JPH064680B2 - 高濃度ヒトγ型インターフェロンフラグメント水溶液の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、高濃度ヒトγ型インターフェロンフラグメン
ト水溶液の製造法に関する。

（従来の技術） インターフェロン（以下ＩＦＮと略称することがある）
は、高等動物の細胞がウィルスや核酸などの刺激によっ
て誘発されて産生する蛋白であり、抗ウィルス作用，抗
腫瘍作用などを有する。

ヒトのインターフェロンには、現在α型，β型およびγ
型の３種の性状の異なるタイプが存在することが知られ
ている。

α型インターフェロン（以下ＩＦＮ−αと略称する）、
β型インターフェロン（以下ＩＦＮ−βと略称する）に
関する研究は比較的すゝんでおり、精製法もそれらの物
性もかなり明らかになって来ている。

γ型インターフェロン（以下ＩＦＮ−γと略称すること
がある。）はリンパ球の芽球化やリンホカイン産生が起
るような状況下で、免疫担当細胞から産生されるため免
疫インターフェロンとも呼ばれている。ＩＦＮ−γはＩ
ＦＮ−αやＩＦＮ−βと比較して、抗細胞増殖活性や抗
腫瘍活性が高いといわれており、臨床的応用面からより
期待されている。しかし、その産生に新鮮なリンパ球が
必要であることなどの制約があるため、これまで効率の
よい産生系は確率されていない。また、異なる実験系で
は、異なる細胞種が異なる分子種のＩＦＮ−γを産生す
る可能性も示唆されており、その構造や性質に関しても
不明な点が数多く残されている。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明者らは、遺伝子組換え技術により生産されたヒト
ＩＦＮ−γの精製につき技術開発研究を行なっている
際、ヒトＩＦＮ−γが非常に多量化を起しやすく、精製
が困難であることを認め、これを解決するために還元性
硫黄化合物および蛋白変性剤の共存下にゲル過するこ
とを特徴とするヒトIFN−γ単量体の製造法を開発した特
開昭６１−１６１２２３号公報参照）。この方法で得ら
れたヒトＩＦＮ−γ単量体水溶液には還元性硫黄化合物
および蛋白変性剤が含まれており、これらの低分子化合
物のうち特に蛋白変性剤は製剤には用いられないので除
去する必要があるが、該除去処理により得られる水溶液
中のヒトＩＦＮ−γは溶解度が低く、濃縮操作等におい
て容易に析出するため、製剤原料としてはあまり適切で
ないことが判明した。

本発明者らは、さらに鋭意研究を行ないヒトＩＦＮ−γ
難溶化の原因を究明し、高濃度ヒトＩＦＮ−γ水溶液の
製造法を確立した。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、蛋白変成剤を含有するヒトＩＦＮ−γフラグ
メントの３０〜２００μｇ／mlの希薄水溶液からゲル濾
過により蛋白変成剤を除去し、当該希薄水溶液を液体状
態で２４〜７２時間熟成させ、ついで０．２〜１．５mg
／mlに濃縮することを特徴とする該水溶液の製造法を提
供するものである。

上記、蛋白変性剤を含有するヒトＩＦＮ−γフラグメン
ト（以下ヒトＩＦＮ−γと略称する）水溶液として、好
ましくは、粗ヒトＩＦＮ−γを還元性硫黄化合物および
蛋白変性剤の共存下ゲル過して得られるヒトＩＦＮ−
γ単量体水溶液が用いられる。

より具体的には、上記γＩＦＮ−γは、第５図で例示さ
れる１４６個のアミノ酸からなるポリペプチドの種々の
フラグメントを包含する。種々のフラグメントとして
は、例えば上記ポリペプチドのＮ末端部分の４個以下の
アミノ酸が欠落したＮ末端部欠落スピーシーズや上記ポ
リペプチドもしくはＮ末端欠落スピーシーズの第１３１
番アミノ酸残基以降の部位で切断されたＣ末端部欠落シ
ピーシーズなどが挙げられる。

上記種々のフラグメントの中では、第５図で示される第
１４６個のアミノ酸からなるポリペプチドのＮ末端部分
の４個以下のアミノ酸が欠落したＮ末端部欠落スピーシ
ーズまたは当該Ｎ末端部欠落スピーシーズのＣ末端部分
が切断されたものが好ましい。

とりわけ本発明のヒトＩＦＮ−γとしては第５図で示さ
れる１４６個のアミノ酸からなるポリペプチドの 欠落 が好ましい。

希薄水溶液は、例えば、単量化しているＩＦＮ−γの溶
液を凝集沈澱しないように緩衝液を用いて３０〜２００
μｇ／ｍｌに希釈して得られるが、凝集沈澱しないよ
うにすればどんな方法をとってもかまわない。通常、pH
5.０−8.０の緩衝液のみで希釈すると、ただちに白沈が
出るので、好ましくは、これに0.５〜４程度の蛋白変性
剤を緩衝液に含ませたもので稀釈すると凝集沈澱のない
稀薄な溶液を得ることができる。またＩＦＮ−γがシス
ティン残基を有する場合は上記緩衝液には、さらに還元
性硫黄化合物を含有させてもよい。

上記蛋白変性剤としては、例えば、グアニジン塩（塩酸
塩，硫酸塩）、尿素，チオシアン酸塩（ナトリウム塩，
カリウム塩）などがあげられる。

蛋白変性剤は、上記希薄水溶液を、ゲル過または限外
膜過することにより除去されるが、ゲル過するのが
好都合である。

ゲル過の方法は、通常用いられるカラム法が適してい
る。

ゲル過の原液として上記ヒトＩＦＮ−γ希薄水溶液が
好ましいが、多少析出物があってもゲル過にさしつか
えない程度であればかまわない。またゲル過中に一部
析出することもあるが、析出物は、たとえば、０．２２
μのメンブレンで過すれば、除去できる。

ゲル過用のゲルとしては市販のものなどから自由に選
択されるが、デキストラン，ポリアクリルアミド，アガ
ロースなどのゲル粒子が好ましい。とりわけセファデッ
クスＧ−２５，トリスアクリルＧＦ−０５など低分子化
合物の除去に適したものがあげられる。

使用するゲルの量は、通常負荷するサンプルの２〜１０
０倍量（V/V）、好ましくは５〜２０倍量である。

展開溶媒は、通常pHについて5.０〜8.０、とりわけ中性
付近の緩衝液を用い、またＩＦＮ−γがシスティン残基
を有する場合は、好ましくは還元性硫黄化合物を１〜１
００ｍＭとりわけ５〜２０ｍＭの濃度で含有させる。

具体的には、展開溶媒であらかじめ平衡としたゲルカラ
ムに上記希薄水溶液を負荷する。これを展開溶媒により
溶出する。溶出速度は、サンプルの不純度，ゲルの種
類，量により異なるが、通常ＳＶ（スペース ベロシテ
ィ）0.１〜１０、好ましくはＳＶ0.５〜３である。溶出
液は通常の方法により分画する。

ヒトＩＦＮ−γの画分は、通常の方法、たとえばO.D.２
８０ｎｍの吸収等で溶出曲線として表わすことにより容
易に検出することができる。

蛋白変性剤を除去した希薄水溶液の液体状態での熟成
は、該希薄溶液を適当な時間，温度で放置することで達
成できる。

熟成の温度、時間の両ファクターは適宜決められるが、
温度についてはヒトＩＦＮ−γの雑菌汚染等の観点から
低温、たとえば４℃附近が、また熟成の効率の観点から
３５〜４０℃が好ましいが、０℃〜４０℃附近であれ
ば、適当な温度を選ぶことができる。時間については、
ゲル過直後を濃縮すると白濁してくるが、１時間も放
置しておけば、白濁はずっと少なくなる。通常0.５〜７
日間、好ましくは２４〜７２時間放置後濃縮すれば十分
である。

なお、必要により、熟成を行う前またはその途中で無菌
過等の操作をすることもできる。

濃縮は、限外膜処理により好都合に行うことができる。
限外膜はMWCO 10,000程度のものを用いるのが好まし
く、通常の操作によって行うことができる。

上記により製造されるヒトＩＦＮ−γ水溶液は、０．２
〜１．５mg／ｍのヒトＩＦＮ−γを含有し、前記の製
造法による０．０５mg／ｍ程度のものに比し、易溶化
されたヒトＩＦＮ−γを含有する高濃度水溶液であり、
ヒトＩＦＮ−γの大量製造中間体として好適である。

本発明によるヒトＩＦＮ−γの易溶化は以下により達成
するものと考えられる。

すなわち粗ヒトＩＦＮ−γを還元性硫黄化合物および蛋
白変性剤の共存下にゲル過して得られる原料のヒトＩ
ＦＮ−γは、共有結合的にも非共有結合的にも単量体で
あるが、蛋白変性剤を除去すると非共有結合的に多量体
となりその溶解度が低下するものと推定される。これを
希薄水溶液状態で熟成させると、一度生じたヒトＩＦＮ
−γ多量体が、安定な非共有結合二量体となり、その易
溶化が達成され、容易に高濃度に濃縮が可能となったと
考えられる。

本発明により製造される高濃度ヒトＩＦＮ−γ水溶液は
前記の方法で得られるヒトＩＦＮ−γ水溶液に比し高濃
度であるので、保存用凍結品や凍結乾燥して得られる注
射用製剤等の原液として、より有利に使用される。

本発明により製造されるヒトＩＦＮ−γは、低毒性で、
従来の方法で得られるヒトＩＦＮ−γと同様の目的に同
様の用法により使用でき、抗ウィルス，抗腫瘍，細胞増
殖抑制および免疫増強作用等を有するので、公知のＩＦ
Ｎ−γと同様にして投与することができる。

なお、原料の蛋白変性剤を含有するヒトＩＦＮ−γ水溶
液は、例えば粗ヒトＩＦＮ−γを還元性硫黄化合物およ
び蛋白変性剤の共存下にゲル過することにより製造で
きる。

ここで粗ヒトＩＦＮ−γはヒトＩＦＮ−γを含有するも
のであればいかなるものでもよい。実用面からは、上記
ヒトＩＦＮ−γ生産能を有する微生物を培養して得られ
る菌体抽出液，硫安分画液，抗体カラム溶出液，イオン
交換溶出液を粗ヒトＩＦＮ−γとして用いるが、不純蛋
白量が多いほど還元性硫黄化合物の量が多く必要になり
経済的ではないため、一般には抗体カラムあるいはイオ
ン交換カラム溶出液等を適用するのが好ましい。また粗
ヒトＩＦＮ−γは多量化していてもさしつかえない。

還元性硫黄化合物としては、例えばシスティン，Ｎ−ア
セチルシスティン，Ｎ−アセチルホモシスティン，還元
型グルタチオン，チオエタノールアミン，モノチオグリ
セロール，ジチオスレイトール，炭素数１〜７のチオア
ルカン，ロンガリットなどの有機含硫黄化合物やメタ重
亜硫酸塩（ナトリウム塩，カリウム塩）などの無機含硫
黄化合物があげられる。

蛋白変性剤としては、前記したものがあげられる。

ゲル過用のゲルとしては市販のものなどから自由に選
択されるが、デキストラン，ポリアクリルアミド，アガ
ロースなどのゲル粒子が好ましい。また、例えば遺伝子
組み換え技術により製造されるヒトＩＦＮ−γに適用す
る場合、その分子量が１７，１４３であることや他の不
純蛋白との分離効率を考え、分画範囲1,０００〜８0,０
００程度の性能を有するものから選択して使用するのが
好都合である。具体的にはとりわけセファデックスＧ−
５０，Ｇ−７５，セファクリルＳ−２００，バイオゲル
Ｐ−１０，Ｐ−３０，Ｐ−６０等があげられる。

使用するゲル量は、通常負荷するサンプルの５〜１００
倍（W/W）好ましくは１０〜３０倍（W/W）量である。

ゲル過の方法は、通常用いられるカラム法が適してい
る。

すなわち、粗ヒトＩＦＮ−γを緩衝液などに溶解し水溶
液となし、展開溶媒であらかじめ平衡としたゲルカラム
に負荷する。これを展開溶媒により溶出する。溶出速度
は、サンプルの不純度，ゲルの種類，量により異なる
が、通常ＳＶ（スペース ベロシティ）０．１〜１０、
好ましくはＳＶ０．５〜３である。溶出液は通常の方法
により分画する。

ヒトＩＦＮ−γと還元性硫黄化合物および蛋白変性剤を
共存させるのは上記ゲル過操作のいずれの工程におい
てでもよいが、ヒトＩＦＮ−γをゲルに負荷するための
水溶液および展開溶媒に還元性硫黄化合物および蛋白変
性剤を加えておくのが好ましい。

なお蛋白変性剤は、抽出，抗体カラム処理など前処理で
使用している場合には、カラムに負荷するための水溶液
に改めて加えることなくその溶液のまま使用することが
可能である。

上記負荷用水溶液および展開溶媒は、pHについては５．
０〜８．０、とりわけ中性付近で、還元性硫黄化合物を
１〜１００mMとりわけ５〜２０mMの濃度で含有させるの
が好ましく、蛋白変性剤を０．１〜７Ｍとりわけ１〜２
Ｍの濃度で含有させることが好ましい。

本願明細書中、ＩＦＮ−γの活性としての抗ウィルス活
性；国際単位（ＩＵ）は、単位（ユニット）の確定した
国際標準ＩＦＮ−γと目的とする資料を、ヒト羊膜由来
ＦＬ細胞株に対するシンドビス ウィルス（Sindbis Vi
rus）の細胞変性効果阻止試験を用いて測定し、その比
率から力価を算出して求めたものである。溶液中の蛋白
量は、Ｅ：280nm＝１．０を１mgとして計算して求め
た。

以下実施例および参考例により本発明をより具体的に説
明するが、これらにより本発明は制限されるものではな
い。

なお参考例中に記載した抗体カラムＡｂ（Ｍｏγ２−１
1.１）は特開昭５９−８０６４６号公報記載の方法で調
製した。

実施例１ 参考例１(iii)でえた 含有溶出画分の2.２ｍ（0.３３１mg／ｍ含有）に８
倍量の１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび0.５Ｍ塩酸グア
ニジンを含む２５ｍＭ酢酸緩衝液（pH6.０）の希釈液を
添加，混合し、低濃度溶液を調製した。この溶液を予め
１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む２５ｍＭ酢酸緩衝液
（pH6.０）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム
（2.６×１５cm）に負荷し、同一緩衝液で溶出し、塩酸
グアニジンを除去した の溶出画分３０ｍをえた。この溶液のタン白含量は0.
０２２mg／ｍで、澄明であった。

本溶出画分を４℃で２４時間熟成したのち、ダイアフロ
−ＹＭ−１０，２５mmφ（アミコン社製限外過膜）を
用い限外過により濃縮しフィルター（0.２μｍ）で
過し0.６８ｍの澄明な溶液を得た。タン白含量は0.６
７０mg／ｍであった。またタン白回収率は６３％であ
った。

実施例２ 実施例１で得られた の性状は以下のとおりであった。

(1)ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定 見かけ上の分子量約１7,０００でモノマーに収斂した。

測定条件：ＳＤＳ濃度，0.１％；アクリルアミド濃度４
％（濃縮ゲル），１2.５％（分離用ゲル）；電圧，６０
Ｖ（濃縮時），１８０Ｖ（分離時）；濃縮６０分，分離
3.０時間；発色剤，クマシーブリリアント ブルー (2)ゲル過による分子量測定 見かけ上の分子量は約３5,０００であった第１図。

測定条件 (i)資料：本発明の高濃度des ＩＦＮ−γ水溶液（タン白濃度＝0.６７０mg／ｍ） 標準タン白：牛血清アルブミン（Ｍ．Ｗ．６8,００
０），卵白アルブミン（Ｍ．Ｗ．４5,０００）およびキ
モトリプシノーゲンＡ（Ｍ．Ｗ．２5,０００） (ii)ゲル過：２５ｍＭ酢酸アンモニウム，および１５
０ｍＭ NaClを含むpH6.0の緩衝液で平衡化したセファ
デックスＧ−１００カラム（1.0×５５cm）に資料0.２
７mg／0.４ｍおよび各標準タン白１mg／0.４ｍを負
荷し、溶出速度２ｍｍ／時間，フラクション0.５ｍ
でゲル過を行った。

本発明の は、ＳＤＡ−ＰＡＧＥでは単量体（見かけ上の分子量約
１7,０００）として検出され、ゲル過では二量体（見
かけ上の分子量約３5,０００）として検出されることか
ら、分子量約１7,０００のサブユニットからなる二量体
であり、その結合は非共有結合であることが判明した。

参考例１ の製造 (i)形質転換体の製造 ＩＦＮ−γ発現プラスミドpRC23/IFI-900〔EPC公開第00
89676号公報実施例７参照〕を制限酵素NdeI,NcoIで消化
し、ＩＦＮ−γ遺伝子部分を含むNdeI-NcoI 710bp Ｄ
ＮＡ断片（Ａ）を分取した。一方、プラスミドｐＲＣ２
３を制限酵素Bgl II,EcoR Iで消化し、λＰＬプロモー
ターを含む２６５ｂｐのＤＮＡ断片(B)を分取した。
（Ａ），（Ｂ）と化学合成して得た蛋白合成開始コドン
を含むオリゴヌクレオチドアダプター ＡＡＴＣＡＴＧＣＡＧＧＡＴＣＣＡ ＧＴＡＣＧＴＣＣＴＡＧＧＴＡＴ をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてNde I,EcoR Iののりしろ
部分に結合させた。得られたＤＮＡ断片をNco I,Bgl II
で処理して得たプラスミドpRC２３／ＩＦＩ−９００に
結合させ、 欠落ＩＦＮ−γのポリペプチドをコードする発現プラス
ミドpLC2を構築した。（第２図）このプラスミドpLC2を
用いてCohenらの方法〔プロシージング オブ ナショ
ナル アカデミー オブ サイエンス ＵＳＡ，第６９
巻，２１１０頁（１９７２）〕に従って大腸菌ＲＲＩ
（pRK248 cIts）を形質転換し、形質転換体エシエリヒ
ア コリ(Escherichia coli＝E. coli)RRI(pLC2,pRK248
CIts)を得た。

(ii)形質転換体の培養 上記(i)で構築したプラスミドを含む菌株(E.coli RRI(p
Lc2,pRK248cIts)を１％バクトトリプトン，0.５％酵母
エキス，0.５％食塩，７μｇ／ｍテトラサイクリンを
含む液体培地５０ｍ中で、３５℃，１２時間振とう培
養を行った。培養液を0.５％カザミノ酸，0.５％グルコ
ース，７μg/mlのテトラサイクリンを含むＭ９倍2.5
に移し、３５℃で４時間、ついで４２℃で３時間培養し
た。遠心分離して菌体を集め、−８０℃で保存した。

(iii)ＩＦＮ−γｄ３の精製 上記(ii)と同様の方法で得た凍結菌体7.１ｇを７Ｍ塩酸
グアニジンおよび２ｍＭフェニルメチルスルフォニルフ
ルオライドを含む0.１Ｍトリス塩酸緩衝液（pH7.０）２
２ｍに懸濁し、４℃で１時間攪拌したのち１0,０００
×ｇで３０分間遠心分離にかけて上清２４ｍを得た。
この上清にＰＢＳ３００ｍを加えて希釈し、抗体カラ
ム（Ｍｏ γ２−１1.１，カラム容量１５ｍ）に流速
１ｍ／分でかけた。そののち、0.５Ｍ塩酸グアニジン
を含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.０）６０
ｍでカラムを洗浄し、ついで、２Ｍ塩酸グアニジンを
含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.０）４５ｍ
で溶出し、抗ウィルス活性を有する画分２５ｍを得
た。この画分２５ｍをあらかじめ１ｍＭエチレンジア
ミン四酢酸，0.１５Ｍ塩化ナトリウム，１０ｍＭシステ
ィンおよび２Ｍ塩酸グアニジンを含む２５ｍＭ酢酸アン
モニウム緩衝液（pH6.０）で平衡化したセファクリルＳ
−200（ファルマシア社製）のカラム（2.６×９４ｃ
ｍ），カラム容量５００ｍにかけ、同一緩衝液で溶出
して抗ウィルス活性を有する画分４０ｍを得た。ここ
で得られた 欠落ＩＦＮ−γのポリペプチド は、7.０mgであり比活性は2.７×１０⁶IU/mgであった。

参考例２ 参考例１(iii)でえた 溶出画分1.２ｍ（0.６２１mg／ｍ）を予め１５０ｍ
Ｍ塩化ナトリウムを含む２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝
液（pH6.０）で平衡化したセファデックスＧ−２５のカ
ラムに負荷し、同一緩衝液で溶出し、塩酸グアニジンを
除去したＩＦＮ−γの溶出画分をえた。この溶出液は溶
出直後に白濁を生じ沈澱したので、フィルター（0.２μ
ｍ）で過し、2.４ｍの澄明液を得た。含量は0.150m
g／ｍタン白でタン白回収率は４８％であった。

（発明の効果） 本発明によりヒトγ型インターフェロンは易溶化され、
高濃度ヒトγ型インターフェロン水溶液を得ることがで
きる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例２（２）のゲル過の結果を示す。●は
本発明のＩＦＮ−γを、○は標準タン白（Ａ：キモトリ
プシノーゲンＡ，Ｂ：卵白アルブミン，Ｃ：牛血清アル
ブミン，Ｄ：チトクロームＣ）を示す。 第２図は参考例５に開示した発現用プラスミドpLC2の構
築図を示す。 第３図は１４６個のアミノ酸からなるＩＦＮ−γのアミ
ノ酸配列を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】蛋白変成剤を含有するヒトγ型インターフ
   ェロンフラグメントの３０〜２００μｇ／mlの希薄水溶
   液からゲル濾過により蛋白変成剤を除去し、当該希薄水
   溶液を液体状態で２４〜７２時間熟成させ、ついで０．
   ２〜１．５mg／mlの濃度に濃縮することを特徴とする高
   濃度ヒトγ型インターフェロンフラグメント水溶液の製
   造法。
2. 【請求項２】ヒトγ型インターフェロンフラグメントが
   １４６個のアミノ酸からなるヒトγ型インターフェロン
   ポリペプチドのＮ末端部分の４個以下のアミノ酸が欠落
   したＮ末端部欠落スピーシーズまたは当該Ｎ末端部欠落
   スピーシーズのＣ末端部分が切断されたものである特許
   請求の範囲第１項記載の製造法。