HU196460B

HU196460B - Process for producing homogenous immune interferon fragment and pharmaceutical compositions comprising it

Info

Publication number: HU196460B
Application number: HU843510A
Authority: HU
Inventors: Susumu Honda; Hiromu Sugino; Hsiang-Fu Kung
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1983-09-20
Filing date: 1984-09-19
Publication date: 1988-11-28
Also published as: ES536027A0; DE3468690D1; NO159610B; ES8606885A1; ATE31933T1; MC1623A1; NO843751L; ZA846549B; AU577314B2; KR850002283A; DK447684A; HUT35288A; CA1298219C; FI843668L; JPS6163697A; EP0136620B1; PH19646A; AU3330384A; PT79230A; IL72985A0

Description

Találmányunk

Cys	Tyr	Cys	Gin	Asp	Pro
Asn	Leu	Lys	Lys	Tyr	Phe
Val	Ala	Asp	Asn	Gly	Thr
Lys	Asn	Trp	Lys	Glu	Glu
Gin	Ser	Gin	Ile	Val	Ser
Lys	Asn	Phe	Lys	Asp	Asp
Val	Glu	Thr	Ile	Lys	Glu
Phe	Asn	Ser	Asn	Lys	Lys
Lys	Leu	Thr	Asn	Tyr	Ser
Gin	Arg	Lys	Ala	Ile	His
Ala	Glu	Leu	Ser	Pro	Ala

Tyr	Val	Lys	Glu	Ala	Glu
Asn	Ala	Gly	His	Ser	Asp
Leu	Phe	Leu	Gly	Ile	Leu
Ser	Asp	Arg	Lys	Ile	Met
Phe	Tyr	Phe	Lys	Leu	Phe
Gin	Ser	Ile	Gin	Lys	Ser
Asp	Met	Asn	Val	Lys'	Phe
Lys	Arg	Asp	Asp	Phe	Glu
Val	Thr	Asp	Leu	Asn	Val
Glu	Leu	Ile	Gin	Val	Met
Ala	Lys	Thr	Gly	Lys

aminosav-szekvenciával rendelkező - mely szekvencia az amino-végcsoporton adott esetben további metionin-maradékot tartalmazhat más peptidekt.ól mentes és a gamma-interferonnal lényegében azonos aktivitású polipeptid és a fenti polipeptidet tartalmazó gyógyászati készítményekre előállítására vonatkozik.

Találmányunk tárgya eljárás a fenti polipeptidnek IFN-^-t tartalmazó transzformált mikroorganizmusból történő előállítására. Az eljárás szerint a transzformált mikroorganizmust a sejtek felszakítása után (pl. szonifikáció vagy kémiai lizis segítségével) proteáz-inhíbitor távollétében extraháljuk és a kapott extraktumot monoklonális anti-testek felhasználásával immun interferonná tisztítjuk.

Az ábrák rövid ismertetése

Az 1. ábrán tisztított rekombináns humán immun interferon nátrium-dodecil-szulfát (poliakrilamid gél elektroforézisét- (a továbbiakban SDS-PAGE) mutatjuk be reduktív /A; 0,7 mól ö-merkapto-etanol/ és nem redukáló (B) körülmények között.

A 2. ábrán a rekombináns humán immun interferon várható aminosav-frekveneiáját a 15K és 18K rIFN-χ species tényleges DNS szekvenciájával hasonlítjuk össze.

A 3. ábrán a 15K és 18K rlFN-j C-tei— minális peptidjeinek HPLC elválasztását mulatjuk be CNBr kezelés után.

Az irodalomban számos módszert ismertettek az interferon néven ismert vírus-ellenes fehérje-család extrakciójára és tisztítására. Jelen ismereteink szerint három főbb interferon-típust különböztetünk meg: IFN-oC (leukocita), IFN-ű (fibroblaszt) és IFN-ji (immun). Bár a különböző interferon-típusok vírus-ellenes és burjánzásgátló hatásuk vagy szerkezeti felépítésük alapján összefüggnek, az irodalomban eddig egyetlen egységes módszert sem ismertettek mindhárom interferon-típus extrakciójára és tisztítására. A leukocita-interferonnak más fehérjéket ós sejtmaradványokat tartalmazó nyers keverékből történő extrakciójára és tisztítására felhasználható módszerek valójában nem alkalmasak fibroblaszt vagy immun interferonnak ugyanezen készítményből történő extrakciójára és tisztítására.

Az ismert tisztítási eljárások extrakciós lépése során a mikroorganizmust mechanikus (azaz szonifikáció) vagy kémiai lizisnek ve20 tették aló, amelynek során - gyakran rekombináns módszerek utján - nyerték a kívánt .idegen' fehérjét. A mechanikai vagy kémiai lízis-módszerek során azonban a keverékbe különböző sejt-proteázok is bekerülnek. E proteázok ezután enzimes behatás révén lebonthatják a keverékben levő .idegen fehérjét.

Az irodalom szerint az immun interferon bizonyos aminosav szekvenciái a virus-elle30 nes aktivitás szempontjából nem lényegesek, így pl· Capon és társai közleménye szerint (11. sz. közlemény) a γΙΓΝ-ϊ 136-146. aminosavai a vírus-ellenes hatás szempontjából nem esszenciálisak.

A találmány előnyös foganatositási módjainak ismertetése

Azt találtuk, hogy immun interferon esetében a szokásos extrakciós módszerekkel (pl. az iroalomban leírt, szonifikáció vagy mechanikai lízis) nem nyerhető intakt vagy teljes aminosav-szekvenciával rendelkező immun interferon. A rekombináns technológia csupán a közelmúltban ért el olyan fejlettségi fokot, amelynek segítségével a jellemzéshez és aminosav-szekvencia meghatározáshoz elegendő mennyiségű rINF-ϊ állítható elő. Az rINF-ΐ készítmények szokásos módszerekkel történő extrakciója és a tisztított anyag aminosav-szekvenciájának meghatározása során azt találtuk, hogy a tisztított készítmény többfajta különböző molekulatömegű fehérjefajtát tartalmaz. Az aminosav-szekvencia meghatározása során azt találtuk, hogy ezek a fehérje-fajták ténylegesen az immun-interferon intakt szekvencia formájának az intakt szekvencia fehérjék proteolitikus fragmentjeivel képezett kombinációjából állnak.

Meglepő módon bál· felismerésünk értelmében a technika állása szerinti keverék intakt immun interferon fehérjét és fragmenseit egyaránt tartalmaz, azt találtuk, hogy a keverék egyik komponense biológiai aktivitá65 sát nyilvánvalóan megtartja.

196160

A humán rlFN-^-nak az e fehérjét termelő és tartalmazó transzformált mikroorganizmusokból történő extrakcióját szonifikáció vagy mechanikai lizis felhasználásával egyszerűen és hatékonyan elvégezhetjük. Feltételezésünk szerint azonban proteázok az extrakciós lépés alatt lebontják az rlFN-Tí-t. A fagyasztott sejtek szonifikációja során proteolitikus termékek keverékét kapjuk, igy pl. 15K rlFN-'^-t (molekulatömeg kb. 15 000 dalion; a találmányunk szerinti vegyüiet) amely a 132-146 sz. C-terminális aminosav-maradékok lehasadása utján jön létre. Azt találtuk, hogy a 15K rIFN-γ tisztítás után más proteolitikus fragmentektöl mentes és biológiai aktivitása lényegében a teljes 18K rlFN-K fehérjéével (10⁷ egység/mg) azonos és a homogén természetes humán immun interferonéval (7. sz. irodalmi hely) összehasonlítható. A 15K fehérje aniinosav-összetétele és N-terminális szekvenciái a DNS szekvencia alapján vártaknak felelnek meg. A 2. ábrán a 15K rIFN-^-aminosavat és a megfelelő DNS szekvenciát, valamint a teljes immun interferon fehérje aminosavat és megfelelő DNS szekvenciáját mutatjuk be. A teljes 18K humán rIFN-χ DNS bázis szekvenciáját a leírásban az 1. sz. irodalmi helyen leírtaknak megfelelően alkalmazzuk.

Az extrakciós eljárásoktól függően az rIFN-Ή különböző molekulatömegű fajtáit (kb. 15.000-18.000 dalion) külön tisztítjuk.

Λ 18.000 látszólagos molekulatömegű [ nátriuni-dodecil-szulfát/poliakrilamid gól elektroforézis szerint] tisztított interferont guanidines extrakcíóval nyerjük. Az alacsony 15.000 molekulatömegű immun interferon fajtát azonban előnyösen guanidin távoilétében végzett szonifikációval extraháljuk. Mind a 18K, mind a 15K fehérje amino terminális szekvenciája összhangban áll a humán immun interferon fehérje DNS kódolása alapján várt szekvenciával.

Ugyancsak találmányunk körébe tartozik az amino-végcsoporlon a cisztein (Cys) előtt metionin (Met) maradékkal kezdődő polipeptid előállítása is.

A 18K és 15K fehérje C-terminális szekvenciáit a CNBr kezelés után nyert tisztított C-terminális peptid analízisével és szekvenciájának megállapításával határozzuk meg. A 18K rIFN-}j-ból felszabadított C-terminális peptid aminosav-összetétele és szekvenciája az rIFN-κ várt szekvenciájával összhangban áll és ez azt jelzi, hogy a 18K fajta az intakt molekula. Ezzel szemben a 15K rlFN-ϊ C-végcsoportjáböl CNBr hasítással más peptid szabadul fel. Az aminosav-összetétel és szekvencia meghatározás alapján ez az eltérő peptid felel meg a 121-131. aminosav-maradékoknak és ez arra utal, hogy a 15K fajta a proteolitikus termék.

A találmányunk szerinti eljárás előnyös foganatosítási módja szerint a fermentációs műveletnél recipiensként az Escherichia coli 4

K-12 294 törzset alkalmazzuk, feltéve, hogy mást nem közlünk. Ezt a törzset a 2 055 382A sz. brit szabadalmi bejelentésben írták le és az American Type Culture Collection intézménynél 1978. október 28-án ATCC 31446 számon deponálták. Minden rekombináns DNS műveletet a National Institutes of Health irányelveinek megfelelően végeztünk el.

Találmányunkat azonban nem korlátozzuk a fent említett E. coli K-12 294 törzs alkalmazására, hanem eljárásunk során más ismert E. coli törzsek [pl. E. coli MA210 vagy E. coli RR1 (ATCC 31 343)] vagy más mikroorganizmusok is felhasználhatók, amelyek sok képviselője bárki számára hozzáférhető, vagy deponálásra került, és elismert mikroorganizmus letétbehelyezö intézmények útján beszerezhető ( pl. American Type Culture Collection, lásd ATCC katalógus).

Az .interferon aktivitás' kifejezés az interferonok jellemző vírus-ellenes és növekedés-ellenes aktivitására utal. Az rlFN jellemző vírus-ellenes aktivitását a Familletti P.C. és társai által leírt citopatikus hatásgátlö teszttel határozzuk meg [Methods in Enzyinology 78, 378 (1981)]. Az rlFN jellemző növekedés-ellenes aktivitását Evinger és Pestka módszerével határozzuk meg [Methods in Enzymology 79, 45 (198DJ. A rlFN-ϊ C-végcsoportjának utolsó 16 aminosav-raaradékát tartalmazó szintetikus polipeptid monoklónális antitestjeit állítjuk elő. A rlFN-? tisztítására az egyik monoklonális antitestet alkalmazzuk (Mo íj 2-1 l.l)· A találmány során a monoklonális antitesteket és az antitest affinitásos oszlopot a 103 898 sz. európai szabadalmi leírásban foglaltak szerint készítjük el.

A találmányunk szerint előállított új immun interferont az egyéb ismert interferonokkal azonos célokra használhatjuk (pl. vírusos vagy neoplasztikus rendellenességek megelőzése és kezelése vagy imntunoszupressziv állapotok kezelése). A találmányunk szerinti új immun interferont gyógyászatilag alkalmas orális, injekciós vagy helyi kezelésre szolgáló készítmények alakjában alkalmazhatjuk. A dozirozás és dózis-tartomány az ismert interferonok klinikai alkalmazása során használt értékeknek felel meg (általában napi 1-200.10⁶ egység). A találmányunk szerint előállított gyógyászati készítmények a korábbiakban ismertetett immun interferont és gyógyászatilag alkalmas hordozóanyagot tartalmaznak. A készítmények előállításához bármely alkalmas és szokásos hordozóanyagok felhasználhatók. E célra szerves vagy szervetlen, enterális, perkutáns vagy parenterális adagolásra alkalmas hordozóanyagokat (pl. vizet, zselatint, gumiarábikuiiiot, laktózt, keményítőt, magnézium-sztearátot, talkumot, növényi olajokat, pollalkilénglikolokat, vazelint stb.) alkalmazhatunk. Λ gyógyászati készítmények ezenkívül további gyógyászati hatóanyagokat tartalmazhatnak. Ezenkívül a gyógyászati készítményekhez további adalékokat {pl. ízesítő anyagokat, tartósítószereket, stabilizálószereket, emulgeálószereket, puffereket stb.) is adhatunk, a gyógyszergyártás ismert módszerei szerint.

A találmányunk szerinti gyógyászati készítmények az alábbi szokásos típusokba tartozhatnak:

a) Orális adagolásra alkalmas szilárd készítmények (pl. tabletták, kapszulák, drazsék, porok, granulák stb.).

b) Orális adagolásra szolgáló folyékony készítmények (pl. oldatok, szirupok, szuszpenziók, elixirek stb.).

c) Parenterális adagolásra szolgáló készítmények (pl. steril oldatok, szuszpenziók vagy emulziók stb.).

d) Helyi alkalmazásra szolgáló készítmények (pl. oldatok vagy szuszpenziók, kenőcsök, krémek, gélek, mikronizált porok, aeroszol stb.).

A gyógyászati készítmények sterilezhetók és/vagy adjuvánsokat (pl. tartósító-, stabilizáló-, nedvesítő- vagy emulgeálószereket, az ozmózis nyomás változásához előidéző sókat és/vagy puffereket) tartalmazhatnak.

A parenterális adagolásra alkalmas készítmények intravénásán vagy intramuszkulárisan befecskendezhető infúziós vagy injekciós oldatok lehetnek. Ezek a készítmények is további, a találmányunk szerint előállított új immun interferonnal szinergetikus kölcsönhatásba nem lépő gyógyászati hatóanyagokat tartalmazhatnak. A parenterális készítményekhez a gyógyszergyártás ismert módszerei szerint további adjuvánsokat (pl. tartósító-, stabilizáló- vagy emulgeálószereket, puffereket stb.) is adhatunk.

Eljárásunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk.

Z. példa

Antigénként hasznait hordozófehérje-polipeptid komplex szintézise

A H-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-LeuPhe-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OH polipeptidet thyro-globullnnal (a továbbiakban TG) kapcsoljuk Goodfriend és társai módszerével [Science 144, 1334 (1964)].

Magát a pepiidet szokásos peptid-szintetikus módszerekkel állíthatjuk elő. A szilárdfázisú és folyadékfázisú módszert egyaránt felhasználhatjuk, bár sok esetben a folyékony fázisú szintetikus módszer előnyös. Megfelelő peptid-szintéziseket pl. az alábbi irodalmi helyek Írtak le: Schröder és Lübke: .The Peptides', Vol. 1. Academic Press, New York, USA, 1966; vagy Izumiya és társai: .Peptide Syntheses, Maruzen, Tokyo, Japán, /

1975; vagy Haruaki Yajima: .Experiments in Biochemistry, Vol. 1. 207-400 oldalak, Tokyo Kagaku Dojin, 1977. E módszerek közül többek között - az azidos, kloridos, savanhidrides, vegyes savanhidrides, DCC és aktív észteres módszereket, a Woodward K.-reagenst, felhasználó módszert, a karbodiimidazolos módszert, az oxidációs-redukciós módszert és a DCC/addiciós (pl. HONB, HOBt, HOSu) módszert említjük meg.

Az IFN-γ 131-146. fragmerisének részletes előállítása a 103 898 sz. európai szabadalmi leírásban került ismertetésre.

2,5 mg fenti polipeptidet. 3,75 mg TG-vel összekeverünk, majd 2 ml 50 millimólos foszfát-puffért adunk hozzá és az elegyet jegesvízben erőteljesen keverjük. Ezután fokozatosan 30,4 mg karbodiimid-hidroklorid és 200 ml desztillált viz oldatát csepegtetjük hozzá. Λ reakció befejeződése után desztillált vízzel szemben 24 órán ét dializáljuk, majd liofilizáljuk. 4,7 mg fehérje-komplexet kapunk.

2. példa

Enzimhez kötött antigén előállítása az enzim immunológiai meghatározásához (EIA) az antitest kimutatásához

Az EIA számára az enzimhez kötött antigént Kitagawa és társai módszerével állítjuk elő [Journal of Biochemistry 79, 233 (1976)].

(i) A maleimido-csoport bevitele a polipeptidbe

Az 1. példa szerint előállított polipeptidet (350 nmól) 1 ml 100 nmólos foszfát-pufferben oldjuk (pH 6,8) és az oldatot 585 Mg (1,75 Mmól) N-(4-karboxi-ciklohexil-metil)-maleimid N-hidroxi-szukcinimid-észternek 70 m1 Ν,Ν-dimetil-formamiddal képezett oldatához adjuk. Az elegyet 30 °C-on 30 percen át keverjük. A reakció befejeződése után Sephadex G-25 oszlop felhasználásával kromatografálva 185 nmól, bevitt maleimido-csoportot tartalmazó polipeptid frakciót kapunk.

(ii) Λ maleimido-csoportot tartalmazó polipeptid fl-D-galaktozidázzal történő kapcsolása

A maleimido-csoportot tartalmazó polipeptidet (16,5 nmól) 3,3 nmól ű-D-galaktozidázzal elegyítjük. A reakciót 4 °C-on 18 órán át végezzük, majd 412,5 nmól β-merkapto-etanol hozzáadásával leállítjuk. A fl-D-galaktozidázzal kapcsolt polipeptidet Sepharose 6B oszlopon frakeionáljuk és a további kísérletekben felhasználjuk.

3. példa

Immunizálás db 7-8 hetes BALB/C egeret 40 Mg (fehérjében kifejezve) az 1. példa szerint előállított fehérje-komplex mint antigén Freund-féle teljes adjuvánssal képezett bensőséges keverékével szubkután inokulálunk (primer immunizálás). A primer immunizálás után két héttel az egereket a fentivel azonos dózisú antigén Freund-féle nem-teljes adjuvánssal képezett bensőséges keverékével szubkután ismét inokuláljuk (szekunder immunizálás). További két hét elteltével a második immunizálással azonos módon harmadik immunizálást hajtunk végre. A harmadik immunizálás után 0 nappal az egerekből részle5 ges vérmintát veszünk és a szérum-antitest titereket az alábbiakban ismertetésre kerülő EIA-módszerrel meghatározzuk [lásd: Imraunopharmacology 1, 3 (1978)]. A legmagasabb antitest-titert mutató y-2 számú egeret

120 pg antigén 0,5 nil vizes nátrium-kloriddal képezett oldatának intravénás inokulátásával végző immunizálásnak vetjük alá. Az egyes egerek antitest-titer adatait az 1. táblázatban foglaljuk össze.

I. táblázat

Immunizált egerek antipeptid-antitest titere

B/T (%)

Λζ egér száma	Első immunizálás 1/	Második immunizálás 2/	Harmadik immunizálás 3/
K-1	4/	N.D.	24.5
2	N.D. 5/	19.3	35.3
3	-	N.D.	24.7
4	N.D.	1.3	1.7
5	N.D.	1.8	5.0
6	-	N.D.	0.8
normál
egér	0.6	0.1	N.D.

1/ Szérum hígítás aránya: 1/1000

2/ Szérum hígítás aránya: 1/6300

3/ Szérum hígítás aránya: 1:7800

4/ -: nem kimutatható

5/ N.D.: nem határoztuk meg

B/T: (kötött enzim aktivitás/ teljes hozzáadott enzim aktivitás) x 100

EIA-módszer

A 2. példa szerint előállított fehérjekomplex-szel immunizált egerek széruméban vagy a hibridoma felülúszóban levő antitest-aktivitást EIA-módszerrel határozzuk meg [Imraunology 1, 3 (1978)]. A szérumot vagy a hibridoma felülúszót A-pufferrel (20 mM NazHPCM, 100 mM NaCl, 0,1% NaN3, 1 mM MgClz, pH 7,0) hígítjuk, majd a hígított elegy 100 ul-es részletét 100 pl enzimhez kötött polipeptid-származékkal (2. példa) elegyítjük és a reakciót 24 °C-on 24 órán át folytatjuk. Ezután 100 ul 3%-os, nyúl anti-egér IgG-vel kapcsolt cellulózt adunk hozzá és a x reakciót 24 °C-on 4 órán át folytatjuk. A reakció befejeződése után a cellulózt 0,5% Tween 20-t tartalmazó Λ-pufferrel alaposan mossuk, majd 500 ul 20 Mg/ml-es 4-metil-umbelUferil-ű-D-galaktozidot adunk hozzá. Λ reakciót 37 °C-on 2 órán át végezzük, majd 3 ml 100 nmólos karbonát-puffer (pH 10,5) hozzáadásával leállítjuk. Λ fluoresszencia intenzitást fluoron,éterrel mérjük (gerjesztés 365 nn,; emisszió 450 nm).

4. példa

Sejt-füzió

A 3. példában leírt végső immunizálás után három nappal a }j-2 egér tápét kivágjuk, rozsdamentes szűrön nyomás alatt átszűrjük és Eagle-féle minimális esszenciális közegben (MÉM) szuszpendáljuk. Ily módon táp-sejt szuszpenziót nyerünk. A sejt-fúzióhoz BALB/C egérből származó P3-x63.Ag8.lll (P3U1) mieloma-sejteket alkalmazunk [Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1 (1978)]. A sejt-fúziót Köhler és Milslein eredeti módszerével végezzük el [Natúré 256, 495-497 (1975)]. A lépsejtekel és P3U1 sejteket külön-külön szérum-mentes MEM-el háromszor mossuk és 5:1 arányban (a sejtek számában kifejezve) összekeverjük. Az elegyet 800 fordulat/perc sebességgel 15 percen át centrifugáljuk, ezalatt a sejtek kiülcpednek. Λ felül elhelyezkedő folyadék alapos eltávolítása után az üledéket enyhén fel65 lazítjuk, 0,3 ml 45%-os polietilénglikol (PEG,

-510

6000-t (Koch) adunk hozzá és az elegyet 37 °C-os meleg víztartályban 7 percen át állni hagyjuk, mikorís a sejt-fúzió lejátszódik. Ezután 2 ml/perc sebességgel MEM-t adunk hozzá. Az összesen 12 ml MÉM hozzáadása utén kapott elegyet 600 fordulat/perc sebességgel 15 percen át centrifugáljuk, majd a felül elhelyezkedő folyadékot eltávolítjuk. A sejt-üledéket 10% magzati borjú szérummal kiegészített RPMI-1640 táptalajban (RPMI 1640-10FCS) szuszpendáljuk 2 χ 10^{5 *} P3U1 sejt/ml koncentrációban és 24-mélyedéses multi-csészékben (Linbro) levő 144 mélyedést 1-1 ml szuszpenzióval beoltunk. A beoltás után a sejteket 37 °C-on 5% szén-dioxid-gázt tartalmazó inkubátorban 37 °C-on inkubáljuk. 24 óra elteltével HAT-szelektív tenyésztést indítunk meg oly módon, hogy HAT-tal (1 x 10^-4 M hipoxantin, 4 χ 10'⁷ M aminopterin, 1,6 χ 10*⁵ M timidin) kiegészített RPMI 1640-10FCS táptalajt adunk hozzá, 1 ml/mélyedés mennyiségben. A HAT-szelektiv tenyésztést folytatjuk, miközben a starttól számított 3., 5. és 7. napon 1 nil régi tenyészetet 1 ml HAT-közegre cserélünk le. A hibridómák növekedését a sejt-fúzió után 10-14 nappal figyeljük meg. Mihelyt a fermentlé színe sárgába megy át (kb, 1 x 10® sejt/ml) a felülúszót összegyűjtjük és az anti-test jelenlétét az ΕΙΛ-uiódszerrel megvizsgáljuk. A fenti módon 141 olyan mélyedést vizsgálunk meg, amelyben hibridóma növekedést megfigyeltünk. Két mélyedésben (1(2-11 és 1(2-100) intenzív antitest-aktivitást, még két másik mélyedésben (ϊ2-62 és y2-70) gyenge antitest-aktivitást figyeltünk meg.

5. példa

Klónozás

Három mélyedésből (?2-ll, ϊ2-62 és χ2100) származó, pozitív antitest-aktivitást mutató mélyedésből származó hibridómákat a hatérhlgitásos módszerrel klónozunk. A hibridóma sejteket RPMI 1640-20FCS-ben legalább 2-hibridóma sejt/ml koncentrációban szuszpendáljuk és a szuszpenziót 96-mélyedést tartalmazó mikrolemez mélyedései között 0,1 ml részletekben elosztjuk. A fenti elosztásban tápsejtként minden mélyedéshez 5 χ 10⁵ BALB/C egér timocitát adunk. Λ fentiek eredményeként a sejtburjánzás kb. 2 hét múlva figyelhető meg. Λ felülúszót összegyűjtjük és az antitestek jelenlétét a 3. példában leírt EIA-módszerrel meghatározzuk. Antitest aktivitást tapasztalunk k2-1L mélyedés 19 kiónja közül 8-ban, a ϊ2-62 mélyedés 54 kiónja közül 3-ban, és a 1(2-100 mélyedés 47 kiónja közül 5-ben (2. táblázat).

2. táblázat

Klónozott hibridómák anti-peptid antitest aktivitása

Hibridóma száma	B/T (%)
X2-L1
1	68
2	31
3	63
6	68
7	67
9	69
12	42
18	60
1(2-62
14	20
16	21
34	16
Ϊ2-100
2	69
3	70
16	56
25	80
46	33

Hiperimmun egér szérum 35

6. példa

Monoklónális antitestek IFN-y-hez való kötődési kapacitása

A monoklónális antitestek IFN-^-hez való kötődési kapacitását az alábbi módszerrel határozzuk meg. Nyúl anti-egér IgG antitesttel kapcsolt cellulóz 3%-os oldatához (300 μΐ) a ϊ2-ϋ, χ2-62 és 1(2-4.00 sejtek 3 klónozott sejt vonal tenyészetének felülúszó ját (300 jul) adjuk és a reakciót szobahőmérsékleten 12-20 órán át folytatjuk. A cellulózt ezután fiziológiai konyhasóoldattal alaposan mossuk és az alábbi eljárással nyert IFN-u-ból 500 U/ml-t adunk hozzá. A felülúszót 3-4 órás reakció után összegyűjtjük és az alábbi eljárással nyert IFN-K-t adunk hozzá. A felülúszót 3-4 órás reakció után összegyűjtjük és az IFN-χ aktivitást a citopatikus hatás (CPE) leolvasó módszerrel mikrolemez felhasználásával meghatározzuk [Applied Microbiology 16, 1706 (1968)]. 96 mélyedést tartalmazó mikrolemez minden mélyedésébe 50 μΐ MEM-t helyezünk és az első mélyedésbe 50 μΐ IFN mintát adunk, majd kétszeres sorozathígitást alkalmazunk. Minden mélyedéshez 50 μΐ WISH-féle sejt-szuszperiziót (4 x 10^s sejt/ml) adunk 20% FCS-t tartalmazó MEM-ben és az inkubálást szén-dioxid-gáz inkubátorban

-612

L3 °C-on 24 órán át folytatjuk. Ezután minden mélyedéshez 2000 TCIDs (TCIDso = közepes sejttenyészet fertőző dózis) koncentrációra beállított 50 pl vesiculáris stomatitis vírus (New Yersey törzs) ké- 5 szítményt adunk és az inkubálást szén-dioxid inkubátorban 37 °C-on folytatjuk. Mintegy 35 óra elteltével, amikor az IFN mintát nem tartalmazó mélyedésben levő sejtek 100%-os CPE-t mutatnak, minden mélyedést a CPE j() meghatározása céljából mikroszkopikusan megvizsgálunk és az 50%-os CPE-t mutató mélyedésben levő IFN-minta hígítási faktorának reciprokát tekintjük IFN-titernek.

IFN-γ minta gyanánt a humán perifériális limfociták 40 pg/ml concanavalin A-val és ng/ml 12-0-Letra-dekanoil-forból-13-acetáttal történő stimulálása után 72 órával öszszegyűjtött felülúszót alkalmazunk. Λ fenti felülúszó tenyészet minden ml-e 4400 egység humán IFN-^-t (hővel és savval szemben labilis) tartalmaz. Ha az IFN-jj-hoz kötődő kapacitást mutató antitestek vannak jelen a klónozott sejt-tenyészet felülúszóban, úgy a hozzáadott ΙΕΝ-γ-nak a cellulózon az antitestekhez kell kötődni és a felülúszó IFN—χ— -aktivitásának csökkenni kell. A γ2-11 klón esetében az IFN-γ viszonylag intenzív kötődő kapacitása figyelhető meg és a hozzáadott IFN-γ (550 E/ml) 50-75%-a az antitestekhez 15 kötődik (3. táblázat).

3. táblázat

Monoklonális antitestek IFN-}' aktivitást megkötő hatása

Hibridóma tenyészet	Maradék IFN aktivitás (E/ml)
1. kísérlet	2. kísérlet
Υ2-11.1	138	275
K2-11.2	207	N.D.
Ϊ2-11.6	N.D.	275
Ϊ2-62.2	275	550
γ2-62.3	275	550
γ2-100.2	550	N.D.
γ2-100.3	550	N.D.
-	550	550

7. példa

Monoklonális antitest-termelő hibridömák ascites képzése

Az ascites-képzödést oly módon idézzük elő, iiogy 0,5 ml ásványolajjal intraperitoneálisan előkezelt BALB/C egereket 1 x 10^Gy2—11.1, IFN-γ aktivitást megkötő anti-testek termelésére képes klón-sejtekkel intraperitoneálisan inokulálunk. A hibridómák intraperitoneális beadása után 10 nappal az ascitikus folyadékot levesszük és az antitest-aktivitást 10⁷-szeres hígításig megvizsgáljuk. A megfelelő klón sejt-tenyészet felülúszó esetében antitest aktivitás 10⁴-szeres hígításig figyelhető meg, ugyanakkor az ascites-képződés (ascitizáció) az antitest aktivitás kb. 1000-szeres növekedéséhez vezet.

8. példa

Monoklönáiis antitest tisztítás

Kiindulási anyagként 4 ml, a 7. példa szerint kapott ascitikus folyadékot haszná8 lünk és a monoklonális anti-lest tisztítást

Slaeelin és társai módszerével végezzük el [Journal of Biological Chemistry 256, 9750 (1981)). Az ascitikus folyadékot a ribrinszerü anyagok eltávolítása céljából előbb 10.000 fordulni/perc sebességgel 15 percen át centrifugáljuk, majd foszfát-só pufferrel (PBS: 8,1 mM NalkPOt, 1,5 mM KH2PO1,

2,7 mM KCl, 137 mM NaCl; pH 7,2) olyan koncentrál; ióra hígítjuk, iiogy az ultraibolya abszorbció 280 nm-nél (Azsa) 12 és 14 közötti érték Ingyen. A hígított mintához telített, vizes ammóniuni-szulfál-oldatol. adva a szulfátkoncentrációt -17%-ra állítjuk be. Az elegyet 1 °C-on 60 percen át keverve elvégezzük a kisózást, majd centrifugáljuk (10.000 fordu55 lat/perc, 15 perc). A kapott csapadékot 50 mmól nátrium-kloridot tartalmazó 20 mmól trisz-pufferben (pH = 7,9) oldjuk és 2 liter fenti pufferrel szemben dializáljuk. 2 óra múlva a dializáló oldaloL ugyanezen összetéθθ Lolli oldat friss 2 literes mennyiségével lecseréljük és a dialízist további 15 órán át folytatjuk. Λ kiváló csapadékot centrifugálússal (10.000 fordulal/perc, 15 perc) eltávolítjuk és a felülúszót olyan koncentrációra

-714 állítjuk be, hogy az A2ao 20—30 közötti érték legyen.

A mintát 50 mmól nátrium-kloridot tartalmazó megfelelő mennyiségű trisz-pufferrel (pH = 7,9) egyensúlyba hozott DEAE-cellulóz oszlopon (8 ml, Wattman DE52) frakcionáljuk; az eluálást 50 minői nátrium-kloridot tartalmazó trisz-pufferrel, 1,5 níl/perc átfolyási sebességgel végezzük el. A fenti körülmények között antitest aktivitást főként a ki- 10 folyó frakciókban tapasztalunk. A SDS-PAGE-módszerrel [Laemlie és társai: Natúré 227,

680 11970)1 igazoljuk, hogy a tisztitott minta ténylegesen az antitest.

4.

Az auimóniuin-sziilfátos kisó/ással és DEAE-cellulóz frakcionálással kapott frakciók közül néhányat 2-inerkapto-elanollal redukálunk, majd 17%-os SOS gél-elektroforézisnek 5 vetünk alá 24 órán át 30 volt feszültség mellett. Az antitest aktivitás csúcsoknak megfelelően két sávot tapasztalunk, a kb. 55 kilodalton (II lánc) és kb. 28 kilodalton IL lánc) molekulatömegeknek megfelelő helyzetekben. Az ily módon tisztitott antitest frakció 17 IFN-X-megkötó kapacitásának meghatározása céljából IFN-}í-t adunk hozzá (2200 U/ml). Azt találtuk, hogy az IFN-^ kb. 50%-a az antitesthez kötődik (4. táblázat).

táblázat

Minta			Hígítás Maradék IFN aktivitás
				(U/ml)
X2-11.1 frakció 17			10-¹	1100
			10-²	1100
			ΙΟ'³	2200
			ΙΟ*⁴	2200
Anti-IgE monoklonális
antitest			10-¹	2200
			io-^z	2200
			ΙΟ'³	2200
			ΙΟ'⁴	2200
9. példa			35 antitesteket	(Miles) alkalmazva úgy, hogy
			olyan IgG	al-osztály legyen azonosítható,
Al-osztály, amelyhez a monoklonális	an-	amelyhez ^2	-11.1 monoklonális antitestek tar-
ti tes tek tartoznak			toz hatnak. A monoklonális antitest és a kecs-
			ke anti-egér IgG2b antitest között egyetlen
Tisztított antitest	frakciót (17 jelű)	(8.	40 különálló sáv található, mig a monoklonális
példa) 10-szeresére hígítunk és agaron	im-	antitest és	a többi anti-anti-test között nem
muno-kicsapásos reakciónak vetjük	alá	figyelhető meg sávképződés. Ennek megfele-
(Ouchterlony teszt: Imiuunological Methods,	lóén a monoklonális antitest az IgG2b-hez
Gel-Diffusion Techniques, Blackwell, Oxford,	tartozik (5.	táblázat).
1964) kecske anti-egér	IgGl, G2a, G2b cs	G3	45

5. táblázat

Monoklonikus antitest al-osztály

Antigén	Anti-test	Kicsapásos görbe
Találmányunk szerinti monoklonális anti-test (Frakció 17)	Anti-IgGl
	Anti-IgG2a	-
-	Anti-IgG2b	+
-	Anti-IgG3	-

-816

10. példa

Λ 8. példa szerinLi eljárással tisztított kifolyó frakciókból 25 ml (65,3 mg) monoklonális antitestet egy éjjelen át 0,1 mólos nátrium-hidrogén-karbonáttal szemben (pH = = 8,3) dializálunk. Külön lombikban 25 ml AFFl-GEL 10-et. (Bio-Rad) vízzel alaposan mosunk, üvegszűrő felhasználásával, 0,1 mólos nátrium-hid fogén-karbonát-oldatban szuszpendálva (pH = 8,3) és a .fenti anti-testtel összekeverjük. Az elegyet 4 órán át 4 °C-on a reakció lejátszatása céljából enyhén keverjük, majd 4 “C-on egy éjjelen ét állni hagyjuk. Az AFFI-GEL 10-t 0,1 mólos nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal (pH = 8,3) üvegszüró alkalmazásával alaposan mossuk. A gélhez 25 ml, 0,1 mól eüanol-amint és 0,15 mól nátrium-kloridot tartalmazó oldatot (pH = 8,0) adunk. Az elegyet 4 °C-on egy órán át rázatjuk a még visszamaradó reagálatlan aktiv csoportok blokkolása céljából. A gélt ezután PBS-el alaposan mossuk és 25 ml, 0,1% nátriuni-azidot tartalmazó PBS-ben (0,01 mól/liter foszfát nálríum-kloridban, 8,5 g/1, pH = 7,0) szuszpendáljuk. A szuszpenziót 4 °C-on tároljuk. A hozzáadott antitest és a szűrletben levő antitest mennyisége alapján azt találtuk, hogy az anLitest 2,35 mg/ml gél arányban kötődik a gélhez. Antitest oszlopként az ily módon kapott reakciótermékkel töltött oszlopot alkalmazunk.

II. példa

Az rlFN-·)! termeléshez E. coli RRI törzset alkalmazunk [pRK148cIts' pRC231/IFI900J (e rekombináns organizmus szerkezetét a 99 084 sz. európai szabadalmi leírásban ismertették). A pRK248cIts és pRC231/IFl-900 plazmidok hőmérsékletre érzékeny Lambda-represszort és IFN-)) géneket tartalmaznak. Az rIFN-)( gének kifejezésre juttatása a Pl promoterrel való szabályozás alatt történik.

Λζ E. coli RRl törzs (pRK248clta, PRC231/IFI-900J eg.v éjszakás tenyészetét LB táptalajon 30 °C-on tenyésztjük. Az egyéjszakás tenyészet 1 literét kazamino-savakat tartalmazó minimális M-9 táptalajjal 10 literre hígítjuk. A .kazamino-savak * kazein hidrolízisével nyert, a mikrobiológiában felhasznált aniinosav-keverékek. Λ .minimális M-9 táptalaj ugyancsak a mikrobiológiában használatos táptalaj, amelynek összetétele a következő: dinátrium-hidrogén-foszfát 6 g/1; kálium-dihidrogén-foszfát 3 g/1; nátrium-klorid 0,5 g/1; ammónium-klorid 1 g/1; 1 mól/liter koncentrációjú magnézium-szulfát-oldat inl/1; 1 mól/liter koncentrációjú kulciumklorid-oldal 0,1 inl/1; 20%-os glükóz-oldat 0,1 nd/1; pH = 7,4. Logaritmikus növekedése mellett a tenyészet hőmérsékletét 30 °C-ról 42 °C-ra növeljük, majd a tenyésztést 42 °C-on 2-3 órán át folytatjuk. A baktériumokat centrifugálással összegyűjtjük és a baktérium-tartalmú labdacsokat felhasználásig -20 °C-on tároljuk. A fermentáció és a feldolgozás minden műveletét a National Instilutes of Health rekombináns DNS irányelveivel összhangban végezzük el.

Az rlFN-if szintetikus 131-146. C-terminális peptidjeinek monoklonális anlilesljeit a fenti módszerrel készítjük el. Az rlFN-y tisztítására Mo χΖ—11.1 monoklonális antitestet alkalmazunk. A monoklonális antitest-oszlopot a 10. példában leírtak szerint készítjük el.

Az rIFN-χ ^1,C-jód-ecetsavval történő karboximetilezését 6 mól guanidin-hidroklorid jelenlétében, a (3) irodalmi helyen leírtak szerint hajtjuk végre. Λ reagens fölöslegét C-8 fordított fázisú oszlopon történő nagynyomású folyadékkromatografélással távolítjuk el. A karboxipeptizádos bontási 0,2 mólos ainmónium-hidrogén-karbonát-oldatban a (4) irodalmi helyen leírtak szerint végezzük el.

A rlFN-y CNBr-el történő kezelését (inetioninhoz viszonyítva 100-szoros moláris fölösleg) 70%-os hangyasavban az (5) irodalmi helyen leírtak szerint végezzük el. A CNBr peptideket C-18 fordított fázisú oszlopon nagynyomású folyadékkromatografálással választjuk el. A peptid eluálását 0 és 70% közötti mennyiségű metii-ciánidot tartalmazó trifluor-ecetsav elegyek kel lineáris grádiens szerint végezzük el.

A fehérje vagy peptid mintákat lezárt, nitrogénnel öbliteLt, evakuált csövekben, 4% tioglikolsaval tartalmazó állandó forrásban levő sósavban 20-24 órán át hidrolizáljuk. Az aminosavanalízisl a (6) irodalmi helyen leírtak szerint fluoreszcamin aminosav-analizátorban hajtjuk végre.

A karboximetilezett fehérjék szekvencia analíziséhez a (7) irodalmi helyen leírtak szerint ABI (Applied Biosystem Inc.) gázfázisú szekvenciátort (47OA) alkalmazunk. A PTH-aminosavak mintáit a (8) irodalmi helyen leírtak szerint ultraszférikus ODS oszlopon fordított-fázisú nagynyomású folyadékkromaLográfiával azonosítjuk.

Valamennyi tisztítási lépést 4 '’C-os hőmérsékleten végezzük el. 25 g fagyasztott sejtet háromszoros mennyiségű (75 ml) 7 mól/lileres guanidin-lddrokloridban szuszpendálunk (pH = 7), Az elegyet 1 órán át keverjük, majd 1 órán keresztül 30.000 g sebességgel centrifugáljuk. A felül elhelyezkedő folyadékot tízszeres mennyiségű, Dulbecco-féle foszfáttal pufferolt konyhasó-oldattal (PBS) vagy 0,15 mólos nátrium-borát-pufferrel (pH = 9,5) hígítjuk, majd 30 percen keresztül 30.000 g sebességgel centrifugáljuk. Eljárhatunk oly módon is, hogy 25 g fagyasztott sejtet másfélszeres térfogatú (37,5 ml) 0,15 mólos nátrium-borát-pufferben (pH = 9,5) szuszpenálunk és 1 órán át keverünk. Az elegyet 30-30 mp-ig 5 ízben szonifikáljuk, majd 30.000 g sebességgel 1 órán át centrifugáljuk.

-918

A guanidin-hidrokloridos extrakcióból vagy szonifikációból származó, felül elhelyezkedő folyadékot forgó rázató gépen 25 ml kovasavval 1 órán át keverjük, majd PBS-el előmossuk. Az elegyet oszlopra visszük fel és az oszlopot összesen 20-30 oszloptérfogatnyi 1 mólos nátrium-klorid-oldattal mossuk. Az oszlopot 0,5 mól tetrametil-ammónium-kloridot tartalmazó 0,01 mólos nátrium-borát-pufferrel (pH = 8) eluáljuk. Az interferont kb. 200 ml oldószerrel eluáljuk és 4 részre osztjuk. Minden részletet PBS-el egyensúlyba hozott monoklonális anti-test (k2- 11.1) affinitás oszlopra viszünk fel (4 ml ágytérfogat).

Az oszlopot 10 oszloptérfogatnyi PBSpufferrel mossuk, majd 1 mólos guanidin-hidrokloriddal vagy 50%-os etilénglikollal [amely 1 mól nátrium-klorídot és 20 mmól nátrium-foszfát puffért (pH = 7,0) tartalmaz] eluáljuk. Az interferont az első 20 ml-el eluáljuk.

Az SDS-PAGE elvégzése Laemmli módszerével történik (9. irodalmi hely). A fehérjét fluoreszcamin analízissel határozzuk meg, referens standardként kristályos marha-szérum-albumint alkalmazunk. Az interferon aktivitást a (10) irodalmi helyen leírt módon, vesicularis stomatitis vírus és humán WISH sejtek felhasználásával, a citopatikus hatás inhibiciós assay segítségével határozzuk meg. Az összes interferon titert a részlegesen tisztított humán immun interferon referencia standardhoz viszonyítva, referens egység/ml formájában fejezzük ki.

Az extrakciós tisztítási műveleteket a 6. táblázatban foglaljuk össze. Az össz-kitermelés 25-32% és a tisztítás mértéke 100-769-szoros, az átlagos fajlagos aktivitás 1 χ 10⁷ egység/mg. Az rIFN-ϊ őssz-kitermelése a guanidines extrakció esetében 3-4szer nagyobb. A tisztítási műveletek utolsó lépésének SDS-PAGE diagramját az 1. ábrán mutatjuk be. A guanidines. extrakcióval tisztított termék kb. 18.000 daltonnál (18K rIFN-κ) egyetlen sávot mutat, míg a szonifikációs eljárás esetében kb. 15.000 daltonnái (15K rlFN-jf) egy fősáv és kb. 17.000 daltonnál (l.A ábra) egy melléksáv jelentkezik. Nem-redukáló gélen a rIFN-ϊ dimerjei és oligomerjei is képződnek (l.B ábra).

A 18K rIFN-3 homogén és aminosav-öszszetétele a DNS szekvencia alapján várható összetételnek felel meg. A 15K és 18K rlFN-jf aminosav-ősszetótelét a 7. táblázatban tüntetjük fel. Automata gázfázisú fehérje/peptid szekvencia meghatározó készülékben néhány száz pikomól redukált és karboximetilezett 15K és 18K fehérje Edman-bomlést szenved. A 15K illetve 18K fehérjék első 32 és 26 maradékának aminosav-N-terminális szekvenciái a DNS szekvencia alapján vártnak felelnek meg (2. ábra). A szekvencia analízis első és harmadik ciklusában ¹⁴C-karboximetilezett ciszteineket mutattunk ki. N-terminális metionint nem mutattunk ki.

A 18K és 15K rlFN-^ N-terminális szekvencia analízise azt mutatja, hogy mindkét fehérje esetében e tartományok szekvenciája a DNS szekvencia alapján, várttal azonos. A fenti tartományban fellépő esetleges kiesések vagy változások meghatározása céljából a C-terminális peptideket is jellemezzük. A karboxipeptidáz A (CPA) által megbontott elegy aminosav analízise azt mutatja, hogy a 18K rlFN-Tj-ból szerin és/vagy glutamin (C-terminális aminosavak) szabadul(nak) fel, ugyanakkor azonban azonos körülmények között a CPA a 15K rlFN-^-t nem bontja. Minthogy a Ser-Gin képezi a rlFN-? C-terminális szekvenciáját, a 18K species intakt C-terminust tartalmaz, míg a 15K species esetében a C-terminális maradék (Lys) ettől eltérő és CPA nem bontja.

A DNS-szekvencia alapján várható C-terminális maradékok további bizonyítása céljából a C-terminális peptideket CNBr-es kezelés után analízisnek és szekvencia-meghatározásnak vetjük alá. A C-terminális peptideket C18 fordított-fázisú oszlopon nagynyomású folyadékkromatográfiával választjuk szét (3. ábra). A 15K rlFN-u esetében a gradiens korai részéből eluálva erős peptid csúcsot (II. csúcs) nyerünk és ez a peptid a 18K rIFN-ϊ CNBr-el történő megbontása után kapott keverékben nincs jelen. A fenti peptid aminosav-analizis alapján homoszerint vagy homoszerin-laktont nem tartalmaz . és ezért a 15K fehérje C-terminális CNBr peptidjének tekintendő. A fenti fehérje aminosav-anallzis alapján (8. táblázat) az IFN—χ 121-131 sz. aminosav-maradó kának felel meg (arginin nem mutatható ki). A 11 aminosav szekvenciáját szekvencia-analízissel igazoljuk (2. ábra). A 18K rlFN-^.. esetében az eluálás korai részében viszonylag széles csúcsot kapunk, amelyet sekély gradienssel két csúcsra választunk szét.

Az aminosav analízis azt mutatja, hogy az első csúcs a 18K fehérje CNBr C-terminális peptidje (8. táblázat) és az aminosav-öszszetétel a 138-146. aroinosav-maradéknak felel meg. A 9 aminosav szekvenciáját szekvencia-meghatározással igazoljuk (2. ábra).

A 15K fehérje C-terminális aminosava a meghatározás alapján lizin.

A fenti eredmények igazolják, hogy a 18K fajta az érintetlen rlFN-? molekula, mig a 15K fajta a proteolitikus termék. A 131 sz. aminosav és a 132 sz. aminosav maradékai közötti peptid kötést (Lys-Arg) a 15K fajtán hasítjuk el.

12. példa

Az immun interferon 15K fragmensét a más fragraenseket (pl. a 17K fragmensét) tar11

-1020 talmazó keverékből az alábbi, további eljárásokkal homogenitásig tisztítjuk. Monoklonális antitest affinitás oszlopon tisztított szonifikációs felülúszót (fehérje 10,3 mg; fajlagos. aktivitás 0,9 x 10⁶ E/mg (SDS-PAGE gél elek- 5 troforézissel) 16 oszlop gél; akrilamid

12,5 sűly%; SDS 0,1%; vastagság 3-5 mm) tovább tisztítunk. A gél egy részét előbb Coomassie Brilliant Blue R-250 színezékkel megfestjük, majd 10% ecetsavat tartalmazó ff.

táblázat rlF'N-y tisztítása

15%-os metanollal szinteleniljük. gélen levő

15K sávokat a többi rész mellől kivágjuk, öszszetöl'jük ós 0,1%-os SDS-ben 4 °C-on két napon át keverjük.

Az oldatot szűrőpapíron átszűrjük. A szűrletet liofilizáljuk, majd 6 térfogat etanollal egyesítjük. Λ kiváló csapadékot 0,1% SDS-ben oldva a homogén 15K monomer komponens oldalát kapjuk (fehérje 1,1 mg; fajlagos aktivitás 0,3 x 10⁶ E/mg).

Tisztítási	Ossz-	Teljes	Fajlagos	Tisz-	Kitér-
lépés	fehérje	aktivitás	aktivitás	títés	melés
	mg	egység	egység/mg	-szoros	%
	I. Guanidines	extrakció
Felülúszó	2.806	2.5 x 10«	9 x 10’		100
Kovasav	98	1.0 x 10«	1 x 10«	11	40
Monoklonális
antitest	8	0.8 x 10«	1 x 10'	110	32

II. Szonifikáció

Felülúszó	6.136	8.0	x 10^;	1.3 x	10'	-	100
Kovasav	87	4.5	x 10⁷	5.2 x	10«	400	56
Monokonális
antitest	2	2.0	x 10’	1.0 x	10’	769	25

7. táblázat 8. táblázat

A 15K és 18K ríFN-Tj aminosav-összetétele (maradék-számok) 40 ^{A <;s} 18K CNBr C-terminális peptidjei

	18K (1-146)	15K (1-131)	15K	18K
Asp	20.9 (201	19.9 (20)		Thr	0,9 (1)
Thr	5.1 (5)	4,9 (5)	45	Ser	1,1 (1) 0,84	(1)
Ser	9.8 (11)	6.7 (9)		Glu	1,1 (1) 1,1	(1)
Glu	18.5 (18)	15.1 (16)		Pro	* (1)
Pro	* (2,	* (2)		Gly	1,5 (1) 1,3	(1)
Gly	5.9 (51	5.6 (4)		Ala	2,4 (3! 1,1	(L)
Ala	8.2 (8)	7.3 (7)	50	Leu	1,0 (1) 1,1	(1)
Cys	* (2)	* (2)·		Phe	1,0	(1)
Val	9.1 (8)	9.1 (8)		bys	1,9 (2) 2,8	(3)
Met	4.8 (4)	3.8 (3)		Helyzetek a
Ile	7.2 (7)	6.6 (7.)		szekvenciában	121-131 138-	146
l.eu	10.5 (10)	9.6 (9)	55
T.vr	5.5 (5)	4.8 (5)		A zárójelben le	vő számok a DNS s	zek vencia
Phe	10.3 (10)	8.2 (9)		várható maradékok számát jelentik.
His	1.8 (2)	2.5 (2)
bys	19.9 (20)	16.9 (19)		*az értékeket nem határoztuk meg.
Arg	8.6 (8)	5.6 (3)	60	Λ leírásban szereplő irodalmi utalásokat
Trp	* (1)	* (1)		az alábbiakban	részletezzük;
A zárójelben levő számok	a DNS szekvencia		I. Cray, P.W.,	, el al., Natúré 295	', 503-508
alapján	várható maradékok	számát jelzi.		(1982)
'az értékeket nem határoztuk meg.	65

-1122

2. Slahelin, T., et al., J. Bioi. Chem. 256, 9750-9754 (1981)

3. Allén, G., Sequencing of Protein and

Peptides, pp. 30-31 (1981), Norlh-Holland Publishing Co., Amsterdam, New 5 York

4. Amber, R.P., Methods in Enzymology 11, 436-445 (1967)

5. Wolfe, R.A. and Stein, S., Modern Methods in Pharniaeology, pp. 55-77/1982, 10

Alán R, Liss, Inc. New York, NY.

6. Stein, S. and Brink, L. Methods in Enzymology, 79, 20-25 (1981)

7. Hewick, R.M., Ilunkapillar, M.W., llodd,

L.E. and Dreyer, W.I., J. Hiol. Chem. 256, 7990-7997 (1981)

8. Hawke, D., Yuan, P-M., and Shively, J-E. Anal. Biochem. 120, 302-311 (1982)

9. Laemmli, U.K., Natúré 227, 680-685 (1970) 10.. Rubínsleín, S., Fainilletti, P.C. and Pestka, S., J. Viroi. 37, 755-758 (1981)

11. Capon. D.J., Leung, D.W., llitzenian, R.A., Perry, L.J., Kohl·. W.J., Cray, P.W., Dérynék, R., and Goeddel, D.V., The Third aunual International Congress Tor Interferon Research, Miami, Fia. ( 1982).

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás

Cys Tyr Cys Gin Asp Pro Tyr Val Lys Glu Alá Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Alá Gly His Ser Asp Val Alá Asp Asn Gly Thr Len Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gin Ser Gin Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gin Ser Ile Gin Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met ' Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gin Arg Lys Alá Ile llis Glu Leu Ile Gin Val Met Alá Glu Leu Ser Pro Alá Alá Lys Thr Gly Lys

aminosav-szekvenciával rendelkező - mely szekvencia az amino-végcsoporton adott esetben további metionin-maradékot tartalmazhat más peptidektől mentes és a gamma-interferonnal lényegében azonos aktivitású polipeptid előállítására immun interferont tartalmazó transzformált mikroorganizmusok sejtjeinek felszakítása, majd extrakciója és a kapott extraktum tisztítása útján, azzal jellemezve, hogy az immun interferont tartalmazó transzformált mikroorganizmusokat proteáz-inhibitor távollétében extraháljuk és a kapott extraktumot monoklonális antitestek Felhasználásával tisztítjuk.

35

2. Λζ 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtek felszakitását szoriifikáció útján végezzük el.

3. Eljárás gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy aa 1. igétiy40 pont szerinti eljárással előállított

Cys Tyr Cys Gin Asp Pro Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Val Alá Asp Asn Gly Thr Lys Asn Trp Lys Glu Glu Gin Ser Gin Ile Val Ser Lys Asn Phe Lys Asp Asp Val Glu Thr He Lys Glu Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Gin Arg Lys A la Ile His Alá Glu Leu Ser Pro Alá

Tyr Val Lys Glu Alá Glu Asn Alá Gly His Ser Asi> Leu Phe Leu Gly Ile Leu Ser Asp Arg Lys Ile Mel. Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Gin Sor Ile Gin Lys Ser Asp Met Asn Val Lys Phe Lys Arg Asp Asp Phe Glu Val Thr Asp Leu Asn Val Glu Leu Ile Gin Val Met Alá Lys Thr Gly Lys

aminosav-szekvenciával rendelkező - mely szekvencia az amino-végcsoporton adott esetben további metionin-maradékot tártál- 55 mázhat -, más peptidektől mentes és a gamma-interferonnal lényegében azonos aktivitású polipeptidet gyógyászatilag alkalmas inért hordozóanyagokkal összekeverjük.