NO830697L

NO830697L - Homogent menneske-immun-interferon og fremstilling derav

Info

Publication number: NO830697L
Application number: NO830697A
Authority: NO
Inventors: Stanley Stein; Richard A Wolfe
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1982-03-01
Filing date: 1983-02-28
Publication date: 1983-09-02
Also published as: AU1181283A; GB2119383A; JPS58159417A; PT76310B; EP0087686A3; FI830557L; GB8305506D0; ZW4683A1; EP0087686A2; ZA83768B; NZ203364A; ES8407499A1; GT198301619A; DK104283A; MC1499A1; DK104283D0; GR77910B; MTP924B; IL67978A0; MW783A1

Description

<>>Foreliggende oppfinnelse vedrører human-immun-interferon

...I i

i ny form av et stabilt, homogent protein og en fremgangsmåte for fremstilling derav. Slikt homogent human-immun-interferon er terapeutisk anvendelig som et antivirus- og knti-proliferativt middel og tjener i kombinasjon med I andre former av interferon så som leukosytinterferon ti. L å

i synergisere aktiviteten til slike andre interferoner.

i

i l

Partiell rensning av human-immun-interferon er beskrevet av Georgiades og Johnson [Methods in Enzymology 7_8, 536 (1981)].

Trinnene som ble anvendt for rensning inbefattet behandling med Matrex Blå absorbent, supernatanten behandles med kontrollert-pore glass for å absorbere interferonet, interferonet eleveres med NaCl-etylenglykol og interferonfrak-sijonen<e>slås sammen og kromatograferes på en ultrogel AcA-54 kolonne med elevering av interferontoppen med IM NaCl/ ...18% etylenglykol. Interferonaktivitetsmengden eleveres i molekylvektområdet 35 000 - 70 000. Den spesifike aktiviteten til ultrogeltoppfraksjonen ble angitt å være 10 6 "3j0 ..Dette ble angitt å være det reneste materialet fremstilt på det tidspunkt og har en renhet mindre enn ca. 10 %.

i

Induksjon og produksjon i stor skala av human-immun-inter- j f eroner er beskrevet av Johnson et al. [Methods in Enzyj-mology, 7_8'158 (1981) ] . De angir at høyeste utbytter kv interferon oppnås fra perifere lymfosytter fra mennesker j i • som stammer fra normale donatorer hvilke induseres medj<j>i i T-cellemitogenstafylokokkisk enterotoksin A. Denne fremr ; gangsmåte tilveiebringer en midlere interferonkonsentrasjon i på 1 000 enheter/ml, eller 2.5 x IO<5>enheter pr. 100 mlj!blod. Partielt renset immun-interferon som stammer fra j i foannevnte utgangsmateriale er av forfatterne beskrevet! å være egnet for antistoff-produksjon og for initiering av i

kliniske forsøk på mennesker, men detaljerte opplysninger foreligger ikke.

j

i Ikke-glykosilert human-immun-interferon i rå form ble fremstilt ved bruk av tunikamysin av Mizrahl og 0'Malley

.[Methods in Enzymology, 78.'209 (1981)]. Det ikke-glykosi-

lerte immun-interferon viste biologisk aktivitet, men tåptei sin evne til å bindes til et immobilisert lektin (ConA-

j I Siefarose)<.>

Affinitetskromatografi av human-immun-interferon ble be-j-skrevet av 0'Malley [Methods in Enzymology, 7J3, 540 , (1981) i].

Basert på undersøkelser av forskjellige pasienters immun-interferonmengder tyder på at immun-interferon spiller en rolle i vertens forsvarsreaksjon på virusinfeksjoner og at immunoundertrykte verter er påvirket i sin evne til å oppnå

i I e■ n slik reaksjon. Dertil indikerte resultater som ble opip-

I nådd ved bruk av forskjellige indusere og flere forskjellige

affinitetskolonner at immun-interferonet består av en

: , heterogen sammensetning interferonbestanddeler med forskjelI<->

I I

I lige hydrofobisitetsgrader. Videre karakterisering kunne ikke gjøres uten tilgang på rensede interferonpreparater

■fra hvilke forurensende maskerende substanser var blitt i fjernet.

Nathan et al. [Nature 292, 842 (August 27, 1981)] har beskrevet fremstilling av human-immun-interferon ved en

j human-T-lymfosytcellelinje. Interferonet ble renset ved! bruk av kontrollerte poreglasskuler etterfulgt av kolonne-

; '• kromatografi med ultrogel AcA-44. Den spesifike aktivi-j6

i teten til toppfraksjonen fra denne kolonnen var 1.2 x 10 i (mindre enn 5 % rent) og den tilsynelatende molekylvekt J var ca. 40 000.

t

<!>

Induksjon av human-leukosytter ved Con A og partiell rens- i

i i ning ved absorbsjon på kiselgel og elevering med pufferj j inneholdende etylenglykol ga to anti-virus aktive bestanddeler som var adskilbare fra hverandre ved gelfiltrering. Bestanddelene (kalt 45K og 22K) hadde tilsynelatende mole- j kylvekter på ca. 45 000 og ca. 22 000. 4 5K-komponenten var j artsspesifik, relativt syreømfintlig (pH 2) og ble dårlig nøytralisert av antistoffer til human-f ibroblast-interf eronj.

i Forfatterne sluttet at sannsynligvis inneholdt 45K-bestand-j

j delen hovedsakelig molekylvarianter av human-immun-intér-feron. Se Van Damme et al. [Eur. J. Immunol., 1^, 937-942

(1981)].

Senere har Yip et al. [Science 215, 411 (Januar 22, 1982)]

beskrevet behandling av sterkt konsentrert, partielt renset i ' I

human-immun-interferonpreparater med 0.1 % SDS ved temperaturer mellom 20 og 25°C. De bemerket at slik behandling ii kke fullstendig ødela den biologiske aktiviteten som t. iId-ligere observert ved bruk av høyere temperaturer. De isp-"lerte to topper med biologisk aktivitet fra SDS-PAGE-an|-lyse med tilsynelatende molekylvekter på 20 000 og 25 000 og sporaktivitet ble observert i området tilsvarende en I miolek<y>lvek<t>på ca. 5 0 0 00. Forfatterne mente at under de-niatureringsbetingelsene som ble anvendt i målingen dis-siosierer en høymolekylvektform av immun-interfer.onene i de to observerte bestanddeler. (Se også Yip et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA 79_, 1820 (Mars 1982).

Til slutt har Goeddel et al. publisert en artikkel ved Second Annual International Congress for Interferon Research

...i San Francisco, California den 21 - 23 oktober 1981, som beskrev kloning av et human-immun-interferon komplementært D! NA og dets ekspresjon i tre forskjellige verts-vektorsy!s-

j terner. Basert på nukleotidsekvensen til dette klonede gen i og under antagelse av riktig plassering av initieringen i til den ekspresserte proteinsekvens, består putativt human-j i immun-interf eron av 146 aminosyrer med en total molekylvektj j på ca. 17 000. Ifølge Gray et al. [Nature 295, 503 (Febiruar i 11, 1982)] er aminosyresammensetningen som stammer fra

I nukleotidsekvensen som følger:

i

i 1 i

! Rått human-immun-interferon som kan anvendes ved utøvelsien av foreliggende oppfinnelse kan stamme fra alle tilgjenge-lige kilder. En egnet kilde for rått human-immun-interferon

er fra induserte normale leukositter. Økede utbytter av ! konsentrasjoner av human-immun-interferon kan oppnås vec. å innokulere et céllekulturmedium forsynt med serum, så som fetalt kalveserum og et middel som stimulerer cellevekst, og g<i>jør det mulig å inkubere blandingen i tilstrekkelig lar.g

RtsPuiMpd pI tlei1m6l e4n0a-tt meecredt iluclmeénl, e leen kgujhelntannuodrmmeeglsdåvr iuamm re infsosr ot m edn einnnndoee bholfrilnedmeggr . aEnct gas. megå2 ntee- rt, 1e0 r%

fetalt kalveserum. Det supplementerte medium kan også inne-j holde vanlige tilsatte bestanddeler som egner seg for ælle-p kultus så som for eksempel en puffer, for eksempel 12.5 til j 25mH hepes (N-2-hydroksyety1-poperasin-N'-2-etan sulfonsyre). i i Det cellevekst-stimulerende middel som er brukbart i praksis for foreliggende oppfinnelse er et fytohemagglutinin (PHA) tilsatt i en mengde fra ca. 0.1 til 10 jag/ml. Den anvendte inkubasjonstemperatur bør fortrinnsvis være ca. 37°C. I

-alminnelighet vil cellene gjennomgå 1-2 fordoblinger x

i l! øpet av to dager. ii

i Etter fullstendig inkuberingstid inuseres cellene. Anvende-i lig induseringsmidler som kan anvendes er velkjente på området og inbefatter spesifike antigener eller ikke-spési-fike mitogener. Eksempler på slike iduseringsmidler er fytohemagglutininer (PHA), konkanavalin A (Con A), pokeweed mitogen (PWM) , renset proteinderivat (PPD) , tetanustoksoid !

(TT), vaksine virus-antigen (VM), stafylokokkenterotoksin A, forbolestere så som 12-o-tetradekanoylforbol 13-acetat (TPA) og lignende. Det er generelt funnet at induksjonsmetoder som anvender spesifike antigener som normalt tilsettes kultilirenp inneholder lymfosytter som forut er sensitivisert overfor antigenet fører til forholdsvis dårlige utbytter av immun-j interferon. Således foretrekkes induksjon med T-celle mitogener. Spesielt foretrukket blant mitogenene er fytohemåg-glutininer, særlig foretrukket er fytohemagglutinin-L i j

i forbindelse med TPA som beskrevet av Yip et al., Proe. Natlj. Acad. Sei. USA 78, 1601 (1981). j

PHA brukes i en konsentrasjon i området fra ca. 1 til 10 ug/ml, mens TPA brukes i en konsentrasjon i området fra| ca. 5 til 20 ng/ml. Forbolesteren settes til mediet først pg etter et tidsrom på 2 - 3 timer PHA. Inkubasjonstide! kan være fra 48 - 120 timer, fortrinnsvis ca. 96 timer.

De pelleteres deretter ved sentrifugering og den immun-:.nter-feronholdige supernatant filtreres for å fjerne alt celle-avfall, helst gjennom et filter med 3 n porestørrelse. Ved i å bruke en slik fremgangsmåte for cellevekst og induksjon er det mulig å vesentlig øke utbyttet og konsentrasjoneii åv human-immun-interferonet som kan fremstilles pr. enhet

' I

cellepopulasjon sammenlignet med tidligere kjente metoder. Således var for eksempel gjennomsnittskonsentrasjonen for 45 preparater ca. 13 000 enheter/ml.

En alternativ kilde til rått human-immun-interferon er fra rekombinant mikroorganismer som er blitt transformert med

-gen eneekt spi reopsejornastviev kttoir lsitnannd ehvoeldd enande venhduemalnse -imamv unre-kinomtbeirnfeanrotnI-

DNA-teknikker som var velkjente. Rekombinant mikroorganismer kan fermenteres, høstes og immun-interferonet ekstra--. heres fra cellene ved vanlige fremgangsmåter så som for eksempel analogt med de fremgangsmåter som er beskrevet av Goeddel et al., Nature 287, 411 (1980), Wetzel et al, Journal of Interferon Research ]., 381 (1981) og Gray et al., Nature 295, 503 (1982). Det resulterende cellefrie ekstrakt kan deretter behandles på samme måte som beskrevet i det; følgende for supernatantmediet fra induserte leukosytter. Det må imidlertid bemerkes at immun-interferonet til for-skjell fra leukosyttinterferon er labilt i høye temperaturer og syre eller basisk pH, og man må derfor være for-siktig ved fremstillingen av råmaterialene for å unngå slike ekstreme tilstander. ji

Fremgangsmåteaspektet ved foreliggende oppfinnelse innbe-fatter en tre-trinns metode for rensing av human-immun-!

i interferon fra den cellefrie supernatant eller ekstraktL

I det første trinnet blir human-immun-interferonet selek-

! tivt absorbert pa en affinitetskolonne, de ikke-absorberte forurensninger vaskes vekk fra kolonnen og deretter elej-yeres human-immun-interferonet i sterkere renset form.

Affinitetskolonnerensing av human-immun-interferon er alle-' rede kjent innenfor området. De spesifike kolonnematerialer og eleveringsbetingelser er ikke sterkt kritiske ved ut-øI velsen av foreliggende oppfinnelse og således kan man a!n-vende alle fremgangsmåter for affinitetskromatografi som éir kjente, for eksempel bruk av kontrollert pore plass eller en båret lektin kolonne. En foretrukket affinitets-

I

kromotografifremgangsmåte for bruk i tre-trinns prosessen

i foreliggende oppfinnelse anvender såfremt det dreier seg om naturlig forekommende interferon en kolonne av concanavalin-A sefarose som er en handelsvare, hvilken fortrinnsvis er blitt forvasket med forfatpuffet saltvann i(PBS) eller et dyrkningsmedium så som et minimalt essen-

; I

tielt medium. Etter belastning av kolonnen og vasking méd minst et kolonnevolum PBS eller kulturmediet kan human-immun-interferonet eleveres med en fortynnet løsning av pufferet a-mety1-D-manosid, fortrinnsvis med en konsetra-sjon av ca. 0.2M. i De sammenslåtte aktive fraksjoner fra affinitetskromatografi-trinnene utsettes deretter for et nytt meget effekt tivt svak kation-bytter væske-kromatografi-trinn. I dette andre trinn fremstilles en karboksymetylkiselkolonne (CM) ved å vaske med en forholdsvis konsentrert, for eksempel 1 til 2 M saltløsning så som for eksempel et alkalimetallhalogenid, fosfat eller sulfat, fortrinnsvis KC1. Kolonnen re-ekvilibreres deretter med en vandig puffer, fortrinnsvis fosfatpuffer, pH 7.5, eller med vann og belastes med

de sammenslåtte aktive fraksjoner fra affinitetskolonne-trinnene fortynnet med vann. Etter vasking med vann eller en lav saltkonsentrasjonsløsning inntil proteinkonsentraj-sjonen som observeres i utløpet vender tilbake til bak-j j grunnsnivåer, eleveres kolonnen med en økende saltkonseh-trasjonsgradient. Aktive fraksjoner påvises ved biologiske målinger og slås sammen. Størrelsen av kolonnen, de an-j

vendte strømningshastigheter og puffere som brukes er ikke j særlig kritiske for en korrekt utøvelse av oppfinnelsen<1>. Det må påpekes at saltkonsentrasjonen som velges ikke bør interferere med den metodikk som anvendes for proteinpåf-

visning. Et foretrukket system anvender fluoreskaminana--lyse av proteinet og kompatibel saltgradient laget fra 0 1 til 1 molar kaliumklorid i pufferløsning, så som forty"1nnet kaliumfosfat, pH 7.5.

De aktive fraksjoner fra karboksymetylkiselkolonnen ble slått sammen og konsentrert. En foretrukken metode for fremstilling av den immun-interferonholdige løsning er å anvende en filterkjegle, fortrinnsvis en CF 25 filterkjegle som er forvasket med 0.4 M KC1, 25 mM kaliumfosf^t, pi H 7.5, og H Å ~0. Den konsentrerte løsning injiseres så ij én for-ekvilibrert kiselgel-gjennomløpskolonne og eleveres med en fortynnet puffet saltløsning. Som forut er den an-

! i vendte saltløsning ikke strekt kritisk og kan velges blant éthvert alkalimetallhalogenid, fosfat eller sulfat, for-f-trinnsvis kaliumklorid med en konsentrasjon i området fra 0!.01 til 1.0M. Pufferen som brukes i dette trinn er et fortynnet alkalimetallfosfatpuffer, helst kaliumfosfat, pH 7.5. pet rensede human-immun-interferon eleveres i en enkel hovedproteintopp med bioaktivitet som svarer til den pro-tiein topp.Avhengig av tilstanden til det råimmune-interferon brukes som utgangsmateriale og virkningsgraden av rensetrinnene, kan det være mulig å oppnå homogent produkt på dette punkt. Hvis preparasjonen fremdeles ikke er full-si tendig renset, er det mulig å rekonsent. rere de aktive<!>;

fraksjoner og deretter gjenta kromatograferingen på enten TSK eller CM kolonnene for å oppnå homogenitet.

I

Fraksjoner fra både karboksymetylkiselgel og kiselgel-gjennomtrengningskolonner ble målt i en sytopatisk effekt (CPE) inhiberings bestemmelse som beskrevet i U.S. pateint nr. 4,241,174, ved bruk av både Hep-2 (human) og MDBK (stor-fe) som bestemmelsesceller. Antivirusaktiviteten ble observert med fraksjoner fra begge kolonner på human Hep-2 linjejn men ikke når de samme fraksjoner ble prøvet mot bovin MDBK celler. Disse arter er spesifikt indikative for nærvær av human-immun-interferon og avklarer nærværet av enhver nevn-verdig mengde human-leukosytter eller fibroblast-type-inter-. feroner som ville gi en positiv måling.mot bovin MDBKcellene. Det homogene human-immun-interferon som erholdes ved ut| øvelsen av forannevnte fremgangsmåteaspekt av oppfinnelsen viste en spesifik aktivitet på ca. 1 x 10 enheter/mg protein. Verdien for den spesifike aktivitet skyldes bare omtrentlig variabiliteten til bestemmelsen samt manglende tilgang på en human-immun-interferon-referansestandard.

Den tilsynelatende molekylvekt for det homogene protein

er ca. 45 000 dalton bestemt ved polyakrylamidgelelektro-forese i natriumdodesylsulfat. Denne molekylvekt er også

i overensstemmelse med vandringen på TSK-kolonnen.

i

Interferoner har vist antivirus, antitumor, vekstinhiberings-og immunoundertrykkelsesaktivitet. Disse aktiviteter har<i>blitt oppnådd selv på det kliniske nivå ved bruk av doser på 1 - 10 x 10^ enheter daglig når man bruker relativt rå preparater hvorav mindre enn 1 % var human-interferon. -Nylig har sterkere rensede rekombinant-human-leukosyt-interferoner A og D (IFLr-A og IFLr-D) kommet inn i kliniske -dfoosresør ko. ppFotirsl øk 19m8 emd ilfalilolnenedr e endhoeseter r mked an IFtoLrle-A revreisst . Gaet neen<r>e<kellletj->terapeutiske daglige doser i området fra ca. 10 - 100 mii ll-i ioner enheter kan anvendes, helst ca. 50 millioner enheter. I direkte analogi med det ovenstående kan homogent human-immun-interferon anvendes i samme doseringsområde. Det ér i også mulig å anvende mer enn en type human-interferon i samtidig terapi. Egnede doseringstyper å anvende, for eksempel human-immun-interferon i forbindelse med et human-leukosyt-interferon så som IFLr-A vil være åpenbare for en fagmann. Bruk av slik paralell terapi fører til én synergistisk forsterkning av interferonenes aktivitet og i reduserer den nødvendige mengde for å oppnå den ønskede<!>terapeutiske virkning. |j

i i Fremgangsmåte og produktaspektet ved foreliggende opp- i finnelse illustreres videre i de følgende eksempler: j j

i

Eksempel 1

Blod fra 7-10 normale humandonatorer (ca. 50 ml/ donator) j bo' plpod samgiler s 1v5 ed x 1l• e0 u6kolefoukreossyet. tHevre. r Lmeuiklolsiyltitteer r sleepukaoreforers isefrråt

i

blodceller ved sedimentering i 2 % hydroksetyls.tivelse. Leukosyttene skilles fra den øvre fase og pelleteres ved

I

sentrifugering ved 500 x g.

i

"1

Lj eukosy• ttene inokuleres så ved 10 gceller/ml i 5 - 8 liter

i

RPMI 16 40-medium (Gibco) suplementert med 2 - 10 % fetalt kialveserum, 25 mM hepes og 0.2 - 0.5 ug/ml PHA-L. PHA stimulerer celleformeringen. Dyrkningen inkuberes to dager ved 37°C i en 16 liters kolbe. Cellene gjennomløper 1-2 fordoblinger i løpet av denne inkuberingen.

i

- Dyrkningen induseres etter tilsetning av et samme volum nytt medium med TPA og PHA som beskrevet. Forbolesteren TPA tilsettes virkningsbeholderen i 10 ng/ml i 3 timer

-etterfulgt av PHA ved 2ug/ml. Induksjonen forløper i ca.

96 timer. Cellene pelleteres så ved sentrifugering ved

1 000 x g og den immun-interferonholdige supernatant

filtreres ( 3 u) for å fjerne cellulært avfall. Den fil-trerte løsning er nå klar for rensing.

i Alle de følgende trinn utføres kaldt ved en temperatur på ca.4°C.

Di et kondisjonerte medium som erholdes som ov/enfor beskrevet ble i rekkefølge filtrert igjen gjennom et 3 ju og deretter j gjennom et 0.22 u nalgen filter. Det ble så satt på en J kolonne av concanavalin-A sefarose (Con A) (Pharmacia Fine Chemicals eller Sigma Chemical Co.) som tidligere var vasket med enten Dulbecco's fosfat pufferet saltvann (PBS)

(Grand Island Biological Supply Co.) eller en F-ll dyrkningsmedium (Grand Island Biological Supply Co.). 35 ml volum av Con-A ble gjerne brukt for å absorbere immun-interferonet fra 1 liter av kondisjonert medium. Kolonnen ble deretter vasket med minst ett kolonnevolum PBS ellejr

! I

F-ll medium. Interferonet ble deretter elevert med 0.2M 1 tx-metyl-D-mannosid i PBS og de aktive fraks ble slått sammen. Stabilitet ved slike aktive fraksjoner vist neden-for i tabell 1.

i

i Måling j Alle immun-interferonprøver ble titrert ved bruk av CPE reduksjonsmålingen som beskrevet i U.S. patent nr 4,241,174 med unntak av at Hep-2-celler (ATCC nr. CCL 23) ble brukitsom målecelle. Prøver ble infisert med ves.ikulær stomatitt-virus (VSV) etter en 6 timers inkubering av interferon-prøven og målecellene. Alle immun-interferonkonsentrasjoner ble justert i forhold til referanseenheter ved bruk av 1 NIH (G-134-901-527) leukosyt-interferonstandard. Det neste rensetrinn anvendte en svak kation-bytte væske-kromatografikolonne med høy virkningsgrad. CM 200 harpiks, 10 nm (Separation Industries, Orange, N.J.) ble pakket i en 25 cm x 1.46 cm I.D. kolonne og klargjort for bruk ved rensing med 2M KCl og re-ekvilibrering med 25 mM fosfat;i<->puffer, pH 7.5, eller med destillert, ionfritt vann (denne ..vannkvalitet brukes gjennom hele denne metoden). Det aktive, samlede elevat fra Con-A-kolonnen ble fortynnet

med et tilsvarende volum vann og pumpet ved 1.5 ml/min. på CM-kolonnen. Kolonnen ble deretter vasket med 25 mM kaliumfosfat, pH 7.5, inntil proteinen i kolonneutløpetj

v!ar nede på bakgrunnsnivået som man fant ved automatisk I kontroll av kolonnen med fluoresamin. Kolonnen ble så elevert med 0.5 ml/min med en gradient av økende KC1 ( 0 IM) i 25 mM kaliumfosfatpuffer, pH 7.5. Det eleverte interferon fra kolonnen nær midten av salt-gradienten og aktive fraksjoner ble målt med biologisk måling.

De aktive fraksjoner fra CM-kolonnen ble slått sammen og konsentrert på en forvasket CF 25 filterkjegle (Amicon C<j>rp.). Den konsentrerte løsning ( 0.5 ml eller mindre) ble så xn-

6jIi.s7e5 rct mi ) e( n BTioSK -Ra2d 50 Lkabioseralgteorl-iegjse) nnsoomm løvpasr kofolorn-nee kvi(l3i0 bxreizt og elevert med 0.3 M KCl, 25 mM kaliumfosfat. pH 7.5, ved 24 ml/t og fraksjoner ble oppsamlet i l-miftutts intervaller. Aktiviteten svarte til en topp av protein. Homogent immun-xnterferon kan erholdes i en eller flere fraksjoner på -dette trinn avhengig av utgangsmaterialet og virkningsgraden av de tidligere trinn. Om nødvendig kan urene fråk-sj joner konsentreres og kromatograferes på nytt på o TSK elIler

-CM-kolonne for å oppnå homogenitet.

i

Aminosyreanalyse av homogent human-interferon fremstilt fra

I I

indusert human-leukosytter som ovenfor beskrevet ble utført ved bruk av påvisning med fluoreskamin etter-kolonne. Prøver ble tørket i våkum og hydrolysert ved 6N HCl inneholdende 4 % tioglykolsyre.i 24 timer i våkum ved 110°CL For systeinsyreanalyse ble prøver behandlet med permaurj-s' yre i 2 timer ved 0 O c, tørket og hydrolysert ved 6N HCl 1 j i 24 timer i våkum ved 110°C. Aminosyreanalysen for to i prøver (en prøve in duplo) er oppført nedenunder i tabell 2\. Det bør bemerkes at analysen ikke er korrigert for tap av I visse sensitive aminosyrer så som tryptofan, treonin og serin] pg heller ikke for ufullstendig hydrolyse.

_ L __„ J

S! om ovenfor påpekt har den spesifike aktivitet som obserL-vi eres for homogent human-immun-interferon ca. 1 x 10 8 enheter/mg og den tilsynelatende molekylvekt for det homogene proteinet er ca. 45 000 dalton ifølge polyakrylamid (10 - 20 % gradient) gelelektroforese i SDS ved bruk av ca. 100 ng belastning og anvendelse av sølvfarging.

Eksempel 2

Parenteral doseringform med homogent human- immun- interferon. i j

i Homogent human-immun-interferon for injeksjon er et frys-

tørket preparat i sterile glass. Hvert glass inneholder ca.I 15 meg homogent immun-interferon. Den lyofiliserte kake re-i

konstitueres før. bruk med limi sterilt vann for injeksjon. Dette preparat er regnet for intramuskulær injeksjon og iikke for intravenøst bruk. Formuleringen kan inneholde c.e følgende bestanddeler:

Claims

1. Fremgangsmåte ved økning av renheten til human-immun-"-Ji interferon, karakterisert ved at man fiører en løsning inneholdende delvis renset human-immun-interferon på en svak kation-byttevæske-kromatografikolonne mjed høy virkningsgrad og eleverer aktive fraksjoner som inneholder human-immun-interferon med øket renhet fra kol-l r I onnen ved bruk av en gradient med økende saltkonsentrasjon. 2t.

Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man som svak kation-byttevæske-kromatografikoi-onne-materiåle anvender karboksymetylkiselgel.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ■v ied at kolonnen eleveres med 0 - IM gradient KC1 i i kaliumfosfatpuffer, pH 7.5. i

4. Fremgangsmåte for å øke renheten av human-immun-inter-i i feron, karakterisert ved at man førér en løsning inneholdende delvis renset human-immun-interferon på en kiselgel-gjennomløpskolonne og eleverer aktive . fraksjoner inneholdende human-immun-interferon med øket renhet fra kolonnen ved bruk av en pufferet løsning inneholdende en lav saltkonsentrasjon. i

5. Fremgangsmåte ifølge kra 4, karakterisert ved at man som eleveringsløsning anvender 0.3M KC1 i 25mM kaliumfosfatpuffer, pH 7.5.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av homogent human-immun-interferon, karakterisert ved at man uitfører de følgende trinn i kombinasjon: a) fører en løsning av rått human-immun-interferon gjennom en affinitetskolonne som absorberer interferonet, vasker i i ikke-absorberte enheter ut fra kolonnen og eleverer aktive fraksjoner inneholdende human-immun-interferon fra koloijinen; b) fører sammenslåtte aktive fraksjoner fra trinn a) på en I svak kation-byttevæske-kromatografikolonne med høy virknin <g> s-grad og eleverer aktive fraksjoner som inneholder human-immun-interferon med øket renhet fra kolonnen ved bruk av en gradient med økende saltkonsentrasjon; c) fører sammenslåtte aktive fraksjoner fra trinn b) på en kiselgel-gjennomløpskolonne og eleverer aktive fraksjonar inneholdende human-interferon med øket renhet fra kolonnen i ved bruk av en pufferet løsning inneholdende en lav salt-konsentrasjone og, om nødvendig, d) resirkulerer sammenslåtte aktive fraksjoner fra trinn c) til trinn b) eller c) for fremstilling av homogent human-interferon. ...

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert jv e d at man som af f initetskolonne-materiale i trinn a) ianvender concanavalin-A sefarose, som rått human-immun- -jinterferon naturlig forekommende materiale og eleverer de aktive fraksjoner med en puffet a-metyl-D-mannosidløs-hing.

:8. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert . iv e d at man som svak kation-byttevæske-kromatografikolonne i trinn b) anvender karboksymetylkiselgel og ele-Iverer kolonnen med en 0 - IM gradient KCl i kaliumf osf at-i puffer, pH 7.5.

( 9. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert . ,v e d at kiselgel-gjennomløpskolonnen eleveres med en iløsning som er 0.3 M KCl i 25 mM kaliumfosfatpuffer, pH 7.5. i 10. Fremgangsmåte ved fremstilling av en parenteraldoserings- •form, karakterisert ved at man blanjder homogent human-immun-interferon med en bærer som er egnet for parenteral applikasjon og terapeutisk akseptable hjelpestoffer og bringe den resulterende blanding i en egnet .doseringsform, og om ønsket fryse tørke en vandig løsninjg.