CN1479627A - 蛋白质纯化及回收方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及干扰素β(IFN－β)的纯化及回收的改进方法以及含实质为单体IFN－β的组合物。其中一种纯化方法是，将基本上纯化的IFN－β或其变体沉淀，然后溶解到盐酸胍溶液中。用合适的缓冲液稀释使蛋白复性。本发明还提供了一种无沉淀步骤的相似的纯化方法。IFN－β复性后渗滤或透析到适当的药用的缓冲液中以除去残留盐酸胍，从而制得含实质为单体IFN－β的药物组合物。

Description

蛋白质纯化及回收方法
技术领域
本发明涉及生物化学工程领域。更具体地说，本发明涉及一种改进的生物化学回收方法，通过该方法可以使重组干扰素β以相当高的纯度和单体形式重折叠和回收。该组分可用于药物制剂。
技术背景
天然产生的干扰素是种属特异性的蛋白质，通过病毒、双链RNA、其他多核苷酸、抗原及促分裂原的诱导后各种细胞可以产生干扰素。干扰素具有多种生物活性，包括抗病毒、抗增殖、免疫调节以及抗细胞活性。通过对这些活性的研究至少可以鉴定出三种不同类型的人源干扰素，文献报道，这三类干扰素是由性质不同的结构基因编码的不同蛋白质。干扰素多为糖蛋白，最初是根据其细胞来源进行分类的，后来重新分类为α、β和γ。
干扰素β(“IFN-β”)由成纤维细胞和上皮细胞产生。天然的干扰素β是通过多核糖肌苷酸和多核糖胞苷酸诱导培养人成纤维细胞产生的，再经过色谱及电泳技术进行分离和纯化。用这种方法纯化的干扰素价格昂贵而且困难，因而阻碍了对其治疗效果进行广泛的临床实验和评价。从天然来源中分离干扰素仍是相当困难和昂贵的。
最近用重组DNA(“rDNA”)技术克隆了几种人源干扰素基因，并且在大肠杆菌中表达(Nagola等(1980)Nature 284：316；oeddel等(1980)Nature 287：411；Yelverton等(1981)Nucleic Acids Res.9：731；Streuli等(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2848)。具有天然干扰素β样性质的蛋白质或多肽也可以利用重组DNA技术通过如下步骤制备，首先从病毒诱导的人源细胞中提取富含聚腺苷酸的12S的信使RNA，然后以信使RNA为模板合成双链cDNA，将cDNA引入合适的克隆载体，用载体转化合适的微生物，收获微生物并从中提取干扰素β。例如欧洲专利申请28033号(1981年5月6日出版)、32134号(1981年7月15日出版)和34307号(1981年8月26日出版)描述了多种利用重组DNA技术生产干扰素β的方法。从重组DNA克隆中表达的蛋白质或多肽已经纯化和检测，发现具有和天然干扰素相似的性质。因而细菌产生的干扰素具有潜在的抗病毒和抗肿瘤药物的治疗用途。通过这种细菌发酵可以以相对低的成本制备大量的干扰素，因此使干扰素可以有更广泛的应用，比如临床研究。
用于临床研究的干扰素β必须具有相当高的纯度，不被有毒的宿主细胞成分、细胞碎片以及其他在提取和纯化步骤引入的外源性化学物质所污染。目前有几种方法用于制备、回收和纯化干扰素β。
美国专利4,462,940和5,702,699号所公开的纯化和回收干扰素β的方法及其他相似的方法可以制备纯态的干扰素β，这种干扰素β在没有强溶解剂如十二烷基磺酸钠(“SDS”)存在的条件下趋向于形成凝聚体。另外，上述方法是将蛋白质暴露于高pH值条件下，这种条件(1)有可能对蛋白质的生物学性质产生不制影响，(2)导致组合物中含有在纯化过程中用于溶解蛋白质的残留量的SDS。
因此，需要改进回收和纯化过程以避免IFN-β处于高碱性状态下，制剂不含有或基本不含有SDS，蛋白质在适合肠外给药的pH下溶解。本发明的目的在于提供药学上可接受的IFN-β样品，它具有相当高的纯度并且在纯化和回收过程中易于重折叠。
发明概要
本发明提供可用于制备IFN-β药物制剂的改进方法。此方法可提供含有IFN-β的单体的、液体的药物组合物。此方法包括增强蛋白质在回收过程中重折叠的条件。
为了达到上述及其他目标以及与在此广泛描述的本发明的目的相适应，本发明提供了一种改进的方法用于纯化和回收IFN-β。其实施例之一是，改进的方法包括制备一种含有IFN-β的溶液，从这种溶液中分离出大体上纯化的IFN-β库，用酒精将纯化的IFN-β从库中沉淀下来，将沉淀的IFN-β溶解到盐酸胍中形成含有再增溶变性的IFN-β的溶液。然后将含有再增溶变性的IFN-β的溶液稀释到合适的第一缓冲液中，得到含有再增溶变性的IFN-β的溶液；然后所得到的溶液渗滤或透析到药学上可接受的缓冲液中。这最后一步除去残存的盐酸胍，得到含有实质为单体的IFN-β的、适合肠外给药的药物制剂。
在另一个实施例中，纯化和回收IFN-β的改进方法包括：获得大体上纯化的IFN-β样品，并将此样品与盐酸胍混合得到含有增溶变性的IFN-β的溶液，然后将此含有增溶变性的IFN-β的溶液稀释到合适的第一缓冲液中，获得含增溶复性的IFN-β的溶液。然后将得到的增溶复性的IFN-β溶液渗滤或透析到药学上可接受的缓冲液中。如上所述，这最后一步除去残存的盐酸胍，得到含有实质为单体的IFN-β的、适合肠外给药的药物制剂。
本发明的另一方面涉及改善微生物产生IFN-β的回收过程。利用本发明的方法，有可能制备不含或实质不含SDS(＜10微克SDS/每毫克IFN-β)的IFN-β药物制剂。本发明的另一方面是利用本发明所描述的方法不需要某些物质如人血清白蛋白(HAS)来稳定IFN-β的制备。大体上为单体形式的IFN-β可以稀释到水相缓冲液中用药物制剂。因此，本方法可用于制备本发明的药物组合物。
附图简要说明
图1显示在盐酸胍增溶步骤IFN-β稀释到不同缓冲液中后收集的HPLC色谱数据。
图2显示盐浓度及pH值对从4M盐酸胍、10mM磷酸钠、pH7.0的缓冲液中回收IFN-β的影响。
图3显示Tween80对根据本发明所述方法制备的复性IFN-β凝聚的影响。
发明的详细描述
本发明涉及一种新的制备实质单体形式的IFN-β的方法。所谓“实质单体”是指存在于制备物或组合物中的大多数IFN-β(重量计)是单体的而不是凝聚的。“凝聚”是指多肽分子之间通过物理相互作用而形成非共价多聚物，这些多聚物可能是可溶性的，也可能从溶液中沉淀出来。在实质单体组合物或制剂中单体态IFN-β所占的百分比(重量百分比)可以51％不等或更大。本发明所提供的制备含有实质单体IFN-β组合物的方法不使用传统的稳定剂HSA，所得到的组合物不含或基本不含增溶剂十二烷基磺酸钠(SDS)(即含＜10微克SDS/每毫克IFN-β)。因而，这些含有实质单体IFN-β的组合物适合用于制备药物或治疗制剂。IFN-β多肽的单体形式仍是可溶的，因此据说“可溶于”本发明的药物组合物中。综上所述，本发明提供了不含HSA、不含SDS的IFN-β药物组合物，该组合物包括至少约51％的单体形式IFN-β，而不是其凝聚形式，优选至少约55％、60％、65％、70％、80％、85％单体形式IFN-β的组合物，更优选至少约90％或更高单体形式IFN-β的组合物。
在本发明的一个实施例中，含有实质单体IFN-β的组合物由如下方法制备：从溶液中沉淀基本上纯化的IFN-β，经过盐酸胍溶解将沉淀重悬浮，过滤除去IFN-β初样品中残存的SDS，然后将得到的盐酸胍-IFN-β溶液用适当的缓冲液稀释使IFN-β复性。“实质纯化”是指原材料中的IFN-β大体上或基本上不含有某些组分，这些组分在天然存在环境即生产重组IFN-β所用的天然细胞或宿主细胞中通常与蛋白质伴随或相互作用。大体上不含细胞组分的IFN-β多肽包括制备的蛋白质中杂蛋白的比例少于约30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％(干重)。当IFN-β多肽或其他生物活性变体通过重组技术制备后，优选的是培养基中化学前体或感兴趣的非蛋白化学物质所占比例少于约30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％(干重)。因此，本发明所述方法中所用的“基本上纯化的IFN-β”是指通过SDS/PAGE分析至少有约70％纯度，优选是至少75％、80％、85％纯度，更优选是至少90％或更高的纯度。
在另外一个实施例中，含实质单体IFN-β的组合物的制备不需要上述的沉淀步骤。这种方法是将含有基本上纯化的IFN-β的样品与盐酸胍混合得到含有增溶变性的IFN-β的溶液，然后将得到的盐酸胍-IFN-β溶液用适当的缓冲液稀释使IFN-β复性。这些制备步骤的衍生结果是含有实质单体IFN-β的组合物的基础，也是制备含有实质单体IFN-β的可注射制剂方法的基础，这种制剂可用于IFN-β反应性疾病的IFN-β治疗。
这里所用的术语“IFN-beta”或“IFN-β”是指干扰素β及其变体，有时是指干扰素β样多肽。例如，人IFN-β变体可以指天然产生的(即IFN-β位点上的等位基因变体)或重组制备的蛋白质，具有与成熟的天然的人IFN-β相同类似或实质类似的氨基酸序列。保留其活性的IFN-β片段或IFN-β的截短形式也被称作“IFN-beta”或“IFN-β”。这些具有生物活性的IFN-β片段或截短形式是通过本领域已知的重组βNA技术除去全长IFN-β氨基酸序列上的氨基酸残基而得到的。IFN-β多肽可以是糖基化的(IFN-β-1a)，也可以是非糖基化的(IFN-β-1b)。文献报道糖基化和非糖基化的IFN-β具有相同的特异活性，因而与糖基部分无关，且不影响IFN-β的生物活性。
这里所指的IFN-β变体包括天然成熟IFN-β序列的各种突变蛋白质(例如美国专利号5,814,485，参考文献已列出)，其中一个或多个对生物活性不是必需的半胱氨酸残基已被故意删除或被其他氨基酸替代以除去分子间交联或形成错误的分子间二硫键的位点。这种类型的IFN-β变体包括那些用甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸或甲硫氨酸替代成熟天然IFN-β氨基酸序列上的17位半胱氨酸的IFN-β。丝氨酸和苏氨酸是较佳的替代氨基酸，因为其化学结构与半胱氨酸相似，而丝氨酸取代是最佳的。例如，有一个IFN-β变体就是用丝氨酸替代成熟天然IFN-β氨基酸序列上的17位半胱氨酸的(美国专利5,814,485号)。17位半胱氨酸也可以采用本领域的已知方法删除(例如美国专利5,814,485号，参考文献已列出)，得到一个比天然成熟IFN-β短一个氨基酸的成熟IFN-β。另见美国专利4,530,787和4,572,798以及4,588,585号。因此，本发明也包括具有一个或多个突变的并且有助于提高其药物用途的IFN-β变体。
熟练的技术人员将知道通过突变编码IFN-β的核苷酸序列可引入额外的变化，从而导致IFN-β氨基酸序列的改变，不改变干扰素的生物学活性。通过从编码天然IFN-β的相应核酸序列上引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失可以得到与天然IFN-β氨基酸序列不同的编码IFN-β变体的分离的核酸分子，这样一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入编码的IFN-β中。突变可以通过标准技术如定点诱变和PCR介导的诱变来实现。这种IFN-β变体也包括在本发明中。
例如，保守氨基酸的取代可以在一个或多个预测的非必需氨基酸残基上进行。这里所说的“非必需氨基酸”残基是指在这个残基上对野生型IFN-β序列进行改变不会改变其生物活性，而必需氨基酸残基则是生物活性所必需的。“保守氨基酸取代”是指用具有相似侧链的氨基酸残基来替代原来的氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中定义。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸、组氨酸)、不带电的极性侧链(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)非极性侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分枝侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。这些取代无法在保守氨基酸残基上进行，或者在保守基序内无法存在氨基酸残基。
另外，IFN-β核苷酸序列也可以通过在全长或部分IFN-β编码序列上随机突变获得，如饱和诱变，所得到的突变体通过IFN-β生物活性筛选以鉴别保留生物活性的突变体。诱变后，所编码的蛋白质可以通过重组技术进行表达，蛋白活性则通过本发明所描述的标准分析技术测定。
具有生物学活性的IFN-β变体与参照IFN-β分子如天然人IFN-β相比一般至少是80％，更优先是约90％到95％或更高，最优选是约99％的氨基酸序列同一性，这里天然人IFN-β作为比较的基础。这里所说的“序列同一性”是指当变体的氨基酸序列的指定的相邻区段与参照分子的氨基酸序列放在一起对比时，变体多肽与作为参照的多肽分子内发现的相同氨基酸残基。
为了达到两个序列最佳排列以确定序列同一性的目的，变体的氨基酸序列的邻近区段相对于参照分子的氨基酸序列来说可以含有额外的或删除的氨基酸残基。用于与参照氨基酸序列比较的相邻区段至少有20个邻近氨基酸残基。通过分配间隙罚分方法来提高与变体氨基酸序列间隙相关的序列同一性的校正值。这种序列排列方法在本领域是众所周知的。
因此，可以利用数学算法则来确定任何两个序列之间的百分比同一性。一种用于序列比较的优选的、非限制性的数学算则是Myers/Millers算法(Comput.Appl.Biosci.4：11-7)。这种算法运用在ALIGN程序(2.0版本)中，它是GCG排列软件包的一部分。在比较氨基酸序列时，PAM120重量残基表、12间隙长度罚分以及间隙罚分或4可以和ALIGN程序一起使用。另外一种用于序列比较的优选的非限制性数学算法是Karlin/Altschul算法(1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877)，后来作者对运算法则作了改进(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877)，这种算法被运用到Altschul等的NBLAST和XBLAST程序中(1990，J.Mol.Biol.215：403-410)。BLAST氨基酸序列搜索可以和XBLAST程序(分数＝50，字长＝3)一起进行得到与感兴趣的多肽相似的氨基酸序列。为了获得有间隙的排列以达到比较的目的，可以利用有间隙的BLAST(Altschul等1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)。另外，PSI-BLAST可用于进行整体搜索以检测分子之间的远缘关系。见Altschul等(1997)同上述。在运行BLAST、有间隙的T或PSI-BLAST程序时，可以使用默认参数，见网站ncbi.nlm.nih.gov。也可以参见LIGN程序(Dayhoff(1978)《蛋白质序列与结构图集5：附录3》，医药研究基金，华盛顿特区)以及Wisconsin序列分析程序包中的程序，第8版(从Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin得到)，例如GAP程序，其程序的默认参数已被利用。
在考虑氨基酸序列同一性百分比时，有些氨基酸残基可能因为保守氨基酸取代而位置有差异，但这并不影响蛋白质的功能特性。在这些情况下，序列同一性百分比可能要上调以适应保守的取代氨基酸的相似性。这种调整在本领域是众所周知的。如Myers和Miller(1988)Comput.Appl.Biosci.4：11-7。
本发明所涉及的生物活性的IFN-β变体应保留IFN-β活性，特别是其与IFN-β受体结合的能力。IFN-β变体的生物活性可以通过已知的任何方法测定。这种分析方法的例子见于以下文献报道：Fellous等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA79：3082-3086；Czerniecki等(1984)J.Virol.49(2)：490-496；Mark等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：5662-5666；Branca等(1981)Nature 277：221-223；Williams等(1979)Nature 282：582-586；Herberman等(1979)Nature 277：221-223以及Anderson等(1982)J.Biol.Chem.257(19)：11301-11304。
本发明所涉及的IFN-β多肽以及IFN-β变体多肽的非限制性例子在以下文献中有描述：Nagata等(1980)Nature 284：316-320；Goeddel等(1980)Nature287：411-416；Yelverton等(1981)Nucleic Acids Res.9：731-741；Streuli等(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2848-2852；EP028033B1以及EP109748B1。也见于美国专利4,518,584；4,569,908；4,588,585；4,738,844；4,753,795；4,769,233；4,793,995；4,914,033；4,959,314；5,545,723以及5,814,485号。这些描述本文已纳入作为参考。这些引用的文献在IFN-β多肽的残基和区域改变后不会丧失生物活性方面也为我们提供了指导。
这里所说的“重组制备的IFN-β”是指IFN-β具有和天然IFN-β类似的生物活性并且是通过重组DNA技术制备的。用含有编码IFN-β多肽的核苷酸序列的表达载体转化宿主细胞，然后培养这些细胞可以制备IFN-β。宿主细胞可以转录核苷酸序列并产生所需的蛋白，可以是原核细胞(如大肠杆菌)，也可以是真核细胞(如酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞)。重组生产IFN-β的例子见于以下文献：Mantei等(1982)Nature 297：128；Ohno等(1982)Nucleic Acads Res.10：967；Smith等(1983)Mol.Cell.Biol.3：2156以及美国专利号4,462,940；5,702,699和5,814,485；本文已纳入作为参考。另外，美国专利号5,795,799描述的IFN-β-1a是在中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)中重组产生的；本文已纳入作为参考。已采用重组DNA(rDNA)技术克隆了人源干扰素基因，并且在大肠杆菌中表达(Nagola等(1980)Nature 284：316；Goeddel等(1980)Nature 287：411；Yelverton等(1981)Nucleic Acids Res.9：731；Streuli等(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2848)。另外，IFN-β也可以通过转基因动物或植物产生，即通过基因工程技术改造动物或植物使其表达感兴趣的IFN-β蛋白，这些方法在本领域是已知的。
具有天然干扰素β样性质的蛋白质或多肽也可以利用重组DNA技术通过以下步骤制备：首先从病毒诱导的人源细胞中提取富含多聚腺苷酸的12S信使RNA，然后以信使RNA为模板合成双链cDNA，将cDNA引入合适的克隆载体，用载体转化合适的微生物，收获微生物并从中提取干扰素β。例如欧洲专利申请28033号(1981年5月6日出版)、32134号(1981年7月15日出版)和34307号(1981年8月26日出版)描述了各种利用重组DNA技术生产干扰素β的方法。
另外，IFN-β也可以通过任何已知的肽合成技术进行化学合成。合成方法见如下例子：Li等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：2216-2220；Steward andYoung(1984)《固相肽合成》(SolidPhase Peptide Synthesis)，Pierce ChemicalCompany，Rochford，Illinois)；Baraney and Merrifield(1980)《肽：分析、合成、生物学》(The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology，Gross andMeinhofer编，卷2(Academic Press，New York，1980)，3-254，讨论固相肽合成技术；和Bodansky(1984)《肽合成的原理》(Prnciples of Peptide)Synthesis(Springer-Verlag，Berlin)以及Gross and Meinhofer编，(1980)《肽：分析、合成、生物学》(The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology)，卷1(AcademicPress，New York)，讨论经典的溶液合成。也可利用同步多肽合成方法化学制备IFN-β，例子见Houghten(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：5131-5135以及美国专利号4,631,211。
这里所描述的含有实质单体IFN-β的组合物的制备优先是按照本发明所提供的两个改进纯化方法之一进行。第一种纯化方法包括以下三个基本步骤：(1)IFN-β从含有基本上纯化的IFN-β的溶液中沉淀；(2)IFN-β沉淀物溶解于盐酸胍中以获得IFN-β的再增溶；(3)IFN-β的复性，较佳是采用合适的缓冲液通过稀释或透析来完成。通过这种纯化方法所产生的IFN-β是可溶的、稳定的并且大体上以单体形式存在。所得到的组合物经合适的药用缓冲液进一步渗滤或透析就可以作为药物组合物。最后一步是从含有复性IFN-β的溶液中除去残留的盐酸胍，提供具有适合肠外给药的pH值的制剂。
根据本发明所提供的纯化方法，首先通过从溶液冲沉淀基本上纯化的IFN-β制备IFN-β沉淀物。沉淀是降低IFN-β的溶解度完成的。IFN-β溶解度的下降和IFN-β的沉淀也可以通过酒精的使用如脂肪族酒精，(如乙醇)而取得。对于一些蛋白质来说，通过变性和/或凝集反应而产生的沉淀是不可逆的，从而导致蛋白失活，但是在本发明的沉淀的IFN-β例子中，沉淀反应是可逆的。因此，在此纯化方法的后来步骤中回收的可溶性IFN-β保持其生物活性。
得到的沉淀物溶解于盐酸胍得到包含增溶变性的IFN-β和盐酸胍的溶液。在以SDS为增溶剂进行初步纯化而得到基本上纯化的IFN-β的实例中，经盐酸胍溶解后SDS仍作为沉淀物存在。这些沉淀的SDS可以用已知的标准过滤方法除去，较佳是在进行此改进纯化方法的下一步之前就进行过滤。与IFN-β沉淀物混合的盐酸胍的量要足以溶解所得到的盐酸胍-IFN-β溶液中沉淀的IFN-β，即在盐酸胍-IFN-β溶液中盐酸胍的浓度是约6-10M，较佳是约6-9M，更佳是的6-8M。尽管是增溶的，但此溶液中的IFN-β还是变性的。复性IFN-β需要将盐酸胍-IFN-β溶液稀释到缓冲液中，从而得到含有再增溶复性的IFN-β和残留盐酸胍的溶液。此溶液中的IFN-β大体上是单体的，即经HPLC检测至少约51％的IFN-β以单体形式存在，较佳是至少约70％、75％、80％、85％，更佳是至少约90％或更高。
在再增溶和复性步骤中，盐酸胍是作为增溶剂以增加IFN-β的溶解度。“增加IFN-β的溶解度”是指与在相同pH、相同组分但不含有盐酸胍的溶液中可溶解IFN-β的量相比时，IFN-β在pH约3.0-9.0、含有盐酸胍的溶液中可溶解IFN-β的量增加了。盐酸胍增强IFN-β溶解度的能力可以用本领域已知的方法确定，包括本发明所描述的方法。
本发明所提供的纯化方法中稀释步骤可以用任何合适的缓冲液以获得IFN-β的复性。合适的缓冲液包括以下种类：醋酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐以及Tris-HCl。具体选择哪种要根据稀释后所需要的溶液pH值而定。如果纯化方法包括沉淀步骤，较佳用于稀释的缓冲液pH值约为4.0-8.0，包括的4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，更佳是的5.0-7.0。经过此稀释步骤后，再增溶复性的IFN-β溶液中残留的盐酸胍的浓度较佳约为1.6M或更低，更佳约为0.8M或更低。
所得到的再增溶复性的IFN-β溶液含有大体上以单体形式存在的IFN-β(即单体IFN-β比例大于约51％)。此外，再增溶复性的IFN-β溶液含有残留量的盐酸胍。这种组合物可用于制备适合肠外给药的药物制剂。如此，作为增强溶解度的残留盐酸胍可以通过将再增溶复性的IFN-β溶液透析或渗滤到合适的药用缓冲液中加以除去。“除去残留盐酸胍”是指含有纯化步骤所得到的实质单体IFN-β的药物制剂中所含有的盐酸胍浓度为10mM或更低，较佳是5mM或更低。任何合适的药用缓冲液都可以制备上述药物制剂，只要IFN-β仍增溶，并大体上以单体形式存在。在一个实施例中，合适的药用缓冲液含有的精氨酸或氯化钠浓度与不含精氨酸或氯化钠的缓冲液相比足以增加单体IFN-β的产量。对于精氨酸来说，足以增加单体IFN-β产量的浓度是约0.2-1.0M，较佳是约0.4-0.8M，包括0.4M、0.5M、0.6M、0.7M和0.8M。在一个实施例中，合适的药用缓冲液中含有的精氨酸浓度约为0.5M。对于氯化钠来说，足以增加单体IFN-β产量的浓度是约0.2-1.2M，较佳是0.2-1.0M，更佳是0.5-1.0M。在一个实施例中，合适的药用缓冲液中含有的氯化钠浓度约为1.0M。
第二种制备含有实质单体IFN-β的组合物的纯化方法与第一种方法相似，但提供了一种不需要沉淀步骤的组合物制备方法。第二种纯化方法包括以下两个基本步骤：(1)将含有基本上纯化的IFN-β的样品与盐酸胍混合从而获得含有增溶变性的IFN-β的溶液；(2)IFN-β的复性，较佳是通过适当的缓冲液稀释。如前所述，盐酸胍是作为溶解度增强剂使用的，其使用量与上述第一种纯化方法相似。因此，第一步后，含有增溶变性的IFN-β的溶液中盐酸胍的浓度大约为6-10M，较佳约为6-9M，更佳约为6-8M。如上所述，初始的基本上纯化的IFN-β溶液中含有SDS，经过此步骤SDS会沉淀，这些沉淀的SDS可以用本领域已知的标准过滤方法从溶液中滤掉。
与第一种纯化方法一样，盐酸胍-IFN-β溶液中IFN-β是变性的。IFN-β的复性可以通过任何适当的缓冲液稀释来完成，缓冲液的pH值范围约为3.0-5.0，较佳约为3.0-4.0，更佳约为3.0。在此稀释步骤中完成复性IFN-β的合适缓冲液包括：甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸以及琥珀酸、醋酸、磷酸、甲酸盐和柠檬酸，也可以是上述任何的盐类。经过此步稀释后，留在增溶复性的IFN-β的溶液中残留盐酸胍的浓度大约为1.6M或更低，较佳约为0.8M或更低，更佳约为0.1M或更低。复性后，得到的组合物含有实质单体的IFN-β，即至少有51％的IFN-β是单体的，较佳至少约70％是单体的，测定方法为HPLC，较好的检测方法为分析超离心(见Liu and Shire(1999)J.Pharm.Sci.88：1237-1241，本文已纳入作为参考)。这种复性的IFN-β溶液中残留的盐酸胍可以通过如第一种方法所述的制备含实质单体IFN-β的药物制剂的方式除去。任何适当的药用缓冲液都可以使用，就象本发明其他地方所描述的那样，只要IFN-β仍是增溶的并且大体上以单体形式存在。在一个实施例中，合适的药用缓冲液从如下种类中选择：甘氨酸、天冬氨酸和琥珀酸钠，较佳是甘氨酸。这样药物制剂的pH值约为3.0-5.0，较好约为3.0-4.0，最好约为3.0。
如本发明所描述的那样，由本发明所提供的纯化方法制备的大体上为单体形式的IFN-β有几种用途。例如，这种单形式的IFN-β可以直接用于配制适合肠外给药的药物组合物。经过合适的药用缓冲液渗滤或透析步骤除去残留的盐酸胍后，所得到的药物组合物加入稳定剂可以防止变性和丧失生物活性，稳定剂包括但不仅仅限于蛋白质和碳水化合物，较佳选择来自以下种类：甘露醇、山梨醇、甘油、葡萄糖、蔗糖和海藻糖以及它们的混合物。作为本发明的另一方面，经过渗滤(或透析)以及稳定步骤所得到的IFN-β制备物可以冻干并在惰性、无毒、生理相容性载体介质中复原用于治疗和临床应用。
本发明的药物组合物是用已知浓度的实质单体形式的IFN-β配制的，因此给与特定剂量会促进所需的治疗反应，此反应相对于正在进行治疗中的一种特定的IFN-β反应性状态。“所需的治疗反应”是指身体状态或与身体状态相关的症状的改善。
含有IFN-β的药物组合物在针对IFN-β反应性状态的治疗上是有用的。“治疗”是指通过IFN-β的治疗可以增强现有的正常状态、治疗对IFN-β起反应的异常状态以及通过采取IFN-β处理的预防性措施以阻止或减轻异常状态发生的严重程度。“IFN-β反应性状态”是指能对IFN-β反应产生积极或消极的任何状态。这种IFN-β反应性状态可能是正常状态。例如，哺乳动物经过IFN-β治疗增强了免疫反应的敏感性和/或能力。这种治疗也包括IFN-β处理以保护机体免受病毒感染或降低病毒感染的严重程度，例如登革热病毒或新德比斯病毒。反之，IFN-β反应性状态也可以是异常状态如恶性黑素瘤。这种异常状态可以是慢性的，即其发生有或长或短的持续性，也可以是急性的。IFN-β反应性状态也可能称为慢性和急性状态，如缓解-复发的多发性硬化。任何IFN-β反应性疾病都可能得益于本发明所提供的IFN-β药物组合物。对IFN-β产生反应的状态也包括免疫失调，如免疫缺陷，其中包括由于疾病、感染或由环境以及其他因素如化疗、化学物质中毒造成的免疫系统损伤而引起免疫耐受降低。
下面实施例是以举例说明而非限定的方式提供的。
实施例
实施例1：IFN-β的制备
本实验中所用的IFN-β是在大肠杆菌中制备的，纯化的前几步在美国专利号4,462,940和/或4,816,400中已有基本描述。即：转化的细菌用于生产IFN-β；宿主细胞浓缩后破碎细胞壁。然后在制备纯化的IFN-β库后按照本发明提供的方法制备IFN-β。
基本过程如下：
1、用乙醇从纯化的IFN-β库中沉淀IFN-β。六份纯化的IFN-β库用四份乙醇。此步骤后干扰素产率大于80％，离心后成一小球。
2、把小球溶于8M的盐酸胍中形成约为10mg/ml的蛋白质溶液。小球的溶解是快速的；存在的少量SDS不溶解可以通过过滤除去。
3、然后得到的盐酸胍溶液稀释到10mM的缓冲液中。
实施例2：盐酸胍处理步骤的稀释参数
先进行初步实验以确定盐酸胍处理步骤中最佳的稀释参数。测定相对产率的小规模实验数据如表1中所列出的；最好的结果出现在稀释后pH大于4.0、盐酸胍的浓度低于0.8M条件下。干扰素β单体的浓度用HPLC确定，所用缓冲液为pH＝3.0、400mM的甘氨酸。表2的结果和图1中的典型色谱图显示，尽管在较低pH得到非共价多聚物，但pH在5.0或更高时得到单体的IFN-β。
表1：HPLC检测盐酸胍(8M)IFN(∽10mg/ml)溶液稀释后的相对产率
               稀释后盐酸胍浓度
    10mM缓冲液     pH     0.2M     0.4M     0.8M     1.6M
    甘氨酸     3     2     2.1     1     1
    乙酸钠     4     13     12.7     6     2
    乙酸钠     5     68     68     33     30
    柠檬酸钠     6     79     62     43     42
    磷酸钠     7     82     71     41     48
    Tris HCl     8     99     83     40     38
表2：HPLC检测盐酸胍(8M)IFN(约10mg/ml)溶液稀释后凝聚体的百分比
    稀释后盐酸胍浓度
    10mM缓冲液     pH     0.2M     0.4M     0.8M     1.6M
    甘氨酸     3     78     51     35     39
    乙酸钠     4     ＜1     3     4     11
    乙酸钠     5     1     1     1     2
    柠檬酸钠     6     1     1     1     2
    磷酸钠     7     1     1     1     3
    Tris HCl     8     1     2     1     2
实施例3：盐酸胍稀释步骤的产率
将实验规模放大以评估盐酸胍稀释步骤的产率。结果如表3所示：以pH为6-8的缓冲液40倍稀释后可以得到41％-57％的产率，蛋白终浓度约为0.15mg/ml。检测样品中SDS的浓度为每毫克IFN低于10微克。
表3：IFN从8M盐酸胍(40倍稀释)中重折叠回收
    10mM缓冲液     pH     [IFN]mg/ml     ％产率
    柠檬酸钠     6     0.12     41
    磷酸钠     7     0.17     57
    Tris HCl     8     0.15     52
实施例4：透析除去稀释后残留的盐酸胍
通过透析除去稀释后残留的盐酸胍。在pH为5、不添加NaCl的条件下可以得到的最高产率为83％；如图2所示，在pH为7.0、1000mM NaCl存在的条件下可以得到的最高产率为70％。在所有的例子中，透析后都有沉淀产生，但采用HPLC分析表明可溶性组分是单体的。
实施例5：搅拌对盐酸胍-复性IFN-β物质的影响
取少量IFN-β溶解在含10mM磷酸(pH＝7.0)、100mM NaCl的缓冲液中，加入试管置于复式摇床。大约3小时后50％左右的IFN-β沉淀出来。这说明合适的表面活性剂如Tween 80可以增强稳定性。Tween 80的加入稳定了干扰素因而能增加透析步骤的产量。然而，Tween 80也可以如图3所示的那样以浓度依赖的方式诱导凝集。这些凝聚体是可溶性的。其它的表面活性剂可能效果更好。
实施例6：使用阶乘设计方法优化蛋白质的复性和制剂
用一系列实验来评价下列阶段IFN-β的回收量：(1)在8M盐酸胍溶液中IFN-β变性阶段；(2)用缓冲液快速稀释使IFN-β重折叠阶段；(3)在精氨酸存在及不存在的条件下透析除去残留盐酸胍以得到终制剂阶段。利用半阶乘设计实验优化制剂的组分及上述1-3个阶段的条件。可采用的因素包括蛋白浓度、盐酸胍浓度、pH、温度以及精氨酸浓度。
实验结果表明，pH、IFN-β浓度、稀释后的盐酸胍浓度和精氨酸浓度是有意义的模式条件，其中对模式影响最大的是IFN-β浓度和精氨酸浓度。精氨酸与pH之间的相互作用起重要的作用。使用含10mM NaPO4(pH＝7.0)和精氨酸的缓冲液可以得到最佳结果，阶段1-2的总产率达到80-100％，阶段3的产率达到70-80％。
实施例7：不用乙醇沉淀纯化方法中SDS的除去及IFN-β组合物的制备
纯化的IFN-β-1b(1升，浓度为1.91mg/ml，溶于0.4％SDS、50mM乙酸盐缓冲液中、pH＝5.5)5℃储存。在储存期间有一些SDS沉淀。将250ml IFN-β-lb(477.5mg)与229g盐酸胍(6M、总体积为400ml)混合，用磁力搅拌器在室温下搅拌15分钟。然后将6M的盐酸胍/蛋白质溶液通过SartobranP Capsule(0.45μm孔径)过滤除去沉淀的SDS。紫外分光光度计以280nm波长测量蛋白质浓度为1.02mg/ml。蛋白产量为406mg或85％。
将400ml盐酸胍处理的溶液用MilliporeLabscaleTFF(Millipore，Inc.)渗滤系统浓缩。所使用的滤膜为双层PelliconXL Biomax0.1cm2 10kD聚砜膜(Millipore，Inc.)。浓缩后体积为37ml，蛋白浓度为10.3mg/ml，浓缩后产量为381mg或93％。
用移液管将10ml(103mg)浓缩的盐酸胍/蛋白质溶液缓缓加入到590ml的5mM、pH为3.2的甘氨酸溶液中。用磁力搅拌器快速搅拌缓冲液；然后将蛋白溶液直接加到缓冲液的旋涡中。此步骤将6M的盐酸胍/蛋白质溶液稀释了60倍，得到浓度为0.17mg/ml的0.1M盐酸胍/蛋白质溶液。将此600ml溶液转移到装有两层PelliconII 10kD 0.1cm2聚砜膜的容量为500ml的渗滤器中，先被浓缩成蛋白浓度为0.23mg/ml的约400ml溶液，然后用9倍体积(3.6L)、pH为3.2的5mM甘氨酸缓冲液过滤。最后的渗滤液(402ml)用紫外分光光度计以280nm波长测量，蛋白质终浓度为0.23mg/ml，产量为92.46mg或95％。经过整个纯化过程可溶性蛋白总产率为72％。
说明书中提到的所有出版物和专利申请是表示适合此发明的本领域熟练技术人员的水平。本文纳入的所有出版物和专利申请在相同程度上作为参考，似乎各出版物或专利申请都是具体地和单独地纳入作为参考。说明书中列出副标题只是为了更容易地评述文件，并不打算以任何方式对文献的内容进行限定。
尽管上述发明已经以说明和实施例方式在某些细节上作了描述以便达到清楚理解本发明的目的，但显然在实际操作过程中可以在本发明的范围内作某些改变和调整。

Claims (20)

1.一种制备可注射的干扰素β(IFN-β)的制剂的方法，它包括：
a)制备含IFN-β的第一溶液，从此溶液中分离纯化的IFN-β库，并用酒精将所述IFN-β从库中沉淀出来以形成沉淀物；
b)将所述沉淀物溶解于盐酸胍以形成含有增溶变性的IFN-β和盐酸胍的第二溶液；
c)将所述第二溶液稀释到第一缓冲液以获得含有增溶复性的IFN-β和残留盐酸胍的第三溶液；以及
d)将所述第三溶液渗滤或透析到药学上可接受的第二缓冲液中以从所述第三溶液中的除去残留盐酸胍，因而制得上述可注射的IFN-β制剂。
2.含有用如权利要求1所述方法制造的基本上为单体IFN-β的药物组合物。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述的第二缓冲液含有精氨酸或氯化钠。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述的第一缓冲液的pH约为5.0-8.0，且其中所述残留的盐酸胍以1.6M或更低的浓度存在于所述第三缓冲液中。
5.一种制备可注射的干扰素β(IFN-β)的制剂的方法，其特征在于，所述方法包括用盐酸(HCl)胍变性IFN-β，然后用第一缓冲液稀释使IFN-β复性以得到含有残留的盐酸胍的复性的IFN-β溶液，并将上述复性的IFN-β溶液渗滤或透析到药学上可接受的第二缓冲液中以从所述复性的IFN-β溶液中除去所述残留的盐酸胍，因而制得所述可注射的IFN-β制剂。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述第一缓冲液的pH约为3.0-5.0，且其中所述残留的盐酸胍以1.6M或更低的浓度存在于所述复性的IFN-β溶液中。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述第一缓冲液的pH约为3.0-4.0，且其中所述残留的盐酸胍以0.2M或更低的浓度存在于所述复性的IFN-β溶液中。
8.如权利要求6所述的方法，其中，所述第一缓冲液的pH约为3.0，且其中所述残留的盐酸胍以0.1M或更低的浓度存在于所述复性的IFN-β溶液中。
9.含有用如权利要求5所述方法制造的基本上为单体IFN-β的药物组合物。
10.一种制备含有基本上为单体干扰素β(IFN-β)的组合物的方法，所述方法包括：
a)制备基本纯化的IFN-β的沉淀物；
b)将所述沉淀物溶解于盐酸(HCl)胍以得到含有增溶变性的IFN-β的第一溶液；以及
c)用缓冲液稀释所述第一溶液以复性所述IFN-β。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述缓冲液的pH约为5.0-8.0。
12.含有用如权利要求10所述方法制造的基本上为单体IFN-β的药物组合物。
13.一种制备可注射的干扰素β(IFN-β)的制剂的方法，所述方法包括：
a)获得含基本上纯化的IFN-β的样品；
b)将所述样品与盐酸(HCl)胍混合以得到含有增溶变性的IFN-β的第一溶液；
c)将所述第一溶液稀释到第一缓冲液中以得到含有增溶复性的IFN-β和残留盐酸胍的第二溶液；以及
d)将所述第二溶液渗滤或透析到药学上可接受的第二缓冲液中以从所述第二溶液中除去残留的盐酸胍，因而制得所述可注射的IFN-β制剂。
14.含有用如权利要求13所述方法制造的基本上为单体IFN-β的药物组合物。
15.如权利要求13所述的方法，其中，所述第一缓冲液的pH约为3.0-5.0，所述残留的盐酸胍以1.6M或更低的浓度存在于所述的第二溶液中。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述第一缓冲液的pH约为3.0-4.0，所述残留的盐酸胍以0.2M或更低的浓度存在于所述的第二溶液中。
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述第一缓冲液的pH约为3.0，所述残留的盐酸胍以0.1M或更低的浓度存在于所述复性的IFN-β溶液中。
18.一种制备含有基本上为单体干扰素β(IFN-β)的组合物的方法，所述方法包括：
a)制备含有基本上纯化的IFN-β的样品；
b)将所述样品与盐酸(HCl)胍混合得到含增溶变性的IFN-β的第一溶液；以及
c)用缓冲液稀释所述第一溶液以复性所述IFN-β。
19.如权利要求18所述的方法，其中，所述缓冲液的pH约为3.0-5.0。
20.含有用如权利要求18所述方法制造的基本上为单体IFN-β的药物组合物。
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