CN100368438C - 一种抗乙肝病毒融合蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗乙肝病毒融合蛋白及其编码基因与应用。该抗乙肝病毒融合蛋白，自氨基端到羧基端是依次紧密串联的乙型肝炎病毒表面抗原、连接肽、凝血酶识别位点和胸腺肽；所述连接肽的氨基酸序列为GlyGlyGlySer；所述凝血酶识别位点的氨基酸序列为ArgLys；所述胸腺肽的氨基酸序列如序列表中序列2所示。本发明的抗乙肝病毒融合蛋白用作乙肝治疗性疫苗。

Description

一种抗乙肝病毒融合蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种抗乙肝病毒融合蛋白及其编码基因与应用，特别涉及一种在汉逊酵母中表达的抗乙肝病毒融合蛋白及其编码基因与以该抗乙肝病毒融合蛋白为活性成分的疫苗。

背景技术

乙肝病毒传染性相当强，几乎无孔不入，叫人防不胜防。由于乙肝患者在早期并无明显不良反应或自觉症状，病情呈慢性及隐匿性发展，以致患者不能及时诊断治疗，延误了病情而导致肝硬化甚至肝癌的发生，在此过程中，由于病人未能隔离，乙肝病毒伺机蔓延，危害更多人。据国家卫生部统计，我国乙肝病毒感染率高，乙肝病毒携带者达1.2亿之多，几乎每10人中就有一人被感染。慢性乙肝和肝硬化患者有3000余万，且每年新增病人200万。每年因肝硬化和肝癌而死亡的人数超过30万。目前的乙肝疫苗只能起到预防作用，不能彻底的治疗乙肝。所以治疗性乙肝疫苗的生产就成为了目前的首要任务。

1995年前医学界普遍认为，疫苗只作预防疾病用。随着免疫学研究的发展，人们发现了疫苗的新用途，即可以治疗一些难治性疾病。从此，疫苗兼有了预防与治疗双重作用，治疗性疫苗属于特异性主动免疫疗法。1998年在法国、日本也开始用乙肝病毒某些基因片段表达的多肽加上各种不同佐剂配制的治疗性疫苗作临床研究，观察这种多肽疫苗对慢性乙肝病毒携带者的治疗作用。其结果揭示，这种疫苗对乙肝病毒转基因鼠有抗病毒作用，单一应用特别是与抗乙肝病毒药联合应用，对慢性乙肝病毒携带者有一定的疗效。1999年美国研制了新的多肽治疗性疫苗，并对这种治疗性疫苗的免疫学作用进行了深入研究。初步证明，治疗性疫苗可以打破慢性乙肝病毒感染患者最主要的免疫学反应紊乱，即对乙肝病毒及其抗原不产生免疫应答——免疫耐受状态。

乙肝病毒(HBV)感染人体后肝脏慢性损害变化极为复杂，由于抗HBV药物的疗效与各种免疫细胞和免疫活性因子有依赖关系，故近几年有许多学者主张用联合疗法。河南新乡医学院第一附属医院孙屹峰等人采用胸腺肽，乙肝疫苗，干扰素三者联合治疗慢性乙型肝炎，其结果显示，干扰素以被证实对慢性HBV感染有确切疗效，但因其无法清除共价闭合环状DNA(_CCCDNA)及已整合到宿主DNA中的病毒基因，故复发率高。他的研究结果显示，胸腺肽能够促进有丝分裂原激活T细胞成熟，增强集体干扰素及白介素-2的分泌。大剂量胸腺肽可以对抗慢性HBV感染患者血清免疫抑制因子，恢复ConA诱导和抑制细胞功能；加强干扰素的治疗效果均与其促进机体细胞免疫有关。大剂量的胸腺肽能使慢性HBV感染的“免疫耐受”被打破。用乙肝疫苗能进一步刺激机体的特异性细胞免疫，最终达到更好地清除机体内HBV的目的。叶新水等人从治疗慢性乙型肝炎的临床观察中得出的结论是，胸腺肽加乙肝疫苗联合组30例，乙肝疫苗组30例，护肝组20例，通过临床观察发现，HbeAg/Hbe转换率联合组46.7％，乙肝疫苗组20％，联合组比后两组具有显著性差异(P＜0.05)。齐鲁石化公司中心医院的翟志珍用胸腺肽与乙肝疫苗联用治疗慢性乙肝76例，结果显示，两组HbeAg、HBVDNA阴转率及抗Hbe阳转率差异均有高度显著差异，治疗组明显优于对照组(P＜0.01)，而且治疗组在治疗过程中未见明显的副作用。现在已知慢性肝炎及其乙肝病毒携带者缺乏同型的抗HBs抗体，且发现有免疫耐受现象，用胸腺肽提高机体免疫功能，用乙肝表面抗原刺激机体特异性免疫反应，二者联用可同时增强细胞免疫和体液免疫功能，同时调节免疫平衡，有利于抑制或清除机体内的HBV。缩短了干扰素的使用时间，避免血清中干扰素抗体的产生，同时使干扰素长期应用所产生的诸多不良反应得到降低。

胸腺肽是具有生物活性的多肽制剂，具有增强细胞免疫功能，调节免疫状态的作用。其主要作用有：1)在胸腺内使骨髓肝细胞转化为T细胞，2)提高已成熟的具有免疫活性的淋巴细胞的免疫功能。

目前胸腺肽已在多个国家批准生产，用于抗病毒及肿瘤等治疗。但是现在临床使用的胸腺肽多为化学合成产品，价格比较昂贵，推广应用受到限制。目前很多学者采用融合蛋白的方法合成胸腺肽基因，并获得成功表达。由于胸腺肽单体分子是仅有28个氨基酸的小分子短肽，纯化非常困难，因此不利于工业化生产。目前，许多学者利用融合蛋白和串体方法成功的表达了胸腺肽，并且纯化出的单体类似物和天然胸腺肽活性相当。例如，第四军医大学的石继红等人将胸腺肽和硫氧还原蛋白融合表达，并得到了高效表达，而且生物活性很高。

国内主要采用的是将干扰素，乙肝疫苗，胸腺肽三者联合起来共同治疗乙肝，大量的临床实验表明这种方法在治疗乙肝方面较为理想，但是共同用三种药物较为复杂，且胸腺肽不易于纯化。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种抗乙肝病毒融合蛋白及其编码基因。

本发明所提供的抗乙肝病毒融合蛋白，自氨基端到羧基端是依次紧密串联的乙型肝炎病毒表面抗原、连接肽、凝血酶识别位点和胸腺肽；所述连接肽的氨基酸序列为GlyGlyGlyGlySer；所述凝血酶识别位点的氨基酸序列为LysArg；所述胸腺肽具有如序列表中序列2所示的氨基酸序列(石继红等，第四军医大学，天然胸腺素α1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达，中国生化药物杂志，2003年第24卷第二期，55-57)。

所述乙型肝炎病毒表面抗原可以是现有的ayw1、ayw2、ayw3、ayw4、adw2、adw4、ayr、adrq+及adrq-亚型乙型肝炎病毒表面抗原中的任意一种；优选为adw2亚型乙型肝炎病毒表面抗原。

当所述乙型肝炎病毒表面抗原为ayw2亚型乙型肝炎病毒表面抗原时，所述抗乙肝病毒融合蛋白为HBVAg-Thyα₁，是具有下述氨基酸序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：4的氨基酸残基序列；

2)将序列表中SEQ ID №：4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有乙肝病毒抗性的蛋白质。

其中，序列表中序列4是由261个氨基酸残基组成。自序列4的氨基端第1-226位氨基酸残基为adw2亚型乙型肝炎病毒表面抗原；自序列4的氨基端第234-261位氨基酸残基为胸腺肽的蛋白序列；自序列4的氨基端第232-233位氨基酸残基为凝血酶识别位点；自序列4的氨基端第227-231位氨基酸残基为连接肽(linker)序列。

上述抗乙肝病毒融合蛋白的编码基因(HBVAg-Thyα₁)也属于本发明的保护范围。

上述抗乙肝病毒融合蛋白的编码基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：3的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：4蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

其中序列表中序列3是由783个脱氧核苷酸组成，自5′端的第1位到第783位脱氧核苷酸为编码序列(ORF)。自5′端的第1位到第678位脱氧核苷酸为adw2亚型乙型肝炎病毒表面抗原的编码序列，自5′端的第700位到第783位脱氧核苷酸为胸腺肽的编码序列，自5′端的第679位到第693位脱氧核苷酸为linker的编码序列，自5′端的第694位到第699位脱氧核苷酸为凝血酶识别位点编码序列。

含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种预防和/或治疗乙型肝炎的疫苗，它的活性成分是上述抗乙肝病毒融合蛋白。

所述疫苗还包括佐剂，如铝佐剂、蜂胶、壳聚糖等。

常用的佐剂是福氏佐剂(Freund adjuvant)，其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1∶2～9(V/V)，这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成为完全佐剂。

所述预防和/或治疗乙型肝炎的疫苗可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

所述预防和/或治疗乙型肝炎的疫苗的用量一般为0.06-0.6μg抗乙肝病毒融合蛋白/kg体重/次，每7-30天给药一次，一般共需2-6次。

本发明还提供了一种表达上述抗乙肝病毒融合蛋白的方法。

本发明所提供的表达上述抗乙肝病毒融合蛋白的方法，是将所述抗乙肝病毒融合蛋白的编码基因导入多形汉逊酵母中，表达得到抗乙肝病毒融合蛋白。

所述抗乙肝病毒融合蛋白的编码基因可通过表达载体pHMOXZR25S-HBVAg-Thyα₁或pHFMDZR25S-HBVAg-Thyα₁导入多形汉逊酵母中。

所述pHMOXZR25S-HBVAg-Thyα₁或pHFMDZR25S-HBVAg-Thyα₁通过电穿孔的方法导入多形汉逊酵母。

所述多形汉逊酵母可为AS2.2412(购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心)。

本发明将乙型肝炎病毒表面抗原，如adw2亚型乙型肝炎病毒表面抗原和胸腺肽在酵母中进行融合表达，为了使乙肝表面抗原和胸腺肽同时具有正确的空间结构和生物学功能，采用了小的连接肽GlyGlyGlyGlySer使乙型肝炎病毒表面抗原和胸腺肽连接起来，并且添加了凝血酶识别位点LysArg，以便二者在体内能够分离，使乙肝表面抗原基因充当乙肝疫苗，刺激机体特异性免疫反应，分离出的胸腺肽可以提高机体免疫功能，这样二者联用可同时增强细胞免疫和体液免疫功能，同时调节免疫平衡，有利于抑制或清除机体内的HBV，达到治疗乙肝的效果。

本发明所用的adw2亚型乙型肝炎病毒表面抗原基因是现在我国主要流行的乙肝表面抗原基因(序列表中序列5)，胸腺肽基因是根据汉逊酵母密码子的偏爱性设计的，两者中间加上linker GlyGlyGlyGlySer和凝血酶识别位点LysArg，设计合成了编码乙肝表面抗原和胸腺肽的融合蛋白的编码基因，可以在多形汉逊酵母中高效表达乙肝表面抗原和胸腺肽的融合蛋白HBVAg-Thyα₁。融合蛋白的免疫学活性与单一乙肝表面抗原的免疫原性相同。本发明的乙肝表面抗原和胸腺肽融合蛋白可用作乙肝治疗性疫苗。

附图说明

图1为汉逊酵母表达载体pHFMDZRA-M结构图

图2为汉逊酵母表达载体pHMOXZRA-M结构图

图3为汉逊酵母表达载体pHFMDZR25SA-M结构图

图4为汉逊酵母表达载体pHMOXZR25SA-M结构图

图5为HBVAg-Thyα₁PCR产物鉴定的电泳图

图6为HBVAg-Thyα₁westen bloting图

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中所述百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、HBVAg-Thyα₁及其编码基因的获得

一、adw2亚型乙型肝炎病毒表面抗原和胸腺肽融合基因的合成

根据文献(石继红等，第四军医大学，天然胸腺素α1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达，中国生化药物杂志，2003年第24卷第二期，55-57)报道的胸腺肽的蛋白序列(序列表中SEQ ID No.2，由28个氨基酸组成)并对其蛋白进行优化，改造成为多形汉逊酵母偏爱胸腺肽的核苷酸序列(自序列表中序列1的5′端第22-105位脱氧核苷酸)。在adw2亚型乙型肝炎病毒表面抗原S蛋白的编码基因(含有681个碱基，序列表中SEQ ID No.5)和上述合成的胸腺肽基因序列之间加上了linker序列，凝血酶识别位点，通过基因合成仪，人工合成新设计的乙肝表面抗原基因和胸腺肽融合基因，经测序表明该基因具有序列表中SEQ No.3的核苷酸序列。

将该乙肝表面抗原基因和胸腺肽融合基因命名为HBVAg-Thyα₁，其序列全长共计783个多核苷酸，自5′端第1-678位脱氧核苷酸为乙肝表面抗原基因编码序列，自5′端第679-693位为linker序列，自5′端第694-699位为凝血酶识别位点，自5′端第700-783位脱氧核苷酸为多形汉逊酵母偏爱胸腺肽的核甘酸序列。HBVAg-Thyα1的编码蛋白HBVAg-Thyα1具有序列表中SEQ No.4的氨基酸残基序列。自序列4的氨基端第1-678位氨基酸残基为乙肝表面抗原adw2；自序列4的氨基端第700-783位氨基酸残基为胸腺肽；自序列4的氨基端第694-699位氨基酸残基为凝血酶识别位点；自序列4的氨基端第679-693位氨基酸残基为连接肽。

二、含有HBVAg-Thyα₁表达载体的构建和HBVAg-Thyα₁的表达

1、FMD启动子载体和MOX启动子载体的构建

对pHFMDZ-A和pHMOXZ-A(pHFMDZ-A和pHMOXZ-A的构建过程见文献Houhui Song，Yong Li，Weihuan Fang，Yunfeng Geng，Xu Wang，Min Wang，Bingsheng Qiu，Development of a set of expression vectors  in Hansenula polymorpha，Biotechnology Letters，Volume 25，Issue 23，Dec 2003，1999-2006)进行改造得到新的FMD启动子载体pHFMDZR25SA-M和MOX启动子载体pHMOXZR25SA-M，这两个载体含有自主复制序列，HARS(序列表中SEQ ID No.6)和25SrDNA(序列表中SEQ ID No.7)，这两个原件可以提高目的基因的拷贝数；并将pHFMDZ-A和pHMOXZ-A的终止序列AOX-TT分别替换成为FMD-TT序列(序列表中SEQ ID No.8)和MOX-TT序列(序列表中SEQ ID No.9)，使其与启动子更配套。pHFMDZR25SA-M和pHMOXZR25SA-M在电穿孔转化酵母的过程中不用线性化，可以用质粒直接进行电穿孔转化。构建的方法如下：

1)设计引物(表1)从汉逊酵母基因组扩增HARS、25SrDNA、FMD-TT和MOX-TT序列

表1.扩增HARS、25SrDNA、FMD-TT和MOX-TT序列的引物序列

HARS-up(BglII)	5’G<u>A AGATCT</u>GTCGACGAACCCGCGTTTGAGT3’BglII
		HARS-down(BamHI)	5’CGG<u>GATCC</u>GTCGACTCCCGCGACTCGGC3’BamHI
25S-up(BglII)	5‘GTA<u>AGATCT</u>GACTACTGGCAGGATCAAC3’BglII
		25S-down(BamHI)	5‘GTA<u>GGATCC</u>GTTTAGACCGTCGTGAGAC3‘BamHI
FMD-TT-UP(XbalI)	5’GC<u>TCTAGAG</u>GAGGAGCTGATTGGATCTAGATGA 3’XbalI
		FMD-TT-down(BamHI)	5’GA<u>GGATCCC</u>GTTCCCGTGTAGACGTTGGTAT 3’BamHI
MOX-TT-up(XbalI)	5‘GC<u>TCTAGA</u>CGTGGAAGGACATACCGCTTTTGAG’3’XbalI
		MOX-TT-down(BamHI)	5‘CG<u>GGATCC</u>ATTCCCGAGTCTGTTCTTGGATGG‘3BamHI

以表1中HARS上下游引物(HARS-up和HARS-down)、25S上下游引物(25S-up和25S-down)、FMD-TT上下游引物(FMD-TT-up和FMD-TT-down)和MOX-TT上下游引物(MOX-TT-up和MOX-TT-down)，用汉逊酵母基因组作为模板，分别扩增HARS、25SrDNA、FMD-TT和MOX-TT序列。扩增的程序为，94℃5min加热变性后，94℃1min，56℃45sec，72℃，1min，30个循环后再72℃延伸10min。扩增得到的目的片段进行电泳后割胶回收后再根据设计的双酶切位点进行双酶切，酶切之后再割胶回收备用，得到目的片段分别为512bp的HARS、2807bp的25SrDNA、556bp的FMD-TT和382bp的MOX-TT。将pHFMDZ-A(Houhui Song，Yong Li，Weihuan Fang，Yunfeng Geng，Xu Wang，Min Wang，Bingsheng Qiu，Development of a set ofexpression vectors in Hansenula polymorpha，Biotechnology Letters，Volume25，Issue 23，Dec 2003，1999-2006)用XbaI和BamHI双酶切后电泳后割胶回收3035bp的大片段，回收的产物与经XbaI和BamHI双酶切后的FMD-TT PCR产物进行连接，再将连接产物转化大肠杆菌，利用抗性(zeocin)培养基进行筛选，用FMD-TT上下游引物进行PCR鉴定阳性克隆，把经PCR鉴定表明含有FMD-TT的连接产物命名为pHFMDZA-M。将pHFMDZA-M用BglII单酶切，电泳后回收线性化的酶切产物，将其与用BglII和BamHI双酶切后的HARS PCR产物进行同尾酶连接，这样连接后原来HARS引物上的BamHI位点被破坏掉，只剩下BglII位点，再将连接产物转化大肠杆菌，在抗性培养基上培养，利用HARS引物鉴定阳性克隆，把鉴定表明含有HARS的连接产物命名为pHFMDZRA-M(图1)，将得到的阳性克隆再进行BglII单酶切，电泳后回收线性化的酶切产物，将其与用BglII和BamHI双酶切的25SrDNA的PCR产物进行连接，将连接后的产物同样转化大肠杆菌，在抗性培养基上培养，利用25SrDNA上下游引物鉴定阳性克隆，把鉴定表明含有25SrDNA的连接产物命名为pHFMDZR25SA-M(图3)。MOX启动子载体的构建过程同上述载体的构建过程，将经XbalI和BamHI双酶切的MOX-TT终止子的PCR产物连接到XbalI和BamHI双酶切的pHMOXZ-A(Houhui Song，Yong Li，Weihuan Fang，Yunfeng Geng，Xu Wang，Min Wang，Bingsheng Qiu，Development of a set of expression vectors in Hansenula polymorpha，Biotechnology Letters，Volume 25，Issue 23，Dec 2003，1999-2006)上，把含有MOX-TT的载体命名为pHMOXZA-M，将pHMOXZA-M用BglII单酶切，电泳后回收线性化的酶切产物，将其与用BglII和BamHI双酶切后的HARS PCR产物进行同尾酶连接，这样连接后原来HARS引物上的BamHI位点被破坏掉，只剩下BglII位点，再将连接产物转化大肠杆菌，在抗性培养基上培养，利用HARS引物鉴定阳性克隆，把鉴定表明含有HARS的连接产物命名为pHMOXZRA-M(图2)，得到的阳性克隆再进行BglII单酶切，电泳后回收线化的酶切产物，将其与用BglII和BamHI双酶切的25SrDNA的PCR产物进行连接，将连接后的产物同样转化大肠杆菌，在抗性培养基上培养，利用25SrDNA上下游引物鉴定阳性克隆，把鉴定表明含有25SrDNA的连接产物命名为pHMOXZR25SA-M(图4)。

为了连接方便，通过PCR扩增在HBVAg-Thyα₁的5‘端加上了EcoRI酶切位点，3’端加上了NotI酶切位点，引物序列为：

上游引物序列为：HBsAg-up-ECoRI：5‘CG GAATTCATGGAGAACATCACATCAGG3’

下游引物序列为：TA4‘cgggatccgcggccgcgttctcagcctcctcaacaacctccttcttc3’

其扩增体系为50ul，扩增程序为94℃5min，94℃1min，56℃45sec，72℃，1min，30个循环后再72℃延伸10min。PCR扩增得到5‘端加上了EcoRI酶切位点，3’端加上了NotI酶切位点的HBVAg-Thyα₁片段。将该HBVAg-Thyα₁片段用EcoRI和NotI酶切后，分别插入到pHMOXZR25SA-M(图4)和pHFMDZR25SA-M表达载体(图3)的EcoRI和NotI酶识别位点之间。把经过测序表明含有HBVAg-Thyα₁的pHMOXZR25SA-M命名为pHMOXZR25S-HBVAg-Thyα；把经过测序表明含有HBVAg-Thyα₁的pHFMDZR25SA-M命名为pHFMDZR25S-HBVAg-Thyα₁。

2、pHMOXZR25S-HBVAg-Thyα₁和pHFMDZR25S-HBVAg-Thyα₁在多形汉逊酵母菌中的表达

与其它甲醇酵母(如巴斯德毕赤酵母)不同，发明人构建的重组表达载体不用线性化，直接采用电穿孔转化法转化多形汉逊酵母。

本发明对(Faber，Haima et al.，1994)的电穿孔转化法进行了改进，即避免了电穿孔过程中的短路现象又提高了转化效率(转化率高达10⁶)。改进后的实验步骤如下：

挑多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)AS2.2412(购自中国科学院微生物所菌种保藏中心)单克隆于5ml YPD液体培养基中，37℃培养过夜，取2ml菌液加入200ml预温至37℃的YPD中，37℃培养至OD₆₀₀＝1.2-1.5之间(约6h)。室温6000rpm离心5min，弃上清，用500mlTED(100mmol/L Tris-HCl；50mM EDTA；25mmol/L DTT，pH＝8.0)悬浮细胞。在37℃摇床，200rpm摇15min，4℃6000rpm，离心，5min，弃上清，用200ml预冷的270mmol/L的蔗糖轻轻悬浮细胞，4℃ 6000rpm，离心，5min，弃上清，用100ml预冷的270mmol/L的蔗糖轻轻悬浮细胞，4℃ 6000rpm，离心，5min，弃上清，用1ml预冷的270mmol/L的蔗糖轻轻悬浮细胞，分装成100ul/管，-80℃保存，在100ul的感受态细胞中加入10ul质粒DNA(pHMOXZR25S-HBVAg-Thyα₁或pHFMDZR25S-HBVAg-Thyα₁)，轻轻混匀后加入2mm孔径的电击杯中，电击参数：50uF，100Ω，1.5KV，电击后立即加入940ul的YPDTM(1％酵母提取物；1％蛋白胨；2％葡萄糖；1mmol/L MgCL₂)，吸取至2-5ml的小管中，37℃摇床，200rpm培养1h。取100ul涂于含有Zeocin抗生素(终浓度100ug/ml)的YPD平板，37℃培养2-3天，在平板上出现大、中、小三种不同类型的菌落。挑取菌落，用下述两对引物进行PCR鉴定重组子，提取大菌落酵母的基因组DNA，利用PCR方法检测HBVAg-Thyα₁是否插入酵母基因组，引物为：

HBsAg-up-EcoRI：5’CGGAATTCATGGAGAACATCACATCAGG3’

TA4-down：5‘cgggatccgcggccgcgttctcagcctcctcaacaacctccttcttc3’，PCR的反应程序为：94℃5min，94℃1min，56℃45sec，72℃，1min，30个循环后再72℃延伸10min。扩增得到783bp的产物的电泳检测图谱如图5所示，图5中泳道M为MakerIII分子量标准(购自清华天为时代公司)，泳道1是含有pHMOXZR25S-HBVAg-Thyα₁的阳性克隆，泳道2是pHFMDZR25S-HBVAg-Thyα₁的阳性克隆，挑取经PCR测定正确的转化子克隆作为种子进行发酵。

将种子在YPD液体培养基中37℃培养12h后，按照5％比例(体积比)接种到新鲜的YPD发酵培养基中，培养48小时，加入甲醇，使其终浓度为0.5～1％(V/V)，再培养48～72小时后，收获发酵液，4℃12000rpm离心3min收集菌体，用PBS悬浮菌体，破碎细胞，为了破碎效果更好，可以在菌体中加入玻璃珠。破碎后，12000rpm离心3min收获上清，得到HBVAg-Thyα₁融合蛋白，对HBVAg-Thyα₁融合蛋白进行SDS-PAGE和western-blotting分析。本次实验主要是检测乙肝表面抗原的表达情况，其中，western-blotting中所用的一抗为乙肝表面抗原的抗体，该抗体来自于乙肝表面检测试剂盒，该试剂盒购买自华美生物公司。western-blotting分析的结果，见图6，图6中泳道1为乙肝标准品作为阳性对照，泳道2是含有pHMOXZR25S-HBVAg-Thyα₁的阳性克隆，泳道3是pHFMDZR25S-HBVAg-Thyα₁的阳性克隆。从westernblotting可以看出在乙肝表面后面连接了胸腺肽并没有影响乙肝抗原的免疫活性，两个克隆都成功的表达了乙肝表面抗原基因，而且表明pHMOXZR25S-HBVAg-Thyα₁的表达量比较高。此外，除用甲醇诱导发酵外，多形汉逊酵母表达系统也可以用1％(V/V)的甘油或1％(V/V)的葡萄糖诱导发酵。

3.表达产物的抗原活性鉴定

用EcoRI/NotI双酶切pHFMDZR25SA-M、pHMOXZR25SA-M，回收酶切后线化产物，然后再与EcoRI/NotI双酶切好的乙肝表面抗原基因进行连接，从而获得了含有乙肝表面抗原基因的酵母表达载体pHFMDZR25S-HBVAg、pHMOXZR25S-HBVAg。pHFMDZR25S-HBVAg、pHMOXZR25S-HBVAg、pHFMDZR25S-HBVAg-Thyα₁、pHMOXZR25S-HBVAg-Thyα₁按照步骤2的方法转化多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)AS2.2412，经筛选后得到的转化子，按照步骤2的方法诱导表达后进行活性鉴定，具体方法如下：

将诱导表达后的发酵产物经过12000rpm离心3min后收集菌体。用PBS悬浮菌体后超声波破碎细胞。12000rpm离心3min，收集上清。将所得的上清按华美生物工程公司生产的乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)程序进行乙肝表面抗原免疫活性的检测，其检测结果说明在联入了胸腺肽后并没有影响乙肝表面抗原基因的表达和乙肝表面抗原的免疫原活性。

将没有连接胸腺肽的乙肝表面抗原的酵母菌种(转pHFMDZR25S-HBVAg的转化子和转pHMOXZR25S-HBVAg的转化子)和连接有胸腺肽的乙肝表面抗原的酵母菌种(转pHFMDZR25S-HBVAg-Thyα₁的转化子和转pHMOXZR25S-HBVAg-Thyα₁的转化子)同时各选用三个克隆进行试管发酵，发酵后采用不同诱导时间(表2、表3、表4和表5)取样，破碎细胞后取50μl上清进行其酶联免疫检测，其ELLISA检测结果如表2、表3、表4和表5所示：

表2.pHFMDZR25S-HBVAg发酵产物检测结果

菌种克隆1	OD<sub>450</sub>0.186(30h)	OD<sub>450</sub>0.496(50h)
			菌种克隆2	OD<sub>450</sub>0.367(30h)	OD<sub>450</sub>0.941(50h)
菌种克隆3	OD<sub>450</sub>0.278(30h)	OD<sub>450</sub>0.876(50h)

表3.pHFMDZR25S-HBVAg-Thyα₁发酵产物检测结果

菌种克隆1	OD<sub>450</sub>0.083(30h)	OD<sub>450</sub>0.291(50h)
			菌种克隆2	OD<sub>450</sub>0.198(30h)	OD<sub>450</sub>0.679(50h)
菌种克隆3	OD<sub>450</sub>0.302(30h)	OD<sub>450</sub>0.889(50h)

表4.pHMOXZR25S-HBVAg发酵产物检测结果

菌种克隆1	OD<sub>450</sub>0.272(30h)	OD<sub>450</sub>0.414(50h)
			菌种克隆2	OD<sub>450</sub>0.505(30h)	OD<sub>450</sub>0.793(50h)
菌种克隆3	OD<sub>450</sub>0.378(30h)	OD<sub>450</sub>0.776(50h)

表5.pHMOXZR25S-HBVAg-Thyα₁发酵产物检测结果

菌种克隆1	OD<sub>450</sub>0.300(30h)	OD<sub>450</sub>0.462(50h)
			菌种克隆2	OD<sub>450</sub>0.298(30h)	OD<sub>450</sub>0.679(50h)
菌种克隆3	OD<sub>450</sub>0.298(30h)	OD<sub>450</sub>0.587(50h)

结果表明，在乙肝表面抗原后面连接了胸腺肽基因后并没有影响乙肝表面抗原基因的表达，不同的诱导时间发酵产物的量是不一样的，诱导50小时的发酵产物比诱导30小时的发酵产物明显多。表达产物均具有乙肝表面抗原的抗原活性。

序列表

<160>9

<210>1

<211>105

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

ggcggcggcg gctctaagag atctgacgct gctgttgaca cttcttctga gattactact     60

aaggacttga aggagaagaa ggaggttgtt gaggaggctg agaac                    105

<210>2

<211>28

<212>PRT

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>2

Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp Leu

1                5                  10                  15

Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn

            20                  25

<210>3

<211>783

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

atggagaaca tcacatcagg attcctagga cccctgctcg tgttacaggc ggggtttttc     60

ttgttgacaa gaatcctcac aataccgcag agtctagact cgtggtggac ttctctcaat    120

tttctagggg gatcacccgt gtgtcttggc caaaattcgc agtccccaac ctccaatcac    180

tcaccaacct cctgtcctcc aatttgtcct ggttatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt    240

atcatattcc tcttcatcct gctgctatgc ctcatcttct tattggttct tctggattat    300

caaggtatgt tgcccgtttg tcctctaatt ccaggatcaa caacaaccag tacgggacca    360

tgcaaaacct gcacgactcc tgctcaaggc aactctatgt ttccctcatg ttgctgtaca    420

aaacctacgg atggaaattg cacctgtatt cccatcccat cgtcctgggc tttcgcaaaa    480

tacctatggg agtgggcctc agtccgtttc tcttggctca gtttactagt gccatttgtt    540

cagtggttcg tagggctttc ccccactgtt tggctttcag ctatatggat gatgtggtat    600

tgggggccaa gtctgtacag catcgtgagt ccctttatac cgctgttacc aattttcttt    660

tgtctctggg tatacattgg cggcggcggc tctaagagat ctgacgctgc tgttgacact    720

tcttctgaga ttactactaa ggacttgaag gagaagaagg aggttgttga ggaggctgag    780

aac                                                                  783

<210>4

<211>261

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln

1               5                   10                  15

Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu

            20                  25                  30

Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys

        35                  40                  45

Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser

     50                 55                  60

Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe

65                  70                  75                  80

Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val

                85                    90                  95

Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly

            100                 105                 110

Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala

        115                 120                 125

Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp

    130                 135                 140

Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys

145                 150                 155                 160

Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu

                 165                170                 175

Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu

            180                 185                 190

Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile

        195                 200                 205

Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val

    210                 215                 220

Tyr Ile Gly Gly Gly Gly Ser Lys Arg Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr

225                 230                 235                 240

Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val Val

                245                 250                 255

Glu Glu Ala Glu Asn

            260

<210>5

<211>681

<212>DNA

<213>乙肝病毒(Hepatitis B virus)

<400>5

atggagaaca tcacatcagg attcctagga cccctgctcg tgttacaggc ggggtttttc     60

ttgttgacaa gaatcctcac aataccgcag agtctagact cgtggtggac ttctctcaat    120

tttctagggg gatcacccgt gtgtcttggc caaaattcgc agtccccaac ctccaatcac    180

tcaccaacct cctgtcctcc aatttgtcct ggttatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt    240

atcatattcc tcttcatcct gctgctatgc ctcatcttct tattggttct tctggattat    300

caaggtatgt tgcccgtttg tcctctaatt ccaggatcaa caacaaccag tacgggacca    360

tgcaaaacct gcacgactcc tgctcaaggc aactctatgt ttccctcatg ttgctgtaca    420

aaacctacgg atggaaattg cacctgtatt cccatcccat cgtcctgggc tttcgcaaaa    480

tacctatggg agtgggcctc agtccgtttc tcttggctca gtttactagt gccatttgtt    540

cagtggttcg tagggctttc ccccactgtt tggctttcag ctatatggat gatgtggtat    600

tgggggccaa gtctgtacag catcgtgagt ccctttatac cgctgttacc aattttcttt    660

tgtctctggg tatacatttg a                                              681

<210>6

<211>512

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

gtcgacgaac ccgcgtttga gtacttgctc aagctttctg gtagacgttg tagtactcat     60

gaaacaagcc ttagcactct gatctgtttc tcttgggtag cggtgagtgg tttattggag    120

ttcactggtt tcagcaaatc tgtcatctag acaatattgt tactaaattt ttttgaacat    180

acaattgttc gtaattcatc tattattata catcctcgtc agcaatttct ggcagacgga    240

gtttactaca acgtctttga gtatgaggcc gagaaatcca gctctgtggc catactcagt    300

cttgacagcc tgctgatgtt ggctgcgttc aacgcaataa gcgtgtcctc cgactccgag    360

ttgtgctcgt tatcgtcgtt ctcatcctcg gaaaaatcac acgaaagaac atactcacca    420

gtaggctttc tggtccctgg ggcacggctg tttctgacgt attccggcgt tgataatagc    480

tcgaaagtga acgccgagtc gcgggagtcg ac                                  512

<210>7

<211>2807

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

agactactgg caggatcaac cagataacta tctgatgtta ggccggaacc taacaagcgc     60

ttcccgctaa acagcccgag agctgtccag cagacaaagc agcagatatt attatcagtt    120

cgcaatcaag attccaagag aaatctcaat cggcagaagc ccaccgcgcc ggccgcttta    180

ctggccctcg cagagactaa ctgcatccat atagccctct ttgagttctc ccgaataatt    240

tccgcaaaat cattttggca gctgataacg ctaccaaaag tttttacatc attatcctgg    300

aaggaagtta caagcagaaa catcacgtag taaaaaaaaa ctacggctat gcttcgctgc    360

agactcccaa attcgtcttt agtagagttc ttgccatagg ctagtaatcc actaaatcca    420

tcagtgctca cacacaaaaa taattagaaa tttggtatga gactgttcag gctactcagg    480

ccatcaaaaa ttattttttt gtgaccgccc aagatcaccc atgttgaatt agccttgaga    540

gaaagtgtat ctgacgataa caactttact ctctccacta atcaacgagg ccttgaagag    600

ttcttttcag aactcccttt cgaagatcga accccaaacg cgcagaagct ttcgcttctt    660

cacattcagt tttcaaatct tcttttatgc tttcgcatga aagtccatcc gcatctctca    720

cgtataattt cctctccaat ataatttatt ccaaaatttc catagttatg catttacttt    780

tttttcgcaa ctctctccag ctttttatat ttttcatttc gattctaatt ctataccatc    840

tccaaatatt attcccccga cgtatttctt tgtaccacga aatttttact tcgtgccacc    900

ccctactacg cgacaaccaa aaaattaaag atactcaaaa aaccacaatc tcgtcactgg    960

aatatggagt ttctacgctt tgcagtcaat tccctttaac attgacattg tgcaggtctc   1020

caaattgaca ttcatacaat ccatgccggt tcttcatttt tcaacaggag atcctcttct   1080

aatttccaat ttctccatct ttttaattct cctacgtaga atcgtcaaac cactcataca    1140

atatcacttc agtacatcct tcatctacgg ttacagtggt cttctctatc atccatcata    1200

ctatctcacc taccaagaaa aaaaaaaaat attatggtta cgcatttcgt tctacaacag    1260

ctgccaccac cagccaacag ttagttgaaa agtacttctc ccttgctaaa tccatatccc    1320

ccactcgttt ccatactctt tcggttgcgg ccatatctag cagaaagcac cgtttcccgt    1380

ccgatcaact gtagttaagc tgctaagagc ctgaccgagt agtgtagtgg gagaccatac    1440

gcgaaactca ggtgctgcaa tctttttttt ttttattatt tttttttccc ttccctccag    1500

tccaacgcgg tctcgaggtc gcgttctgca tcaatccatt gtctatccaa acgtctatat    1560

atatatgccc acctcttcca cacctatctt ttttttcctc ccagcacgta gagaagagtg    1620

gtcgccaatc ctaatccctc cgacttcttc ttgtaatcct gcctttagga agagcagcaa    1680

cagtggtatg gtgcaaaaag tcttcattca tcctttacca ctaccacttt ttttgccggc    1740

tcttccaggc accttgtagc acctctttca actctgccac catctctata cttaaatttt    1800

cctttccagc gccagataac aaacaggacg tgtgccacac actttgcatc acagaatatc    1860

tgtcgattct gcctactttt gttagcttag ttgcccgtat cgtactcact tttcatacga    1920

caaccatcaa ttaccataca ttttttttca tttaccttct attttactat ggtacagaat    1980

atctgtcatt tgtcagagct caggacactt ctattggcca atatcacccg aaatgtttga    2040

gctagatatc cttacaccac ttcactactc acatcgaaaa ttcaatctaa attattgaag    2100

gcttgctacc aaaaaaaaat aaagaaaaat aaaaaaaaaa aatcatatcc ctgaaaaata    2160

catgataata ataataagta ggaaaaaaaa aaaaattaga aaaataatgc tggttcctct    2220

cctcgactca aatgtttttt ttatacacca tccagaattg ttccacgcac gacctctgct    2280

tcaaaaaaat taaaaatctc ctctaaaaga cacccggcta ccaccaagta atatctctta    2340

ggggagattg tgttgtgtaa acacaaacaa atcggacaac tgaggcttaa tctcagcaga    2400

tcgtaacaac aaggctactc tactgcttac aataccccgt tgtacattta agtcgtatgc    2460

aaaggattta tcctcgcgca taatgacatt gctatccacc ggcaagcact taaaaccttt    2520

ccgttaaaag caccattgcc agcctgctat ggttcagcga cacagagtgc cttattcgta    2580

tccaactaaa atgtgcgagg gcaagaaatc atcgctttct agcatggatt ctgacttaga    2640

ggcgttcagc cattatccag cagatggtag cttcgcggca atgcctgatc agacagccgc    2700

aaaaaccaat tatctgaatg aacggttcct ctcgtactaa gttcaattac tattgcgata    2760

acattcatca gtagggtaaa actaacctgt ctcacgacgg tctaaac                  2807

<210>8

<211>556

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

agcggtcttg gaggagctga ttggatctag atgaaatagg aaatataatt atggctctac     60

tgcgctgcgt aaacgtcact gtaggcgatt tcgcttagcc caagtccgcg atgcggtccg    120

acgacaccag agcgcgtcca cctcctgtgc gccgcaccgc ccccaaagga ggttgcggct    180

gtgcggctcg acgcgaccaa aaaaataagc gtcaaaagga ggtgtcaggg aagcacgccg    240

tggggctcga gatatataaa gcgcagcgta gctttgtctg tcttgctaat  gagcgacgac   300

caagccttgg aaattttcct gaaatccccc gtcacccagg acatgatcca ccacttggtg    360

acggtcacct tacaggttct gccttgcgag tcctccaaga ccatcaccca gaaagtcaag    420

tcttcagccg acacagagcc cgtgctcaag accaagccgc tgccctcgct gcatgacttt    480

caccaagctc gtccgctata ccaacgtcta cacgggaacg ttgatgtcga ccatcgtgtt    540

cctcaacaga ctncaa                                                    556

<210>9

<211>382

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

tctagacgtg gaaggacata ccgcttttga gaagcgtgtt tgaaaatagt tctttttctg     60

gtttatatcg tttatgaagt gatgagatga aaagctgaaa tagcgagtat aggaaaattt    120

aatgaaaatt aaattaaata ttttcttagg ctattagtca ccttcaaaat gccggccgct    180

tctaagaacg ttgtcatgat cgacaactac gactcgttta cctggaacct gtacgagtac    240

ctgtgtcagg agggagccaa tgtcgaggtt ttcaggaacg atcagatcac cattccggag    300

attgagcagc tcaagccgga cgttgtggtg atatcccctg gtcctggcca tccaagaaca    360

gactcgggaa tatctcggat cc                                             382

Claims (12)

1.一种抗乙肝病毒融合蛋白，自氨基端到羧基端是依次紧密串联的乙型肝炎病毒表面抗原、连接肽、凝血酶识别位点和胸腺肽；所述连接肽的氨基酸序列为GlyGlyGlyGlySer；所述凝血酶识别位点的氨基酸序列为LysArg；所述胸腺肽的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

2.根据权利要求1所述的抗乙肝病毒融合蛋白，其特征在于：所述抗乙肝病毒融合蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。

3.权利要求1或2所述的抗乙肝病毒融合蛋白的编码基因。

4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述抗乙肝病毒融合蛋白编码基因的核苷酸序列选自下组之一：

1)序列表中SEQ ID NO：3所示的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：4所示蛋白质序列的多核苷酸序列。

5.含有权利要求3或4所述基因的表达载体。

6.含有权利要求3或4所述基因的转基因细胞系。

7.含有权利要求3或4所述基因的宿主菌。

8.一种预防或治疗乙型肝炎的疫苗，它的活性成分是权利要求1或2所述的抗乙肝病毒融合蛋白。

9.一种表达权利要求1或2所述的抗乙肝病毒融合蛋白的方法，是将所述抗乙肝病毒融合蛋白的编码基因导入多形汉逊酵母中，表达得到抗乙肝病毒融合蛋白。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述抗乙肝病毒融合蛋白的编码基因通过表达载体pHMOXZR25S-HBVAg-Thyα₁或pHFMDZR25S-HBVAg-Thyα₁导入多形汉逊酵母中。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述pHMOXZR25S-HBVAg-Thyα₁或pHFMDZR25S-HBVAg-Thyα₁通过电穿孔的方法导入多形汉逊酵母。

12.根据权利要求9或10或11所述的方法，其特征在于：所述多形汉逊酵母为AS2.2412。

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