CN85101554A - 生产高增溶蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
从含有蛋白变性剂的人体γ-干扰素的稀水溶液中分离蛋白变性剂后,就地使生成的溶液老化并浓缩,制取高度浓缩的人体γ-干扰素水溶液。
Description
本发明阐述高增溶蛋白及其生产。
更具体地说,本发明述及人体γ-干扰素高浓水溶液。
干扰素(下面有时缩写为IFN)是由高级动物细胞经过病毒、核酸等刺激作用而诱导产生的蛋白。在它们的性质中,具有抗病毒、抗癌活性。
众所周知,人体干扰素按其特性有三种不同的类型,即:α、β、γ型干扰素。
对α型干扰素(下面缩写为IFN-α)和β型干扰素(下面缩写为IFN-β)已进行过相当广泛的研究。因此,已经开发出提纯它们的方法,并对它们的性质也了解得相当多。
γ型干扰素(下面有时缩写为IFN-γ)是由可免疫细胞在淋巴细胞能发生胞芽转形变异或产生淋巴细胞活素的环境中产生的。因此,它也叫做免疫干扰素。
IFN-γ与IFN-α、IFN-β相比,则有较高的抗增生或抗癌活性,予计会有较广泛的临床应用。然而,由于各种各样的局限性(例如生产上需要新鲜的淋巴细胞),曾建立的生产系统也是效率不高的。另外,有证据说明,不同的细胞形式可以产生不同的IFN-γ分子形式,其结构和性质在当前还是未知的。
本发明的目的在于研究利用遗传工程技术所生产的人体IFN-γ的提纯工艺。在研究过程中,发现人体IFN-γ具有强的聚合倾向性,其提纯显得很困难。为了减少这种倾向性,已研究出生产单节显性人体IFN-γ的方法。该方法包括在还原硫化物和蛋白变性剂存在下进行凝胶过滤的过程(美国专利,申请号为654,789)。由上述方法制得的单节显性人体IFN-γ水溶液含有还原硫化物和蛋白变性剂。其中低分子化合物,特别是蛋白变性剂应该除掉,因为它不能用在药物生产上。但是,在除掉蛋白变性剂后所得到的水溶液之中的人体IFN-γ,其溶解度低,而且在用浓缩或其它方法处理时,能够沉淀出来。利用本发明方法可生产出人体IFN-γ的高浓水溶液,以及在该溶液中高增溶的人体IFN-γ。
本发明提供了人体γ-干扰素高浓水溶液的生产方法,它包括:从含有蛋白变性剂的人体γ-干扰素的稀释水溶液中脱除蛋白变性剂;所得到的溶液就地老化;然后进行浓缩。本发明还提供一种含有非共价的γ-干扰素二聚物的人体γ-干扰素水溶液。
作为上述的含有蛋白变性剂的人体IFN-γ的水溶液,最好使用一种将粗IFN-γ在还原硫化物和蛋白变性剂同时存在下进行凝胶过滤所得到的人体IFN-γ水溶液。
所提及的用上述方法欲提纯的粗IFN-γ,可以是任何一种含有人体IFN-γ的材料。例如,可以使用由浓缩自然界存在的人体IFN-γ所得到的粗产品,即天然IFN-γ(nIFN-γ);可以使用由培养法进行培养能产生IFN-γ的微生物(用基因控制*技术制取的)所得到的含有人体IFN-γ的材料,即复合IFN-γ(rIFN-γ)〔参见:欧洲专利说明书No.0,089,676;核酸研究,10,2,487-2,501(1982);自然,295,503-508(1982);核酸研究,10,3605-3615(1982)〕。更具体地说,上述的IFN-γ包括*原文为mainpulation,疑误;可能为manipulation诸如由146种氨基酸(如图5所示的结果)所组成的多肽和各种不同的多肽碎片,例如:N端基部分一缺陷形式,即多肽的N端基部分缺少不多于四个的氨基酸;C端基部分一缺陷形式,即在整个多肽或N端部分一缺陷形式的不早于第131氨基酸的残基位置上被断开。因此,rIFN-γ包括被丝氨酸或苏氨酸取代的多肽之多肽半胱氨酸残基。
其中最好的是如图5所示的由146种氨基酸组成的多肽和多肽〔脱-(C1 ys-T2 yr-C3 ys)IFN-γ〕的C1 ys-T2 yr-C3 ys-缺陷形式。
例如,将单节显性状态的IFN-γ溶液用缓冲剂稀释到浓度为30-200微克/毫升,精心操作,不会导致聚集或沉淀,从而得到稀释水溶液。也可以使用不会引起聚集或沉淀的其它方法。因为单独使用PH为5.0-8.0的缓冲剂进行稀释时,通常是直接生成白色沉淀,所以在稀释时最好使用含有蛋白变性剂浓度为0.5-4摩尔的缓冲剂,由此能够得到没有聚集或沉淀倾向的稀释溶液。当IFN-γ含有半膀氨酸残基时,上述的缓冲剂还可以含有还原硫化物。
蛋白变性剂包括胍盐(盐酸盐、硫酸盐)、脲和硫氰酸盐(钠盐、钾盐)等,其中最好的是胍的盐酸盐。
上述的稀释水溶液经过凝胶过滤或超过滤处理,最好采用凝胶过滤,则能脱除蛋白变性剂。
凝胶过滤适于采用常规塔柱方法来实现。
欲进行凝胶过滤的溶液最好是上述的人体IFN-γ稀释水溶液。尽管如此,但还含有少量沉淀,如果凝胶过滤没有出什么毛病的话。在凝胶过滤过程中,可能出现部分沉淀,但这种沉淀物能够被除掉,如采用0.22微米薄膜进行过滤的方法。
上述的凝胶过滤过程所用的凝胶,可以任选自工业用的凝胶,最好是粒状凝胶,例如葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖,特别好的是Sephadex G-25、Trisacryl GF-05及其它,它们都适用于脱除低分子量化合物。
凝胶用量一般为2-100倍(体/体),最好是5-20倍(对所处理的样品量)。
所开发的溶剂是一种缓冲剂,一般具有PH值为5.0-8.0,最好约为中性,而且最好含有还原硫化物,其浓度为1-100毫摩尔。当IFN-γ含有半胱氨酸残基时,溶剂浓度最好为5-20毫摩尔。
更具体地说,首先用所开发的溶剂把凝胶柱平衡,然后再载以上述的稀释水溶液。使用所开发的溶剂进行冲洗。冲洗速率取决于样品中杂质含量、凝胶类型及其数量,空速(SV)范围一般为0.1-10,最好为0.5-3。冲洗液用常规方法进行分馏。
含有人体IFN-γ的馏份容易用常规方法加以检测,例如可采用一种检验分析以光密度(O.D)280毫微米吸附数据为基础所绘制的洗出液曲线之方法。
稀释水溶液在脱除蛋白变性剂之后,在液态所进行的老化过程,是在上述稀释溶液维持在适当温度和适当时间的条件下方能有效。
在进行老化的过程中,可以采用任何适当的方法来选择温度和时间因素。从微生物污染的可能性观点来看,老化温度最好为4℃左右;从老化效率的观点来看,最好为35-40℃。合适的温度可选自于0-40℃范围。至于老化时间,如果凝胶过滤随即浓缩过程,那么会出现混浊,但这种混浊只经一小时老化,便变得很轻微。老化时间一般为0.5-7天,24-72小时就足够了。
当需要的时候,在老化之前或老化过程中可以进行诸如无菌过滤之类的操作。
例如,采用超过滤方法进行浓缩过程是有利的。超过滤薄膜可将分子量截止到10,000,而且能够用常规方式进行超过滤。
用上述方法制得的人体IFN-γ水溶液含有人体IFN-γ的浓度为0.2-1.5毫克/毫升。可见,与采用以前的方法制得的溶液(人体IFN-γ浓度约为0.05毫克/毫升)相比,这是含有增溶IFN-γ的高浓水溶液。因此,它适于用作大规模生产人体IFN-γ的中间体。
粗IFN-γ在还原硫化物和蛋白变性剂存在下进行凝胶过滤所得到的人体IFN-γ原料,既是共价的、又是非共价的单节显性体,只要脱除蛋白变性剂就能转变为非共价的聚合物。通过稀释水溶液状态下的老化过程,可使一度生成的人体IFN-γ聚合物转化为稳定的非共价二聚物,从而达到增溶作用,而且有可能容易浓缩到高浓度。
按照本发明方法制得的高浓IFN-γ水溶液,与采用以前的方法制得的IFN-γ水溶液相比,则有较高的人体IFN-γ浓度。因此,它特别适于生产可贮存的冷冻产品或用于制备诸如注射用的冻干药物。
按照本发明制得的人体IFN-γ是低毒的,可用于上述目的,并以同样方式用作制备常规IFN-γ产品。因为它具有抗病毒、抗癌、抗增生、免疫及其它活性,所以它也能以同样的方式用作众所周知的IFN-γ产品。
含有蛋白变性剂的人体IFN-γ水溶液,系本发明实用的原料,可用粗IFN-γ、并在还原硫化物和蛋白变性剂的存在下进行凝胶过滤来制取。
上述的粗人体IFN-γ可以是任何一种含有人体IFN-γ的材料,例如:自然界存在的人体IFN-γ,或用基因控制技术制得的、能产生IFN-γ的微生物经过培养所得到的人体IFN-γ,经过浓缩和离析而得到的产物均可以使用〔参见:欧洲专利说明书No.0,089,676;核酸研究,10,2,487-2,501(1982);自然,295,503-508(1982)〕。从实用的观点出发,细胞萃取液、硫酸铵分馏产品、抗体柱冲洗液、或上述的能产生IFN-γ的微生物经培养而得到的离子交换柱冲洗液均可用作粗IFN-γ。但因外源蛋白量越多,耗费还原硫化物的数量越大,所以一般都希望使用抗体柱冲洗液或离子交换柱冲洗液。在这种粗材料中,人体IFN-γ可能以聚合物的形式出现。
上述的还原硫化物包括有机含硫化合物,例如:半胱氨酸、N-乙酰基半胱氨酸、N-乙酰基高半胱氨酸、谷胱甘酞(还原态)、硫代乙醇胺、一硫代甘油、二硫苏糖醇、硫代烷烃(C1-7)、雕白粉;以及无机含硫化物,例如间二硫化物(钠盐、钾盐)。其中,谷胱甘酞(还原态)是最好的。
所说的蛋白变性剂包括那些上述的物质。
上述的凝胶过滤过程所用的凝胶可任选自工业用的凝胶,最好是粒状凝胶,例如葡聚糠、聚丙烯酰胺和琼脂糖。在处理由基因控制技术所制得的人体IFN-γ时,考虑到复合IFN-γ的分子量(17,143)和分离外源蛋白的效果,最好是选择和使用分子量为1,000-80,000的、能够分馏的凝胶。
这类凝胶的典型例子有Sephadex G-50和G-75、Sephacryl S-200以及Biogel P-10、P-30和P-60。
所用的凝胶数量一般为5-100倍(重/重),最好是10-30倍(重/重)(对所处理的样品量)。
凝胶过滤最宜采用常规塔柱方法。
例如,将人体IFN-γ溶解在缓冲剂中,在事先用开发的溶剂平衡过的凝胶塔柱上,要载以IFN-γ水溶液。并用所开发的溶剂进行冲洗。冲洗速率取决于样品中杂质含量、凝胶类型及其数量,但空速(SV)一般为0.1-10,最好为0.5-3。
在凝胶过滤过程的任一步骤上,还原硫化物和蛋白变性剂与人体IFN-γ同时存在。不过,最好是将还原硫化物和蛋白变性剂在装载凝胶以前加到人体IFN-γ水溶液中,以及加到所开发的溶剂中。
在诸如萃取或抗体塔柱处理等予处理步骤中已用蛋白变性剂的情况下,那么在凝胶塔柱上所处理的水溶液当不再加蛋白变性剂时也能够加以利用。
上述的所装载的水溶液和所开发的溶剂之PH值为5.0-8.0,最好约为中性,而且含有还原硫化物,其浓度为1-100毫摩尔,最好是5-20毫摩尔,蛋白变性剂为0.1-7摩尔,最好是1-2摩尔。
用国际单位(IU)表示的、以抗病毒活性来描述的IFN-γ活性之测定方法是:将具有给定效能(用国际单位表示)的国际标准IFN-γ样品和本发明所述及的样品,在人体羊膜衍生的FL细胞线中经受Sindbis病毒诱导的细胞病效应(Cytopathic effect)防护试验,然后以所得的效能数据之间的对比为基础来计算IFN-γ活性。溶液中蛋白数量的测定方法是:以假定E:280毫微米=1.0相当于1毫克为基础来进行计算。
下面的实例和参考实例对本发明做了更详细的说明。不过,值得注意的是,它们决不是对本发明进行限制。
在参考实例中提到的抗体塔柱Ab(Mo γ2-11.1)是按照欧洲专利说明书No.0,103,898的方法制成的。
附图简介:
图1、2、3分别表示例7(2)、(3)和例10(2)所做的凝胶过滤试验的结果。欲测定的IFN-γ之样品用。表示;标准蛋白用o表示(A:胰凝乳白酶原A;B:卵清蛋白;C:牛血清清蛋白;D:细胞色素C)。
图4说明参考实例5所提出的表示质体PLC2的结构图。
图5表示由146个氨基酸组成的IFN-γ之氨基酸系。
实例1
从含有参考实例2(Ⅱ)洗出液530毫升的γ-干扰素(单节显性体)中,取出26毫升剂量(含蛋白9.85毫克),向其中加入174毫升25毫摩尔的醋酸酯缓冲稀释液(pH6.0),其中含10毫摩尔盐酸半胱氨酸,150毫摩尔氯化钠,0.5摩尔盐酸胍,以及0.01%的非离子活性剂Tween 20,随即搅拌。即配制成含蛋白0.05毫克/毫升的低浓度溶液。将此溶液载于事先用25毫摩尔醋酸酯缓冲液(PH6.0)平衡过的葡聚糖凝胶G-25柱(5×60厘米)上,该缓冲液含10毫摩尔盐酸半胱氨酸,150毫摩尔氯化钠,以及0.01%非离子活性剂Tween20,然后用同样缓冲液冲洗以得到不含盐酸胍的γ-干扰素洗出液馏分(190毫升,含蛋白9.12毫克)。该溶液的蛋白浓度为0.048毫克/毫升,溶液清晰透明,蛋白回收率92.5%,γ-干扰素的比活性为3.7×106国际单位/毫克。
实例2
用实例1配制的含γ-干扰素洗出液馏分(含蛋白1.92毫克)40毫升,在4℃下老化24小时,然后用直径为43毫米的Diaflo PM-10(Amicon超过滤薄膜)进行超过滤,将之浓缩成4毫升。浓缩物清晰透明,蛋白浓度为0.470毫克/毫升。蛋白回收率98%(1.88毫克),γ-干扰素的比活性为6.8×106国际单位/毫克蛋白。
实例3
用实例1所得含γ-干扰素洗出液馏分40毫升(含蛋白1.92毫克),在4℃下老化100小时,之后用实例2中同样方法将之浓缩到4毫升。浓缩物清晰透明,蛋白浓度为0.475毫克/毫升。蛋白回收率为99%(1.9毫克)γ-干扰素的比活性为7.3×106国际单位/毫克蛋白。
实例4
用参考实例2(Ⅱ)的同一方法制得的含γ-干扰素的洗出液馏分(510毫升;0.388毫克/毫升),混合以3,447毫升实例1中所用的稀释液,得到含蛋白0.05毫克/毫升的溶液。将此溶液载于事先用实例1中所用的平衡缓冲液平衡过的葡聚糖凝胶柱(14×100厘米)上,随即用相同的缓冲液冲洗。得到3,760毫升不含盐酸胍的γ-干扰素洗出液。溶液的蛋白浓度为0.048毫克/毫升,γ-干扰素的比活性为3.5×106国际单位/毫克蛋白。将该溶液于4℃下老化48小时,然后用直径为150毫米的Diaflo PM-10浓缩到188毫升,所得γ-干扰素溶液清晰透明,蛋白浓度为0.96毫克/毫升,γ-干扰素的比活性为6.7×106国际单位/毫克蛋白,聚集成单节显性体型,用十二烷基硫酸钠(SDS专页)进行鉴定。
实例5
配制一种蛋白浓度为0.05毫克/毫升的低浓度溶液。方法是用含有参考实例4所得洗出液馏分(450毫升)的人体γ-干扰素(单体),混合以3,240毫升25毫摩尔醋酸酯缓冲稀释液(PH6.0),该缓冲液含有10毫摩尔谷胱甘肽(还原态),150毫摩尔氯化钠,0.5摩尔盐酸胍,以及0.01%的Tween20。
将上述溶液载于事先用25毫摩尔醋酸酯缓冲液(PH6.0)平衡过的葡聚糖凝胶G-25柱(14×100厘米)上,该缓冲液含有10毫摩尔谷胱甘肽(还原态),150毫摩尔氯化钠,以及0.01%Tween20用同样的缓冲液进行凝胶过滤,得到不含盐酸胍的人体γ-干扰素洗出液馏分(3,180毫升;155.8毫克)。溶液中蛋白浓度为0.048毫克/毫升。蛋白回收率84.4%,其比活性为3.5×106国际单位/毫克蛋白。将此溶液于4℃下老化48小时,然后用实例2中的相同方法将之浓缩成159毫升。浓缩物清晰透明,蛋白浓度为0.92毫克/毫升。蛋白回收率93.9%(146.3毫克)。人体γ-干扰素的比活性为6.8×106国际单位/毫克蛋白。
实例6
配制蛋白浓度为0.05毫克/毫升的溶液,方法是向参考资料实例2中所用方法得到的人体γ-干扰素(单体)洗出液馏分(0.392毫升蛋白/毫升)435毫升中,加入2,975毫升的25毫摩尔醋酸酯缓冲稀释液(PH6.0),其中含150毫摩尔氯化钠,0.5摩尔盐酸胍,以及0.01%的Tween 20。将配制的溶液载于葡聚糖凝胶G-25柱(14×100厘米)上,该吸附柱事先已用含有150毫摩尔氯化钠及0.01%Tween 20并用氮气充分冲洗过的醋酸酯缓冲液(PH6.0)25毫摩尔平衡过。用同样的缓冲液处理凝胶过滤,得到不含盐酸胍及谷胱甘肽(还原态)的人体γ-干扰素洗出液馏分(3,280毫升,138毫克蛋白)。溶液中蛋白浓度0.042毫克/毫升。蛋白回收率81%,人体干扰素的比活性为2.8×106国际单位/毫克蛋白。将此溶液在4℃下老化24小时,然后用实例2中的方法浓缩成300毫升。浓缩物中蛋白的浓度为0.239毫克/毫升。蛋白回收率为52%(71.8毫克),人体γ-干扰素的比活性为1.1×106国际单位/毫克蛋白。
实例7
实例5中所得人体γ-干扰素,具有如下特性:
(1)用十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶胶块电泳法(SDS-专页)
聚集成单节显性体型测定其表观分子量约为18,000
条件:SDS浓度 0.1%
丙烯酰胺浓度 6%(凝胶用于浓缩)
12.5%(凝胶用于分离)
电压 60伏(浓缩电压)
180伏(分离电压)
浓缩60分钟,分离2.5-3.0小时;
着色试剂 考马斯亮兰
(2)用凝胶过滤法测定其分子量,表观分子量约为40,000(图1)
条件:
(ⅰ)试样:按本发明所配制的高浓度人体γ-干扰素水溶液(蛋白浓度1.231毫克/毫升;不含Tween20)
标准蛋白:牛血清蛋白(分子量68,000)
卵清蛋白(分子量45,000)
胰凝乳蛋白酶原A(分子量25,000)
细胞色素C(分子量12,500)
(ⅱ)凝胶过滤:用含有25毫摩尔醋酸氨,150毫摩尔NaCl以及10毫摩尔谷胱甘肽(还原态)的缓冲液(pH6.0)平衡葡聚糖凝胶G-100柱(2.7×87厘米),载以2.46毫克试样/2毫升以及5毫克各种标准蛋白/2毫升。进行凝胶过滤,冲洗速度21毫升/小时,并分成每份4.5毫升。
(3)使用SDS(十二烷基硫酸钠),用凝胶过滤测定分子量。表观分子量约为18000(图2)
条件:
(ⅰ)试样:按照本发明配制的高浓度人体γ-干扰素水溶液(蛋白浓度1.029毫克/毫升;不含Tween20)
标准蛋白:牛血清蛋白(分子量68,000)
卵清蛋白(分子量45,000)
胰凝乳蛋白酶原A(分子量25,000)
细胞色素C(分子量12,500)
(ⅱ)凝胶过滤:用事先经含有25毫摩尔醋酸氨,150毫摩尔NaCl,10毫摩尔谷胱甘肽(还原态)和0.1%SDS的缓冲液平衡过的葡聚糖凝胶G-100柱(2.7×87厘米),载之以2.06毫克试样/2毫升以及5毫克各种标准蛋白/2毫升。开始进行凝胶过滤,其冲洗速度为21毫升/小时,并分成每份4.5毫升。
在SDS专页及SDS凝胶过滤中,实例5的人体γ-干扰素发现为单节显性体(表观分子量约18,000)而在凝胶过滤中,发现为二聚物(表观分子量约40,000)。这可以说明,所谓的γ-干扰素是由次一级的单位组成的二聚物,每一单位的分子量大约为18,000,而且是无共价键的。也就是说,人体γ-干扰素是一种共价单体也是一种非共价二聚物。
实例8
配制蛋白浓度为0.059毫克/毫升的溶液200毫升。其方法是用含有按照参考实例4的方法得到的洗出液馏分(0.322毫克/毫升)的人体γ-干扰素(单体)36毫升,混合以164毫升的25毫摩尔醋酸酯缓冲稀释液(PH6.0),其中含10毫摩尔谷胱甘肽(还原态),150毫摩尔氯化钠,0.5摩尔盐酸胍。将上述溶液载于事先用25毫摩尔醋酸酯缓冲液(PH6.0)平衡过的葡聚糖凝胶G-25柱(5×60厘米)上,缓冲液含10毫摩尔谷胱甘肽(还原态)和150毫摩尔氯化钠。用同样的缓冲液进行凝胶过滤,得到不含盐酸胍的人体γ-干扰素洗出液馏分(218毫升)。溶液中蛋白浓度为0.045毫克/毫升。洗出液在37℃下老化3天,经过Acro50A(0.2微米,Gelman)无菌过滤后,再把溶液通过Diaflo PM-10(Amicon超过滤薄膜)超过滤,浓缩到10毫升。浓缩物清晰透明,蛋白浓度0.905毫克/毫升。在SDS专页方法中,浓缩物聚合呈单节显性体状。人体干扰素的比活性为3.7×106国际单位/毫克蛋白。
实例9
向从参考实例5(ⅲ)所得的含有γ-干扰素脱(C1 ys-T2 yr-C3 ys)的洗出液(含蛋白0.331毫克/毫升)2.2毫升中,加入8个体积的25毫摩尔醋酸酯缓冲稀释液(PH6.0),其中含有150毫摩尔氯化钠和2摩尔盐酸胍,随即进行搅拌,从而配得低浓度溶液。将此溶液载于事先用含150毫摩尔氯化钠的25毫摩尔醋酸酯缓冲液(PH6.0)平衡过的葡聚糖凝胶G-25柱(2.6×15厘米)上,用同样的缓冲液进行冲洗,得到不含盐酸胍的γ-干扰素脱(C1 ys-T2 yr-C3 ys)洗出液馏分(30毫升),溶液中蛋白浓度为0.022毫克/毫升,溶液清晰透明。
将此洗出液馏分在4℃下老化24小时,然后用Diaflo YM-10,直径25毫米(Amico超过滤薄膜。过滤所用过滤器0.2微米)超过滤,浓缩成0.68毫升清晰透明的溶液。蛋白浓度为0.670毫克/毫升。蛋白回收率为63%。
实例10
实例9所得γ-干扰素脱(C1 ys-T2 yr-C3 ys)具有下列特性:
(1)用SDS-专页方法测定其分子量
聚集成为单节显性体状,确定其表观分子量约为17,000。
条件:SDS浓度 0.1%
丙烯酰胺浓度 4%(凝胶用于浓缩)
12.5%(凝胶用于分离)
电压 60伏(用于浓缩)
180伏(用于分离)
浓缩60分钟,分离3.0小时;
着色试剂 考马斯亮兰
(2)用凝胶过滤法测定分子量,表观分子量约为35,000(图3)
条件:
(ⅰ)试样:
实例9中所得的高浓度γ-干扰素脱(C1 ys-T2 yr-C3 ys)水溶液(蛋白浓度0.670毫克/毫升)
标准蛋白:牛血清蛋白(分子量68,000)
卵清蛋白(分子量45,000)
胰凝乳蛋白酶原A(分子量25,000)
细胞色素C(分子量12,500)
(ⅱ)凝胶过滤:
用事先经含有25毫摩尔醋酸氨及150毫摩尔NaCl的缓冲液(PH6.0)平衡过的葡聚糖凝胶G-100柱(1.0×55厘米),载以0.27毫克试样/0.4毫升以及1毫克各种标准蛋白/0.4毫升,进行凝胶过滤,其流速为2毫升/小时,并分成每份0.5毫升。
用SDS专页方法,得自实例9的γ-干扰素脱(C1 ys-T2 yr-C3 ys)是一单节显性体(表观分子量约为17,000),而凝胶过滤法所得到的是二聚物(表观分子量约为35,000),所以说明γ-干扰素是由次一级的单位组成的二聚物,每一单位分子量大约为17,000,而且是无共价键的。
参考实例1
把在欧洲专利说明书No.0089676中实例8所叙述的载有人体γ-干扰素表达基因的RRI菌种(PRK248CITS,PRC231/IFI-900),在Mg葡萄糖培养基中于30℃下进行培养,一直到细胞浓度达3-4×108细胞/毫升。加入葡萄糖及酪蛋白氨基酸使其浓度分别达到1.0%及0.5%。于42℃下经过1小时诱导,将培养物离心过滤,收集细胞,冷冻储存。
参考实例2
(Ⅰ)取参考实例1所得冷冻细胞1,000克,加入3000毫摩尔的三盐酸盐缓冲液(PH7.0),其中含7摩尔盐酸胍,2摩尔的苯基甲基磺酰氟。将混合物于4℃下搅拌1小时,然后离心分离(用17,000RPM,30分钟),得到清晰透明的上层物料,用含有137毫摩尔氯化钠,2.7毫摩尔氯化钾,8.1毫摩尔磷酸氢二钠和1.5毫摩尔磷酸二氢钾(以后缩写为PBS)的缓冲液稀释成70倍。最后生成的沉淀用Sharples离心机分离除去(10,000RPM)。所得上层物料(220立升)用Pericon薄膜过滤器(Millipore公司产品;分子量截止到10,000)浓缩至15立升。浓缩物在4℃下静置过夜,生成的沉淀再一次在Sharples离心机上离心过滤除去。将所得上层物料加在装好抗体的塔柱上〔Ab(Moγ2-11.1);5×30厘米〕,流速为1000毫升/小时。然后用下列各种洗涤溶液按次序通过塔柱,即2500毫升PBS,5000毫升10毫摩尔磷酸盐缓冲液(PH7.0)其中含1摩尔氯化钠和0.1% Tween20,2500毫升PBS以及2500毫升20毫摩尔磷酸盐缓冲液(PH7.0)其中含0.5摩尔盐酸胍。此后用含有2摩尔盐酸胍的磷酸盐缓冲液(PH7.0)20毫摩尔进行冲洗。收集500毫升具有抗病毒活性的洗出液馏分。
(Ⅱ)向参考实例2(Ⅰ)所得的洗出液馏分中加入盐酸半胱氨酸,直到浓度达10毫摩尔。
用上述人体γ-干扰素溶液500毫升载于事先用25毫摩尔醋酸酯缓冲液(PH6.0)平衡过的Sephacryl S-200(医药用的)塔柱(9×100厘米)上,缓冲液含有1毫摩尔乙2胺4乙酸酯,150毫摩尔氯化钠,10毫摩尔盐酸半胱氨酸和2摩尔盐酸胍。用同样缓冲液冲洗。收集单节显性体洗出液馏分(530毫升)。如此得到的馏分聚集呈单节显性体状,也可用十二烷基硫酸钠(SDS专页)形成胶块电泳(表观分子量约为18,000)。经过上述分子筛处理,得到201毫克人体γ-干扰素,比活性为3.3×106国际单位/毫克。
参考实例3
将参考实例2(Ⅱ)所得200毫升(75.8毫克)剂量的人体γ-干扰素(单节显性体)洗出液馏分(530毫升;0.379毫克/毫升),载于事先用25毫摩尔醋酸酯缓冲液(PH6.0)平衡过的葡聚糖凝胶G-25柱(5×60厘米)上,缓冲液含10毫摩尔盐酸半胱氨酸,150毫摩尔氯化钠以及0.01%Tween 20。继之用相同的缓冲液冲洗,从而得到不含盐酸胍的人体γ-干扰素洗出液馏分。该洗出液洗出后立即出现云雾,需要沉淀。然后将洗出液离心过滤(10,000 RPM/30分钟)。上层物料中蛋白含量测定值为0.05毫克/毫升。蛋白回收率为11.9%(9毫克)。人体γ-干扰素的比活性为3.3×106国际单位/毫克蛋白。
参考实例4
向参考实例2(Ⅰ)中所得的洗出液馏分(420毫升)中加入谷胱甘肽(还原态),直到浓度达10毫摩尔。将上述人体γ-干扰素水溶液420毫升载于事先用25毫摩尔醋酸酯缓冲液(PH6.0)平衡过的Sephacryl S-200(医药用的)塔柱(9×100厘米)上,该缓冲液含1毫摩尔乙二胺四乙酸酯,150毫摩尔氯化钠,10毫摩尔谷胱甘肽(还原态)和2摩尔盐酸胍,随即用相同的缓冲液冲洗,从而得到450毫升单节显性体洗出液馏分。用上述方法所得人体γ-干扰素(0.410毫克/毫升)的比活性为3.4×106国际单位/毫克蛋白。
参考实例5 脱(C1 ys-T2 yr-C3 ys)γ-型干扰素的生产
(ⅰ)转化体的生产
以限制性内切酶NdeⅠ和NcoⅠ煮解γ-干扰素的表达质粒PRC23/IFI-900〔参见已公开的欧洲专利局(EPC)专利说明书No.0089676〕,于是分离出含γ-型干扰素基因区的710bp NdeⅠ-NcoⅠ脱氧核糖核酸(DNA)片段(A)。分别地以限制性内切酶BglⅡ和Eco RI煮解质粒PRC23,分离出含λPL启动子的265bp DNA片段(B)。片段(A)和(B)便化学上合成了。使用T4DNA连接酶,以Ede RI和Eco RI的粘性末端作连接部位,把含密码子的低核苷酸
AATTCATGCAGGATCCA
GTACGTCCTAGGTAT
连接在一起,开始蛋白质的合成。在以NcoⅠ和BglⅡ处理之后,所得到的DNA片段连接到PRC23/IFI-900,从而构成一个表达质粒PLC2,为C1 ys-T2 yr-C3 ys-缺乏的γ-干扰素多肽编码(图4)。用Cohen等人的方法〔P.N.A.S.(美国),69卷,2110页(1972)〕,把这个质粒PLC2用来使大肠桿菌RRI(PRK248 CIts)转换,生成一种转化体,大肠桿菌(缩写成E.Coli)PRI(PLC2,PRK248 CIts)。
(ⅱ)转化体的培养
在50毫升含有1%细菌胰化胨(Bacto-tryptone),0.5%酵母抽提物、0.5%氯化钠和7微克/毫升四环素的液体介质中,把载着上述(ⅰ)中构成的质粒的菌株E.Coli RRI(PLC2,PRK 248 CIts)在35℃以摇瓶培养。把培养的肉汤转移到2.5升含0.5%酪蛋白氨基酸,0.5%葡萄糖和7微克/毫升四环素的Mg介质中,在35℃生长4小时,然后在42℃生长3小时。以离心分离收集细胞并在-80℃储存。
(ⅲ)净化
在22毫升含7摩尔盐酸胍和2毫摩尔苯基甲基磺酰氟的0.1摩尔三羟甲基氨基甲烷盐酸化物的缓冲溶液中,悬浮按上述(ⅱ)中同样方式得到的7.1克冻结的细胞。在4℃把悬浮物搅拌1小时,然后在10,000×g下离心分离30分钟,得24毫升上层清液。加300毫升丁二酸-1,4-丁二醇聚酯(PBS)把上层清液稀释。
以1毫升/分钟的流率把稀释液应用于抗体柱(Moγ2-11.1,柱的容量为15毫升)。此后,用60毫升含有0.5摩尔盐酸胍的20毫摩尔磷酸钠缓冲液洗涤抗体柱,然后以45毫升含有2摩尔盐酸胍的20毫摩尔磷酸钠缓冲液(PH7.0)冲洗,得25毫升抗病毒的活性馏份。把这个馏分(25毫升)用于预先以含有1毫摩尔乙二胺四乙酸、0.15摩尔氯化钠、10毫摩尔半胱氨酸和2摩尔盐酸胍的25毫摩尔醋酸铵缓冲液平衡过的Sephacryl S-200(制药用的)柱,然后以同一缓冲溶液冲洗,得40毫升抗病毒的活性馏分。
如此得到的C1 ys-T2 yr-C3 ys-缺乏的γ-干扰素多肽脱(C1 ys-T2 yr-C3 ys)γ-干扰素重7.0毫克,比活性为2.7×106国际单位/毫升。
参考实例6
将参考实例5(ⅲ)中所得的一份为1.2毫升(0.621毫克/毫升)脱(C1 ys-T2 yr-C3 ys)干扰素洗出液馏分,装进一个预先以含有150毫摩尔氯化钠的25毫摩尔醋酸铵缓冲溶液(PH6.0)平衡过的Sephadex G-25柱中,跟着以同样的缓冲溶液冲洗,由此得到不含盐酸胍的γ-干扰素的洗出液馏分。由于这个洗出液在洗提后马上发生混浊而生成沉淀。所以用一个漏斗(0.2微米)把洗出液加以过滤,得到2.4毫升清晰透明的含0.150毫克/毫升蛋白质的溶液。蛋白质的收率为48%。
Claims (25)
1、为生产高浓度人体r-干扰素水溶液,并使之就地老化并浓缩。本法包括从含蛋白变性剂的人体r-干扰素的稀水溶液中提取蛋白变性剂的方法。
2、按照权利要求1的方法,在高浓度人体γ-干扰素水溶液中的人体γ-干扰素为非共价的二聚物。
3、按照权利要求1的方法,所得人体γ-干扰素为重组体的人体γ-干扰素。
4、按照权利要求1的方法,所得人体γ-干扰素是由图5所示的146个氨基酸组成的一种多肽。
5、按照权利要求1的方法,所得人体γ-干扰素是脱(C2 ys-T2 yr-C3 ys)γ-干扰素。
6、按照权利要求1的方法,含蛋白变性剂的人体γ-干扰素的稀水溶液是在还原性硫化合物和蛋白变性剂与含有蛋白变性剂的缓冲溶液存在下,把粗的人体γ-干扰素加以凝胶过滤而得到的稀洗出液。
7、按照权利要求1的方法,稀水溶液中的人体γ-干扰素的浓度为30-200微克/毫升。
8、按照权利要求1的方法,该蛋白变性剂是胍盐。
9、按照权利要求1的方法,该胍盐是盐酸胍。
10、按照权利要求1的方法,该人体γ-干扰素的稀水溶液含有浓度为0.1至7摩尔的蛋白变性剂。
11、按照权利要求1的方法,把含有蛋白变性剂的人体γ-干扰素稀水溶液加以凝胶过滤而分离。
12、按照权利要求11的方法,该凝胶是由葡聚糖凝胶聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶组成的一组中选出的一员。
13、按照权利要求11的方法,该凝胶为葡聚糖凝胶。
14、按照权利要求11的方法,把人体γ-干扰素稀水溶液装进用凝胶填充的柱中进行凝胶过滤,然后以缓冲溶液提取γ-干扰素。
15、按照权利要求14的方法,该缓冲溶液的PH为5.0至8.0。
16、按照权利要求14的方法,该缓冲溶液中含有一种还原性硫的化合物。
17、按照权利要求14的方法,以0.1至10的空速进行提取。
18、按照权利要求1的方法,在温度0°至40℃下使溶液就地老化0.5至7天。
19、按照权利要求18的方法,在温度35°至40℃下使溶液就地老化24至72小时。
20、按照权利要求1的方法,以超过滤进行老化溶液的浓缩。
21、γ-干扰素水溶液中含有人体γ-干扰素的非共价二聚物。
22、按照权利要求21的水溶液,其中人体γ-干扰素为图5所示的146个氨基酸组成的多肽。
23、按照权利要求22的水溶液,其中人体γ-干扰素的表观分子量,在没有十二烷基硫酸钠存在下在凝胶过滤中大约为40,000,在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶块电泳中和在十二烷基硫酸钠存在下凝胶过滤中大约为18,000。
24、按照权利要求21的水溶液,其中人体γ-干扰素为脱(C1 ys-T2 yr-C3 ys)γ-干扰素。
25、按照权利要求24的水溶液,其中人体γ-干扰素的表观分子量,在没有十二烷基硫酸钠存在下在凝胶过滤中大约为35,000,在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶块电泳中大约为17,000。
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