CN1113952A - 白细胞介素2-乙肝病毒前s抗原融合蛋白及其制法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物制品，它为白细胞介素2
(IL-2)与乙肝病毒前S(Pre-s)抗原的融合蛋白，具
有免疫佐剂和疫苗性能。通过优化转译起始序列，合
成IL-2和Pre-s功能区基因上下游引物、SD序列
及中间接头，去除IL-2终止密码子，增设Pre-s下
游终止密码子TAG，经基因融合与基因表达程序获
得具有IL-2和Pre-s双活性融合蛋白。它可做为
免疫增强剂用于多种疾病的治疗。
Description
本发明涉及一种生物制品。
以往研究表明：IL-2是由T淋巴细胞分泌的一种细胞因子，可作用于T、B细胞，NK细胞和巨噬细胞，增强抗感染、抗肿瘤的免疫功能，IL-2还具有免疫佐剂效应，增加抗原的免疫原性。它是治疗肿瘤、免疫性疾病及病毒感染性疾病的重要生物制品。
HBV Pre-s抗原有强的诱导T和B细胞免疫应答的表位，具有和肝细胞膜受体结合的位点。Pre-s抗原能刺激机体产生保护性抗体，并克服对S抗原的无应答状态，且所诱导的T和B细胞免疫应答早于S抗原。HBVPre-s抗原与S抗原一起可能构成更有效的乙肝疫苗（MulelJJet al，J.Immunol，1985，135：646;EltinghausenSE et al，J.Immunol，1985，135：1488;Karray S et al，J.Exp.Med，1988，168：85;Veutos et al，Lancet.1987，2：119;Alberti A et al，Hepatology;1984，4：220;Neurath AR et al，Cell，1986，46：492;Franco A et al，J.Exp.Med，1992，175：1195;Neurath A R et al，Vaccine，1989，7：234;Milich DR et al，Science，1985，228：1195;）.
目前有IL-2与别的细胞因子、免疫球蛋白、病毒抗原或细菌毒素的基因融合与化学融合产品，并试用于临床治疗与诊断。已有化学合成的IL-2与HBVs抗原10个氨基酸肽和IL-116-3-171位9个氨基酸肽与HBVs抗原20个氨基酸肽的融合分子，后者能刺激产生中和抗体。已有HBV基因工程疫苗，并应用于人群预防，有HBVPre-s抗原中单独的HBVPre-s1和Pre-s2化学合成抗原和基因重组抗原的研究报导，得出上述研究结果。
上术都是IL-2和HBVPre-s抗原单分子在某些领域的研究。目前尚未见具有IL-2-HBVPre-s抗原融合蛋白的报导。
现有IL-2制品稳定性不高，纯化与保存需加微量SDS，另外其在体内半衰期短，用于抗肿瘤和抗病毒感染治疗的剂量大，易出现副作用。现有的血源和基因工程乙型肝炎疫苗只有预防作用，没有治疗效果，现在各种药物对清除HBV慢性感染或携带者治疗效果均不理想。为了增强IL-2的稳定性，在纯化与保存中不加SDS，延长其在体内的半衰期，减少副作用，提高抗肿瘤、抗病毒感染的治疗效果，同时为了研制一种既能预防HBV感染，又能诱导慢性乙肝患者或HBV携带者对HBV产生有效免疫应答，以清除体内HBV的药物，我们用基因工程方法制备了IL-2-HBVPre-s抗原融合蛋白。
本发明的目的是通过下述方法实现的。
我们通过优化转译起始序列，合成IL-2和Pre-s上下游引物，SD序列和IL-3N端片段接头，去除IL-2终止密码子，增设Pre-s下游终止密码子，经PCR扩增目的基因，分别进行克隆，再经PCR扩增及酶切获得IL-2和HBVPre-s抗原功能区基因片段，纯化后经基因融合，重组到大肠杆菌表达载体pKpL-3a，转化大肠杆菌诱导表达、分离包涵体，变性，复性及纯化获得具有IL-2HBVPre-s抗原双活性的融合蛋白。
IL-2-HBVPre-s抗原融合蛋白较IL-2和Pre-s单分子或双分子联合应用有更多生物学效应。
图1为IL-2-HBVPre-s抗原融合蛋白DNA碱基序列（bp）
图2为氨基酸序列图
图3为融合蛋白表达载体示意图，其中1示IL-2基因，2示中间接头，3示Pre-s基因，4示pKpL载体DNA。
下面结合附图对本实施例作详细说明。
图1 IL-2-HBV Pre-s抗原融合蛋白由IL-2序列（DNA序列1-405bp），IL-3N端亲水性中间接头（DNA序列405-448bp），HBVPre-s抗原序列（DNA序列449-945bp）编码，中间接头由Ala、Pro、Met、Thr、Gln、Pro、Leu、Lys、Ser、Trp、Val所组成。IL-2和Pre-s抗原与天然分子实质上一致，可与相应配基结合，转导生物信息，引起生物活性，并可与相应抗体进行反应。
为获得最佳碱基排列，避免可能干扰转译起始的mRNA二级结构，增加表达的IL-2均一性和稳定性，在构建IL-2cDNA质粒表达克隆pKpL-hIL-2时已除去其起始密码子ATG。现以人工合成的SD序列为上游引物（5′TCGACCTAAGGAGGTTTAAC3′），IL-2基因功能区3′端为下游引物（5′-GTTAGTGTTGAG ATGATGCTTT3′），下游引物去除终止密码TAG，以pKpL-hIL-2cDNA克隆为模板，经PCR扩增IL-2基因片段，获得约0.4Kb产物。该PCR产物用PromegaMagic试剂纯化，经SalⅠ酶切后再纯化，与SmaⅠ接头连接，再经SmaⅠ酶切，将经上述处理的PCR产物与经SalⅠ和SmaⅠ双酶切后的pKpL表达载体重组，转化pop2136受体菌，挑选克隆，经诱导表达和质粒酶切鉴定获阳性克隆pKpL-mhIL-2。
按已公布的HBV ayw亚型DNA序列设计Pre-s功能区基因上游和下游引物，上游引物为Pre-s1基因上游序列（5′CCACACAATCTTTCCACCACCAAT3′）去掉了起始密码子ATG;下游引物为Pre-s2下游序列（5′ACTCTAGATGTTCTCCATGTTCAGCG3′）引入XbaⅠ酶切位点和终止密码子TAG。以pHBV-1克隆为模板，PCR扩增Pre-s基因片段，获得约0.5Kb产物，经Promega Magic试剂纯化，XbaⅠ酶切，再经纯化后，与带IL-3N端亲水性氨基酸中间接头的pKpL表达载体重组;经清除后，转化受体菌pop2136，经诱导表达和质粒酶切鉴定获得阳性克隆pKpL-Pre-s。
图2显示pKpL-3a表达载体，由温度诱导抑制子基因cⅠ857ts，pL启动子，SD序列及紧跟的多克隆位点（SalⅠ、PstⅠ、SphⅠ、HindⅢ），Cat基因，Ampr基因，复制起始点等组成。将纯化的pKpL-mhIL-2经SalⅠ和SmaⅠ双酶切，Promega Magic试剂纯化;以IL-3N端亲水性氨基酸中间接头序列（5′GCTCCCATGACCCAGACAACG3′）为上游引物，Pre-s下游序列为下游引物（见上），pKpL-Pre-s克隆为模板，PCR扩增中间接头-Pre-s功能区基因片段，经Promega Magic试剂纯化，XbaⅠ酶切，再纯化，将纯化的表达载体pKpL-3a用SalⅠ和XbaⅠ双酶切，纯化。将上述三种酶切纯化产物在最适条件下重组，转化受体菌pop2136，经诱导表达和质粒鉴定获得IL-2-HBVPre-s抗原融合蛋白的表达克隆pKpL-ⅠP1。
将pKpL-ⅠP1克隆转化pop2136受体菌，以2%接种量种于LA液体培养基，30℃水浴振荡约7小时，加等体积新鲜LA液体培养基，42℃诱导4小时，8000rpm，5min收获菌体，裂解，SDS-PAGE电泳，用薄层扫描仪测得表达蛋白占菌体总蛋白31%，蛋白带的分子量为33-35KD，与理论计算值相符，融合蛋白氨基酸序列与图1序列相应氨基酸一致。
将上述收获菌体置冰浴超声破碎，10000rpm，10min4℃，包涵体沉淀用含2M尿素洗涤液（含TritonX-100）洗涤一次，再用0.01MpH7.4PBS洗一次，8M尿素变性（含-ME，Glycine）37℃1小时，室温过夜复性，透析后过离子交换层析柱，可获得纯度大于95%的纯品。
用IL-2依赖细胞株CTLL经MTT化学显色比色法测定融合蛋白制品中IL-2活性单位，比活性>107u/mg蛋白。用ELISA和Western Blot方法证明融合蛋白含有Pre-s抗原性和pHSA受体活性。
本发明的优点是：
1、IL-2-Pre-s抗原融合蛋白使IL-2溶解度增加，稳定性增强。
2、IL-2-Pre-s抗原融合蛋白可使IL-2在体内半衰期处长，因而能提高IL-2抗癌治疗效果。
3、IL-2-Pre-s抗原融合蛋白由于IL-2的佐剂效应及免疫调节效应和Pre-s强免疫原性，能使对HBVs抗原无应答的个体和HBV携带者产生中和抗体和特异性细胞免疫。
4、IL-2-Pre-s抗原融合蛋白具有双重导向性，有利于激活免疫活性细胞，特别是增强肝脏局部免疫功能，有利于肝炎与肝癌的治疗。
5、本制备方法简单可靠，产量高，成本低，有利于大规模生产。
Claims (7)
1、一种白细胞介素2-乙肝病毒前S抗原的融合蛋白，其特征在于是由白细胞介素2-亲水性氨基酸中间接头-乙肝病毒前S抗原多肽序列组成，分子量为33-35KD。
2、根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的亲水性氨基酸中间接头序列的长度为30-45bp DNA。
3、根据权利要求1和2的融合蛋白，其特征在于所述的亲水性氨基酸中间接头由白细胞介素-3N端序列的氨基酸Ala、Pro、Met、Thr、Gln、Pro、Leu、Lys、Ser、Trp、Val所组成。
4、根据权利要求1的融合蛋白编码序列，其特征在于含有图1DNA序列。
5、根据权利要求1的融合蛋白，其特征在于含有图1DNA序列相应的氨基酸序列。
6、一种白细胞介素2-乙肝病毒前S抗原融合蛋白的制备方法，其特征在于：
（1）白细胞介素3N端亲水性氨基酸中间接头与乙肝病毒前S抗原功能区基因的克隆。
（2）白细胞介素2功能区基因去除终止密码的克隆。
（3）融合蛋白表达载体pKpL-3a进行表达。
（4）大肠杆菌的高效表达融合蛋白。
（5）经变性、复性和液相层析而获得纯品。
7、根据权利要求1的融合蛋白，可应用于免疫调节抗癌和乙型肝炎预防与治疗的药剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 94106490 CN1113952A (zh) | 1994-06-23 | 1994-06-23 | 白细胞介素2-乙肝病毒前s抗原融合蛋白及其制法和用途 |
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|---|---|---|---|
| CN 94106490 CN1113952A (zh) | 1994-06-23 | 1994-06-23 | 白细胞介素2-乙肝病毒前s抗原融合蛋白及其制法和用途 |
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| CN1113952A true CN1113952A (zh) | 1995-12-27 |
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ID=5032586
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| CN 94106490 Pending CN1113952A (zh) | 1994-06-23 | 1994-06-23 | 白细胞介素2-乙肝病毒前s抗原融合蛋白及其制法和用途 |
Country Status (1)
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| CN (1) | CN1113952A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100368438C (zh) * | 2006-02-21 | 2008-02-13 | 中国科学院微生物研究所 | 一种抗乙肝病毒融合蛋白及其编码基因与应用 |
-
1994
- 1994-06-23 CN CN 94106490 patent/CN1113952A/zh active Pending
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| CN100368438C (zh) * | 2006-02-21 | 2008-02-13 | 中国科学院微生物研究所 | 一种抗乙肝病毒融合蛋白及其编码基因与应用 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |