esencialmente libre de componentes
que acompañan o interactúan normalmente con la proteína como se
encuentra en su ambiente de origen natural, es decir, una célula
nativa o célula hospedante en el caso de
IFN-\beta producido recombinantemente. Un
polipéptido IFN-\beta que está libre de material
celular incluye preparaciones de proteína que tienen menos del 30%,
25%, 20%, 15%, 10%, 5% o 1% (en peso seco) de proteína
contaminante. Cuando el polipéptido IFN-\beta o
una variante activa biológicamente del mismo se produce
recombinantemente, el medio de cultivo representa preferiblemente
menos del 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% o 1% (en peso seco) de
precursores químicos o compuestos químicos que no son proteínas de
interés. Así, se dice que un IFN-\beta
"sustancialmente purificado" para su uso en los métodos de la
presente invención tiene un nivel de pureza de al menos el 70%,
preferiblemente un nivel de pureza de al menos el 75%, 80%, 85%, más
preferiblemente un nivel de pureza de al menos el 90% o superior,
determinado por análisis de SDS/PAGE.
En otra realización, la composición que
comprende IFN-\beta monómero se prepara en
ausencia de la etapa de precipitación señalada antes. De esta
manera, una muestra que comprende IFN-\beta
sustancialmente purificado se mezcla con HCl de guanidina para
obtener una solución que comprende IFN-\beta
desnaturalizado solubilizado; el IFN-\beta se
renaturaliza después por dilución de la solución de HCl de
guanidina-IFN-\beta resultante
con un tampón apropiado. Las ramificaciones de estas etapas de
preparación son la base para los métodos de la presente invención,
para preparar formulaciones inyectables que comprenden
IFN-\beta sustancialmente monómero, que son útiles
para terapia de IFN-\beta dirigida a enfermedades
sensibles a IFN-\beta.
El término "IFN-beta" o
"IFN-\beta" según se usa aquí se refiere a
IFN-\beta o variantes del mismo, a las que se
hace referencia a veces como polipéptidos tipo
IFN-\beta. Así, por ejemplo, variantes de
IFN-\beta humano, que pueden ser de origen
natural (por ejemplo, variantes alélicas que tienen lugar en el
sitio de IFN-\beta) o producidas
recombinantemente, tienen secuencias de aminoácidos que son las
mismas, o similares a, o sustancialmente similares a, la secuencia
de IFN-\beta humano nativo maduro. También se
abarcan por el término "IFN-\beta" o
"IFN-beta" fragmentos de
IFN-\beta o formas truncadas de
IFN-\beta que conservan su actividad. Estos
fragmentos o formas truncadas activos biológicamente de
IFN-\beta se generan separando residuos de
aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de
IFN-\beta de longitud completa usando métodos de
ADN recombinante muy conocidos en la técnica. Los polipéptidos
IFN-\beta pueden ser glicosilados
(IFN-\beta-1a) o no glicosilados
(IFN-\beta-1b), ya que se ha
informado en la bibliografía que ambos IFN-\betas
glicosilado y no glicosilado muestran actividades específicas
cualitativamente similares y que, por tanto, los restos glicosilo no
están implicados y no contribuyen a la actividad biológica de
IFN-\beta.
Las variantes de IFN-\beta
abarcadas aquí incluyen muteínas de la secuencia de
IFN-\beta maduro nativo (véase, por ejemplo, la
Patente de los EE.UU. Nº 5.814.485), en la que se han suprimido o
sustituido deliberadamente con otros aminoácidos uno o más residuos
de cisteína que no son esenciales para la actividad biológica, para
eliminar lugares para reticulación intermolecular o formación de
enlaces disulfuro intramolecular incorrecta. Las variantes de
IFN-\beta de este tipo incluyen las que contienen
una glicina, valina, alanina, leucina, isoleucina, tirosina,
fenilalanina, histidina, triptófano, serina, treonina o metionina
que sustituye a la cisteína encontrada en el aminoácido 17 de la
secuencia de aminoácidos nativa madura. Serina y reonina son las
sustituciones más preferidas por su analogía química con cisteína.
Son más preferidas sustituciones de serina. Véase, por ejemplo, la
variante de IFN-\beta en la que la cisteína
encontrada en el aminoácido 17 de la secuencia nativa madura es
sustituida por serina (Patente de los EE.UU. Nº 5.814.485). La
cisteína 17 puede suprimirse también usando métodos conocidos en la
técnica (véase, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. Nº
4.518.584), produciendo una muteína de IFN-\beta
maduro que es un aminoácido más corta que el
IFN-\beta maduro nativo. Véanse también, como
ejemplos, las Patentes de los EE.UU. Nº 4.530.787; 4.572.798 y
4.588.585. Así, también están abarcadas por la presente invención
variantes de IFN-\beta con una o más mutaciones
que mejoran, por ejemplo, su utilidad farmacéutica.
El técnico experto apreciará que pueden
introducirse cambios adicionales por mutación en las secuencias de
nucleótidos que codifican IFN-\beta, condiciendo
por ello a cambios en la secuencia de aminoácidos de
IFN-\beta, sin alterar la actividad biológica del
interferón. Así, puede crearse una molécula de ácido nucleico
aislada que codifique una variante de IFN-\beta
que tenga una secuencia que difiera de la secuencia de aminoácidos
para el IFN-\beta nativo introduciendo una o más
sustituciones, adiciones o supresiones de nucleótidos en la
secuencia de nucleótidos correspondiente que codifica el
IFN-\beta nativo, de tal modo que se introduzcan
una o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos en
el IFN-\beta codificado. Pueden introducirse
mutaciones por técnicas estándares, tales como mutagénesis dirigida
por el lugar y mutagénesis mediada por PCR. Tales variantes de
IFN-\beta también son abarcadas por la presente
invención.
Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones de
aminoácidos conservadoras en uno o más residuos de aminoácidos
predichos, preferiblemente no esenciales. Un residuo de aminoácido
"no esencial" es un residuo que puede alterarse de la
secuencia de tipo natural de IFN-\beta sin alterar
su actividad biológica, mientras que se requiere un residuo de
aminoácido "esencial" para actividad biológica. Una
"sustitución de aminoácido conservadora" es una en la que el
residuo de aminoácido es sustituido por un residuo de aminoácido que
tiene una cadena secundaria similar. Se han definido en la técnica
familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas secundarias
similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas
secundarias básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina),
cadenas secundarias ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido
glutámico), cadenas secundarias polares no cargadas (por ejemplo,
glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina,
cisteína), cadenas secundarias no polares (por ejemplo, alanina,
valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina,
triptófano), cadenas secundarias beta-ramificadas
(por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas secundarias
aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano,
histidina). Tales sustituciones no se harían para residuos de
aminoácidos conservados, o para residuos de aminoácidos que residan
dentro de un motivo conservado.
Alternativamente, pueden hacerse secuencias de
nucleótidos de IFN-\beta variantes introduciendo
mutaciones aleatoriamente a lo largo de la totalidad o parte de una
secuencia de codificación de IFN-\beta, tal como
mediante mutagénesis de saturación, y puede examinarse en los
mutantes resultantes la actividad biológica de
IFN-\beta para identificar mutantes que mantengan
actividad. Tras la mutagénesis, la proteína codificada puede
expresarse recombinantemente, y puede determinarse la actividad de
la proteína usando técnicas de ensayo estándares descritas aquí.
Las variantes de IFN-\beta
activas biológicamente tendrán generalmente al menos 80%, más
preferiblemente del 90 al 95% o más, y aún más preferiblemente el
99% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de
aminoácidos de la molécula de IFN-\beta de
referencia, por ejemplo, el IFN-\beta humano
nativo, que sirve como base de comparación. Por "identidad de
secuencias" se quiere decir que se encuentran los mismos
residuos de aminoácidos dentro del polipéptido variante y la
molécula de polipéptido que sirve como referencia cuando se alinea
y compara un segmento contiguo especificado de la secuencia de
aminoácidos de la variante con la secuencia de aminoácidos de la
molécula de referencia.
Con fines de alineamiento óptimo de las dos
secuencias para determinar la identidad de secuencias, el segmento
contiguo de la secuencia de aminoácidos de la variante puede tener
residuos de aminoácidos adicionales o residuos de aminoácidos
suprimidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de la molécula
de referencia. El segmento contiguo usado para comparación con la
secuencia de aminoácidos de referencia comprenderá al menos 20
residuos de aminoácidos contiguos. Pueden hacerse correcciones para
identidad de secuencias aumentada asociada con inclusión de huecos
en la secuencia de aminoácidos de la variante asignando
penalizaciones por huecos. Los métodos de alineamiento de secuencias
son muy conocidos en la técnica.
Así, la determinación del porcentaje de
identidad entre dos secuencias cualesquiera puede conseguirse usando
un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitativo preferido de un
algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es
el algoritmo de Myers y Miller (1988) Comput. Appl. Biosci.
4:11-7. Tal algoritmo se utiliza en el programa
ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete de software de
alineamiento GCG. Puede usarse una tabla de residuos de peso
PAM120, una penalización por longitud de hueco de 12 y una penalidad
por hueco de 4 con el programa ALIGN cuando se comparan secuencias
de aminoácidos. Otro ejemplo no limitativo preferido de un
algoritmo matemático de uso para comparar dos secuencias es el
algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90:5873-5877, modificado como en Karlin y Altschul
(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Tal
algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul
et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. Las
búsquedas de secuencias de aminoácidos de BLAST pueden realizarse
con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3,
para obtener una secuencia de aminoácidos similar al polipéptido de
interés. Para obtener alineamientos con huecos con fines de
comparación, puede utilizarse BLAST con huecos como se describe en
Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res.
25:3389-3402. Alternativamente, puede usarse
PS1-BLAST para realizar una búsqueda integrada que
detecta relaciones distantes entre moléculas. Véase Alschul et
al. (1997) supra. Cuando se utilizan programas BLAST,
BLAST con huecos o PS1-BLAST, pueden usarse los
parámetros por defecto. Véase la website para ncbi.nim.nih.gov.
Véase también el programa ALIGN (Dayhoff (1978) en Atlas of Protein
Sequence and Structure 5: Supl. 3, National Biomedical Rsearch
Foundation, Washington, D.C.) y programas en el Wisconsin Sequence
Analysis Package, Versión 8 (disponibles de Genetics Computer Group,
Madison, Wisconsin), por ejemplo, el programa GAP, en el que se
utilizan parámetros por defecto de los
programas.
programas.
Cuando se considera el porcentaje de identidad
de secuencia de aminoácidos, algunas posiciones de residuos de
aminoácidos pueden diferir como resultado de sustituciones de
aminoácidos conservadoras, que no afectan a propiedades de la
función de la proteína. En estos casos, el porcentaje de identidad
de secuencias puede ajustarse hacia arriba para dar cuenta de la
similitud en aminoácidos sustituidos conservadoramente. Tales
ajustes son muy conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Myers y
Miller (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17.
Las variantes activas biológicamente de
IFN-\beta abarcadas por la invención deben
conservar actividades de IFN-\beta,
particularmente la capacidad para unirse a receptores de
IFN-\beta. La actividad biológica de variantes de
IFN-\beta puede medirse por cualquier método
conocido en la técnica. Pueden encontrarse ejemplos de tales
ensayos en Fellous et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci USA
79:3082-3086; Czemiecki et al. (1984) J.
Virol. 49(2):490-496; Mark et al.
(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5662-5666;
Branca et al. (1981) Nature 277:221-223;
Williams et al. (1979) Nature 282:582-586;
Herberman et al. (1979) Nature 277:221-223; y
Anderson et al. (1982) J. Biol. Chem.
257(19):11301-11304.
Se indican ejemplos de polipéptidos
IFN-\beta y polipéptidos variantes de
IFN-\beta abarcados por la invención en Nagata
et al. (1980) Nature 284:316-320; Goeddel
et al. (1980) Nature 287:411-416; Yelverton
et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9:731-741;
Streuli et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
78:2848-2852; documento EP028033B1 y EP109748B1.
Véanse también las Patentes de los EE.UU. Nº 4.518.584; 4.569.908;
4.588.585; 4.738.844; 4.753.795; 4.769.233; 4.793.995; 4.914.033;
4.959.314; 5.545.723; y 5.814.485. Estas citas proporcionan también
una guía relativa a residuos y regiones del polipéptido
IFN-\beta que pueden alterarse sin pérdida de
actividad biológica.
Por "IFN-\beta producido
recombinantemente" quiere decirse IFN-\beta que
tiene actividad biológica comparable con
IFN-\beta nativo y que se ha preparado por
técnicas de ADN recombinante. Puede producirse
IFN-\beta cultivando una célula hospedante
transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia
de nucleótidos que codifica un polipéptido
IFN-\beta. La célula hospedante es una que puede
transcribir la secuencia de nucleótidos y producir la proteína
deseada, y puede ser procariota (por ejemplo, E. coli) o
eucariota (por ejemplo, una células de levadura, insecto o
mamífero). Se dan ejemplos de producción recombinante de
IFN-\beta en Mantei et al. (1982) Nature
297:128; Ohno et al. (1982) Nucleic Acids Res. 10:967; Smith
et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156; y Patente de los
EE.UU. Nº 4.462.940, 5.702.699 y 5.814.485.
Véase también la Patente de los EE.UU. Nº
5.795.779, en la que se produce recombinantemente
IFN-\beta-1a en células de ovario
de hámster chino (CHO). Se han clonado genes de interferón humano
usando tecnología de ADN recombinante ("rADN") y se han
expresado en E. coli (Nagola et al. (1980) Nature
284:316; Goeddel et al. (1980) Nature 287:411; Yelverton
et al. (1981) Nuc. Acid Res. 9:731; Streuli et al.
(1981) Proc. Natl. Acad Sci. USA 78:2848). Alternativamente, puede
producirse IFN-\beta por un animal o planta
transgénicos que se ha diseñado genéticamente para expresar la
proteína IFN-\beta de interés según métodos
conocidos en la técnica.
Pueden producirse también proteínas o
polipéptidos que presentan propiedades tipo
interferón-beta nativo con tecnología de rADN
extrayendo ARN mensajero 12S rico en poli A de células humanas
inducidas víricamente, sintetizando cADN de doble cadena usando el
mARN como plantilla, introduciendo el cADN en un vector de clonación
apropiado, transformando microorganismos adecuados con el vector,
cosechando los microorganismos y extrayendo de ellos el
interferón-beta. Véanse, por ejemplo, Solicitudes de
patente europea Nº 28033 (publicada el 6 de Mayo de 1981); 32134
(publicada el 15 de Julio de 1981); y 34307 (publicada el 26 de
Agosto de 1981), que describen diversos métodos de producción de
IFN-\beta empleando técnicas de rADN.
Alternativamente, IFN-\beta
puede sintetizarse químicamente, mediante alguna entre varias
técnicas que son conocidas por los expertos en la técnica de
péptidos. Véanse, por ejemplo, Li et al. (1983) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 80:2216-2220; Stewart y Young (1984)
Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Company, Rockford,
Illinois) y Baraney y Merrifield (1980) The Peptides: Analysis,
Synthesis, Biology, reds. Gross y Meinhofer, Vol. 2 (Academic
Press, Nueva York, 1980), págs. 3-254, que discuten
técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida; y Bodansky (1984)
Principles of Peptide Synthesis (Springer-Verlag,
Berlin) y Gross y Meinhofer, reds. (1980) The Peptides: Analysis,
Synthesis, Biology Vol. 1 (Academic Press, Nueva York), que discuten
síntesis en solución clásica. También puede prepararse químicamente
IFN-\beta por el método de síntesis de péptidos
múltiple simultánea. Véanse, por ejemplo, Houghten (1984) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135; y Patente de los
EE.UU. Nº 4.631.211.
La preparación de las composiciones que
comprenden IFN-\beta monómero se realiza
preferiblemente según uno de dos métodos de purificación. El
primero de estos métodos de purificación, que se proporciona aquí
para una mejor comprensión de la invención y no como una
realización de la invención, comprende tres etapas básicas: (1)
precipitación de IFN-\beta de una solución que
comprende IFN-\beta purificado; (2) disolución del
precipitado de IFN-\beta en hidrocloruro (HCl) de
guanidina para conseguir resolubilización del
IFN-\beta; y (3) renaturalización del
IFN-\beta, preferiblemente mediante dilución o
diálisis usando un tampón aceptable. Este método de purificación
produce IFN-\beta que es soluble, estable y está
en forma monómera. La composición resultante puede formularse como
una composición farmacéutica por diafiltración o diálisis
adicionales de esta composición con un tampón aceptable
farmacéuticamente. Esta etapa final separa HCl de guanidina residual
de la solución que comprende IFN-\beta
renaturalizado y proporciona una formulación que tiene un pH que es
aceptable para administración parenteral.
Usando este método de purificación de la
invención, se prepara primero un precipitado de
IFN-\beta precipitando
IFN-\beta purificado de una solución. La
precipitación se consigue reduciendo la solubilidad de
IFN-\beta. La reducción de la solubilidad de
IFN-\beta y la precipitación de
IFN-\beta pueden conseguirse con el uso de un
alcohol; por ejemplo, un alcohol alifático tal como etanol. Para
algunas proteínas, la precipitación resulta de una reacción de
desnaturalización y/o agregación que es irreversible, conduciendo a
inactivación de proteínas, pero, en el caso del
IFN-\beta precipitado de la presente invención, la
reacción de precipitación es reversible. Así, el
IFN-\beta soluble recuperado en las etapas
subsiguientes de este método de purificación conserva su actividad
biológica.
El precipitado resultante se disuelve después en
HCl de guanidina para obtener una solución que comprende
IFN-\beta desnaturalizado resolubilizado y HCl de
guanidina. En aquellos casos en los que el
IFN-\beta purificado se ha obtenido usando una
etapa de purificación inicial que incluye el uso de SDS como
solubilizante, el SDS permanece como un precipitado tras la
disolución con HCl de guanidina. Este SDS precipitado se separa por
filtración usando técnicas de filtración estándares conocidas en la
técnica, preferiblemente antes de realizar las etapas subsiguientes
de este método de purificación mejorado. La cantidad de HCl de
guanidina a mezclar con el precipitado de
IFN-\beta es una cantidad suficiente para
solubilizar el IFN-\beta precipitado en la
solución de HCl de
guanidina-IFN-\beta resultante, es
decir, HCl de guanidina 6 M a 10 M, preferiblemente 6 M a 9 M, más
preferiblemente HCl de guanidina 6 M a 8 M en esta solución de HCl
de guanidina-IFN-\beta
resultante. Aunque esté solubilizado, el IFN-\beta
de esta solución también está desnaturalizado. La renaturalización
de la proteína se consigue por dilución de la solución de HCl de
guanidina-IFN-\beta con una
solución tampón, por lo que se obtiene una solución que comprende
IFN-\beta renaturalizado resolubilizado e
hidrocloruro de guanidina residual. El IFN-\beta
de esta solución resultante es monómero, es decir, al menos el 51%
está en su forma monómera, preferiblemente al menos el 70%, 75%,
80%, 85%, más preferiblemente al menos el 90% o más en su forma
monómera, como se determina, por ejemplo, por HPLC de
dimensionamiento.
Durante las etapas de resolubilización y
renaturalización, el HCl de guanidina sirve como un agente
solubilizante para aumentar la solubilidad de
IFN-\beta. Por "aumentar la solubilidad" de
IFN-\beta se pretende decir aumentar la cantidad
de IFN-\beta que puede disolverse en solución a pH
3,0 a pH 9,0 en presencia de HCl de guanidina, en comparación con
la cantidad de IFN-\beta que puede disolverse al
mismo pH en una solución con los mismos componentes pero que
carezca de HCl de guanidina. La capacidad de HCl de guanidina para
aumentar la solubilidad de IFN-\beta puede
determinarse usando métodos muy conocidos en la técnica, incluyendo
los descritos aquí.
Puede usarse cualquier tampón adecuado en la
etapa de dilución de este método de purificación de la invención
para conseguir la renaturalización del IFN-\beta.
Los tampones adecuados de uso en esta etapa incluyen los descritos
después, tales como acetato, citrato, fosfato y Tris HCl, cuya
elección dependerá del pH deseado de la solución resultante tras la
etapa de dilución. Cuando el método de purificación incluye la etapa
de precipitación, preferiblemente el tampón usado para la etapa de
dilución tiene un pH de 4,0 a 8,0, incluyendo 4,0, 4,5, 5,0, 5,5,
6,0, 6,5, 7,0, 7,5 y 8,0, más preferiblemente un pH de 5,0 a
7,0.Después de esta etapa de dilución, preferiblemente la cantidad
de HCl de guanidina residual que permanece en la solución de
IFN-\beta renaturalizado resolubilizado es 1,6 M o
menos, más preferiblemente 0,8 M o menos.
La solución de IFN-\beta
renaturalizado resolubilizado resultante comprende el
IFN-\beta en su forma monómera (es decir, más del
51% es monómero). Además, la solución de IFN-\beta
renaturalizado resolubilizado comprende una cantidad residual de
HCl de guanidina. Esta composición puede utilizarse para preparar
formulaciones farmacéuticas que son adecuadas para administración
parenteral. De esta manera, el aumentador de solubilidad HCl de
guanidina residual puede separarse de la solución de
IFN-\beta renaturalizado resolubilizado por
diálisis o diafiltración de esta solución con un tampón aceptable
farmacéuticamente. Por "separación de HCl de guanidina
residual" se quiere decir que la formulación farmacéutica que
comprende IFN-\beta sustancialmente monómero
preparado usando las etapas de este método de purificación
comprende HCl de guanidina en una concentración de 10 mM o menos,
preferiblemente 5 mM o menos. Puede usarse cualquier tampón
aceptable farmacéuticamente para fabricar la formulación
farmacéutica en tanto en cuanto el IFN-\beta
permanezca solubilizado y sustancialmente en su forma monómera. En
una realización, el tampón aceptable farmacéuticamente comprende
arginina o cloruro sódico en una cantidad suficiente para aumentar
la producción de la forma monómera de IFN-\beta en
comparación con la producción obtenida en ausencia de arginina o
cloruro sódico en el tampón aceptable farmacéuticamente. Para
arginina, la cantidad suficiente para aumentar la producción es de
0,2 M a 1,0 M, preferiblemente de 0,4 M a 0,8 M, incluyendo 0,4 M,
0,5 M, 0,6 M, 0,7 M y 0,8 M. En una realización, la cantidad de
arginina presente en el tampón aceptable farmacéuticamente es 0,5
M. Para cloruro sódico, la cantidad suficiente para aumentar la
producción es de 0,2 M a 1,2 M, preferiblemente de 0,2 M a 1,0 M,
más preferiblemente 0,5 M a 1,0 M. En una realización, la cantidad
de cloruro sódico presente en el tampón aceptable farmacéuticamente
es 1,0 M.
El segundo método de purificación para preparar
una composición que comprende IFN-\beta monómero
es similar al primer método, pero proporciona un medio para
preparar esta composición sin la etapa de precipitación. Este
segundo método comprende dos etapas básicas: (1) mezclar una muestra
que comprende IFN-\beta purificado con
hidrocloruro (HCl) de guanidina para obtener una solución que
comprende IFN-\beta desnaturalizado solubilizado;
y (2) renaturalizar el IFN-\beta, preferiblemente
mediante dilución usando un tampón aceptable. El HCl de guanidina
sirve como agente de aumento de la solubilidad como se ha indicado
antes, y se usa en cantidades similares a las indicadas antes para
el primer método de purificación. Así, después de la primera etapa,
la cantidad de HCl de guanidina en la solución que comprende
IFN-\beta desnaturalizado solubilizado es HCl de
guanidina 6 M a 10 M, preferiblemente 6 M a 9 M, más preferiblemente
HCl de guanidina 6 M a 8 M. Como se ha indicado antes, cuando el
IFN-\beta sustancialmente purificado inicial
contiene SDS, el SDS precipita en esta etapa y puede filtrarse de
la solución usando técnicas de filtración estándares conocidas en la
técnica.
Como en el primer método de purificación, el
IFN-\beta de esta solución de HCl de
guanidina-IFN-\beta se
desnaturaliza. La renaturalización se consigue por dilución usando
un tampón aceptable que tiene un pH en el intervalo de 3,0 a 5,0,
preferiblemente 3,0 a 4,0, más preferiblemente 3,0. Los tampones
adecuados para esta etapa de dilución para conseguir la
renaturalización del IFN-\beta incluyen glicina,
ácido aspártico, ácido glutámico y succinato, acetato, fosfato,
formiato y citrato, así como cualesquiera sales de ellos. Después
de esta etapa de dilución, preferiblemente la cantidad de HCl de
guanidina residual que queda en la solución de
IFN-\beta renaturalizado solubilizado es 1,6 M o
menos, preferiblemente 0,8 M o menos, más preferiblemente 0,1 M o
menos. Tras la renaturalización, la composición resultante comprende
IFN-\beta sustancialmente monómero, es decir, al
menos el 51%, preferiblemente al menos el 70%, está en su forma
monómera, como se determina, por ejemplo, usando HPLC de
dimensionamiento, usando preferiblemente ultracentrifugación
analítica (véase, por ejemplo, Liu y Shire (1999) J. Pharm. Sci.
88:1237-1241, incorporado aquí como referencia). El
HCl de guanidina residual de esta solución de
IFN-\beta renaturalizado puede separarse de una
manera similar a la indicada para el primer método de purificación
para preparar una formulación farmacéutica que comprende
IFN-\beta sustancialmente monómero. Puede
utilizarse cualquier tampón aceptable farmacéuticamente como se ha
indicado en otras partes aquí siempre que el
IFN-\beta permanezca solubilizado y
sustancialmente en su forma monómera. En una realización, el tampón
aceptable farmacéuticamente se selecciona del grupo constituido por
glicina, ácido aspártico y succinato sódico, preferiblemente
glicina, de tal modo que la formulación farmacéutica tenga un pH de
3,0 a 5,0, preferiblemente 3,0 a 4,0, más preferiblemente 3,0.
Así, la forma sustancialmente monómera de
IFN-\beta proporcionada por los métodos de
purificación de la presente invención tiene varios usos como se
describe en la presente invención. Por ejemplo, esta forma de
IFN-\beta puede usarse directamente para formular
composiciones farmacéuticas adecuadas para administración
parenteral como se ha indicado aquí. Tras la etapa de diafiltración
o diálisis con un tampón aceptable farmacéuticamente de elección
para separar HCl de guanidina residual, las composiciones
farmacéuticas resultantes pueden estabilizarse frente a
desnaturalización y pérdida de actividad biológica por inclusión de
un estabilizante en las composiciones farmacéuticas, que incluye,
aunque sin limitarse a ellos, proteínas o hidratos de carbono,
escogidos preferiblemente del grupo constituido por manitol,
sorbitol, glicerol, dextrosa, sacarosa y trehalosa, o una mezcla de
ellos. En un aspecto adicional de la presente invención, la
preparación de IFN-\beta obtenida de las etapas de
diafiltración (o diálisis) y estabilización puede liofilizarse y
reconstituirse en un medio vehículo compatible fisiológicamente, no
tóxico e inerte para aplicaciones terapéuticas y clínicas.
Las composiciones farmacéuticas se formulan con
una concentración conocida de la forma sustancialmente monómera de
IFN-\beta, de tal modo que la administración de
una dosis particular promueva una respuesta terapéutica deseada con
respecto a un estado de respuesta a IFN-\beta
particular que experimente terapia. Por "respuesta terapéutica
deseada" se quiere decir una mejora en el estado o en los
síntomas asociados con el estado.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden
el IFN-\beta son útiles en terapia dirigida al
tratamiento de estados de respuesta a IFN-\beta.
Por "terapia" quiere decirse tratamiento de un estado normal
existente que se aumenta por terapia con
IFN-\beta, tratamiento terapéutico de un estado
anormal que responda a IFN-\beta y procedimientos
preventivos o profilácticos que comprenden tratamiento con
IFN-\beta para prevenir o reducir la gravedad de
la aparición de un estado anormal. Por "estado que responda a
IFN-\beta" se quiere decir cualquier estado
que responda positiva o negativamente a IFN-\beta.
Tal estado de respuesta a IFN-\beta puede ser un
estado normal. Por ejemplo, un mamífero puede experimentar terapia
con IFN-\beta para aumentar las características
de respuesta y/o la capacidad de la respuesta inmune. Tales terapias
abarcan el tratamiento para proporcionar protección contra, o
modular, la gravedad de infecciones víricas, por ejemplo, virus
Dengue o virus Sindbis. Como contraste, el estado de respuesta a
IFN-\beta puede ser un estado anormal tal como
melanoma maligno. Tales estados anormales pueden ser crónicos, y
tener lugar así más o menos continuamente, o tales estados
anormales pueden ser agudos. El estado de respuesta a
IFN-\beta podría ser un estado que podría
caracterizarse posiblemente como crónico y agudo, tal como
esclerosis múltiple remitente-reincidente.
Cualquier trastorno de respuesta a IFN-\beta puede
beneficiarse de la administración de las composiciones
farmacéuticas de IFN-\beta de la presente
invención. Los estados de respuesta a IFN-\beta
pueden incluir también trastornos inmunológicos, tales como
inmunodeficiencias, incluyendo tolerancia inmune disminuida como
resultado de enfermedad o infección o daño a la respuesta inmune
resultante de efectos ambientales u otros, tales como quimioterapia
u otra exposición a compuestos químicos tóxicos.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de
ilustración.
Los Ejemplos 1 a 7, así como la figura 3, no
representan realizaciones de la presente invención, pero se
proporcionan para una mejor comprensión de la invención.
Se produjo en E. coli
IFN-\beta para uso en estos experimentos
esencialmente como se describe en la primera de varias etapas de
purificación indicadas en las Patentes de los EE.UU. Nº 4.462.940
y/o 4.816.400. Esto es, se usaron bacterias transformadas para
producir IFN-\beta; las células hospedantes se
concentraron, y se rompieron sus paredes celulares. El
IFN-\beta se preparó después según los métodos de
la presente invención tras la preparación de un agrupamiento de
IFN-\beta purificado.
El procedimiento básico fue como sigue:
- 1.
- Se precipita IFN-\beta del agrupamiento de IFN-\beta purificado usando etanol. Se usan seis partes del agrupamiento de IFN-\beta purificado por cuatro partes de etanol. Esta etapa produce más del 80% del interferón como un glóbulo que puede centrifugarse.
- 2.
- Se disuelve después el glóbulo en HCl de guanidina 8 M hasta una solución de aproximadamente 10 mg/ml de proteína. Esta solubilización es rápida; la pequeña cantidad de SDS presente no se solubiliza y se separa por filtración.
- 3.
- La solución de HCl de guanidina resultante se diluye después en un tampón 10 mM.
Se realizaron experimentos iniciales para
determinar los parámetros de dilución óptimos para la etapa de
dilución de hidrocloruro de guanidina. Se realizó como se indica en
la Tabla 1 un experimento a pequeña escala que medía producciones
relativas; se obtuvieron los mejores resultados por encima de pH 4,0
y por debajo de hidrocloruro de guanidina 0,8 M después de diluir.
La concentración del interferón-beta monómero se
determinó usando HPLC de dimensionamiento con un tampón de glicina
400 mM pH 3,0. Los resultados de la Tabla 2 y un conjunto típico de
cromatogramas en la Figura 1 muestran que, aunque se obtuvieron a
bajos pHs multímeros no covalentes, se obtuvo
interferón-beta monómero a pH 5,0 y superior.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento se aumentó de escala para
evaluar la producción de la etapa de dilución de guanidina. Los
resultados de la Tabla 3 muestran que puede obtenerse una producción
del 41% al 57% con una dilución de cuarenta veces a pH 6 a 8 con
una concentración de proteína final de aproximadamente 0,15 mg/ml.
Las concentraciones de SDS en muestras ensayadas fueron menores de
10 microgramos por miligramo de IFN.
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Se usó diálisis para separar HCl de guanidina
residual presente después de la dilución. A pH 5, la mayor
producción, 83%, se obtuvo sin NaCl adicional presente; y a pH 7,0,
la mayor producción 70%, se obtuvo con NaCl 1000 mM presente como
se muestra en la Figura 2. En todos los casos, hubo precipitación
tras la diálisis, aunque la fracción soluble era monómera, como se
valoró usando HPLC de dimensionamiento.
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Un pequeño volumen de
IFN-\beta en tampón que contenía fosfato 1,0 mM (a
pH 7,0) y NaCl 100 mM se puso en un tubo sobre un sacudidor de
extremo a extremo. Después de aproximadamente 3 horas, alrededor del
50% del material de IFN-\beta había precipitado.
Esto sugiere que se aumentará la estabilización por un tensioactivo
adecuado, tal como Tween 80. La adición de Tween 80 estabiliza
interferón y aumenta por ello la producción de la etapa de
diálisis. Sin embargo, el Tween 80 puede inducir también agregación
de una manera dependiente de la concentración, como se muestra en
la Figura 3. Estos agregados son solubles. Otros tensioactivos
pueden actuar más óptimamente.
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Se evaluó una serie de experimentos para estimar
la recuperación de IFN-\beta durante (1) la
desnaturalización de IFN-\beta en hidrocloruro de
guanidina 8 M; (2) repliegue de IFN-\beta por una
dilución rápida con tampón; y (3) diálisis para separar
hidrocloruro de guanidina residual con y sin arginina presente para
obtener una formulación final. La composición de la formulación y
las condiciones de las etapas 1-3 se optimizaron
usando un experimento diseñado semifactorial. Los factores usados
fueron concentración de proteína, concentración de hidrocloruro de
guanidina, pH, temperatura y concentración de arginina.
Se encontró que el pH, la concentración de
IFN-\beta, la concentración de hidrocloruro de
guanidina después de la dilución y la concentración de arginina
eran términos del modelo significativos. Las contribuciones más
altas del modelo se obtuvieron de la concentración de
IFN-\beta y arginina. La interacción entre
arginina y pH jugó un papel significativo. Los mejores resultados
se obtuvieron con tampón de NaPO_{4} 10 mM pH 7,0 que contenía
arginina en el tampón final. La producción total de las etapas
1-2 fue hasta el 80-100% y la
producción de la etapa 3 fue 70-80%.
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Sin el uso de precipitación con etanol
Se guardó a 5ºC
IFN-\beta-1b purificado (1 l de
1,91 mg/ml en 0,4% de SDS, tampón de acetato 50 mM, pH 5,5).
Durante el almacenamiento, parte del SDS presente precipitó. Se
mezclaron 250 ml de este material (477,5 mg) con 229 g de
hidrocloruro de guanidina (6 M, volumen total 400 ml) y se agitó a
temperatura ambiente durante 15 minutos usando una barra de
agitación magnética. La solución de hidrocloruro de
guanidina/proteína 6 M se filtró después con una Cápsula Sartobran®
P (tamaño de poros 0,45 \mum) para separar el SDS precipitado. La
concentración de proteína determinada por UV a 280 nm fue 1,02
mg/ml. La producción de proteína fue 406 mg u 85%.
Los 400 ml del material tratado con hidrocloruro
de guanidina se concentraron utilizando un sistema de diafiltración
Millipore® Labsoale® TFF (Millipore, Inc.) con dos membranas de
polisulfona de 10 kD de 0,1 cm^{2} Pellicon® XL Biomass®
(Millipore, Inc.). El volumen tras la etapa de concentración fue 37
ml con una concentración de proteína de 10,3 mg/ml para una
producción post-concentración de 381 mg o 93%.
Usando una pipeta de transferencia, se añadieron
gradualmente 10 ml (103 mg) de la solución concentrada de
hidrocloruro de guanidina/proteína a 590 ml de solución de glicina 5
mM, pH 3,2. El tampón fue a una agitación rápida usando una barra
de agitación magnética; la solución de proteína se añadió
directamente al vórtice. Esta dilución de 60 x de la solución de
hidrocloruro de guanidina/proteína 6 M produjo una solución de
hidrocloruro de guanidina/proteína 0,1 M con 0,17 mg/ml. Estos 600
ml se transfirieron a una unidad de diafiltración de escala 500 ml
equipada con dos membranas de polisulfona de 10 kD de 0,1 m^{2}
Pellicon® II. Esta solución se concentró inicialmente hasta \sim
400 ml a una concentración de proteína de 0,23 mg/ml, y se diafiltró
a continuación frente a 9 cambios de volumen (3,6 l) de glicina 5
mM a pH 3,2. El diafiltrado final (402 ml) se midió por UV a 280 nm
para una concentración de proteína final de 0,23 mg/ml con una
producción de 92,46 mg o el 90% para la etapa de diafiltración, y
una producción total del 72% de proteína soluble para el
procedimiento de purificación.
Claims (9)
1. Un método para preparar una composición que
comprende interferón-beta
(IFN-\beta) monómero, cuyo método comprende:
- a)
- preparar una muestra que comprende IFN-\beta purificado;
- b)
- mezclar dicha muestra con hidrocloruro (HCl) de guanidina para obtener una primera solución que comprende IFN-\beta desnaturalizado solubilizado; y
- c)
- renaturalizar dicho IFN-\beta por dilución de dicha primera solución con un primer tampón, en el que dicho primer tampón tiene un pH de 3,0 a 5,0, y en el que se obtiene una solución de IFN-\beta renaturalizado que comprende IFN-\beta monómero e HCl de gunidina residual.
2. El método de la reivindicación 1ª, en el que
dicho HCl de guanidina residual está presente en dicha solución de
IFN-\beta renaturalizado en una concentración de
1,6 M o menos.
3. El método de la reivindicación 1ª, en el que
dicho HCl de guanidina residual está presente en dicha solución de
IFN-\beta renaturalizado en una concentración de
0,8 M o menos.
4. El método de la reivindicación 1ª, en el que
dicho HCl de guanidina residual está presente en dicha solución de
IFN-\beta renaturalizado en una concentración de
0,1 M o menos.
5. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1ª a 4ª, que comprende además la etapa de separar
dicho HCl de guanidina residual de dicha solución de
IFN-\beta renaturalizado por diafiltración o
diálisis de dicha solución de IFN-\beta
renaturalizado en un segundo tampón, en el que dicho segundo tampón
tiene un pH de 3,0 a 5,0 y se selecciona del grupo constituido por
glicina, ácido aspártico y succinato sódico.
6. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1ª a 5ª, en el que dicho
IFN-\beta está glicosilado o no glicosilado.
7. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1ª a 6ª, en el que dicho
IFN-\beta se produce recombinantemente.
8. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1ª a 7ª, en el que dicho
IFN-\beta es IFN-\beta humano
maduro o una variante del mismo, en el que dicha variante del mismo
tiene al menos una identidad de secuencia de aminoácidos del 80% con
la secuencia de aminoácidos del IFN-\beta humano
maduro.
9. El método de la reivindicación 8ª, en el que
dicha variante del mismo tiene la secuencia de aminoácidos de
IFN-\beta humano maduro con un residuo de serina que sustituye al residuo de cisteína en posición 17 de la secuencia de IFN-\beta humano maduro.
IFN-\beta humano maduro con un residuo de serina que sustituye al residuo de cisteína en posición 17 de la secuencia de IFN-\beta humano maduro.
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