NO159610B - Fremgangsm te ved rensing av et immuninterferonfrag - Google Patents

Abstract

Fremgangsmåte ved fremstilling av et aktivt fragment og rekombinant human-immun-interferon. Fremgangsmåten omfatter ekstraksjon av transformerte mikroorganismer som kan uttrykke immum-interferon etter brudd av cellene uten en proteaseinhibltor og rensing. ■av det erholdte ekstraktet ved bruk av monoklonale antistoffer til immuninterferon.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte ved rensing av et polypeptid med den følgende aminosyresekvens.

hvilken sekvens eventuelt kan inneholde en ytterligere metioninrest på aminoenden

som hovedsakelig er fri for andre peptider og har hovedsakelig samme aktivitet som gammainterferon. Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte ved rensing av et slikt polypeptid fra en transformert mikroorganisme som kan uttrykke IFN-Y som angitt i patentkravets karakteriserende del. Denne fremgangsmåten omfatter ekstraksjon av de transformerte mikroorganismer etter cellelysing, f.eks. ved ultralydbehandling eller kjemisk lysing, uten en proteaseinhibitor og rensing av det erholdte ekstraktet ved bruk av monoklonale antistoffer til immuninterferon.

Figur 1 illustrerer natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel elektroforese av renset rekombinant human-immun-interferon under reduserende betingelser (A, 0,7M/& -merkaptoetanol)

og ikke reduserende betingelser (B).

Figur 2 illustrerer sammenligningen mellom den forventede aminosyresekvens for rekombinant human-interferon og den faktiske DNA sekvens for 15K og 18K rlFN-/ typer. Figur 3 illustrerer HPLC separasjonen av C-terminale peptider av 15K og 18K rIFN-y etter CNBr behandling.

Det er tidligere beskrevet forskjellige metoder for utfør-else av ekstraksjon og rensing av familien av anti-virus proteiner kjent som interferon. Pr. idag er det kjent tre hovedklasser av interferon: IFN-*d (leukocytt), IFN-^

(fibroblast) og IFN- y (immun). Selv om de forskjellige interferonklasser kan være beslektet med hensyn til anti-virus, antiformering eller struktur, var man ikke tidligere i stand til å frembringe en ensartet metode for ekstraksjon og rensing av leukocyttinterferon fra en råblanding av andre proteiner og celleavfall, ikke virke ved ekstrahering og rensing av fibroblast eller immuninterferon fra den samme type preparat.

Ekstraksjonstrinnet i renseprosessene for ønskede "fremmede" proteiner som var tidligere kjent innebefatter gjerne enten mekanisk ultralyd, eller kjemisk lysing av mikroorganismer som er fremstilt , ofte ved rekombinante teknikker. Under denne mekaniske eller kjemiske lysingsmetoden frigjøres forskjellige, cellulære proteaser i blandingen. Disse proteaser er da fri til å virke enzymatisk på og nedbryte det "fremmede" protein i blandingen.

Det er videre rapportert at visse aminosyresekvenser på . immuninterferon ikke er essensielle for antivirusaktivitet. F.eks. har Capon et al. (henvisning 11) rapportert at.aminosyrer 136-146 i rlFN-y ikke er essensielle for antivirusaktivi tet.

Beskrivelse av foretrukne utførelsesformer

Det er nå i tilfellet av immun — interferon funnet at ekstraksjon og rensing med alle tidligere beskrevne konven-sjonelle teknikker ikke vil gi et fullstendig homogent preparat av immun—interferon med en intakt eller fullstendig aminosyresekvense. Først nylig har rekombinant tekno-logi nådd det punkt hvor det er mulig å oppnå tilstrekke-lige mengder av rIFN~Y til å karakterisere det og bestemme dets aminosyresekvens. Når vanlige tidligere kjente teknikker ble anvendt til å ekstrahere rlFN-y preparater og aminosyresekvensen for renset materiale ble målt, fant man at det rensede preparat faktisk omfattet en rekke beslek-tede proteintyper méd forskjellige molekylvekter. Det er videre funnet ved aminosyresekvensering at disse pro-teinarter faktisk er den intakte sekvensform av immuninterferon i kombinasjon med en hoveddel av proteolytiske fragmenter av det intakte sekvensprotein.

Selv om det overraskende nå er funnet at den tidligere kjente blanding inneholdt både intakt immun-interferon-protein og fragmenter derav, har man nå kommet til at åpen-bart en komponent i denne blandingen har beholdt biologisk aktivitet.

Ekstraksjonen av human rIFN~Yfra transformerte mikroorganismer som produserer og inneholder dette protein kan ut-føres enkelt og effekt ved bruk av ultralyd eller mekansik lysing. Det antas imidlertid at rIFN-Ynedbrytes av proteaser under ekstraksjonstrinnet. Ultralydbehandling av frosne celler gir en blanding av proteolytiske produkter såsom 15K rIFN-Y(MW ca. 15000 dalton) hvilket er et resultat av fjerning av c-terminale aminosyrerester nr. 132-146. 15K rIFN-Y var etter rensing funnet å være fri for andre proteolytiske fragmenter og hadde signifikant biologisk aktivitet lik med det fullstendig 18K rIFN~Yprotein (10<7 >enheter/mg) og sammenlignbart med homogen naturlig human-immun-interferon (henvisning 7). Aminosyreblandinger og N-terminale sekvenser av 15K proteinet var i overensstemmelse med det forventede fra DNA sekvensen. 15K rIFN-Y aminosyren og tilsvarende DNA sekvens er vist i figur 2 sammen med aminosyren og tilsvarende DNA sekvens for det fullstendige immuninterferon protein. DNA basesekvensen til det fullstendige 18K human rIFN-\ som er brukt i denne beskrivelse er som beskrevet i henvisning 1.

Avhengig av ekstraksjonsmetodene har forskjellige molekyl-vekt (MV) arter (ca. 15000-18000 dalton) rIFN- blitt renset separat. Det rensede interferon med molvekt på 18000 dalton på natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofo-rese er erholdt ved guanidinekstraksjon. Imidlertid eks-traheres de lavere 15000 molvekt arter immune interferon fortrinnsvis ved ultralyd under guanidin. Den aminotermi-nale sekvens for både 18K og 15K proteinene var i overensstemmelse med den forventede sekvens utfra DNA kodingene for human immun-interferon proteinet. Aminoenden til immun-inter-feron-proteinet kunne også begynne med en metionin (Met) rest som ytterligere aminoterminal aminosyre til for-skjell fra cystein (Cys) som vist i figur 2.

De C-terminale sekvensene til 18K og 15K proteinet ble bestemt ved analyse og sekvensering av renset C-terminalt peptid etter CNBr behandling. Aminosyresammensetningen- og sekvensen til det C-terminale peptid som ble frigjort fra 18K rIFN-y,passet med den forventede sekvens for rlFN-y , hvilket viser at 18K typen er det intakte molekyl. På den annen side ble et forskjellig CNBr spaltet peptid frigjort fra C-enden av 15K rlFN-^ . Basert på aminosyre og sekvensanalyse tilsvarte dette forskjellige peptidet aminosyrerestene nr. 121-131, hvilket viser at 15K arten var et proteolytisk produkt.

En foretrukket utførelsesform av denne oppfinnelse er mikroorganismen som anvendes som resipient i fermenterings-metodene og med mindre annet er angitt mikroorganismen Escherichia coli K-12 stamme 294 som beskrevet i britisk patent nr. 2055382A som er deponert hos American Type Culture Collection under ATCC tilgjengelighetsnr. 31446 den 28. oktober, 1978. Videre ble alt rekombinant DNA arbeide utført i overensstemmelse med anvendelige forskrifter fra National Institutes of Health.

Oppfinnelsen medfører imidlertid ikke bare bruk av E. coli K-12 stamme 294 nevnt ovenfor, men også andre kjente ekvi-valente E. coli stammer såsom E. coli MA210 eller E. coli RRl (ATCC nr. 31343) eller andre mikroorganismer hvorav mange er allment tilgjengelig eller er deponert og til-gjengelige fra godkjente mikroorganismedeponeringsin-stitusjoner, såsom American Type Culture Collection (se f.eks. ATCC katalogen).

Uttrykket "interferonaktivitet" slik det her er brukt,be-tyr all karakteristisk antivirus og antivekstaktivitet som er karakteristisk for interferonene. Den karakteristiske antivirusaktivitet av rIFN kan bestemmes ved å bruke den cytopatiske effektinhiberingsprøve beskrevet av Familletti, P.C., et al., Methods in Enzymology 78, 387 (1981).

Den karakteristiske antivekstaktivitet av rIFN kan bestemmes ved å bruke den metode osm er beskrevet av Evinger og Pestka i Methods in Enzymology, 79, 45 (1981).

Monoklonale antistoffer ble fremstilt mot et syntetisk polypeptid inneholdende de siste 16 aminosyrerester av det C-terminale peptid av rIFN-y. Et av de monoklonale antistoffer (Moy 2-11.1) ble brukt til rensing av rlFN-f . Nærmere bestemt ble de monoklonale antistoffer og antistoff af f ini tetskolonnen i foreliggende oppfinnelse fremstilt som beskrevet i publisert europeisk patentsøknad nr. 103 898.

Det forannevnte immun-interferon kan brukes for de samme formål som andre kjente interferoner, f.eks. i profylakse eller behandling av virus eller neoplastiske forstyrrelser eller ved behandling av immunosupressive tilstander. Det kan gis i farmasøytisk akseptable orale, injiserbare eller to-piske blandinger og former. Doseringer og doseringsmengder kan være parallelle med slike som vanligvis brukes for klin-iske formål ved kjente interferoner, gjerne ca.1-200 x 10^ enheter daglig. Disse farmasøytiske blandinger i foreliggende oppfinnelse inneholder dette immun-interferon i for-bindelse med et fordragelig farmasøytisk akseptabelt bære-materiale. Alle vanlige bærematerialer kan anvendes. Bære-materialet kan være et organisk eller uorganisk inert bærermateriale som er egnet for enteral, perkutan eller parenteral administrering. Egnede bærere innebefatter vann, gelatin, gummiarabikum, laktose, stivelse, magne-siumstearat, talkum, vegetabilske oljer, polyalkylen-glykoler, petroleumgel o.l. Videre kan de farmasøytiske preparater inneholde andre farmasøytisk aktive midler. Tilsetningsadditiver såsom smaksstoffer, preserveringsmidler, stabilisatorer, emulgeringsmidler, buffere og lig-nende kan tilsettes ifølge akseptert praksis for farmasøy-tisk formulering.

De farmasøytiske preparater kan bringes i alle vanlige former som innebefatter: a) en fast form for oral administrering såsom tabletter, kapsler, piller, pulvere, granu-later o.l.; b) en væskeform for oral administrering såsom løsninger, syrups, suspensjoner, eliksirer o.l.; c) preparater for parenteral administrering såsom sterile løs-ninger, suspensjoner eller emulsjoner; og d) preparater for topisk administrering såsom løsninger, suspensjoner, salver, kremer, geler, mikroniserte pulvere, aerosoler o.l. De farmasøytiske preparater kan steriliseres og/eller innholde hjelpestoffer såsom preserveringsmidler, stabilisatorer, fuktemidler, emulgeringsmidler, salter for varia-sjon av det osmotiske trykk og/eller buffere.

Parenterale doseringsformer kan være infusjoner eller injiserbare løsninger som kan injiseres intravenøst eller intramuskulært. Disse preparater kan også inneholder andre medisinske aktive substanser. Ytterligere additiver såsom preserveringsmidler, stabilisatorer; emulgeringsmidler, buffere og lignende,kan tilsettes ifølge vanlig praksis for farmasøytisk formulering.

Eksempel 1

Syntese av bærerprotein- polypeptidkompleks brukt som antigen

Polypeptidet H-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-AlaSer-Gln-OH ble koblet med tyroglobulin (heretter TG) ifølge metoden til Goodfriend et al., Science 144, 1334 (1964).

Peptidet selv kan fremstilles ved vanlige metoder for pep-tidsyntese. Både fast fase og flytende fasemetoder kan anvendes, selv om den syntetiske metode i flytende fase i mange tilfeller er fordelaktig. Slike metoder for peptid-synteser er f.eks. beskrevet av Schroder and Lubke in "The Peptides", bind 1, Academic Press, New York, USA., 1966, eller av Izumiya et al. i "Peptide Syntheses", Maruzen, Tokyo, Japan, 1975, eller av Haruaki Yajima i "Experiments in Biochemistry", bind 1, sidene 207-400, Tokyo Kagaku Dojin, 19077 og innebefatter bl.a. azidmetoden, kloridme-toden, syreanhydridmetoden, blandet syreanhydridmetoden, DCC metode, aktiv estermetode, metoden som anvender Wood-ward reagens K, karbodiimidazolmetoden, oksydasjons-reduk-sjonsmetoden og DCC/additiv (f.eks. HONB, HOBt, HOSu) metoden .

For en detaljert beskrivelse av fremstillingen av 131-146 fragment av IFN-y se publisert europa patentansøkning nr. 103 898.

2,5 mg av polypeptidet ble blandet med 3,75 mg TG og etter tilsetning av 2 ml 50 mM fosfatbuffer, ble blandingen rørt godt i isvann. Dertil satte man gradvis dråpe for dråpe en løsning av 30,4 mg karbodiimidhydroklorid i 200 ml destillert vann. Deretter ble blandingen omrørt i isvann i 3

timer. Etter at reaksjonen var ferdig ble dialyse utført mot destillert vann i tilstrekkelig grad, etterfulgt av frysetørking som gir 4,7 mg av et proteinkompleks.

Eksempel 2

Fremstilling av enzymbundet antigen for enzymimmunologisk måling ( EIA) for antistoffpåvirkning

Det enzymbundede antigen for EIA ble fremstilt ifølge Ki-tagawa et al., Jornal of Biochemistry 79, 233 (1976). (i) Innføring av en maleimidogruppe i polypeptidet

Polypeptidet (350 nmol) fremstilt i eksempel 1 ble oppløst

i 1 ml 100 mM fosfatbuffer (pH 6,8), og løsningen ble satt til en løsning av 585 ytg (1,75 umol) N-(4-karboksycyklo-heksylmetyl)maleimid N-hydorksy-succinimidester i 70 ;j1 N,N-dimetylformamid. Blandingen ble rørt ved 30°C i 30 minutter. Etter at reaksjonen var ferdig, fraksjonerte man ved bruk av en Sephadex G-25 kolonne som ga 185 nmol av en polypeptidfraksjon med innført maleimidogruppe.

(ii) Kobling av det maleimidogruppeinneholdende polypeptid med 0-D-galaktosidase

Det maleimidoholdige polypeptid (16,5 nmol) ble blandet

med 3,3 nmol 0-D-galaktosidase. Etter 18 timers reaksjon ved 4°C ble 412,5 nmol p -merkaptoetanol satt til for å avslutte reaksjonen. Det -D-galktosidasekoblede polypeptid ble fraksjonert på en Sepharose 6B kolonne og brukt for de etterfølgende eksperimenter.

Eksempel 3

Immunisering

Hver av 6 BALB/C hunmus 7 til 8 uker gamle ble inokulert subkutant med 40 ug (på basis av proteinet) av proteinkomplekset fremstilt i eksempel 1 som antigen i grundig blanding med Freund's complete adjuvant (primær immunisering). To uker etter den primære immunisering ble musene igjen inokulert subkutant med antigenet i samme dose som ovenfor i grundig blanding med Freund's incomplete adjuvant (sekundær immunisering). Ytterligere to uker senere ble en tredje immunisering foretatt på samme måte som den andre immunisering. Seks dager etter den tredje immunisering ble partielle blod-prøver tatt fra musene og serumantistoffkonsentrasjonene ble bestemt ved EIA metoden beskrevet nedenunder (sammenlign Immunopharmacology 1, 3 /1978/). Musen som var nummerert -2 ga den høyeste antistoffkonsentrasjon og ble sluttimmunisert ved intravenøs inokulering med 120 ug av antigenet oppløst i 0,5 ml vandig natriumklorid. Antistoffkonsentrasjonsdata for hver mus er vist i tabell 1.

EIA metode

Påvisningen av antistoffaktivitet i serumet hos mus immu-nisert med proteinkomplekset fremstilt i eksempel 2 eller i hybridoma supernatanten ble utført ved EIA metoden /Immunology 1, 3 (1978)/. Således ble serumet eller hybridoma supernatanten fortynnet med buffer A (20 mM Na2HP04,

100 mM NaCl, 0,1% NaN^, 1 mM MgCl2, pH 7,0) en 100-^1 porsjon av fortynningen ble blandet med 100 pl av det en-zym-bundede polypeptidderivat (eksempel 2) og reaksjonen fikk forløpe ved 24°C i 24 timer. Deretter ble 100 ul 3% cellulose koblet med kanin anti-mus IgG tilsatt og reaksjonen fikk forløpe ved 24°C i 4 timer. Etter fullstendig reaksjon ble cellulosen vasket godt med buffer A inneholdende 0,5% Tween 20, og så ble 500 _ul 20 ug/ml 4-me-tylumbelliferyl-/9-D-galaktosidase tilsatt, og etter 2 timers reaksjon ved 37°C, ble 3 ml 100 mM karbonatbuffer (pH 10,5) tilsatt for å stoppe reaksjonen. Fluorescensin-tensiteten ble målt med et fluorometer (excitation: 365 nm; emission: 450 nm).

Eksempel 4

Cellefusjon

Tre dager etter sluttimmuniseringen som beskrevet i eksempel 3, ble milten skåret ut fra y~2 musen, filtrert under trykk gjennom et rustfritt gitter, og oppslemmet i Eagle's minimale essensielle medium (MEM) hvilket ga en miltcelle-suspensjon. For cellefusjon brukte man BALB/C mus-avledede P3-x63.Ag8.Ul (P3U1) myeloma celler /Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1 (1978)/. Cellefusjonen ble utført ved den opprinnelige metoden til Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497 (1975). Således ble miltcel-ler og P3U1 celler vasket separat tre ganger med serum--fritt MEM og blandet i et forhold på 5:1 (i antall celler). Blandingen ble sentrifugert ved 800 opm i 15 minutter, hvorved cellene ble avsatt. Etter grundig fjerning av supernatanten, ble sedimentet løsnet forsiktig, 0,3 ml 45% polyetylenglykol (PEG) 6000 (Koch-Light) ble tilsatt, og blandingen fikk stå i en varm vanntank holdt ved 37°C i 7 minutter for å bevirke cellefusjon. Deretter ble MEM tilsatt ved en hastighet på 2 ml pr. minutt. Etter tilsetning av totalt 12 ml MEM, ble den resulterende blanding sentrifugert ved 600 opm i 15 minutter, etterfulgt av fjerning av supernatanten. Cellesedimentet ble oppslemmet i RPMI-1640 medium tilsatt 10% føtalt kalveserum (RPMI-1640-10FCS) i en konsentrasjon på 2 x IO<5> P3U1 celler/ml og hver av 144 brønner på 24-brønners multiskåler (Linbro) ble tilført 1 ml av suspensjonen. Etter tilførselen ble cellene inkubert ved 37°C i en 5% karbondioksydgassinku-bator. Etter 24 timer ble HAT-selektiv kultur oppstartet ved tilsetning av RPMI1640-10FCS medium tilsatt HAT (1 x

-4

10 M tymidin) medium i en mengde pa 1 ml pr. brønn.

Den HAT-selektive kultur ble fortsatt, mens 1 ml av det gamle medium ble erstattet av 1 ml HAT medium 3, 5 og 7 dager etter oppstarting av kulturen. Veksten av hybridomer ble notert 10 til 14 dager etter ceilefusjon. Når dyrk-ningsvæsken ble gul (ca. 1 x 10^ celler/ml), ble supernatanten oppsamlet og undersøkt med hensyn til nærvær av antistoff ved EIA metoden, på denne måten ble supernatan-ter fra 141 brønner hvori hybridom vekst var observert, undersøkt. To brønner (y 2-11 og y2-100) viste intens antistoffaktivi tet og to andre brønner ( / 2-62 og y2-70) viste svak antistoffaktivitet.

Eksempel 5

Kloning

Hybridomer fra 3 brønner (y 2-11, f 2-62 ogy2-100) som var positiv i antistoffaktivitet ble klonet ved den begrens-ende fortynningsmetode. Således ble hybridom-celler oppslemmet i RPMI1640-20FCS i en konsentrasjon på minst 2 hybridom-celler/ml og suspensjonen ble fordelt i 0,1 ml porsjoner i brønnene på en 96-brønners mikroplate. I denne fordeling ble 5 x 10 pr. brønn BALB/C mus tymocytter tilsatt som "feeder"-celler. Som et resultat ble cellefor-mering observert i ca. 2 uker. Supernatanten ble så oppsamlet og undersøkt med hensyn til nærvær av antistoffer med EIA Metoden som beskrevet i eksempel 3. Antistoffaktivitet ble notert hos 8 av 19 kloner fra ^2-11 brønn, i 3 og 54 kloner fra"^2-62 brønn og i 5 til 47 kloner fra^2-100 brønn (tabell 2).

Eksempel 6

Bindingskapasitet av monoklonale antistoffer til IFN-/

Bindingskapasiteten til monoklonale antistoffer til IFN-ble målt ved den følgende metode. Til 300 ,ul av en 3% løs-ning av cellulose koblet med kanin antimus IgG antistoff, ble 300 ul av kultursupernatanten fra hver av 2 eller 3 klonede cellelinjer fra hver av V2-11, y 2-62 ogy2-100 brønner tilsatt, og reaksjonen fikk forløpe ved romtempe-ratur i 12 til 20 timer. Så ble cellulosen grundig vasket med fysiologisk saltvann, og 550 enheter/ml IFN-y erholdt ved fremgangsmåten omtalt nedenunder ble tilsatt. Etter 3 til 4 timers reaksjon ble supernatanten oppsamlet og IFN-/' fremstilt ved fremgangsmåten omtalt nedenunder ble tilsatt. Etter 3 til 4 timers reaksjon ble supernatanten oppsamlet og IFN-Y/ aktiviteten deri ble målt ved den cytopatisk effekt (CPE) avlesningsmetode under anvendelse av en mikroplate /Applied Microbiology 16, 1706 (1968)/. Således ble 50 ul MEM plassert i hver brønn på en 96-brønners mikroplate og 50 ul av IFN prøven ble satt til den første brønn, etterfulgt av to-gangers fortynningsserie. Til hver således fremstilt brønn satte man 50 ul av WISH cellesus-pensjon (4 x IO<5> celler/ml) i 20% FCS-holdig MEM, og in-kubering ble utført i en krabondioksydgassinkubator ved 37°C i 24 timer. Deretter ble 50 ul av et vesikulært stomatitt virus (New Jersey stamme) preparat justert til en konsentrasjon på 2000TCID5Q (TCID5Q: midlere vevs-kulturinfeksjonsdose) ble satt til hver brønn og inkuber-ing ble utført i en karbondioksydinkubator ved 37°C. Ca. 35 timer senere,når celler i den IFn prøvefrie brønn viste 100% CPE, ble hver brønn observert mikroskopisk for be-stemmesle av CPE, og den resiproke verdi av fortynnings-faktoren for IFN prøven i den brønn hvori 50% CPE ble notert ble kalt IFN-styrken.

IFN-y prøven som ble brukt var supernatanten oppsamlet 72 timer etter stimulering av humane perifere lymfocytter med 40 pg/ ml konkanavalin A og 15 ng/ml 12-0-tetra-dekanoyl-forbol-13-acetat. Hver ml av denne kultursupernatant'inneholdt 4400 enheter humant IFN-y (varme- og syrelabil). Hvis antistoffer med bindingskapasitet til IFN-Y/ er til-stede i den klonede cellekultursupernatant, skulle det tilsatte IFN-Y da binde til antistoffene på cellulose og reduksjon i IFN-Y aktivitet til supernatanten skulle finne sted. Som resultat fant man for klonet f 2-11, relativ intens bindingsaktivitet til IFN-y og 50-75% av det tilsatte IFN (550 enheter/ml) ble bundet til antistoffet (tabell 3) .

Eksempel 7

Bukvatersotdannelse med monoklonale antistoffproduserende hybridomer

Bukvanndannelse ble frembragt ved intraperitoneal inokulering av BALB/c mus intraperitonealt forbehahdlet med 0,5 ml mineralolje med 1 x 106 V 2-11.1 klonceller som kunne produs-ere antistoffer med IFN- -bindende aktivitet. Ti dager etter intraperitoneal administrering av hybridomer, ble bukvæske tatt ut og undersøkt med hensyn til antistoffaktivitet opptil 10<7->gangers fortynning. Mens antistoffaktiviteten til den tilsvarende klonecellekultur-supernatant ble malt opptil 10 4-gangers fortynning,

førte dannelse av bukvann til en ca. 1000 gangers økning i antistoffaktivitet .

Eksempel 8

Monoklonal antistoffrensing

Ved bruk av 4 ml bukvæske fremstilt i eksempel 7 som utgangs-materiale ble monoklonal antistoffrensing foretatt ved metoden til Staehelin et al. Således ble bukvæske føsrt sentrifugert ved 10 000 opm i 15 minutter for å fjerne fibrin-lignende substanser og ble så fortynnet med fosfatbuffer-saltvann (PBS: 8,1 mM NaH2PC>4, 2,7 mM KC1, 137 mM NaCl; pH 7,2) til en konsentrasjon, ved hvilken ultrafiolett absorp-sjon ved 280 nm (<A>28Q) ville ligge fra 12 til 14. Deretter ble mettet ammoniumsulfat satt til den fortynnede prøven inntil en sulfatkonsentrasjon på 47%. Blandingen ble rørt ved 4°C i 60 minutter for å bevirke utsalting, og ble sentrifugert (10 000 opm, 15 minutter) hvilket ga en felling. Fellingen ble oppløst i 20 mM tris buffer (pH 7,9) inneholdende 50 mM NaCl og dialysert mot 2 liter av samme buffer. To timer senere ble dialyseløsningen erstattet med en frisk 2-liter porsjon av <;>den samme løsning og dialysen ble fortsatt i ytterligere

15 timer. Deretter ble fellingen fjernet ved sentrifugering ved 10 000 opm i 15 minutter, og supernatanten ble justert til en konsentrasjon slik at & 280 verdien ble 20-30. Denne prøven ble fraksjonert på en DEAE-cellulose-kolonne (8 ml, Whatman DE52) ekvilibrert med en tilstrekkelig mengde tris buffer (pH 7,9) inneholdende 50 mM NaCl, idet eluering ble foretatt med tris buffer inneholdende 50 mMol NaCl ved en strømningshastighet på 1,5 ml/ minutt. Under disse betingelser ble antistoffaktiviteten hovedsakelig påvist i utløpsfraksjonene. Bekreftelse på at den rensede prøve er antistoff ble foretatt ved SDS-PAGE metoden som beskrevet av Laemmli et al., Nature 227, 680

(1970). Således ble noen av fraksjonene fremstilt ved am-moniumsulfatutsaltning og DEAE-cellulosefraksjonering redusert med 2-merkaptoetanol, etterfulgt av 17% SDS gel-elektroforese ved 30 volt i 24 timer. I overensstemmelse med antistoffaktivitetstoppene, ble to bånd funnet i stil-linger tilsvarende molekylvekter på ca. 55 kilodalton (H kjede) og ca.. 28 kilodalton (L kjede). Den således rensede antistoff-fraksjon 17 ble undersøkt med hensyn til IFN-Y bindingsaktivitet ved å tilsette IFN (2200 U/ml). Man fant at ca. 50% IFN-Y var bundet til antistoffet (tabell 4) .

Eksempel 9

Underklasse som monoklonale antistoffer tilhører

Renset antistoff-fraks jon 17 (eksempel 8) ble fortynnet 10 ganger og utsatt for immuno-fellingsreaksjonen i agar (Ouchterlony forsøk: Immunological Methods, Gel-Diffusion Technigues, Blackwell, Oxford, 1964) ved bruk av geit antimus IgGl, G2a, G2b og G3 antistoffer (Miles) slik at IgG underklassen som ^2-11,1 monoklonale antistoffer kan , tilhøre kunne identifiseres. Et enkelt tydelig bånd ble funnet mellom det monoklonale antistoff og geitanti-mus IgG2b antistoffet, mens ingen bånddannelse ble funnet mellom det monoklonale antistoff og andre anti-antistoffer. Følgelig ble det monoklonale antistoff funnet å tilhøre IgG2b (Tabell 5).

Eksempel 10

25 ml (65,3 mg) av det monoklonale antistoff fra utløps-fraksjoner fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel 8, ble dialysert natten over mot 0,1M NaHCO^ (pH 8,3). Separat ble 25 ml AFFI-GEL 10 (Bio-Rad) grundig vasket med vann ved bruk av et glassfilter, oppslemmet i 0,IM NaHC^ (pH 8,3) og blandet med det ovennevnte antistoff. Blandingen ble rørt forsikt ved 4°C i 4 timer for å bevirke reaksjonen, og fikk så stå ved 4°C natten over. AFFI-GELET 10 ble vasket godt med 0,1M NaHC03 (pH 8,3) ved bruk av

et glassfilter. Gelen ble tilsatt 25 ml av en løsning (pH 8,0) inneholdende 0,1M etanolamin og 0,15M NaCl. Blandingen ble rystet ved 4°C 1 time for å blokkere eventuelle gjenværende aktive grupper som ikke hadde reagert. Så ble gelen vasket godt med PBS, og oppslemmet i 25 ml 0,1% NaN^-holdig PBS. Suspensjonen ble lagret ved 4°C. Basert på mengden av det tilsatte antistoff og mengden av antistoff i det gjenvunnede filtrat, fant man at anti-

stoffet var konjugert til gelen i et forhold på 2,35 mg/ml gel. En kolonne ble pakket med reaksjonsproduktet fremstilt på denne måten og brukt som en antistoffkolonne.

Eksempel 11

E. coli RR1 (pRK148dts, pRC231/IFI-900) (konstruksjon

av denne rekombinantorganisme er detaljert beskrevet i europeisk patentansøkning nr. 99084) ble brukt for rlFN-y produksjon. Plasmidene pRK248cIts og pRC231/IFI-900 inneholdt h.h.v. temperatur-sensitiv Lambda repressor og IFN-Y^-gener. Ekspresjon av rIFN-\"gen var under kontroll av PL promotoren.

Kulturer natten over av E. coli RR1 (pRK248cIts# pRC231/IFI-900) ble dyrket i LB medium ved 30°C. En liter av kulturen natten over ble fortynnet til 10 liter med minimal M-9 medium inneholdende kasaminosyrer. Ved logaritmisk vekst ble kulturen forandret fra 30° til 42°C,og fortsatte å vokse ved 42°C i 2-3 timer. Bak-teriene ble isolert ved sentrifugering og bakterieaggre-gatene ble lagret ved -20°C inntil bruk. Alle fermenteringa er og fremgangsmåter ble utført ifølge rekombinant DNA forskrifter fra National Institutes of Health.

Monoklonale antistoffer ble laget mot syntetisk 131-146 C-terminalt peptid av rlFN-f på den ovenfor beskrevne måte. Monoklonalt antistoff Mo j 2-11.1 ble brukt for rensingen av rIFN-y . Den monoklonale antistoffkolonne ble fremstilt som beskrevet i eksempel 10.

14

Karboksymetylering av rIFN-Y ved C-jodeddiksyre ble utført i nærvær av 6M guanidin-HCl som beskrevet i henvisning (3). Overskudd reagens ble fjernet med HPLC på C8 revers-fasekolonne. Karboksypeptidasenedbrytning ble ut-ført i 0,2M NH^HCO-j som beskrevet i henvisning (4).

rIFN-Y ble behandlet med CNBr (100-ganger molart overskudd av metionin) i 70 prosent maursyre som beskrevet i henvis-

ning (5). CNBr peptider ble skilt fra ved HPLC på en C-18 revers-fasekolonne. En lineær gradient på 0 til 70 prosent CH3CN i 0, 1% trifluoreddiksyre ble brukt til peptidel-uering.

Protein eller peptidprøver ble hydrolysert i 20-24 timer i forseglede, N2~fylte, evakuerte rør i konstantkokende HC1 inneholdende 4% tioglykolsyre.Aminosyreanalyse ble ut-ført ved bruk av fluorescaminaminosyreanalys.ator som beskrevet i henvisning (6).

En ABI (Applied Biosystem, Inc.) gassfasesekvensanalysator 470A ble brukt for sekvensanalyser av karboksymetylerte proteiner som beskrevet i henvisning (7). Prøver av PTH-aminosyrer ble identifisert ved revers-fase HPLC på en ultrakule ODS kolonne som beskrevet i henvisning (8).

Alle rensetrinn ble utført ved 4°C. Frosne celler (25 g) ble oppslemmet i tre volumdeler (75 ml) 7M guanidin-HCl (pH 7). Blandingen ble rørt i 1 time og så sentrifugert i 1 time ved 30 000 x g. Supernatanten ble fortynnet 10 ganger med Dulbecco's fosfatbufret saltvann (PBS) eller 0,15M natriumboratbuffer (pH 9,5) og så sentrifugert i 30 minutter ved 30 000 x g. Alternativt ble frosne celler (25 g) oppslemmet i 1,5 volumdeler (37,5 ml) 0,15M natriumboratbuffer (pH 9,5) og rørt i 1 time. Blandingen ble ultra-lydbehandlet 5 ganger i 30 sekunder og så sentrifugert i en time ved 30 000 x g. Supernatantene fra hver guanidin-HCl ekstraksjon eller ultralydbehandling ble blandet i 1 time på en roterende ryster med 25 ml kiselgel og forvas-ket med PBS. Blandingen ble satt på en kolonne og kolonnen ble vasket med 20-30 kolonnevolumer IM NaCl. Kolonnen ble så eluert med 0,5M tetrametylammoniumklorid i 0,01M natriumboratbuffer (pH 8,0). Interferonaktivitet ble eluert i ca. 200 ml og oppdelt i 4 volumer. Hvert volum ble satt på en monoklonal antistoff (y 2-11.1) affinitetskolonne (4 ml fyllmassefolum) ekvilibrert med PBS. Etter vasking med 10 kolonnevolumer PBS puffer, ble kolonnen eluert med enten IM guanidin-HCl eller 50% etylenglykol inneholdende IM NaCl og 20 mM natriumfosfatbuffer (pH 7,0). Interferonaktivitet ble eluert i de første 20 ml.

SDS-PAGE ble utført som beskrevet av Laemmli (henvisning 9). Proten ble bestemt ved fluorescaminanalyse med krys-tallinsk bovinserumalbumin som referansestandard. Inter-feronaktivi tet ble bestemt ved en cytopatisk effekt inhi-beringsmåling med vesikulær stomatittvirus og humane WISH celler som beskrevet i henvisning 10. Alle interferonkon-sentrasjoner er uttrykt i referanseenheter pr. ml kali-brert mot referansestandarden av partielt renset human immuninterferon.

En sammenfatning av ekstraksjonsrenseprosessen er angitt i tabell 6 (side 22). Totalutbyttet var 25-32% og rensingen var ca. 100 til 769 ganger med en gjennomsnittlig spesifikk aktivitet på 1 x 10 enheter/mg. Totalutbyttet av rIFN-Y var 3-4 ganger høyere med guanidinekstraksjon. SDS--PAGE for det siste trinn av rensingen er vist i figur 1. Materialet renset fra guanidinekstraksjon viste et enkelt bånd ved ca. 18 000 dalton (18K rIFN-y), mens materialet fra ultralydbehandlingen ga et hovedbånd ved ca. 15 000 dalton (15K rIFN-y) og et mindre bånd ved ca. 17 000 dalton (figur IA). På ikke-reduserende gel ble dimere og oli-gomere av rIFN-y dannet (figur IB).

18K rIFN-y var homogent og aminosyresammensetningen var i overensstemmelse med det som var forventet fra DNA sekvensen. Aminosyreblandinger av 15K og 18K rIFN-Y er vist i tabell 7. Flere hundre pikomol av redusert og karboksyme-tylert 15K og 18K protein gjennomgikk Edman nedbrytning i en automatisk gassfaseprotein/peptid sekvensator. Aminosyre N-terminalsekvensene av de første 32 og 26 rester av 15K henholdsvis 18K proteinene var i overensstemmelse med det som var forventet ut fra DNA sekvensen (figur 2). "^C-karboksymetylerte cysteiner ble påvist i første og tredje syklus av sekvensanalysene. Ikke noe N-terminalt metionin ble påvist. N-terminal sekvensanalyse av 18K og 15K rIFN-y viste at sekvensen for dette området av begge

proteiner er identisk med det som forventes fra DNA sekvensen. De C-terminale peptider er også karakterisert for å bestemme om noen delesjoner eller forandringer opptrer i dette området. Aminosyreanalyse av karboksypeptidase A (CPA) nedbrytningsblanding viste at serin og/eller gluta-min (C-terminale aminosyrer) ble frigjort fra 18K rlFN-y , mens 15K rIFN-/ ikke ble nedbrutt av CPA under samme betingelser. Da Ser-Gln er den C-terminale sekvens for rlFN-y, syntes 18K typene å ha intakte C-ender, mens 15K typene hadde en forskjellig C-terminal rest (Lys) som ikke spal-tes av CPA.

De C-terminale rester som forventes fra DNA sekvensene ble videre bekreftet ved analysering og sekvensering av de C-terminale peptider etter CNBr behandling. C-terminale peptider ble separert på HPLC C-18 revers-fasekolonnen (fig. 3). En skarp peptidtopp (topp II), eluert fra den tidlige del av gradienten, erholdtes fra 15K rIFN-Y og dette peptidet manglet i CNBr nedbrytningsblandingen av 18K rIFN-/. Aminosyreanalyse av dette peptid viste at dette peptid ikke hadde noe homoserin eller homoserinlakton og derfor måtte være det C-terminale CNBr peptid av 15K proteinet. Basert på aminosyreanalyse (tabell 8) tilsvarte dette peptidet aminosyrerestene nr. 121-131 av IFN-y (arginin kunne ikke påvises). Sekvensen til de 11 aminosyrer ble bekreftet ved sekvensanalyse (figur 2). I tilfellet 18K r IFN-v" , fikk man en relativ bred topp i den tidlige del av eluer-ingen. Denne topp ble videre skilt i to topper ved en flat gradient. Aminosyreanalysen viste at den første toppen er det CNBr C-terminale peptid av 18K proteinet (tabell 8) og aminosyresammensetningen tilsvarer aminosyrerester nr. 138-146. Sekvensen av de 9 aminosyrer ble stadfestet ved sekvensbestemmelse (figur 2). Den C-terminale aminosyre i 15K proteinet ble funnet å være lysin.

Disse resultater viser at 18K typene var intakte rIFN-y molkyl, mens 15K typene var det proteolytiske produkt. Peptidbindingen mellom aminosyrerestene nr. 131 og nr. 132 (Lys-Arg) var spaltet på 15K typene.

Eksempel 12

15K fragmentet av immuninterferon ble renset frem til ho-mogenitet fra blandingen som inneholder andre fragmenter, dvs. 17K fragmentet, ved de følgende ytterligere metoder. En ultralydsupernatant (protein 10,3 mg; spesifikk aktivitet 0,9 x 10^ enheter pr. mg) som var blitt renset gjennom den monoklonale antistoffaffinitetskolonne ble videre renset ved SDS-PAGE gel elektroforese (16 plategeler; ak-rylamid 12,5%; SDS, 0,1%; tykkelse, 3-5 mm). En remse av gelen ble først farget med 0,1% Coomassie Brilliant Blue R-250, så avfarget med 10% eddiksyre i 15% metanol. De tilsvarende 15K gelbånd på andre remser på gelen ble skåret ut, knust og rørt i 0,1% SDS ved 4°C i 2 dager. Løs-ningen ble så filtrert på filterpapir. Filtratet ble frysetørket og så forenet med 6 volumdeler etanol. Den resulterende felling ble oppløst i 0,1% SDS og ga en løsn-ing av homogen 15K monomerkomponent (protein, 1,1 mg;, spe-sifisert aktivitet, 0,3 x 10 enheter pr. mg).

REFERANSER

1. Gray. P.W., et al.. Nature 295, 503-508 (1982)

2. Stahelin. T.,et al., J. Biol. Chem. 256. 9750-9754

(1981) 3. Allen, G., Sequencing of Protein and Peptides, pp. 30-31 (1981), North-Holland Publishing Co.. Amsterdam. New York 4. Araber. R.P.. Methods in Enzymology 11. 436-445 (1967) 5. Wolfe, R.A. and Stein, S.. Modern Methods in Pharmaco-logy, pp. 55-77 (1982). Alan R. Liss. Inc.. New York.

NY.

6. Stein. S. and Brink. L.. Methods in Enzymology, 79., 20-25 (1981) 7. Hewick, R.M., Hunkapillar. M.W.. Hpdd, L.E. and Dreyer. W.I., J. Biol. Chem. 256. 7990-7997 (1981) 8. Hawke. D., Yuan, P-M., and Shively, J.E.. Anal. Bio-chera. 120. 302-311 (1982)

9. Laemmli. U.K.. Nature 227. 680-685 (1970)

10. Rubinstein S., Familletti. P.C.. and Pestka, S.. J. Virol. 3_7, 755-758 (1981) 11. Capon. D.J., Leung. D.W., Hitzeman, R.A.. Perry, L.J.. Kohr, W.J.. Gray. P.W.. Derynck, R., and Goeddel. D.V.. The Third Annual International Congress for Interferon Research. Miami. Fla. (1982).

Claims (1)

1. Fremgangsmåte ved rensing av et polypeptid med aminosyre- sekvens hvilken sekvens eventuelt kan inneholde en ytterligere mentioninrest på aminoenden; hovedsakelig fri for andre peptider og med hovedsakelig samme aktivitet som gammainterferon , karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter å rense ved antistoffaffinitetskolonne-kroiuatografi et ekstrakt erholdt fra. lysetransformerte E.. Coli som er i stand til å uttrykke IFN- Jf, ved å bruke monoklonale antistoff som. er spesifikke for de 16 C-terminale aminosyreresidier av IFN-y.