PT79230B

PT79230B - Process for producing a homogeneous imune interferon fragment and of pharmaceutical compositions containing the same

Info

Publication number: PT79230B
Application number: PT79230A
Authority: PT
Inventors: Susumu Honda; Hsiang-Fu Kung; Hiromu Sugino
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1983-09-20
Filing date: 1984-09-19
Publication date: 1986-11-18
Also published as: DE3468690D1; ES8606885A1; HU196460B; NZ209590A; IL72985A0; KR850002283A; AU3330384A; US4604284A; PT79230A; EP0136620B1; JPS6163697A; NO159610B; CA1298219C; NO843751L; GR80403B; DK447684D0; ES536027A0; ATE31933T1; EP0136620A1; HUT35288A

Description

Descrição Breve das Figuras:

to de sédio-poliacrilamida de interferon imune humano recombinante purificado sob condições redutoras (A ; Q,7K de p-mercaptoetanol) e sob condições não-redutoras (B).

A figura 2 ilustra a comparação entre a sequência de aminoácidos prevista do interferon imune humano recombinante e a ver dadeira sequência de ADN das espécies de rIFN~Y de 1% e 1ÒK.

A figura 3 ilustra a separação mediante cromatografia líquido-líquido de elevada resolução dos peptidos de átomo de carbono terminal do rlFN-V de 1% e 16A apds tratamento com brometo de

cianogénio.

Foram estabelecidos anteriormente diversos processos para efectuar a extracção e a purificação da família de proteínas antivirais conhecidas como interferon. Até à data são conhecidas três classes principais de interferon: IFN-°t (leucócito ), IFN~p (fibroblasto) e IFN- (imune). Embora as diversas classes de interferon possam estar relacionadas em termos de arranjo antiviral, antiproliferativo ou estrutural, os conhecimentos até agora existentes têm sido incapazes de estabelecer um processo uniforme para a extracção e a purificação de todas estas classes. Na verdade, muitos dos processos utilizáveis para a extracção e a purificação de interferon de leucócitos a partir de uma mistura bruta de outras proteínas e detritos celulares não poderiamser aplicados à extracção e purificação de interferon de fibroblasto ou de interferon imune a partir do mesmo tipo de preparação.

A fase de extracção nos processos de purificação utilizados antes compreendia tipicamente ou a lise mecânica (isto é, acção de ultra-sons) ou a lise química de microrganismos que tinham

produzido, muitas vezes através de técnicas recombinantes, a proteína "estranha" desejada. Durante este processo de lise mecânica ou química, são também libertadas, na mistura, diversas protea ses celulares. Estas proteases estão depois livres para acturaem sobre e degradarem a proteína "estranha" na mistura .

Foi ainda referido que determinadas sequências de aminoácidos sobre interferon imune não são essenciais para a actividade antiviral. Por exemplo, Capon e colab. (referência 11) têm re ferido que os aminoácidos 136-146 de rIFN»y não são essenciais para a actividade antiviral.

Descrição dos Modos de Realização Preferidos:

Descobriu-se agora, no caso do interferon imune, que a extracção e a purificação por qualquer das técnicas convencionais an teriormente descritas não podem proporcionar uma preparação inteiramente homogénea de interferon imune com uma sequência de aminoácidos intacta ou completa. Apenas recentemente a tecnologia recombinante avançou até ao ponto em que é possível obter quantidades suficientes de rIFN~Y que permitam caracterizá-lo e determinar a sua sequência de aminoácidos. Quando foram utilizadas as técnicas convencionais anteriormente conhecidas para extrair preparações de rIFN-)^ e se determinou a sequência de aminoácidos do material purificado, descobriu-se que a preparação purificada era, de facto, constituída por uma grande variedade de espécies de pro teína relacionadas de diferentes pesos moleculares. Descobriu-se agora mediante sequenciação de aminoácidos que estas espécies de proteínas são realmente a forma de sequência intacta de interferon imune associada a uma grande porção de fragmentos proteolíticos da proteína de sequência intacta. Embora se tenha constatado

agora com surpresa que a mistura utilizada nas técnicas anteriores continha a proteína de interferon imune intacta e os seus fragmentos, descobriu-se com grande surpresa que, aparentemente, um compo nente desta mistura tinha retido actividade biolégica.

A extracção de IFN-^ humano a partir de microrganismos transformados que produzem e contêm esta proteína pode ser efectua da simples e efectivamente utilizando a lise com ultra-sons ou a lise mecânica. No entanto, admite-se que o rIFN-)f é degradado por proteases durante a fase de extracção. Submetendo células con geladas a ultra-sons, obtém-se uma mistura de produtos proteolíticos como rIFN~y de 154 (F.M. cerca de 15000 daltons; o composto de acordo com a presente invenção) que resulta da remoção dos restos de aminoácidos N²s. 13b a 146 do átomo de carbono terminal. Verificou-se que 0 rIFN-de 154, apés purificação, está isento de outros fragmentos proteolíticos e, significativamente, apresentava uma actividade biolégica igual à da proteína rIFN-de 18K completa (10? unidades/mg) e comparável à do interferon imune humg, no natural homogéneo (referência 7). As composições dos sminoácidos e as sequências de átomo de azoto terminal da proteína de 154 estavam de acordo com a que era esperada a partir da sequência de ADN. 0 aminoácido de rIFN-Y de 154 e a sequência de ADN correspondente estão indicados na Fig. 2 juntamente com o aminoácido e a sequência de ADN correspondente da proteína completa do interferon imune. A sequência-base de ADN do rIFN- humano de l8k, cog pleto utilizada ao longo da presente meméria descritiva é a que se encontra descrita na referência 1.

Consoante as técnicas de extracção, as espécies de pes© mo lecular (F. K.) diferentes (cerca de 15.000 a 18.000 daltons) de rIFN- \ foram purificadas separadamente. 0 interferon purificado

com um Ρ. M. aparente de 16.000 daltons sobre electroforese de gel de dodecilsulfato de sédio-poliacrilamida tinha sido obtido median te extracção com guanidina. No entanto, a espécie de interferon imune de Ρ. E. 15.000 mais baixo é extraído de preferência mediante a acção de ultra-sons, na ausência de guanidina. A sequência de grupo amino terminal de ambas as proteínas l8h e 1% estavam de acordo com a sequência prevista a partir do ADN que codifica a pro teína do interferon imune humano. Está também dentro do projecto da presente invenção que o grup© amino terminal da proteína do interferon imune podia começar com um resto de metionina (Met) como aminoácido do grupo amino terminal quando oposta a cisteína (Cys) como se mostra na Fig. 2.

As sequências do átomo de carbono terminal das proteínas de 1SK e 1% foram determinadas mediante análise e sequenciação do peptido de C-terminal purificado apás tratamento com brometo de cianogénio. A composição de aminoácidos e a sequência do peptido de C-terminal libertada a partir de rlFN-^ de lôK condiziam com a sequência prevista de rIPN- indicando que a espécie de 18K é a molécula intacta. Por outro lado, um peptido diferente cindido com brometo de cianogénio foi libertado a partir do C-terminal de rIFN- Y de 1%. Com base na análise de aminoácidos e da sequência, este peptido diferente correspondia aos restos de aminoácido N^Qs. 121 a 131 indicando que a espécie 1% era um produto proteolítico.

Em um modo de realização preferido da presente invenção, o microrganismo utilizado eomo receptor nas técnicas de fermentação e a menos que se indique de outra maneira, é o microrganismo "Escherichia coli" K-12 estirpe 29^ como se descreve na publicação da patente de invenção britânica N2 2O553S2A, que foi depositada na "American Type Culture Collectiorf’ sob o MQ de Entrada ATCC 31^6

em 28 de Outubro de 1978. Além disso, todo o trabalho do ADN rg, combinante foi aqui efectuado de acordo com as directrizes aplicáveis dos "National Institutes of Health",

Porém, a invenção inclui a utilização não sé de "E. coli" k-12 estirpe 29b-, mencionada antes, mas também de outras estirpes de "E. coli" equivalentes conhecidas como "E. coli" MA210 ou "E. coli" RRI (ATCC N² 313b-3), ou de outros microrganismos muitos dos quais se encontram à disposição do público ou estão depositados e podem ser obtidos em instituições de depósito de microrganismos reconhecidos, como a "American Type Culture Collection" (ver, por ex., o catálogo ATCC).

A expressão "actividade de interferon" utilizada no texto refere-se à actividade antiviral e anti-desenvolvimento características dos interferons. A actividade antiviral característica de rIFN pode ser determinada utilizando o ensaio de inibição do efeito citopático descrito por Familletti, P. C., e colab., "Methods in Enzymology", 78, 387 (1981). A actividade anti-desen volvimento característica de rIFN pode ser determinada de acordo com a técnica descrita por Evinger e Pestka em "Methods in Enzymology", 79, b-5 (1981).

Foram produzidos anticorpos monoclonais contra um polipej) tido sintético que contém os restos dos últimos 16 aminoácidos do peptido do C-terminal da rIFN- . Utilizou-se um dos anticorpos monoclonais (Mo 2-11,1) para a purificação de rIFNMais especificadamente, os anticorpos monoclonais e a coluna de afinidade de anticorpo de acordo com a presente invenção foram preparados pela maneira descrita no pedido de patente de invenção europeia publicada N² IO3898.

De acordo com a presente invenção, o novo interferon imune mencionado antes pode ser utilizado para os mesmos fins que os outros interferons conhecidos, por ex. na profilaxia ou no tratamento de perturbações virais ou neoplásticas ou no tratamento de condições de imuno-supressao. Pode ser administrado em composições e modos orais, injectáveis ou tópicos aceitáveis em farmácia. As doses utilizadas e a frequência da sua aplicação estão em paralelo com as correntemente usadas em aplicações clínicas dos interferons conhecidos, tipicamente cerca de 1-200 x 10^ unidades por dia. Estas composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção contêm o citado interferon imune associado a um excipiente compatível aceitável em farmácia. Pode utilizar-se qualquer substância excipiente convencional. A substância excipiente pode ser um material excipiente inerte, orgânico ou inorgânico, apropriado para administração enteral, percutânea ou parenteral. Os excipientes apropriados sao: água, gelatina, goma arábica, lactose, amido, estearato de magnésio, talco, óleos vegetais, polialquilenoglicóis, vaselina e similares. Além disso, as composições farmacêuticas podem conter outros agentes activos sob o ponto de vista farmacêutico. Pode adicionar-se outros aditivos como agentes aromatizantes, conservantes, estabilizantes, agentes emulsionantes, soluções-tampão e similares de acordo com as normas habituais de preparação de medicamentos.

As composições farmacêuticas podem apresentar-se em qualquer forma convencional incluindo: a) uma forma sólida para administra ção por via oral como comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, grânulos, e similares; b) uma forma líquida para administração por via oral como soluções, xaropes, suspensões, elixires e similares;

c) composições para administração parenteral como soluções, suspen sões ou emulsões estéreis; e d) composições para administração tó-

8

pica como soluções, suspensões, pomadas, cremes, geles, pós micro nizados, aerossois e similares. As composições farmacêuticas podem ser esterilizadas e/ou podem conter adjuvantes como conservan tes, estabilizantes, agentes molhantes, emulsionantes, sais regula dores da pressão osmótica e/ou compostos-tampão.

As formas de dosagem parenteral podem ser infusões ou soluções injectáveis que podem ser injectadas por via intravenosa ou intramuscular. Estas composições podem também conter outras substâncias terapeuticamente activas, Pode juntar-se outros aditivos como conservantes, estabilizantes, agentes emulsionantes, compostos-tampão e similares de acordo com as normas habituais de preparação de produtos farmacêuticos.

Exemplo 1

Síntese do complexo de proteína-polipeptido veiculo utilizado como antigénio

0 polipeptido H-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OH é unido à tiroglobulina (de aqui em diante TG) de acordo com o processo de Goodfriend e colab, '•Science”, 144, 1334 (1964).

0 peptido propriamente dito pode ser produzido por proces sos convencionais da síntese de peptidos. Pode utilizar-se ou o processo de fase sólida ou o de fase líquida, embora o processo de síntese de fase líquida seja vantajoso em muitos casos. Esses processos de síntese de peptidos encontram-se descritos, por exemplo, por Schróder e Ltlbke em "The peptides", Vol. 1, Academic Press, Nova York, USA, 1966, ou por Izumiya e colab. em "Peptide Syntheses”, Earuzen, Tóquio, Japão, 1975? ^ou P^or Haruaki Yajima

em "Experiments in Biochemistry", Vol. 1, pág. 207-^00, Tokyo Kagaku Dojin, 1977) e incluem, entre outros, o processo da azida, o processo do cloreto, o processo do anidrido de ácido, o processo do anidrido de ácido misto, o processo da diciclohexilcarbodiimida, o processo do éster activo, o processo que utiliza o reagente K de Woodward, o processo do carbodiimidazole, o processo de oxidação-redução e o processo da diciclohexilcarbodiimida/aditivo (por ex.HONB, HOBt, HOSu).

Para uma descrição pormenorizada da preparação do fragmen to 131-lh-ó de IFN- , ver o pedido de patente de invenção europeia publicada NS IO3.69B.

Mistura-se 2,5 mg do polipeptido citado com 3)75 mg de TG (tiroglobulina) e, apás adição de 2 ml de uma solução-tampao de 50 mM de fosfato, agita-se bem a mistura em água e gelo. Adiccio· na-se gradualmente, gota a gota, uma solução de 30A mg de cloridrato de carbodiimida em 200 ml de água destilada. Em seguida, agita-se a mistura em água e gelo durante 3 horas. Terniinada a reacção, efectua-se a diálise contra água destilada até um grau suficiente e liofiliza-se depois para se obter ê-,7 mg de um complexo de proteína.

Bxemplo 2

Preparação de antigénio ligado a enzima para o Imuno-ensai© de Enzima (EIA) para a detecção de anticorpos

0 antigénio ligado a enzima para EIA foi preparado de acordo com Kitagawa e colab, "Journal of Biochemistry", 79, 233 (1976).

(i) Introdução de um grupo maleimido no polipeptido

«SÉ?

>*' 1 - Μΐ

7S

SJ

10

Dlssolve-se, em 1 ml de 100 mM de solução-tampão de fosfa to (pH 6,8), 35θ nmoles do polipeptido preparado pelo processo descrito no exemplo 1 e adiciona-se a solução resultante a uma ®u tra solução de 5^5 (1>75 ytmoles) de éster de N-hidroxi-succi

nimida da N-(4-carboxiciclohexilmetil)-maleimida em 70 de N,N -dimetilformamida. Agita-se a mistura a 30®C durante 30 minutos. Terminada a reacção, efectua-se o fraccionamento, utilizando uma coluna de Sephadex 0-25, para se obter 185 nmoles de uma fracção de polipeptido com o grupo maleimido nela introduzido.

(ii) Combinação do polipeptido que contém o grupo maleimido com ^-D-galactosidase

Mistura-se 16,5 nmoles de polipeptido contendo 0 grupo ma leimido com 3,3 nmoles de Jõ-D-galactosidase. Após 18 horas de reacção a 4°C, adiciona-se 412,5 nmoles de ^-mercaptoetanol para terminar a reacção. Fracciona-se depois 0 polipeptido combinado com J^-D-galactosidase sobre uma coluna de Sepharcse 6b e utiliza-se nas experiências seguintes.

Exemplo 3

Imunizaçãe

Inoculou-se, por via subcutânea, cada uma de 6 murganhos-fêmeas BALB/C com sete a oito semanas de idade com 40 yxg (calca lado sobre a proteína) do complexo de proteína obtido no exemplo 1 como antigénio em mistura íntima com adjuvante completo de Freund (imunização primária). Duas semanas depois da imunização primária, inocula-se novamente os murganhos, por via subcutânea, com o antigénio, na mesma dose mencionada antes, cuidadosamente

misturado com adjuvante incompleto de Freund (imunização secunda ria). Ainda duas semanas depois, efectua-se uma terceira imunização pela mesma maneira que a imunização secundária. Seis dias depois da terceira imunização, colhe-se amostras de sangue parcial dos murgangos e determina-se os títulos de anticorpo do soro pelo método de EIA descrito adiante £ comparar "Immunopharmacology” 1, 3 (197Õ) J. 0 murganho com o número ^-2 forneceu o título de anticorpo mais elevado e foi submetido a uma imunização final mediante inoculação intravenosa com 120 ^ítg do antigénio dissolvido em 0,5 ml de solução aquosa de cloreto de sódio. Os resultados do título de anticorpo para cada murganho estão indica dos n© quadro 1.

Quadro 1

Títulos de anticorpo antipeptido em murganhos imunizados

	r ........—.................. ..............-.....—-------------------------------------------------------------------------B/Γ (7ϋ
Murganho NS	Imunização primária 1)	Imunização secundária 2)	Terceira imunização 3)
Y-1		N.D.	24,5
2	N.D. 5)	19,3	35,3
3	-	N.D.	Ά,7
4	N.D.	1,3	1,7
5	N.D.	1,6	5,o
6	-	N.D	0,8
Murganho normal	0,6	0,1 1	N.D.

1) Relaçao da diluição do soro: 1/1000

2) Relação da diluição do soro: 1/6500

5) Relação da diluição do soro: 1/7800

4) -: Não detectavel

5) N.D.: Não determinado

B/T: (Actividade do enzima ligado/activadade total do enzima adicionado) x 100

Método de EIA

A deteceão da actividade de anticorpo no soro do murganhos

X

imunizados com o complexo de proteína obtido de acordo com o processo descrito no exemplo 2 ou no liquido sobrenadante do bibridoma foi efectuada pelo método de EIA £ "Immunology" 1,5 (1978)]. Para isso, dilui-se o soro ou o liquido sobrenadante do bibridoma com uma solução-tampão A (20 mM de NagHPO^, 100 mM de NaCl, 0,1 % de NaNp 1 mM de MgClgJ pH 7,0), mistura-se uma porção de 100ytl da diluição com 100 yl do derivado de polipeptido ligado ao enzima (exemplo 2) e deixa-se processar a reacção a 24°C durante 24 horas. Em seguida, adiciona-se 100y/2 de celulose 5 % combinada com IgG de coelho anti-murganho e deixa-se reagir a 24°0 durante 4 horas. Terminada a reacção, lava-se bem a celulose com uma solução-tampão A contendo 0,5 % de Tween 20, adiciona-se depois 500 p2. de 4-metil-umbeliferil- ^-E-galactosido de 20.ytg/ml e, apos 2 horas de reacçao a 57°0, adiciona-se 5 ml de uma solucao-tampão de 100 mM de carbonato (pH 10,5) para terminar a reacção. Mede-se a intensidade de fluorescência com um fluorometro (excitação: 565 nmí emissão: 45O nm).

Exem·

Exemplo 4

Fusão de Células

Três dias depois da imunização final, pela maneira descri ta no exemplo 3> corta-se o baço do murganho ^-2, filtra-se sob pressão através de uma malha inoxidável e suspende-se em meio es sencial mínimo, de Sagle (EEK) para se obter uma suspensão de c£ lulas de baço. Para a fusão das células, utiliza-se células de mieloma ?3“ ^x 63· Ag 8.UI (p3Ul) provenientes de murganho BALB/C Z* "Current Topies in Microbiology and Immunology", 8l, 1 (1978)J. A fusão das células é efectuada pelo método original de KBhler e Eilstein, '‘Nature¹’, 256, 495-^97 (1975)· Assim, lava-se as célu las de baço e as células P381 separadamente, três vezes, com EEE isento de soro e mistura-se as células em uma relação de 5^1 (^emnúmero de células). Centrifuga-se a mistura a 800 rpm durante 15 minutos, depositando-se as células. Apés remoção cuidadosa do líquido sobrenadante, destaca-se ligeiramente 0 sedimento. Adiciona-se 0,3 ml de polietilenoglicol (PSG) 6000 a 45 % (Koch-Light) e deixa-se ficar a mistura em repouso em um tanque de água quente mantida a 37° C durante 7 minutos para se efectuar a fusão das células. Em seguida, adiciona-se MEM a uma velocidade de 2 ml por minuto. Apés adição de um total de Ig ml de EEE, centri, fuga-se a mistura resultante a 600 rpm durante 15 minutos e elimi na-se depois o líquido sobrenadante. Suspende-se o sedimento de células em meio RPEI-1640 suplementado com soro de feto de vitela a 10 % (RPM1-1640-10 FCS) em uma concentração de 2 x 10^ células P3Ul/ml e semeia-se cada uma de 144 concavidades de recipientes múltiplos com 24 concavidades (Linbro) com 1 ml da suspensão.

Apés sementeira, incuba-se as células a 37°C em um incubador com

5 % de anidrido carbónico gasoso. Após 24 horas, inicia-se a

cultura selectiva com HAT , adicionando meio EPEI 164O-1OFCS su-4 “7

plementado com meio de HAT (1 x 10 E de hipoxantina, 4 x 10 M

-5

de aminopterina, 1,6 x 10 E de timidina) em uma quantidade de

1 ml por concavidade. Continua-se a cultura selectiva em HAT en

quanto se substitui 1 ml do meio velho por 1 ml de meio de HAT,

3,5 e 7 dias depois do início da cultura. Toma-se nota do cresci

mento dos hibidromas 10 a 14 dias depois da fusão das células.

6

Quando o caldo de cultura se torna amarelo (cerca de 1 x 10 células/ml), separa-se o líquido sobrenadante e examina-se pelo método de EIA para avaliação da presença de anticorpos. Desta ma neira, são examinados os líquidos sobrenadantes das 141 concavida des em que se observa crescimento do hibridoma. Duas concavidades ( ^2-11 e 2-100) apresentavam uma intensa actividade de anticorpo e outras duas concavidades ( 2-62 e ^2-70) apresentavam uma actividade de anticorpo fraca.

Exemplo 5

Clonagem

Submete-se a clonagem, pelo método de diluição limitativo, os hibridomas de 3 concavidades ( ^2-11, ^2-62 e ^2-100) que apresentam actividade de anticorpo positiva. Deste modo, su£ pende-se as células de hibridoma em F.PEI 1640-20FCS, em uma concentração de pelo menos 2 células de hibridoma/ml e distribui-se a suspensão em porções de 0,1 ml pelas concavidades de uma microplaca com 96 concavidades. Na citada distribuição, distribui-se 5 x 10^, por concavidade, de timocitos de murganho BALH/C como cé lulas alimentadoras. Como resultado, observa-se proliferação de

is

células em cerca de 2 semanas. Separa-se depois o líquido sobrenadante e examina-se, para avaliação da presença de anticorpos, pelo método de EIA como se descreveu antes no exemplo 3. Tomou-se nota da actividade de anticorpo em 8 de 19 clénios da concavidade 2-11, em 3 8e 54 clénios da concavidade ^2-62 e em 5 ée 47 cldnios da concavidade γ2-100 (Quadro 2),

Quadro 2

Actividade do anticorpo anti-peptido dos hibridomas cionados

Hlbridoma N²	B/T (%)
Y2-11
1	68
2	31
3	63
6	68
7	67
9	69
12	42
18	60
V2-62
14	20
16	21
34	16
γ 2-100
2	69
3	70
16	56
25	80
46 —	33

Soro do murganho hiperimune

35

Exemplo 6

Capacidade de ligação de anticorpos monoclonais a IFNA capacidade de ligação de anticorpos monoclonais a lFN-)f é determinada pelo método seguinte:

A 300 fil de uma solução de celulose 3 ligada a anticorpo de IgG de coelho anti-murganho, adiciona-se 3θ0 Λ da cultura sobrenadante de cada uma das 2 ou 3 séries de células clonadas de cada uma das concavidades ^2-11, ^2-62 e ^2-100 e deixa-se reagir à

temperatura ambiente durante 12 a 20 horas. Depois, lava-se cuidadosamente a celulose com soro fisiológico e adiciona-se-lhe 550 U/ml de IFII-^ obtido de acordo com a técnica descrita adiante. Após 3 ^a 4 horas de reacção, separa-se 0 líquido sobrenadante e adiciona-se-lha o obtido pelo processo que se descreve a seguir. Decorridas 3 ^a 4 horas de reacçao, separa-se o líqui, do sobrenadante e determina-se, nele, a actividade de IFN-^ pelo método de leitura do efeito citopático (CPE) utilizando uma microplaca /'"Applied Microbiology", 16, 1706 (1968)/7. Assim, coloca-se de MEM em cada concavidade de uma micro-placa com 96

concavidades e adiciona-se 5θ fib da amostra de IFN à primeira corj cavidade, seguindo-se uma diluição de duas vezes em série. A cada concavidade assim preparada, adiciona-se 5θ fi~l de uma suspensão de células de WISH (4 x 10^ células/ml em meio de MEM contendo 20 % de FOS e efectua-se a incubação em um incubador com anidrido carbó nico gasoso, a 37°C, durante 24 horas. Em seguida, adiciona-se, a cada concavidade, JQ fi.1 de uma preparação de vírus da estomatite vesicular (estirpe Nova Jérsia) ajustada até uma concentração de 2000 TCID^q (TCID^qí dose infecta uma cultura média de tecido) e incuba-se em um incubador com anidrido carbónico, a 37°C. Cerca

de 35 horas depois, quando as células na concavidade isenta de amostra de IFN apresentaram 100 % de CPE, observa-se cada concavidade ao microscópio para avaliação do CPE e é referido, como título de IFN, a recíproca do factor de diluição para a amostra de IFN em que se nota, nessa concavidade, 50 % de CPE.

Utiliza-se, como amostra de IFN-, o líquido sobrenadante recolhido 72 horas depois da estimulação de linfócitos periféricos humanos com 40 yicg/ml de concanavalina A e 15 mg/ml de 12-0-tetra-decanoílforbol-13-acetato. Cada ml desta cultura sobrenadante continha 4400 unidades de IFN-)f humano (instável sob a acção do calor e de ácidos). Se, na cultura sobrenadante de células clonadas, estiverem presentes anticorpos com capacidade de li gação a IFN-, 0 IFN-adicionado deverá ligar-se aos anticorpos sobre a celulose e deverá ocorrer uma redução na actividade de IFN-Y do líquido sobrenadante. Como resultado, observa-se, pa ra 0 clónio ^2-11, uma actividade de ligação relativamente intensa para IFN-e 50-75 % 60 IFN-^ adicionado (550 U/fel) ficam ligados a anticorpos (quadro 3).

QuaQuadro 3

18

por anticorpos monoclonais

Absorção da actividade de lFN-|f

Cultura de hibridoma	... Actividade residual de IFN (U/ml)
A Experiência. 1 I	Experiencia 2
/ 2-11,1	138	275
V 2-11,2	207	N.D.
y 2-n,6	N.D.	275
2-62,2	275	550
Jf 2-62,3	275	550
2-100,2	550	N.D.
2-100,3	550	N.D.
-	550	550

Exemplo 7

Formação de ascite por hibridomas monoclonais produtores de anticorpos

A formação de ascite foi causada pela inoculação intraperitoneal de murganhos BALtí/C previamente tratados, por via intra6 \

péritoneal, com 0,5 ml de óleo mineral com 1 x 10 $2-11,1 de

células de clénios capazes de produzir anticorpos com actividade de ligação de IFN-^ . Dez dias depois da administração de hibri domas por via intraperitoneal, colheu-se o líquido ascítico e exa

minou-se, para avaliação da actividade de anticorpo até uma dilui7

ção de 10 vezes. Embora se detectasse a actividade de anticorpo

da cultura sobrenadante de células de clónios correspondente até

l

uma diluição de 10 vezes, a formação de ascite (ascitizaçao) con duziu a um aumento de cerca de 1000 vezes na actividade de anticorpos .

Exemplo 8

Purificação de anticorpos monoclonais

Utilizando 4 ml do líquido ascítico, obtido pelo processo descrito no exemplo 7, como material inicial, efectua-se a purifi, cação do anticorpo monoclonal pelo método de Staehelin e colab. /'"Journal of Biological Chemistry", 256. 975θ (19θ1) Para ijg, so, centrifuga-se primeiro o liquido ascítico a 10.000 rpm durante 15 minutos para eliminar, dele, as substâncias semelhantes a fibrina e dilui-se depois com uma solução-tampão de fosfato/soro fisiológico (PBS: 8,1 mM de Na^PO^, 1,5 mM de KH^PO^, 2,7 mM de KOI, 137 mM de NaCl; pH 7>2) até uma concentração em que a absorção ultravioleta a 280 nm (A^qq) esteja compreendida entre 12 e

14. Em seguida, adiciona-se uma solução aquosa saturada de sulfa fato de amonio à amostra diluída até uma concentração de sulfato de h-7 X. Agita-se a mistura a 4°C durante 60 minutos para efectuar a mistura dos ingredientes e centrifuga-se depois (10.000 rpm, 15 minutos), obtendo-se um precipitado que se dissolve em so lução-tampao de 20 mM de Tris (pH 7?9) contendo 50 mM de NaCl e dialisa contra 2 litros da mesma solução-tampão. Duas horas depois, substitui-se a solução de diálise por uma nova porção de 2 litros da mesma solução e continua-se a diálise durante mais 15 horas. Em seguida, elimina-se o precipitado mediante centrifugação a 10,000 rpm durante 15 minutos e ajusta-se o líquido sobre-

nadante até uma concentração tal que o valor de &28Q ^fl4^{ue com}“ preendido entre 20 e 3θ» Submete-se esta amostra a fraccionamen to sobre uma coluna de DSAfi-celulose (8 ml, 'whatman DE^) equili brada com uma quantidade suficiente de solução-tampão de Tris (pH 7,9) contendo 50 ml·' de NaCl, eluindo com uma solução-tampão de Tris contendo 50 mM de NaCl, a uma velocidade de escoamento de 1,5 ml/minuto. Sob estas condições, detectou-se a actividade de anticorpo principalmente nas fracções de efluente. A confirmação de que a amostra purificada é constituída por anticorpo é feita pelo método de SDS-rAu£, como foi descrito por Laemmli e colab., "Nature", 227, 6tí0 (1970). leste modo, algumas das frac ções obtidas mediante mistura com sulfato de amónio e fraccionamento sobre DEAE-celuloeesão, cada uma delas, submetidas a redução com 2-mercaptoetanol e, depois, a electroforese de gel com 17 % de SDS, a 30 volts, durante 24 horas. De acordo com os máximos de actividade, observa-se duas bandas nas posições correspondentes aos pesos moleculares de cerca de 55 quilodaltons (cadela H) e cerca de 20 quilodaltons (cadeia L). Examina-se a fraç: ção de anticorpo 17 assim purificada, para avaliação da actividade de ligação a IFN-^, adicionando 2200 l/ml de IFN- . Verifi

cou-se assim que estavam ligados cerca de 50 % âe IFN-y ao anticorpo (Quadro 4).

qua-

Amostra	Diluição	Actividade residual de IFN (U/ml)
Fracção 17 de	í 2-11,1	10"¹		1100
		10“²		1100
		10^-3		2200
		io"⁴		2200
Anticorpo monoclonal	io^-1		2200
de anti-IgE		io”²		2200
		10‘³		2200
	.....................„,„,1	10"^		2200

Exemplo 9

Sub-classe a que pertencem os anticorpos monoclonais

Dilui-se 10 vezes a fracção 17 de anticorpo purificado (exemplo 8) e submete-se a reacção de imuno-precipitação em agar (ensaio de Ouchterlony: "Immunological Methods, Gel-Diffusion Techniques", Blackwel, Oxford, I96M utilizando anticorpos IgGl, G2a, G2b e G3 de cabra anti-murganho (MLles) de maneira a poder identifi car-se a sub-classe de IgG a que possam pertencer os anticorpos monoclonais ^2-11,1. Encontrou-se uma única banda distinta entre 0 anticorpo monoclonal e o anticorpo IgG2b de cabra anti-murganho, não se observando qualquer formação de banda entre o anticorpo monoclonsl e outros anticorpos. Por conseguinte, verificou-se que o

citado anticorpo monocional pertence a igG2b (Quadro 5)·

quadro 5

Sub-classe do anticorpo monoclonal

Antigénio	.................................................. Anticorpo	Curva de precipitação
Anticorpo monoclonal da presente invenção (fracção 17)	Anti-IgGl
11	Anti-IgG2a	-
H	Anti-IgG2b	+
II 4	Anti-IgG3 1	-

Exemplo 10

Dialisa-se, durante a noite, 25 ml (65,3 mg) dos anticorpos monoclonais provenientes das fracções de efluente, purificados de acordo com a técnica descrita no exemplo 8, contra 0,lM de carbonato de hidrogénio e sédio (pH 8,3). Separadamente lava-se cuidadosamente 25 ml de AFFI-GEL 10 (Bio-Rad) com égua, utilizando um filtro de vidro, suspende-se em O,1M de carbonato de hidrogénio e sédio (pH 8,3) e mistura-se com os anticorpos mencionados antes. Agita-se suavemente a mistura a 4°C durante 4 horas para que se efeetue a reacção e deixa-se depois ficar em repouso a 4°C durante a noite. Lava-se bem o AFFI-GEL 10 com 0,lM de carbonato de hidrogénio e sédio (pH 8,3), utilizando um filtro de vidro. Adiciona-se, ao gel, 25 ml de uma solução

1

2^

(ρΗ 8,0) que contem O,1M de etanolamína e 0,15M de cloreto de sódio. Agita-se a mistura a 4°C durante uma hora de modo a bloquear os grupos activos que nao reagiram, eventualmente remanescentes. Depois, lava-se bem o gel com DBS e susnende-se em 25 ml de NaN^ a 0,1 % contendo DBS. Guarda-se a suspensão a 4 0. Com base na quantidade do anticorpo adicionado e na quantidade do anticorpo no filtrado recuperado, verificou-se que o anticorpo estava conjugado com o gel em uma proporção de 2,55 mg/ml de gel. Carree-a-se uma coluna com o produto de reacção obtido desta forma e utiliza-se aquela como uma coluna de anticorpos.

Exemplo 11

Utiliza-se, para a produção de rlEU-^, "E. coli" RKL (pRK148cI^._s, pRC23l/IEI-9OO) (a construção deste organismo recombinante está descrita em pormenor na publicação do pedido de patente de invenção europeia Ν- 99084). Os plasmidios pRKa48cI^._ge pRC23l/lEI-900 continham, respectivamente, renressor lambda sensível à temperatura e genes de IEN- . A expressão do gene rlEN-^ esteve sob contrôlo do promotor P-p

Cultivou-se, durante a noite, culturas de "E. coli" RR1 (pRK248cI_tg, pRC23l/lFI-9OO) em caldo LB a 30°C. Dilui-se 1 litro da cultura durante a noite ate 10 litros com meio M-9 minimo contendo ácidos casamino. Em crescimento logarítmico, a cultura ó desviada de 30° para 42°C e continua a crescer a 42°C durante 2

a 3 horas. Colhe-se as bactérias mediante centrifugação e guarO '

da-se as pastilhas bacterianas a -20 C ate serem utilizadas. Todas as fermentações e técnicas são efectuadas segundo as linhas

directrizes do ADN recombinante dos Institutos Nacionais de saúde.

Os anticorpos monoclonais foram feitos contra o peptido

de C-terminal 131-146 de rlFN-^ sintético pela maneira descrita antes. Utiliza-se anticorpo monoclonal Eo y2-ll_#l na purificação de rlFN-^ . Prepara-se a coluna de anticorpo monoclonal pe la maneira descrita no exemplo 10.

A carboximetilação de rIFN- Jf pelo ácido C-iodoacético é efectuada na presença de 6M de cloridrato de guanidina pela manei ra descrita na referência (3). 0 reagente em excesso é eliminado

mediante cromatografia líquida a alta pressão sobre coluna Cg de fase inversa. A digestão de carboxipeptidase é efectuada em 0,2M de carbonate) de hidrogénio e aménio pela maneira descrita na referência (4).

Trata-se o rlFN-^ com brometo de cianogénio (excesso 100 vezes molar em relaçao à metionina) em ácido fórmico a 70 > como se descreve na referência (5). Separa-se os peptidos-CNtír mediante cromatografia líquida a alta pressão sobre uma coluna C-18 de fase inversa. Utiliza-se, na eluição do peptido, um gradiente linear de 0 a 70 >· de cianeto de metilo (acetonitrilo) em ácido trifluoroacético a 0,1 %.

As amostras de proteína ou de peptido são hidrolisadas durante 20-24 horas, em tubos submetidos a vazio, varridos com azoto e fechados, em ácido clorídrico contendo 4 % de ácido tioglicélico em ebulição constante. Efectua-se as análises de aminoáeidos utilizando um analisador de aminoáeidos com fluorescamina como se des. creve na referência (6).

Utiliza-se um sequenciador (analisador de sequências) de fg. se gasosa ABI (Applied Biosystem, Inc.) 470 A para analisar as sequências das proteínas carboximetiladas, como se descreve na referência (7). As amostras de BTH-aminoácidos foram identificadas mediante cromatografia líquida a alta pressão de fase Inversa sobre uma coluna de ultra-esferas de ODS, como se descreve na referência

Todas as fases da purificação são efectuadas a 4°C. Suspende-se 25 g de células congeladas em três volumes (75 ml) de 7M de cloridrato de guanidina (pFÍ 7). Agita-se a mistura durante 1 ho ra e centrifuga-se depois durante 1 hora a 30.000 x g. Dilui-se dez vezes o líquido sobrenadante com soro fisiológico de Dulbecco tamponizado com fosfato ou com solução-tampão de 0,15M de borato de sódio (pH 9,5) θ centrifuga-se depois durante 30 minutos a 30.000 x g. Em alternativa, suspende-se 25 g de células congeladas em 1,5 volume (37,5 ml) óe uma solução-tampão de O,15M de bora to de sódio (pH 9,5) θ agita-se durante 1 hora. Submete-se a mistura cinco vezes a ultra-sons durante 30 segundos e centrifuga-se depois durante uma hora a 3θ·000 x g. Mistura-se os líquidos sobrenadantes, quer da extracção com cloridrato de guanidina quer do tratamento com ultra-sons, durante 1 hora, sobre um agitador ro tativo, com 25 ml de sílica e lava-se previamente com PBS. Deita-se a mistura sobre uma coluna e lava-se esta com 20 a 30 volumes da coluna de 1M de cloreto de sódio. Elui-se depois a coluna com 0,5M de cloreto de tetrametilamónio em solução-tampão de 0,0lM de borato de sódio (pH 8,0). Elui-se a actividade de interferon em cerca de 200 ml e separa-se em b· porções. Carrega-se cada porção sobre uma coluna de afinidade de anticorpo monoclonal ( ^2-11,1) (coluna de camada: h- ml) equilibrada com PBS. Após lavagem com 10 volumes da coluna de soluçeo-tampão de PBS, elui-se a coluna ou com 1M de cloridrato de guanidina ou com etilenoglicol a 5θ λ contendo 1M de cloreto de sódio e solução-tampão de 20 mM de fosfato de sódio (pH 7,0)· A actividade de interferon foi eluída nos primeiros 20 ml.

Efectua-se SDS-nAGE de acordo com a técina descrita por

V

Laemmli (referência 9). Determina-se a proteíns mediante análise com fluorescamina, utilizando albumina de soro bovino cristalina como padrão de referência. A actividade de interferon foi detex minada por um ensaio de inibição do efeito citopático com vírus da estomatite vesicular e células aISH humanas, como se descreve na referência 10. Todos os títulos de interferon são expressos em unidades de referência/ml graduadas em relação ao padrão de referência de interferon imune humano parcialmente purificado.

Apresenta-se, no quadro 6 (página 29 da memória descritiva) um resumo da técnica de purificação por extracção. A recupe ração total foi de 25 a 32 λ θ a purificação foi de cerca de 100

a 769 vezes com uma actividade específica média de 1 χ 1θ'^ unidades/mg. 0 rendimento total de r±FN-^ foi 3 ^a 4 vezes mais elevado com a extracção com guanidina. SDE-BAQE do óltimo estádio de purificação está representado na Figura 1. 0 material purificado

mediante extracção com guanidina apresenta uma banda simples a cer ca de 18.000 daltons (13 K rlFi-^ ) enquanto o material purificado pela técnica de tratamento com ultra-sons apresenta uma banda principal a cerca de 15.000 daltons (15K rlFN-^ ) e uma banda menor a cerca de 17.000 daltons (Fig. IA). Sobre gel nao redutor, formáram-se dímeros e oligómeros de rlFN-^ (Fig. IB).

0 rIFN-y de ldh era homogéneo e a composição de aminoácidos estava de acordo com a prevista a partir da sequência de ADN. As composições em aminoácidos de rIFN-Χ* de 15K e 18K estão indicadas no Quadro 7. Diversas centenas de picomoles de proteína de 15K e 18K reduzida e carboximetilada sofreram a degradação de Edman em um analisador de sequências (sequenciador) automático de proteína/peptido em fase gasosa. As sequências de aminoácidos de N-terminal dos primeiros 32 e 26 resíduos das proteínas 15K e l8K,

respectivamente, estavam de acordo com o que tinha sido previsto pela sequência de ADN (Fig.l). Forsm detectadas cisteínas ^lL|e-carboximetiladas no primeiro e no terceiro ciclos das análises da sequência. Não se detectou qualquer metionina N-terminal. A análi se da sequência N-terminal do "IFN-Y de 1ÓK e 15K. demonstrou que a sequência desta área de ambas as proteínas é idêntica à prevista a partir da sequência de ADN. Caracterizou-se também os peptidos de C-terminal para determinar se ocorreram quaisquer supressões ou alterações nesta região. A análise dos aminoácidos da mistura de digestão com carboxipeptidase A (CPA) indicou que foram libertadas serina e/ou glutamina (aminoácidos de C-terminal) a partir do rIFN-Υ de l8k, enquanto 0 IFN«Y de 15B não foi digerido por CPA nas mesmas condições. Como Ser-Gln é a sequência de C-terminal de rIFN«Y , a espécie de 18K parece ter o C-terminal intacto enquanto a espécie de l^B tem um resíduo de C-terminal diferente (Dys) que nao é cindido por CPA.

Os resíduos de C-terminal previstos a partir das sequências de ADN foram ainda confirmados mediante análise e sequenciação dos peptidos de C-terminal apés tratamento com brometo de cianogénio.

Os peptidos de C-terminal foram separados sobre uma coluna de fase inversa da cromatografia líquida a alta pressão (Fig. 3). Obtém-se um máximo de peptidos nítido (máximo II), eluindo com a primeira parte do gradiente, a partir do r!FN«Y de l^K e este pe£ tido estava ausente da mistura de digestão com brometo de cianogenio do rIFN~Y de 18K. A análise dos aminoácidos deste peptido indicou que este peptido não tem nenhuma homoserina ou lactona de ho moserina e, por isso, deve ser o peptido-CNBr de C-terminal da pro telna de 15K. Com base na análise dos aminoácidos (Quadro 8) este peptido correspondia aos resíduos de aminoácido N²s. 121-131 de

23

I

IFN-^ (nenhuma arginina detectável). A sequência dos 11 aminoácidos foi confirmada pela análise de sequências (Fig. 2). No ca so de rIFN-$ de 1ÕK, obteve-se um máximo relativamente largo na primeira parte da eluição. Este máximo foi depois separado em dois máximos com um gradiente fraco. As análises de aminoácidos indicaram que o primeiro máximo é o peptido de C-terminal com CNBr da proteína de ltíK (Quadro 8) e a composição dos aminoácidos corresponde aos resíduos de aminoácidos N^s. 138-146. A sequência dos 9 aminoácidos foi verificada mediante determinação da sequência (Fig. 2). Determinou-se que o aminoácido de C-terminal da proteína de 15K era a. lisina.

Estes resultados indicam que a espécie de 18K era a molécula de rIFN~y intacta, enquanto a espécie de 15K era um produto proteolítico. A ligação peptídica entre os resíduos de aminoácido N2 I3I e Νδ I32 (Lys-Arg) estava cindida na espécie de 15K.

Exemplo 12

0 fragmento de 15K de interferon imune foi purificado até à homogeneidade a partir da mistura que contém outros fragmentos, isto é o fragmento de 17K, utilizando as seguintes técnicas adicionais. 0 líquido sobrenadante obtido na técnica de tratamento

com ultra-sons (10,3 mg de proteína; actividade específica; z

0,9 x 10° U/mg), que foi purificado através da coluna de afinidade de anticorpo monoclonal, foi ainda purificado mediante electro forese de gel SDS-FAGE (16 placas de gel; acrilamida: 12,5 >1;

SDS: 0,1 espessura: 3-5 mm). Corou-se primeiro um entalhe do gel com Azul Brilhante Coomassie R-250 a 0,1 % e descorou-se depois com ácido acético a 10 X em metanol a 15 Cortou-se as bandas de gel de 15K correspondentes de outros entalhes sobre o

gel esmagou-se as mesmas e agitou-se em SDS a 0,1 a 4°C, durante 2 dias. Filtrou-se depois a solução sobre papel de filtro. Liofilizou-se o filtrado e juntou-se depois a 6 volumes de etanol. Dissolveu-se o precipitado resultante em SDS a 0,1 / para se obter uma solução de componente monomérico de 154 homogéneo (1,1 mg de proteína; actividade específica: 0,3 x 10 ⁸ U/mg).

Quadro 6

Purificação de rIFN«y

Fase de Puricaçao	Proteína Actividade	Actividade Específica Unidade/mg	N2 de Purifi cações	Rendi mento %
Total mg	Total_ Unidades
	I.	Extracção de	Guanidina
Líquido sobrenadante	c.8o6	2,5 x 10^	9 x IO⁴	-	100
Sílica	98	1,0 x 10⁸	1 χ 10⁶	11	40
Anticorpo Monoclonal	0	0,8 x 10⁸	1 χ 10⁷	110	32
	II.	Sonificação
Líquido sobrenadante	6.I36	8,0 x 10⁷	1,3 χ io⁴		100
Sílica	87	4,5 χ 1o⁷	5,2 x 10⁶	400	56
Anticorpo Monoclonal	2	2,0 χ 10⁷	1,0 x 10⁷	769	25

Quaquadro 7

Composições de Aminoáeidos rIFN-|f de 15K e 18K

	(Números dos resíduos)
18K (1-146)	1¾......li-UU
Asp	20,9 (20)	19,9 (20)
Thr	5,1 ( 5)	4,9 ( 5)
Ser	9,8 (11)	6,7 ( 9)
Glu	18,5 (18)	15,1 06)
Pro	* ( 2)	* ( 2)
Gly	5,9 ( 5)	5,6 ( s
Ala	8,2 ( 8)	7,3 ( 7)
Cys	* ( 2)	* ( 2)
Vai	9,1 ( ΰ)	9,1 ( 8)
Eet	4,7 ( 4)	3,6 ( 3)
Ile	7,2 ( 7)	6,6 ( 7)
Leu	10,5 (10)	9,6 ( 9)
Tyr	5,5 ( 5)	“t,8 ( 5)
Phe	io,3 (io)	8,2 ( 9)
His	1,8 ( 2)	2,5 ( 2)
Lys	19,9 (20)	16,9 09)
Arg	8,6 ( 8)	5,6 ( 3)
Trp	* ( D	* (1)

Os numeros entre parêntesis indicam a quantidade prevista de resíduos a partir da sequência de ADN.

* Valores não determinados.

qua

ii

Peptidos-CNBr de C-terminal de 15 À e l8k

	15K	18K
Thr	0,9
Ser	1,1 (1)	0,84 (1)
Glu	1,1 (D	1,1 (D
Pro
Gly	1,5 (1)	1,3 (D
Ala	2,4 (3)	1,1 (D
Leu	1,0 (1)	1,1 (D
Phe		1,0 (1)
Lys	1,9 (2)	2,8 (3)

Posições na

sequência 121-131 138-146

Os números entre parêntesis indicam 0 número de resíduos vistos a partir da sequência de ADN.

* Não determinado.

RefREFERÊNCIAS

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Claims

Reivindicações

1.- Processo para a produção de um polipeptido com a seguinte sequência de aminoácidos:

Cys Tyr Cys Gin Asp Pro Tyr Vai Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Vai Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gin Ser Gin Ile Vai Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gin Ser Ile Gin Lys Ser Vai Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Vai Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Vai Thr Asp Leu Asn Vai Gin Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gin Vai Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys

sequência esta que pode conter, facultativamente, um resto de metionina adicional no grupo amino terminal,

essencialmente isento de outros peptidos e tendo substancialmente a mesma actividade que o gama-interferon, caracterizado pelo facto de se extrair microrganismos transformados capazes de exprimir interferon imune após rotura das células na ausência de um inibidor de protease e de se purificar o extracto obtido utilizando anticorpos monoclonais em relação ao interferon imune.

2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se efectuar a rotura das células pela acção de ultra-sons.

3. - Processo para a preparação de composições farmacêuticas, caracterizado pelo facto de se misturar um polipeptido

com a seguinte sequência de aminoácidos:

sequencia esta que pode conter, facultativamente, um resto de metionina adicional no grupo amino terminal, essencialmente isento de outros peptidos e tendo substacnialmente a mesma actividade que o gama-interferon, como ingrediente activo com um excipiente inerte apropriado, aceitável sob o ponto de vis

ta farmacêutico.