JPS6163697A - 均質免疫インタフエロン断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、下記の式に示すアミノ酸配列を有し、場合に
より該配列はそのアミノ末端にさらにメチオニン残基を
含んでいてもよく、他のペプチドを本質的に含有せず、
実質的にガンマ−インターフェロンと同じ活性を有する
ポリペプチド、およびそのようなポリペプチドを含む医
薬品組成物に関する。

Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｐ：ｏ　Ｔ
ｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　ＧｌｕＡｓｉ
　（、ｅｕ　ｌ：、ｙｓ乙ｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓ
ｒＩＡｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　ＡＳＰＶａｌ　
Ａｌａ　Ａｓｐ　ＡＳｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈ：　Ｌｅｕ　Ｆ
’ｈａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　工１ｅ　ＬｅｕＬｙｓ　Ａｓ
ｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ
　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　ＭｅｔＧｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇ
ｌｎ　ＩＩｓ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈ
ｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　ＰｈｅＬｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　
Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｒ＞　Ｓｅｃ　Ｉｌｅ　
Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　５ｅｒＶａｌ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｚ　
　ｒｌｅ　　［、ｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｐ　　Ｍｅｔ
　　Ａｓｎ　　Ｖａｌ　　乙ｙｓ　　ＰｈｅＰｈｅＡｓ
ｎ　Ｓｅｘ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｒｑ
　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　ＧｌｕＬｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔ
ｈｚ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅ：　Ｖａｌ　Ｔｈｚ　Ａｓ
ｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　ＶａｌＧｌｎ　Ａｒｑ　Ｌｙｓ　
Ａｌａ　ｒｌｅ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｚｌｅ　Ｇ
ｌｎ　Ｖａｌ　ＭｅｔＡｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ
：Ｐｚｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇａｙ　
Ｌｙｓ本発明はさらに、ガンマーインタフエロンＩＦＮ
−γ）を発現することの出来る形質転換微生物より、上
述のポリペプチドを調製する方法に関する。本調製方法
は形質転換株の細胞を、例えば＆波破砕または化学的溶
菌により破壊した後、プロテア−げ阻害剤非存在下で抽
出し、免疫インタフエロンに対するモノクローナル抗体
を用いて抽出物より精製することより成る。

インタフエロンとして知られる抗ウイルス性たん白質群
の抽出および精製を行なうためのいろいろな方法が今ま
でに考案されている。現在、インタフ１０ンには三種の
主要グループが知られている：ＩＦＮ−α（白血球イン
タフ１０ン）、ＩＦＮ−β（線維芽細胞インタフエロン
）およびＩＦＮ−γ（免疫インタフエロン）である。こ
れらのインターフロン群は、抗ウイルス性、増殖阻害活
性あるいは構造配列の点から類似しているが、これら全
ての群のインタフ１０ンを抽出、精製する統一的な方法
は確立されていない。実際に、白組混合物より抽出し、
精製するのに有効な方法の多くは同類の粗混合物より線
雑芽綱胞インタフエロンまたは免疫インタフエロンを抽
出、精製することは出来ない。

従来知られる精製工程での抽出は、多くの場合組換え技
術を用いて目的の“異種たん白″を生産した微生物を、
機械的（例えば音波破砕）或いは化学的溶菌にて破壊す
るのが典型である。このような物理的または化学的溶菌
の操作中に種々の細胞内プロテアーゼもまた混合物中に
放出される。

これらのプロテアーゼはそこで自由に“異種たん白″に
酵素的に作用し、これを分解してしまう。

ざらに、免疫インタフエロンのあるアミノ酸配列は抗ウ
ィルス活性に必須ではないことが報告されている。例え
ば、Ｃａｐｏｎら（参考文献１））は、γＩＦＮ−γの
第１３６から１４６番目のアミノ酸は抗ウィルス活性に
必須ではないと報告した。

望ましい　体制に関する記載 現在、免疫インタフエロンの場合には、先行技および精
製でも、天然の、或いは完全なアミノ酸配列を有する完
全に均質な免疫インタフエロン調製物を得ることが出来
ないことが明かとなっている。ごく最近になってはじめ
て、組換え技術の進歩によりγＩＦＮ−γの性質を研究
し、そのアミノ酸配列を決定するのに十分な但を得るこ
とが可能となった。従来の慣行技術を用いてγＩ　ＦＮ
−γを抽出し、精製物のアミノ酸配列を決定すると、精
゛製標品が異なる分子量を有する種々の関連たん０種よ
り成ることが実際に発見された。ざらに、アミノ酸配列
決定により、これらのたん０種は実際には天然の配列を
有するたん白のたん自分前断片を↑休とした混合物とし
ての免疫インタフエロンの天然配列型であることが発見
された。驚くことに、上述の混合物が天然の免疫インタ
フエロンたん白とその断片を含有するにも向わらず、こ
の混合物の成分は明かに生物活性を保持していることが
発見された。

ヒトγＩＦＮ−γを生産し、含有している形質転換微生
物からこのたん白質を抽出するには、音波処理または物
理的溶菌を用いて容易にかつ有効に行なうことが出来る
。しかし、抽出過程でγＩＦＮ−γはプロテアーピによ
り分解されると考えられる。凍結細胞を音波処理すると
、例えば１５にγＩＦＮ−γ（分子量がおよそ１５００
０ダルトンで本発明の化合物）のようなたん自分前産物
の混合物が得られる。この１５にγＩ　ＦＮ−γは１３
２番目から１４６番目までのＣ末端アミノ酸残基が除去
されたものである。この１５にγＩＦＮ−γは精製後に
は他のたん自分前断片を含まず、完全な１８にγＩＦＮ
−γたん白（１０７単位／ＩＩｒｇ）と同じ、また天然
型均質ヒト免疫インタフエロン（参考文献７）と匹敵す
る生物活性を示した。１５にたん白のアミノ酸組成およ
びＮ末端配列はＤＮＡ配列から考えられるものと一致し
た。１５にγＩＦＮ−γのアミノ酸および対応するＤＮ
Ａ配列は完全な免疫インタフエロンたん白質のアミノ酸
および対応するＤＮＡ配列と共に第２図に示す。本明細
書を通して使用している完全な１８にヒトγＩＦＮ−γ
のＤＮＡ塩基配列は参考文献１に記載される。

抽出方法により、異な−）だ分子ｆｉ　（ＭＷ）種（約
１５，０００〜ｉｓ、ｏｏｏダルトン）の７１ＦＮ−γ
が精製して得られる。グアニジン抽出によってはドデシ
ル硫酸ブトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動での
見かけの分子量１８．０００ダルトンの精製インタフエ
ロンが得られた。１しかしグアニジンの非存在下で音波
処理によってはより低分子の１５．ＯＯＯＭＷ種の免疫
インタフエロンが選択的に抽出される。１８におよび１
５にたん白質のアミノ末端配列は両者とも、ヒト免疫イ
ンタフ１０ンたん白をコードするＤＮＡから予想される
配列と一致した。免疫インフッ１０ンたん白のアミノ末
端は第２図に示すようにシスティン（Ｃｙｓ）と異なっ
てさらにアミノ末端アミノ酸としてメチオニン（Ｍｅｔ
）残基が付加して始まることも出来るという事も本発明
の範囲である。

１８におよび１５にたん白質のＣ−末端配列はＣＮ　ｒ
Ａγ帆理禮精製したＣ−末端ペプチドを分析して配列決
定された。１８にγＩＦＮ−γから遊離するＣ−末端ペ
プチドのアミノ酸組成および配列はγＩＦＮ−γの予想
される配列と合致し、この事は１８に分子種が天然分子
であることを示している。一方、他のＣＮＢγ分解ペプ
チドが１５にγＩＦＮ−γのＣ末端からＴｉ離しｌ〔。

アミノ酸および配列分析の結果から１．この異なるペプ
チドは第１２１番目から第１３１番目のアミノ酸残基に
対応し、従って１５に分子種はたん自分前産物であるこ
とがわかった。

本発明の好ましい実施態様においては、醗酵工程および
特に記載しない限り、受容菌として用いた微生物はＥｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉに一１２２９４株であり
、本菌は１９７８年１０月２８日付けでΔｍｅｒｉｃａ
ｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒ１３　Ｃｏ１）ｅｃｔｉｏ
ｎにＡＴＣＣＮＱ３１４４６として寄託され、英国特許
公報用２０５５３８２Ａに記載されている。さらに、こ
こに含まれる全ての紺換えＤＮＡ実験はＮＩＨ（Ｎａｔ
ｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔ
ｈ　）の該当するガイドラインに基づいて行なわれた。

しかしながら本発明は、上述のＥ、ｃｏｌｉ　　Ｋ−１
２２９４沫のみでなく、他の同等なＥ、ｃｏｌｉ菌株、
例えばＥ、Ｃ０１ｉ　　ＭＡ　２１０またはＥ、ｃｏｌ
ｉ　　ＲＲ１（△ｒｃｃＮα３１３４３）、或いはその
他の一般に人手可能なまたはＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐ
ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌ　ｆａｃｔｉｏｎ　（例えば
ＡＴＣＣカタログ参照）などの定評のある微生物寄託顆
間に寄託され、またそこから人手可能な多くの微生物を
使用することをも含んでいる。

本明細出で用いる“インタフエロン活性”という詔はイ
ンタフ１０ンに特有の抗ウイルス性および抗生前活性を
指す。γＩＦＮの特有の抗ウィルス活性は、Ｐ、Ｃ，Ｆ
ａｍｉｌｌｅｔｔｉらがＨｅｔｈＯｄＳ　ｉｎＥｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ　７８巻、３８７頁（１９８１年）に記載
している細胞Ｒ性阻害試験を用いて測定される。γＩＦ
Ｎの特有の抗生前活性はＥｖｉｎｇｅｒおよびＰ　ｅ　
ｓ　ｔ　ｋ　ａによりＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　［：ｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ７９巻、４５頁（１９８１年）に記載さ
れた方法を用いて測定される。

モノクローナル抗体はγＩＦＮ−γのＣ末端ペプチドの
最後の１６アミノ酸残塁を含む合成ポリペプチドに対し
て作成された。モノクローナル抗体の一つ（Ｎｏγ２−
１）．１）がγＩ　ＦＮ−ｒの精製に用いられた。より
詳細には、本発明のモノクローナル抗体および抗体アフ
イニテイ力ラムはコーＯツバ特許出願第１０３　８９８
号に記載された方法で調製された。

本発明によれば、上述の新規免疫インタフＴロンは他の
既知インタフエロン類と同じに例えばウィルス性または
腫瘍性疾患の治療または予防、或いは免疫抑制状態の治
療の目的に使用できる。本インクフエＯンは医薬的に容
認できる経口、注射または局部用組成物および仕様で投
与できる。投与量および投与回数は現在臨床に用いられ
ている既知のインタフエロンと対応して、典型的には毎
日１−２００ｘ１０６単位、でよい。本発明の医薬組成
物は該免疫インタフエロンと医薬的に容認される担体物
質と混ぜて含有する。従来のいかなる担体物質も利用で
きる。担体物質は、内服、経皮或いは非経口投与に適し
た有機または無機の不活性担体物質である。適当な担体
としては、水、ピラチン、アラビアゴム、乳糖、でん粉
、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物性油脂、ポ
リアルＶレンゲリコール、ワセリンなどが含まれる。

さらに、医薬調製物は他の医薬活性物質を含有すること
乙ある。香料、保存剤、安定剤、乳化剤、経衝剤などの
添加物も医薬品の慣行として容認される限り添加するこ
ともある。

医薬調製物は従来の如何なる形体にも作成され得る。例
えば二〇）錠剤、カプセル、丸薬、粉末、粒剤なとの経
口投与用の固体；ｂ）溶液、シロップ剤、け／υ濁液、
チンＶなど経口投与用の液体；Ｃ）滅菌溶液、けん濁液
、または乳化液のような注射用；ｄ５よびｄ）溶液、け
ん濁液、炊合、クリーム、ゲル、微ぢ）末、エアゾール
などの局部投与用などである。医薬調製物は滅菌される
こともあり、そして／または、保存剤、安定剤、澗潤剤
、乳化剤、浸透圧調節用の塩類および／または緩衝液な
どの補薬を含むこともある。

きるような浸剤または注射溶液である。これらの剤型も
他の医薬活性物質を含有することができる。

保存剤、安定剤、乳化剤、緩衝液などの添加剤も医薬品
の慣行として容認される限り添加できる。

例　　１ 抗原として使用する担体たん白−ポリペプチド複合体の
合成 ）（−Ｌ　Ｓ　Ｖ　−Ａ　ｒ　ｇ−Ｌ　ｙＳ　−Ａ　ｒ
”　ｇ−Ｓ　ｅ　ｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ
−Ａｒｇ−ＧＩＶ−ＡｒＱ−ＡｒＣｌ−Ａｌａ−３ｅｒ
−Ｇ　’　ｒ　　ＯＨナルホ’Ｊペプチドを５ｃｉｅｎ
ｃｅ　１４４巻、１３３４頁（１９６４年）に記載のＧ
ＯＯｄ　−ｆｒｉｅｎｄらの方法によりチログロブリン
（以下ＴＧと略称）とカップルさせた。

ペプチド自体は従来より知られるペプチド合成法により
合成される。同相法および液相法のいずれも使用できる
が、多くの場合液相合成法の方が有利である。そのよう
なペプチド合成法は例えば、”Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ
ｓ”第１巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ［！
ＷＬ　Ｌｌ　’ｏ　ｋ　ｅに、上り、”Ｐｅｐｔｉｄｅ
　５ｙｎｔｈｅｓｅｓ　　（ペプチド合成）°°（丸首
書店、東京、１９７５年）中で泉谷らにより、或いは”
ＥＸｐｅｒ’ｉｍｅｎｔＳ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｃｍｉ−
ｓｔｒｙ　（生化学実験講座）″第１巻、２０７−４０
０頁（東京化学同人、１９７７年）で矢島冶明（Ｊより
記載されており、アジド法、塩化法、無水酸法、混合無
水酸法、ＤＣＣ法、活性エステル法、ウラドウオード試
ｆｆ１Ｋを使用する方法、カルボジイミダゾール法、酸
化−還元法、およびＤＣＣ／温加物（例えばＨＯＮＢ、
ＨＯＢｔ。

ｌ−１０Ｓ　ｕ　）法などがある。

［ＦＮ−γの１３１−１４６断片の調整法に関する詳細
な説明はコーＯツバ特許出願 第１０３８９８号に記載されている。

該ポリペプチド２．５ｍｇをＴＧ３．７５■と混ぜ、５
０ｍＨのりん酸緩衝液を２ｄ加えた後、水冷浴中で」−
分攪拌した。これに３０．４１）１！ｊの＠酸カルボジ
イミドを２００ｍの蒸溜水に溶解した溶液を徐々に滴化
した。その後水冷浴中で３時間攪拌した。反応完了後、
蒸溜水に対して十分に透析し、凍結乾燥して４．７ｒｎ
ｇのたん白夜合体を得た。

例　　２ 抗体検出のための８１素免疫測定（ＥＩＡ）用ｎり累±
へ−１の一製 ＥＩＡに用いる酵素結合抗原はＫ　ｒ　ｔａｇａｗａ　
　ら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ　７９巻、２３３頁（１９７６年）の方法により調製
した。

（１）　　ポリペプチドへのマレイミド基の導入例１に
より得られたポリペプチド（３５０ｎｍｏｌｅ　）を１
００ｍＭりん酸緩衝液（１）１）６．８＞１ｄに溶解し
、その溶液を５８５μｇ（１，７５μｍｏｌｅ）のＮ−
（４−カルボキシシクロヘキシルメチル）？レイミド　
Ｎ−ヒドロヤシーサクシニミドエステルを７０μｌのＮ
、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解した溶液に添加した
１、混合液を３０℃３０分間攪拌した。反応完了後、セ
ファデックスＧ−２５のカラムを用いて分画し、１８５
ｎｍｏｌｅのマレイミド基が導入したポリペプチド区分
を得た。

（２）　　マレイミド基を含有するポリペプチドとβ−
Ｄ−ガラクトシダーゼとの結合 ！レイミド含有ポリペプチド（１６，５ｎｍｏｌｅ　）
を３．３ｎｍｏｌｅのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼと混合
した。４　’Ｃで１８時間反応後、４１２．５ｎｍ０１
０のβ−メルカプトエタノールを添加して反応を淳止し
た。β−Ｄ−ガラクトシダーゼ結合ポリ、ペプチドをセ
ファロース６Ｂカラムで分画し、以後の実験に決用した
。

例　　３ □ ７−８週令（７）ＢＡ　Ｌ　Ｂ／（ｌ［ｌ？ウス６匹ニ
例１でｊ７られｌこたん自冷合体の４０μ７（たん白質
として）をフロイント完全アジュバントとの親和混合物
として皮下注射した（−次免疫）。−次免疫の２辿間後
に、上記と同じ量の抗原をフロインド不完全アジュバン
トとの親和混合物としてマウスに再び皮下注射した（二
次免疫）。さらに２週間後、三回目の免疫化を第二回目
と同様に行なった。

三次免疫の６日後に、マウスより血液を一部分採１）ノ
して下記に示すＥＩＡ法により血清抗体力ｌ１）ｉを測
定した（　Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、　
１巻、３頁［１９７８年］参照）。γ−２と記したマウ
スが最高の抗体力価を示し、０．５ｍの食塩溶液に溶解
した１２０μグの抗原を静脈注射して最終免疫を行なっ
た。各マウスの抗原力価を第１表に示す。

第１表　免疫したマウスの抗ペプチド抗体力価１）血清
希釈率：１／１０００ ２）血清希釈率：１／６３００ ３）血清希釈率：　１／７８００ ４）−：＠出できず ５）　　Ｎ、Ｄ、：測定せず Ｂ／Ｔ：（結合酵素活性／添加した全酵素活性）Ｘ１０
０ ＥＩＡ法 ＶＡ２で１０られたたん自復合体で免疫したマウスの血
清中またはハイブリトーン上澄液中の抗体活性の検出は
ＥＩＡ法により行なった （　ＩｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏＯＶ　１巻、３
頁：１９７８年）。

血清またはハイブリドーマ上澄液を緩衝液Ａ（２０ｍＭ
　　Ｎａ　　ＨＰＯ，１００ｍＨＮａｃｌ。

０．１％ＮａＮ　　、１ｍＨＭＯＣＩ　　、ｐＨ７，０
）で希釈し、その１００μｌを酵素結合ポリペプチド（
実施例２）１００μｍと混ぜ、２４℃で２４時間反応さ
せた。その後、ウサーギの抗マウスＩｇＧを結合した３
％セルロース１００μｌを加え、２４℃４時間反応させ
た。反応が終了した後、セルロースを０．５％のＴｗｅ
ｅｎ　２０を含む緩衝液へでよく洗い、２０μｇ／ｄの
４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドの
５００μｌを添加して３７℃で２時間反応させた後、反
応を停止するために３ｒｄの１００１）１）４炭酸緩衝
液（ｒｌＨｌｏ、５）を添加した。蛍光強度は蛍光計（
励起：３６５ｎｍ；放出：４５０ｎｍ）で測定した。

例　　４ ■Ｂ 例３に記載された最終免疫の３日後に、γ−２マウスよ
り牌臓を摘出してステンレス製のメシュを通して加圧濾
過し、イーグルの最少必須培地（ＭＥＭ）にけん濁して
牌臓細胞けん濁液を得た。

細胞融合にはＢＡＬＢ／Ｃマウス由来のＰ３−Ｘ６３、
ＡＣ１８、ｔＪＩ（Ｐ３ｔＪＩ）骨髄腫細胞を用いた（
ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｈｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ　ａｎｄｔｍｍｕｎｏ＋ｏｏｙ　８１巻、１
頁（１９７８年）］。細胞融合はにｏｈｌｅｒおよび旧
１ｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ２５６巻、４９５−４９
７頁（１９７５年）の原波により行なった。牌臓細胞お
よびＰ３ｔＪＩＩＢＩｎを血清無添加ＭＥＭで３回、別
々に洗い、５：１（細胞数で）の割合で混合した。混合
液を８００ｒｌ）１０１５分間遠心分離して細胞を沈で
んさせた。上澄液を完全に除去した後洗でんを軽くほぐ
し、０．３ｄの４５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）６０００　（Ｋｏ　ｃ　ｈ　−Ｌｉａｈｔ　）を加え
、混合物を３７℃の湯浴中で７分間静置して細胞融合を
進行させた。その後に、ＭＥＭを毎分２ｄの割合で添加
した。合計１２ｒｄのＭＥＭを添加後、６００ｒｐｍ　
１５分間遠心分離して上澄を除去した。細胞を１０％仔
牛血清加ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＲＰＭＩ　１６４０
−１０ＦＯ３）に２×１０５Ｐ３ｔＪ　Ｉ細胞７ｍｌの
濃度となるようけん濁し、２４穴フルチデイツシ（Ｌｉ
ｎｂｒｏ）の１４４のウェルのそれぞれにその０．１−
を接秤した。接種後細胞を５％炭炭酸ガスインキュベク
ター中３７にインキュベートした。２４時間後に、ＨＡ
Ｔ　（１Ｘ　１０　’Ｍヒポキサンチン、４　Ｘ　１０
−７Ｍアミノプテリン、１、−６Ｘ　１０’Ｍチミジン
）培地を加えたＲＰＭ　Ｉ　１６４０−１０ＦＣ８培地
をウェル当り１ｄ添加することにより１−ＩＡＴ−・選
択培養を開始した１、培首開始後３．５および７日目に
１）ｎＩ。

の古い培地を新しいｌ−Ｉ　Ａ　Ｔ培地に代えてＳＡＴ
選択培養を続けた。細胞融合後１０日から１４４日目バ
イブリド−７の成育が観察された。培養液が黄色になる
と（およそｌＸ１０６個／蔵）、上澄を集めてＥＩＡ法
により抗体の存在を試験した。

このようにしてハイブリドーマの成育が観察された１４
１のウェルの上澄液を試験した。２個のつＴル（γ２−
１）およびγ２−１００）が強い抗体活性を、また他の
２つのウェル（γ２−６２およびγ２−７０）が弱い抗
体活性を示した。

例　　５ クローニング 抗体活性が陽性であった３つのウェル（Ｔ２−１）、γ
２−６２およびγ２−１００）からのハイブリドーマを
制限希釈法によりクローン化した。

即ち、ハイブリトーン細胞を少なくとも２個／戒の濃度
となるようＲＰＭＩ６１４０−２０ＦＣ８にけん濁し、
けん濁液を９６穴のマイクロプレートの各ウェルに０．
１ｄずつ分注した。分注の際、５×１０５個のＢＡＬＢ
／Ｃマウス胸腺細胞を各ウェルに補助細胞として加えた
。その結果およそ２週間後に細胞の増殖がＩｌ寮された
。そこで上澄液を集め、抗体の存在を例３に示したＥＩ
Ａ法で試醗した。抗体活性はγ２−１）つ１ルからの１
９クローン中の８クロニン、γ２−６２ウェルからの５
４クローン中３クローン、γ２−１００ウェルからの４
７クローン中５クローンに観察されたく第２表）。

第　　２　　表 りＯ−ン化したハイブリドーマの抗ペプチド抗体活性 モノクローン抗体のＩＦＮ−γへの結合能は次の方法で
測定した。ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体とカップルしたセ
ルロースの３％溶液３００μｌにγ２−１）、γ２−６
２およびγ２−１００のウェルのそれぞれからの２また
は３コのクローン化細胞のそれぞれの培養上澄液３００
μｌを添加し、室温で１２〜２０時間反応させた。次に
セルロースを生理食塩水で完全に洗い、それに後に述べ
る方法で１）だＩＦＮ−γ５５０単位／ｄを添加した。

３〜４時間反応後上澄液を集めＩＦＮ−γ活性を？イク
ロプレー１・を用いる細胞毒性効果（ＣＰＥ）判定法［
Ａｐｐｌｉｃｄ　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　　１５
巻、１７０６頁（１９６８年）１で測定した。即ち、９
６穴のマイクロプレートの各ウェルに５０μｍのＭＥＭ
を入れ、一番目のウェルに５０μｌのＩＦＮ標品を加え
、続いて順次二倍希釈をした。

このようにして調整した各つ１ルに２０％ＦＯ８含Ｔｈ
ＭＥＭにけん濁したＷＩＳＨ細胞懸濁液（４×１０５個
／ｒｒｄｌ’）を５０μｍ加え、炭酸ガスインキュベー
タ中３７℃２４時間インキュベートした。

その後、濃度を２０００ＴＣＩＤ５ｏ（ＴＣＩＤ５ｏ：
組織培養感染中間濃度）に調整した水痘性口内炎ウィル
ス（Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ株）　５０　ｕ、ｌを各ウェ
ルに加え、炭酸ガスインキュベーター中でインキュベー
トした。およそ３５時間後、ＩＦＮ標品無添加ウェルの
細胞が１００％のＣＰＥを示した時、各ウェルを顕微鏡
下でＣＰＥ判定を行ない、５０％ＣＰＥを示すウェル中
のＩＦＮ標品の希釈率ファクターの逆数をＩＦＮ力価と
した。

使用したＩＦＮ−γ標品はヒト末梢白血球細胞を４０μ
ｇ／Ｍ１．のコンカナバリンＡおよび１５μｇ／ｄの１
２−０−テトラデカノイルホルボルー１３−アセテート
で刺激して７２時間後に集めた上澄液である。本培養液
の上澄１−当り４４００単位のヒトＩＦＮ〜γ（熱およ
び酸第安定）を含有する。クローン化した細胞培養上澄
液にＩＦＮ−γとの結合能を有する抗体があれば、加え
たＩＦＮ−γはセルロース上の抗体と結合し、上澄液の
ＩＦＮ−γ活性が低下する筈である。結γとの比較的強
い結合活性が見られ、加えたＩＦＮ−γの５０−７５％
（５５０単位／ｄ）が抗体と結合したく第３表）。

第　　３　　表 モノクローナル抗体によるＩＦＮ−γ活性の吸収例　　
７ モノクローナル抗体産生ハイブリドーマによるｆｌｕ水
の生産 腹水の生産は０．５ｄの鉱油を前もって腹腔注射したＢ
ＡＬＢ／ＣマウスにＩＦＮ−γ−１結合活性を有する抗
体産生能を持つγ２−１）’、１クローン細胞１Ｘ１０
６を腹腔的接種して行なった。

ハイブリドーマを腹腔内投与１０日後に！Ｉす水を採取
し、抗体活性を１０７倍希釈まで試験した。対応するク
ローン細胞培養上澄液の抗体活性は１０４倍希釈まで検
出したのに対し、腹水１　’：Ｉ：により抗体活性は約
１０００倍増加した。

例　　８ モノクローナル抗体の精製 例７で得られた腹水４−を出発物質として用いてモノク
ローナル抗体精製を５ｔａｅｈｅｌｉｎらの方法（Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｉｉ＋
１ｓｔｒｙ　２５６巻、９７５０頁［１９８１年］）に
より行なった。即ら、腹水を先ず１０．０００ｒｐｍ　
１０分間遠心。

てフィブリン様物質を除去し、次にりん義援耐液−食塩
水（ＰＢＳ　：　８．１ｍＨＮａＨ２ＰＯ４，１，５ｍ
ＨＫｌ−Ｉ　　　Ｐｏ　　　、２．　７ｇＩＨＫＣＩ　
　、１３７ｍＨＮａｃ　ｌ　：ｐＨ７，２）にて２８０
０ｓの紫外部吸収（Ａ　　　）が１２から１４の間にな
る濃度に希釈した。そｇ）後、希釈サンプルに硫酸塩濃
度が４７％となるように飽和硫酸アンモニウム溶液を加
えた。混液を４℃で６０分間攪拌して塩析をさせ、遠心
弁ＰＭ　（１０，ＯＯＯｒｐｍ　、１５分間）を行な゛
つて沈でんを得た。沈でんを５０ｍＨＮａＣｌをａ・む
２０１）Ｈトリス緩１ｆｉｉｉ１！（１）８７　、９　
）　ニ溶解し、２リツトルの同じ緩衝液に対して透析を
行なった。

２時間後に透析液を２リツトルの新しい同じ緩衝液と替
え、さらに１５時間透析を続けた。次に１０、　ＯＯＯ
ｒｐｍ　１５分の遠心分離で沈でんを除去し、十澄液を
Ａｍが２０−３０となるような濃度に調整した。本標品
を５０ｍＨＮａＣＩを含む１〜リス緩衝液（ｐＨ７，９
）の十分量で平衡させたＤＦＡＦ−セルロースカラム（
８〆、Ｗｈ、ａｔｍａｎＤＥ５２）にかけ、溶出は５０
ｍＨＮａＣｌ含有トリの条件下で抗体活性は主に溶出分
画に検出された。

精製標品が抗体であるという確認はＬａｅｍｍ　ｉら、
Ｎａｔｕｒｅ２２７巻、６８０頁（１９７０年）に記載
されている５Ｏ８−ＰＡＧＥ法により行なった。

即ち、ｌｉｉ！！酸アンモニウム塩析およびＤＥＡＥ−
セルロース分画により得られた両分を２−メルカプトエ
タノールで還元し、１７％ＳＤＳグル電気泳動を３０ボ
ルト、２４時間で行なった。抗体活性ピークと一致して
分子♀約５５キロダルトン（Ｈ−鎖）および約２８キロ
ダルトン（Ｌ−ｍ）に相当する位置に２本のバンドが検
出された。このようにして精製した抗体の画分１７にＩ
ＦＮ−γ（２２００Ｕ／ｄ）を加えてｒＦＮ−γ結合活
性を調べた。その結果、約５０％のＩＦＮ−γが抗体と
結合した（第４表）。

第　　４　　表 例　　９ モノクローナル抗体のサブグループ 精製抗体画分１７（例８）を１０倍希釈し、寒天中で山
羊の抗マウス１ｇＧ１、Ｇ２ａＳＧ２ｂおよびＧ３抗体
（ａ＋１ｌｅｓ　）を用いて免疫沈降反応（オークｒ）
ｔｔロニ−・テスト：　Ｉａｕ＋＋ｕｎｏｌｏａｉｃａ
１Ｍｅｔｈｏｄｓ、　Ｇｅ１−Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ　Ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　。

ｏｘｆｏｒｄ、　１９６４年）を行ない、７２−１）．
１モノクロ一ナル抗体が属するＩＱＧサブクラスを固定
した。本モノクローナル抗体と山羊の抗マウスＩｇＧ２
ｂ抗体の間に明確な・一本のバンドが観察され、他方他
の抗体とモノクローナル抗体との間にはバンドの形成は
見られなかった１、従って、該モノクロナール抗体はＩ
ＱＧ２ｂに属することがわかった（第５表）。

モノクローナル抗体のサブクラス 例　　１０ ９１Ｅ）の方法で′Ｒｉ’ＦＪした溶出画分からのモノ
クロ−１ル抗］本２・５ｄ　（６５、３ｍｇ＞をＯ，１
ＭＮａＨＣＯ３（ｐＨ８，３）に対して一晩透析を行な
った。これとは別に、２５ｄのＡＦＦＩ−ＧＥ　ｌ−１
０（Ｂｉｏ　Ｒａｄ　）をガラスフィルターヲ用イテ水
で完全に洗い、０．１Ｍ　　ＮａＨＣＯ３（＋）８８．
３）にけん濁し、上の抗体と混ぜた。混合物を４°Ｃ４
時間静かに攪拌して反応を進行させてから４°Ｃで一晩
静置した後ＡＦＦＩ−ＧＥＬ１０をガラスフィルターを
用いて０．１ＭＮ　ａ　ＨＣＯ３（ｌｌｔｌ　８　、３
　）で洗った。このゲルに０．１ＭＩタノニルアミノお
よび０．１５ＭＮａ１ｌを含む溶液（ＤＨ８，３）２５
ｄを添加し、混合物を４℃で一時間振とうして残存する
活性基を妨げた。次にゲルをＰＢＳで十分洗い、２５ｍ
の０．１％ＮａＮ３・含有ＰＢＳにけん濁した。けんｖ
Ａ液は４℃で保存する。添加した抗体量と回収上？’ｆ
ｌ　、ｒｌ中の抗体量とから、抗体がゲルと２．３５Ｒ
１ｒ　、’　Ｉｄ！の９１合で結合した事がわかった。

このようにして得られた反応生成物をカラムに充填して
抗体カラムとして用いた。

例　　１） Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＲＲＩ（ｐＲＫ２４８ｃｌｔｓ。

ｐＲｃ２３１／ＩＦＩ−９００＞（この組換え体微生物
の構築はヨーロッパ特許出願公開公報１）１９９０８４
に詳細に記載されている。）をγＩＦＮ−γ生産に用い
た。プラスミドｐＲＫ２４８０　Ｉ　ｔｓおよびｐＲＣ
２３１／ＩＦＩ−９００は温度感受性ラムダリプレッサ
ーおよびＩＦＮ−γ遺伝子をそれぞれ含んでいる。

γＩＦＮ−γ遺伝子の発現はＰＬプ０モータの調節下で
ある。

Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＲＲＩ（ｐＲＫ２４８ＣＩｔｓ。

ｐＲｃ２３１／ＩＦ　ｌ−９００）の−晩培簡物をＬＢ
培地中３０℃で増殖させた。−晩１８養物の１リツトル
をカザミノ酸含有の最少Ｍ−９培地で１０倍に希釈した
。対数増殖期に培養を３０°０から４２℃にシフトし、
４２℃で２〜３時間１ａ浪を続けた。バクテリアは遠心
分離により集菌し、細胞ペレットは使用するまで一２０
℃に保存した。

全ての醗酵および工程はＮ　Ｉ　Ｈの組換えＤＮＡ実験
ガイドラインに従って行なった。

モノクローナル抗体はγＩＦＮ−γの１３１−１４６０
末端合成ベプヂドに対して上３７１の方法で調ｊｐ４１
ノだ。モノクローナル抗体ＭＯγ２−１）．１をγＩＦ
Ｎ−γの精製に用いた。モノクローナル抗体カラムは例
１０に記載したように調製した。

１４Ｃ−ヨード酢酸によるγＩＦＮ−γのカルボキシメ
チル化は参考文献（３）に記載されるように６１Ｖ１−
クアニジン塩酸存在下で行なった。過剰な試薬はＣ８逆
相カラムを用いたＨＰＬＣにより除去した。カルボキシ
ペプチダーゼによる滴化は参考文献（４）に記載される
ように０．２ＭＮＨ４ト＋ｃｏ３中で行なった。

ＴＩＦＮ−γを参考文献（５）に記載されるように７０
％ギ酸中ＣＮＢｒ（メチオニンに対しモルで１００倍過
剰）で処理した。ＣＮＢｒペプチドはＣ−１８逆相カラ
ムを用いたＨＰＬＣで分離した。ペプチドの溶出は０．
１％トリノルオロ酢酸中ＣＨ３ＣＮのＯから７０％の直
線勾配で行’ｔＫつだ。

たん白またはペプチド標品は密封し、窒素を流して置換
した管中で４％チオグリコール酸含有沸とう塩酸にて加
水分解した。アミノ酸分析は参考文献（６）に記載され
るフルオレスカミンアミノ酸分析計を用いて行なった。

カルボキシメチル化たん白質の配列決定は参考文献（７
）に記載されるようにＡ　Ｂ　Ｉ　（ＡＩ）ｌ）ｔｉｅ
ｄＢｉＯ３ｖ３ｔｔ３１）１．　Ｉｎｃ、　）の気相シ
ークエンサー４７０Ａを用いた。ＰＴＨ−アミノ酸は参
考文献（８）に記載の通り、超粒子ＯＤＳカラムの逆相
ＨＰＬＣを用いて同定した。

精製ステップは全て４℃で行なった。凍結細胞（２５ｇ
）を３倍型の７Ｍグアニジン塩酸（Ｉ）Ｈ７）にけん濁
した。けん濁液を１時間攪拌した後３０、ｏｏｏｘｇで
１時間遠心分離した。上澄液をダルベツコのりん耐食塩
水（ＰＢＳ）または０．１５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液
（ρ８９．５）で’Ｉ　Ｏｆ８市釈し、３０．０００ｘ
びで３０分間遠心分離した。あるいは、凍結細胞（２５
９）を１　、５１ＦｉＪｆｌ（３７，５ｄ）　（１）０
．１５Ｍ（７）ホウ酸プトリウム緩＠液（１）Ｈ９，５
）にけん濁し、１時間に伴した。混合物を３０秒ずつ５
回音波処理した後３０’、０ＯＯＸ！Ｊで１時間遠心分
離した。

グアニジン塩酸抽出物または音波処理の上澄液を、２５
ｄのシリカと共に回転振どう機上で一時間混合し、ＰＢ
Ｓで予備洗滌した。混合物をカラムに注ぎ、カラムをカ
ラムの２０−３０倍ｍの１ＭＮａＣｌで洗；條した。次
にカラムを０．０１Ｍホウ酸ブトリウム緩自液（ａｌ１
８．０）中の０．５Ｍｊ］・ラメチルアンモニウム塩酸
で溶出した。インタフエ１］ン活性は約２００ｄに溶出
し、４つの分画に東めた。各分画をＰＢＳで平衡化した
モノク１−１−プル抗体（γ２−１）．１）アフイニテ
イ力ラム（ベッド容ｆｆ１４ｄ）にのせた。カラムの１
０倍量のＰＢＳ緩ｔ！ｌ１７８！２で洗った後、１Ｍグ
アニジン塩酸またはＩＭ　　ＮａＣｌおよび２０ｍＨり
ん酸ナトＩＩ　＋’１ノ、淫術９０（ａｌ１７　０）を
台布ｔ　Ｚ＞　Ｒｎ　％　エチレングリコールでカラム
を溶出した。インタフエロン活性は最初の２０ｍに溶出
された。

５ＤＳ−ＰＡＧＥはＬａｅｍｍｌ　ｉ　　（参考文献９
）により記載されるように行なった。たん白はフルオレ
スカミン分析により結晶ウシ血清アルブミンを対照標準
として測定した。インタフエａン活竹は参考文献１０に
報告されているように、水痢性口内炎ウィルスとヒトＷ
ＩＳＨ，Ｉｌｌ胞を用いて細胞毒性効果阻害アッセイで
測定した。全てのインタフエロンカ価は部分精製したヒ
ト免疫インタノエロンの対照標準に対して計痺した相対
単位／　ｔｎｌｌで表示した。

抽出および精製工程の概要を第６表に示した。

全体を通しての回収は２５−３２％で精製度はｉｏｏか
ら７６９倍で平均比活性は１Ｘ１０７単位／Ｒｇであっ
た。全体のγＩＦＮ−γの収量はグアニジン抽出の方が
３−４倍高かった。精製最終段階での５ＤＳ−ＰＡＧＥ
を第１図に示す。グアニジン塩酸抽出から精製したもの
はおよそ１８．０００ダルトン（１８Ｋ　γＩＦＮ−γ
）に単一バンドを示したが、音波処理からのものは主要
バンドがおよそ１５，０００ダルトン（１５に？”　　
ＩＦＮ−γ）に、薄いバンドがおよそ１７．０００ダル
トン（第１Ａ図）に表われた。

’Ｊｔ　Ｍ元手のゲルでγＩＦＮ−γの二ｍ体およびオ
リゴ？−が形成された（第１Ｂ図）。

１８にのＴＩ　Ｆ’Ｎ−γは均質でアミノ酸組成はｌ）
　Ｎ　Ａ配列から予想されるものと一致した。

１５におよび１８にのγＩＦＮ−γのアミノ酸組成を第
７表に示す。数百ビ」モルの還元およびカルボキシメチ
ル化１５におよび１８にたん白を自動気相たん白／ベプ
チドシクエンサーでエドマン分解を行なった。１５にお
よび１８にたん白のそれぞれ最初の３２および２６ｆｌ
ｉｉｌのＮ末端アミノ酸残基配列はＤＮＡ配列から予想
されるものと一致したく第２図）。　Ｃ−カルボキシメ
チル化システィンは配列分析の・一番目と三番目のサイ
クルで検出された。Ｎ末端メチオニンは検出されなかっ
た。１８におよび１５にのγｒＦＮ−γのＮ末端配列分
析により、両たん白のこの領域の配列が同一であること
がわかった。Ｃ末端ペプチドも分析してこの領域で削除
または変化が起っているか調べた。カルボキシペプチダ
ーゼＡ（ＣＰＡ）Ｈ！！化物のアミノ酸分析により１８
にγＩＦＮ−γからはセリンおよび／またはグルタミン
がＭ　Ｂｔし、一方１５にγＩＦＮ−γは同条件下でＣ
ＰＡにより分解されないことがわかった。３ｅｒ−Ｑｌ
ｎはγＩＦＮ−γのＣ末端配列であるから１８ＫＩは完
全なＣ末端を有し、他方１５に種はＣＰＡにより分解さ
れない異なるＣ末＠残基（Ｌｌ／Ｓ）を有することがわ
かった。

ＤＮＡ配列から予想されるＣ末端残基配列はさらにＣＮ
Ｂｒ処理後のＣ末端ペプチドの分析および配列決定によ
り確認された。Ｃ末端ペプチドはＣ−１８の逆相カラム
によるＨＰＬＣで分離した（第３図）。グラジェントの
最初の部分で溶出される鈍いペプチドピーク（ピーク■
）が１５に７１　ＦＮ−７より得られ、これは１８Ｋｒ
　Ｉ　ＦＮ−γのＣＮＢｒ処理物では検出されなかった
。本ペプチドのアミノ酸分析の結果、ホモセリンまたは
ホモセリンラクトンを有しない事がわかり、従って１５
にたん白のＣ末端ＣＮＢｒペプチドであると思われた。

アミノ酸分析に基づき（第８表）、本ペプチドはＩＦＮ
−γ（アルギニンは検出不能）の第１２１番目から１３
１番目に相当した。

１８にγ［ＦＮ−γの場合には溶出の最初の部分に広い
ピークが得られた。このピークはゆるやかなグラジェン
トによりさらに２個のピークに分離された。アミノ酸分
析の結果、最初のピークが１８にたん白のＣＮＢｒ　Ｃ
末端ペプチドである事がねかり（第８表）、アミノ酸組
成は第１３８番目から第１４６番目の残基に対応した。

９個のアミノ酸配列を配列決定により証明した。１５に
たん白のＣ末端アミノ酸はリジンであると決定された。

これらの結果は、１８に種はγＩＦＮ−γの完全な分子
であり、１５に種はたん自分解産物であることを示す。

１５に種では第１３１番目のアミノ酸残塁と１３２番目
のアミノ酸残塁の間（ｌ　ＶＱ−Δｒｎ）のべ１壬に結
合？＜　ｌ：ＴＩ　ｒ　Ｉ、Ｔいた。

例　　１２ 免疫インクフエＯンの１５に断片を他の断片、例えば１
７ＫＴＩｆＩ片を含む混合物から以下に示す工程をさら
に行なって単一に精製した。モノクローナル抗体アフィ
ニティーカラムにより精製した音波処理上澄液（たん白
１０．３ＩｙＪ：比活竹０．９ｘ１０６Ｕ／Ｒｇ）をざ
らに５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動（１６スラブゲル：
アクリルアミド１２．５％；ＳＤＳ　　０．１％、厚さ
３−５　ｍｍ　）によりさらに精製を行なった。ゲルの
一本を先ず０．１％クマシー・ブリリアント・ブルーＲ
−２５０で染色し、次に１５％メタノール中の１０％酢
酸で脱色した。ゲル上の他の泳動の１５Ｋに対応するバ
ンドを切出し、砕いて０．１％ＳＤＳ中で４℃２日間攪
拌した。これを濾紙で濾過した。

濾液を凍結乾燥してから６倍溶のエタノールと混ぜた。

生成した沈でんを０．１％のＳＤＳに溶解して単一な１
５にモノンー成分を得た（たん白、１−１ｍｇ：ｌ？活
性屹３ｘ　１０６ＬＪ　／ｍｇ＞。

第　　７　　表 １５におよび１８にγＩＦＮ−γのアミノＩ’ｌＣ相成
（残基数） １８Ｋ　　　　　　　１５Ｋ Ａｓｐ　　　２０．９　（２０）　　１９．９　（２０
）Ｔｈｒ　　　　５．１　（５）　　　　４．９　（５
）Ｓｅｒ　　　　９．８（１））　　　６．７（９）Ｇ
ｌｕ　　　１８．５　（１８）　　１５．１　（１６）
Ｐｒｏ　　　　　＊　　（２）　　　　　＊　　（２）
Ｇｌ’）／　　　　５．９（５）　　　　５．６（４）
Ａｌａ　　　　８．２　（８）　　　　７．３　＜７）
Ｃｙｓ　　　　　＊　　（２）　　　　　＊　　（２）
Ｖａｌ　　　　９．１　（８）　　　　９．１　（８）
Ｍｅｔ　　　　　　　４　　。　７　　（４）　　　　
　　　　３．　８　　（３）１）ｅ　　　　７．２（７
）　　　　６．６（７）し　ｅｕ　　　　　　１０．　
５　　（１０）　　　　　　９．　６　　（９）Ｔｙｒ
　　　　５．５　（５）　　　　４．８　（５）Ｐｈｅ
　　　１０．３　（１０）　　　８．２　（９）ト１ｉ
ｓ　　　　　　　　　　１．　　８　　　（２）　　　
　　　　　　　２．　　５　　　（２）Ｌｙｓ　　　１
９．９　（２０＞　　１６．９　（１９）ＡｒＱ　　　
　８．６　（８）　　　　５．６　（３）Ｔｒｌ）　　
　　　＊　　（１）　　　　　＊　　（１）カッコ内の
数字はＤＮＡ配列より予想される残基数を示す。

＊　値を測定せず。

第　　８　　表 １５Ｋｉｆｆｉよび１８にのＣＮＢｒＣ−末端ペプチド
１５Ｋ　　　　　１８Ｋ ｒｈｒ　　　　０．９　（１） Ｓｅｒ　　　　１．１　（１）　　０．８４　（１）Ｇ
ｌｕ　　　　１．１（１）　　１．１　　（１）１）ｒ
　ｏ　　　　　：Ｉ：　　（１）Ｇｌｙ　　　　１．５
（１）　　１．３　　（１）Ａｌａ　　　　２．４（３
）　　１．１　　（１）しｅｕ　　　　１．０（１）　
　１．１　　（１）ｐ　ｈ　Ｃ１、０（１） しｙｓ　　　　１．９　（２＞　　２．８　　（３）配
りｌ］中の　　１２１−　　　１３８−１）２置　　　
　１３１　　　　１４６カツコ内の数字はＤＮＡ配列か
ら予想される残基数 二七　値を測定せず。

参　　考　　文　　献 １　グレイ他（Ｇｒａｙ、　ｐ、シー、、ｅｔ、ａｌ、
）ネイチャーＮａｔｕｒｅ）　２９５．５０３−５０８
（１９８２）２　スタヘリン他（Ｓｔａｈｃｌｉｎ、　
Ｔ、ｃｔ　ａｌ、）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｃｍ、２５６
．９７５０−９７５４ドの配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄＰｅｐｔｉｄｅｓ）　
、Ｄｏ、　３０−３１　（１９８１）　、ノースーオラ
ンド出版社（Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｔ　ｌａｎｄＰｕｂｌｉ
ｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、）　、７ムステルダム、ニュー］−
り ４、アンバー（Ａｍｂｅｒ、　Ｒ，Ｐ、　）　、酵累学
のｊｉ法（）４ｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　Ｅｎｚｙｎ＋Ｉ
ｏｑＶ）エユ、４３６−５　ウオルフエ（Ｗｏｌｆｅ、
　Ｒ，Ａ、　）およびスタイン（５ｔｅｉｎ、　Ｓ、　
）　、薬理学における新しい方法（Ｍｏｄｅｒｎ　Ｈｅ
ｔｈＯｄＳ　ｉｎ　ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇＶ）　ｏｐ
、　　５５−７７　（１９８２）　、Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌ
ｉ５ｓ、Ｉｎｃ　、　ニューヨーク、ＮＹ。

６　スタイン（５ｔｅｉｎ、Ｓ、　）およびブリンク（
Ｂｒｉｎｋ、Ｌ、）　、Ｍ素学における方法（Ｈｅｔｈ
ｏｄＳｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ（ＩＶ　）　、７９．２
０−２５７　ヘライック（Ｈｅｗｉｃｋ、　Ｒ，Ｈ，）
バンカピラー（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌａｒ、Ｈ，Ｗ、　）
　、ホット（ＨＯｄｄ、　Ｌ、　［、）およびドレイヤ
ー（Ｄｒｅｙｅｒ、Ｗ、１．　　）　、　Ｊ、Ｂｉｏｌ
Ｃｈｅｍ、　　２５６．７９９０−７９９７　（１９８
１）８　ボーク（Ｈａｖｋｅ、Ｄ、　）　、ヤン（Ｙｕ
ａｎ、　Ｐ−Ｈ，）、およびシベリー（Ｓｈｉｖｃｌｙ
、Ｊ、Ｅ、）　、Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｃｍ、　　　１　２０．３０２−３１）　　
（１９８２）９　レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ、υ、に）、
ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２２７．６８０−６８５　
　（１９７０）１０、　／Ｌ／　ヒ’　：／　シｌｌ−
タイン（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ　Ｓ、　　）　、ファミ
レツテイ−（Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ、Ｐ、Ｃ，）　、お
よびベスカ（Ｐｅｓｔｋａ、Ｓ、　　）　、Ｊ、Ｖｉｒ
ｏｌ、３７．７５５−１）　　カボン（ＣａｌｌＯｎ、
Ｄ、Ｊ、）　、Ｏインタ（Ｌｃｕｎｇ、　Ｄ。

Ｗ　）　、ｌ：：’／”／工？ン（ｌｌｉｔｚｅｍａｎ
、Ｒ，Ａ、　）　、ベリー　（Ｐｅｒｒｙ、Ｌ、Ｊ、）
　、コール（にｏｈｒ、Ｗ、Ｊ、　）　、グレイ（Ｇｒ
ａｙ、Ｐ、Ｗ、　　）　、プリンク（Ｄｃｒｙｎｃｋ、
　Ｒ，）、Ｊ’ｊよびグデル（Ｇｏｃｄｄｅｌ、Ｄ、Ｖ
、　）　、インタ７　工ロンに関η−る第３回国際会議
（丁ｈｅ　Ｔｈ１ｒｄ　ＡｎｎｕａｌＩｎｔｅｒｎａｔ
ｉｏｎａｌ　ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｆｏｒ　Ｉｎｔｅｒｆ
ｅｒｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ　）　、？イアミ、Ｆ１ａ１
）９８２）。

【図面の簡単な説明】

第１図は、粒子構造を示す写真であって、精製した粗換
えヒト免疫インタフエロンの還元条件下（Ａ、０．７Ｍ
β−メルカプトエタノール）および非還元条件下（Ｂ）
でのドデシル硫酸フトリウムーポリアクリルアミドゲル
電気泳動を示す。 第２図は組換えヒト免疫インタフエロンの予想アミノ配
列と１５におよび１８にのγＩＦＮ−γの実際のＤＮＡ
配列の比較を示す。 第３図はＣＮＢｒ処理後の１５におよび１８にγＩＦＮ
−γのＣ末端ペプチドのＨＰＩ　Ｃ分離を示す。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の式で示すアミノ酸配列を有し、場合により
   該配列はそのアミノ末端にさらにメチオニン残基を含ん
   でいてもよく、本質的に他のペプチドを含有せず、実質
   的にガンマ−インタフエロンと同じ活性を有するポリペ
   プチド。 【アミノ酸配列があります】
2. （２）一つの均質なペプチドとしての上記第（１）項記
   載のポリペプチド。
3. （３）治療薬として使用される上記第（１）項または第
   （２）項のいずれか一つに記載のポリペプチド。
4. （４）下記に示すアミノ酸配列を有し、場合により該配
   列がそのアミノ末端にさらにメチオニン残基を含んでい
   てもよく、本質的に他のペプチドを含有せず、実質的に
   ガンマ−インタフエロンと同じ活性を有するポリペプチ
   ドを調製する方法であつて、免疫インタフエロンを発現
   することの出来る形質転換微生物をプロテアーゼ阻害剤
   の非存在下で細胞破壊した後抽出し、得られる抽出物を
   免疫インタフエロンに対するモノクローナル抗体を用い
   て精製することより成る調製方法。 【アミノ酸配列があります】
5. （５）細胞の破壊を音波破砕により行なう、上記第（４
   ）項記載の方法。
6. （６）活性物質として、上記第（１）項または第（２）
   項のいずれか一つに記載のポリペプチドを、そしてそれ
   自体不活性な医薬的に容認される担体を含有する医薬品
   組成物。
7. （７）上記第（１）項または第（２）項のいずれか一つ
   に記載のポリペプチドの治療剤としての使用。
8. （８）上記第（４）項または第（５）項のいずれか一つ
   に記載の方法、またはそれと明かに同等な方法により調
   製された上記第（１）項または第（２）項のいずれか一
   つに記載のポリペプチド。