CN101070347A - 禽流感h5n1新型粘膜免疫疫苗及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种融合蛋白，其能预防禽流感H5N1型病毒的感染。具体而言，本发明涉及一种融合蛋白，该融合蛋白包含禽流感病毒M2蛋白膜外区段、HA分子、大肠杆菌不耐热毒素B亚单位和T细胞抗原表位，本发明还涉及该融合蛋白的制备方法及其药学应用。

Description

禽流感H5N1新型粘膜免疫疫苗及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及新型禽流感病毒H5N1亚型粘膜免疫的融合蛋白疫苗，即由H5N1病毒HA、H5N1病毒M2、大肠杆菌不耐热毒素B亚单位、纯化标签以及T细胞抗原表位序列组成的融合蛋白，及其制备方法及应用。

背景技术

禽流感，尤其是高致病性禽流感病毒，对禽类以及人类都构成了巨大的威胁。传统上使用疫苗来进行预防，所用疫苗包括病毒灭活疫苗、减毒疫苗、重组亚单位疫苗等(Brett JC，Virology，2005；339(2)：273-280)。无论是灭活疫苗还是减毒疫苗，在使用中都存在病毒重新重组的可能，因此有一定的潜在危险。在亚单位疫苗方面，所选用的分子较为集中，主要有M2蛋白(NeirynckS，nature medicine，1999；5：1157-1163)，血细胞凝集素(下文简称为HA)(Treanor JJ，J.Infect Dis，2006；193(9)：1223-1228)，联用HA和NA分子(QiaoCL，Avian Pathol，2003：32(1)：25-32)，此外，DNA疫苗也广为研究和尝试(美国专利，6630455，Mitchell)。以上各种疫苗，虽然能体现出一定的保护效果，但无法诱导机体产生细胞免疫，而且由于病毒的高度变异性，往往很快失去保护效力。

近年兴起的粘膜免疫，不仅可以产生很强的抗体应答，而且还能产生较好的细胞免疫效果。粘膜免疫需要有粘膜佐剂分子，已经证实霍乱毒素B亚单位(下文简称为CTB)、大肠杆菌不耐热毒素B亚单位(下文简称为LTB)均是良好的佐剂分子(Lycke N，European J.of Immunol，1992；22：2277-2281)。采用LTB作为粘膜免疫的佐剂，以H3N2的分子免疫小鼠，再以H5N1病毒攻击小鼠，发现保护效果较好(Tumpey TM，J.Virol，2001；75(11)：5141-5150)。

然而，在针对禽流感H5N1病毒的疫苗研究方面，现有技术中尚未见良好疗效的针对H5N1亚型的粘膜免疫疫苗，更未有良好疗效的针对H5N1亚型病毒的多表位粘膜免疫疫苗。面对可能的禽流感H5N1病毒感染的大流行，人们迫切需要一种新型、高效的疫苗来预防禽流感。本发明提供了一种新的能用于粘膜免疫的融合蛋白及其疫苗组合物，其能预防禽流感H5N1型病毒的感染。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种新的能用于粘膜免疫的融合蛋白及其疫苗组合物，其能预防禽流感H5N1型病毒的感染。本发明还提供了含有所述融合蛋白的药物组合物，如疫苗组合物。此外，本发明还提供了编码所述融合蛋白的多核苷酸以及制备该融合蛋白的方法等。

在第一个方面，本发明提供了一种用于粘膜免疫的融合蛋白，其含有禽流感病毒H5N1亚型的M2蛋白膜外区段、禽流感病毒H5N1亚型的血细胞凝集素(HA)、大肠杆菌不耐热毒素B亚单位(LTB)和T细胞抗原表位。所述融合蛋白能预防禽流感病毒的感染，尤其能预防禽流感H5N1型病毒的感染。其中，所述“禽流感病毒H5N1亚型的M2蛋白膜外区段”指的是具有免疫原性的禽流感病毒H5N1亚型的M2蛋白的膜外部分中的一部分多肽或其具有基本相同免疫原性的功能等价物，优选是选自SEQ ID No.4和6的氨基酸序列或其功能等价物。所述的HA指的是禽流感H5N1亚型病毒的血细胞凝集素蛋白或其具有基本相同免疫原性的功能等价物，优选是如SEQ ID No.8所示的氨基酸序列或其功能等价物。所述的LTB指的是大肠杆菌不耐热毒素B亚单位或其具有基本相同粘膜佐剂功能的功能等价物，优选是如SEQ IDNo.10所示的氨基酸序列或其功能等价物。所述的T细胞抗原表位指的是能够诱导机体产生细胞免疫的抗原表位，优选是如SEQ ID No.12所示的氨基酸序列或其功能等价物。

本文中所用的术语“融合蛋白”是指多个蛋白质或多肽分子连接到一起所形成的新的蛋白质或多肽或其药学上可接受的盐。连接可以通过公知的遗传工程或化学合成方法来进行，优选通过遗传工程方法，即通过重组DNA技术来实现多个蛋白质或多肽分子的融合。本发明的融合蛋白含有禽流感病毒H5N1亚型的M2蛋白膜外区段、禽流感病毒H5N1亚型的血细胞凝集素(HA)、大肠杆菌不耐热毒素B亚单位(LTB)和T细胞抗原表位，优选本发明的融合蛋白由禽流感病毒H5N1亚型的M2蛋白膜外区段、禽流感病毒H5N1亚型的血细胞凝集素、LTB、T细胞抗原表位和非免疫活性成分组成。非免疫活性成分指的是融合蛋白中的部分，其不具有禽流感病毒H5N1亚型的M2蛋白膜外区段、禽流感病毒H5N1亚型的血细胞凝集素和T细胞抗原表位的抗原性，也不具有LTB的佐剂活性，如纯化标签、接头肽、化学修饰部分、融合蛋白N端的Met、融合蛋白N端的信号肽、融合蛋白C端的多聚腺苷酸等。这些都是本领域技术人员所熟知的。如本发明的融合蛋白中亦可包括一些化学修饰部分，如水溶性聚合物。优选水溶性聚合物要为药学上可接受的聚合物，如聚乙二醇，葡萄糖，聚乙烯醇，乙二醇/丙二醇共聚物，丙二醇同源共聚物，多聚氨基酸等。它们可以延长融合蛋白的体内代谢时间，加速生物体对融合蛋白的吸收，增强融合蛋白的稳定性等。当用基因工程手段表达本发明的融合蛋白时，根据生产中所使用的宿主细胞的不同，如原核细胞(如细菌细胞)或真核细胞(如，酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、哺乳动物乳腺反应器)细胞，本发明的融合蛋白可以是糖基化的，也可以是非糖基化的。当在原核生物中表达，融合蛋白N端一般需要有编码Met的核苷酸序列；为了在真核生物中分泌表达，融合蛋白N端需要有信号肽。本文中所用的术语“药学上可接受的盐”指适于与人或动物的组织接触，而无过多的毒性、刺激或变态反应等的盐。药学上可接受的盐是本领域熟知的。

本文中所用的术语“功能等价物”指的是与原有多肽或蛋白质的活性基本相同的变异体多肽。该变异体多肽是在原有多肽或蛋白质序列中变异一个或几个氨基酸残基而获得的多肽，优选是变异一个至五个氨基酸残基而获得的多肽，更优选是变异一个至三个氨基酸残基而获得的多肽。变异可以通过缺失、插入和/或用其他氨基酸取代序列上的原氨基酸残基来实施。本领域技术人员知晓，通过改变已知多肽的编码基因序列并将其导入表达载体，可以制备出取代、插入或添加了氨基酸残基的多肽，这些方法广泛记载于《分子克隆实验指南》(北京：科学出版社，2002年)等本领域公知的文献中。在变异的氨基酸残基中，优选变异为与原氨基酸残基侧链性质相似的其他氨基酸，从而更得以保持原有功能活性。侧链性质相似的氨基酸分别有疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)、含硫原子侧链的氨基酸(C、M)、含羧酸和酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、含碱性基团侧链的氨基酸(R、K、H)、含芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)。

本文中所用的术语“基本相同”指的是功能等价物的活性相对于与原有多肽或蛋白质的活性基本不减弱，优选活性可降低不到30％，更优选可降低不到10％，最优选不减弱。目前已经存在大量检验诸如免疫原性、粘膜佐剂功能或产生细胞免疫能力的实验方法，必要时也可根据本发明实施例所述的具体方法，通过诸如基因工程手段将原有多肽或蛋白质部分替换为相应的功能等价物，由此来选出合适的功能等价物。

优选在本发明第一方面的融合蛋白中，所述的M2蛋白膜外区段的氨基酸序列选自SEQ ID No.4和6；其中所述的HA的氨基酸序列为SEQ ID No.8；其中所述的LTB的氨基酸序列为SEQ ID No.10；其中所述的T细胞抗原表位的氨基酸序列为SEQ ID No.12。

更优选，本发明第一方面的融合蛋白进一步含有纯化标签和/或接头肽。纯化标签(Tag)通常为特定的蛋白质或连续的几个氨基酸序列，其可以与相应结合物质产生特异性结合。因而当融合蛋白中含有纯化标签时，可以较容易地利用其结合性质来对融合蛋白进行纯化和鉴定。目前已经有很多纯化标签可以使用，有些已经商品化了，如His标签、FLAG标签、Myc标签、-半乳糖苷酶标签、蛋白A标签、GST(谷胱甘肽硫转移酶)标签等。本发明的纯化标签优选是His标签，更优选是氨基酸序列为SEQ ID No.14所示的氨基酸序列。接头肽(也称“连接子”)是起连接融合蛋白中各活性成分的不超过20个氨基酸残基大小的肽，其本身并不具有融合蛋白中各活性成分的作用。优选接头肽不超过10个氨基酸残基大小。本发明可使用接头肽连接于本发明中的M2蛋白膜外区段、T细胞抗原表位、HA、大肠杆菌不耐热毒素B亚单位和纯化标签之间，也可以不使用连接肽而让上述活性成分直接。例如，本领域的技术人员所公知的接头肽的序列有：

(1)、Ala_n，n＝2-10

(2)、Gly_n，n＝2-10；

(3)、Gly_n-Ser，n＝2-10

(4)、(Gly_n-Ser)_m，m＝2-3；n＝2-10

(5)、Gly_n-Ser-Gly_m，m＝1-10；n＝1-10

(6)、Gly_n-Pro-Gly_m，m＝1-10；n＝1-10

(7)、(Ala-Gly)n，n＝1～10；

(8)、(Gly-Ala)n，n＝1～10；

(9)、Gly_n-Ala-Gly_m，m＝1-10；n＝1-10

(10)、Ala_n-Gly-Ala_m，m＝1-10；n＝1-10

(11)、上述序列的任意组合形式。

本发明第一方面的融合蛋白优选含有一个或几个M2蛋白膜外区段、一个或几个T细胞抗原表位、1个HA、1个大肠杆菌不耐热毒素B亚单位和1个纯化标签，其中纯化标签连接在大肠杆菌不耐热毒素B亚单位的C端。本发明的融合蛋白优选含有几个M2蛋白膜外区段和几个T细胞抗原表位。其中，M2蛋白膜外区段可以是相同的，也可以是不同的；T细胞抗原表位可以是相同的，也可以是不同的。在一个具体实施方案中，本发明的融合蛋白含有两个M2蛋白膜外区段和两个T细胞抗原表位。融合蛋白中各活性成分的排列次序(其中，M2代表M2蛋白膜外区段，T代表T细胞抗原表位，Tag代表纯化标签)可以是如下次序：

LTB-M2-T-HA-T-M2-Tag；LTB-HA-T-M2-T-M2-Tag；LTB-HA-T-M2-Tag；

HA-T-M2-T-M2-LTB-Tag；HA-T-M2-LTB-Tag；HA-M2-LTB-Tag；

M2-T-HA-T-M2-LTB-Tag；M2-T-HA-LTB-Tag；

更佳地，融合蛋白组成方式为：M2-T-HA-T-M2-LTB-Tag；HA-T-M2-LTB-Tag；M2-T-HA-LTB-Tag。最佳地，融合蛋白组成方式为：M2-T-HA-T-M2-LTB-Tag。

另外优选，本发明第一方面的融合蛋白的氨基酸序列

a)如SEQ ID No.2所示；

或b)是对SEQ ID No.2所示的序列插入、缺失或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列。所述融合蛋白能预防禽流感病毒的感染，尤其能预防禽流感H5N1型病毒的感染。

本领域技术人员知晓，通过改变已知多肽的编码基因序列并将其导入表达载体，可以制备出取代、缺失或插入了氨基酸残基的多肽，这些方法广泛记载于《分子克隆实验指南》(北京：科学出版社，2002年)等本领域公知的文献中。根据本发明实施例所述的具体方法，通过诸如基因工程手段将原有多肽或蛋白质部分替换为取代、缺失或插入了其他氨基酸残基的产物，便能获得能预防禽流感病毒感染的氨基酸序列。

在第二个方面，本发明提供了一种核酸分子，其编码本发明第一个方面所述的融合蛋白。在本文中，“多核苷酸”、“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸序列”可以相互替换使用，均指一个含意。本发明的多核苷酸，可以是DNA形式，也可以是RNA形式，优选DNA形式。DNA形式包括天然cDNA和人工合成的cDNA，DNA可以是编码链或模板链。通过常规技术，如PCR方法、重组法或人工合成的方法，本领域技术人员可以很容易获得本发明的编码融合蛋白的核苷酸序列或其片段。这些序列一旦获得，就可以将其克隆入载体，再转化或转染入相应的细胞，然后通过常规的宿主细胞进行增殖，从中分离得到大量的核苷酸序列。优选本发明的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

在第三个方面，本发明提供了一种载体，其含有本发明第二个方面所述的核酸分子。本文中的术语“重组表达载体”、“表达载体”，有时仅称为“载体”，在此可以交互替换使用，是指本领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其它各种病毒载体。本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等)、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体(痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴病毒载体等)、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。总之，只要能在宿主细胞中稳定复制，任何质粒和载体都可使用。优选表达载体包含选择标记基因，如细菌的氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷选择标志，如His，Leu，Trp等；真核细胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氢叶酸还原酶基因及荧光蛋白标记基因等。在一优选实施方式中，所述表达载体为酵母表达载体。本领域技术人员可利用DNA重组技术等一系列技术，构建含本发明所述编码融合蛋白的DNA序列、合适的转录和翻译调控序列、启动子及选择性标记基因等特定元件的表达载体。上述载体可用来转化、转染合适的宿主细胞，以便获得所需要的融合蛋白。

在第四个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞含有本发明第三个方面所述的载体，或者所述细胞已用本发明第二个方面所述的核酸分子转化或转染。宿主细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如，细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。宿主细胞在转化或转染含本发明所述编码融合蛋白的基因序列后，即构成工程化细胞或细胞株，可用于生产所需融合蛋白。本领域技术人员能够恰当地选择适当的载体、宿主细胞，并熟知如何将载体高效地转化或转染入宿主细胞中，所用方法包括但不限于：氯化钙法、电穿孔法用于细菌细胞，电穿孔法和原生质体融合法用于酵母细胞，脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法以及显微注射法用于哺乳动物细胞等真核细胞。

在第五个方面，本发明提供了制备本发明第一个方面所述融合蛋白的方法，其包括以下步骤：用本发明第四个方面的宿主细胞表达本发明第一个方面所述的融合蛋白，并分离所述的融合蛋白。获得的工程细胞可以通过常规方法培养、诱导来表达所需要的融合蛋白，包括发酵过程和纯化工艺。上述表达的蛋白可在细胞内、细胞膜上或分泌到细胞周质、细胞外。根据需要，可利用融合蛋白的物理的、化学的以及其它生物学特性，进行分离纯化。方法包括但不限于：裂菌(超声波裂菌、渗透压裂菌)，离心，盐析，分子筛色谱，离子交换色谱，吸附色谱(亲和层析、金属鏊合层析)，反向色谱，高效液相色谱，毛细管电泳，制备性等电聚焦以及常规的变性、复性处理等，这些方法均是本领域技术人员所熟知的。

在第六个方面，本发明提供了一种用于粘膜免疫的药物组合物，其包括本发明第一个方面所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体。所述药物组合物能预防禽流感H5N1型病毒的感染。对于本领域普通技术人员来说，已经有很多公知的方法能将蛋白质或多肽活性成分与药学上可接受的载体制备成药物组合物。本文中使用的“药学上可接受的载体”指无毒的填充剂、稀释剂、佐剂或其他制剂辅料。根据本领域的公知技术，可以根据治疗目的、给药途径的需要将药物组合物制成各种剂型，优选该组合物为单位剂量形式，如片剂、胶囊、粉剂、乳液剂、注射剂、喷雾剂型或作为饲料添加剂的剂型。优选该药物组合物为注射剂型、喷雾剂型或作为饲料添加剂的剂型。这些组合物包含不同缓冲液内容(如磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液)、相应的离子强度和pH值，以及其它物质(如聚乳酸、甘露醇等)。也优选该药物组合物为疫苗组合物，优选进一步含有佐剂，如福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、CpG序列等。

在第七个方面，本发明提供了本发明第一个方面所述的融合蛋白在制备预防禽流感的药物中的应用。在第八个方面，本发明提供了本发明第六个方面所述的药物组合物在制备预防禽流感的药物中的应用。上述所述禽流感优选是指由于禽流感H5N1型病毒感染而造成的禽流感。在本发明的一个优选实施方式中，通过对实验动物以特定剂量粘膜给药，有效地保护了实验动物。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1含有融合蛋白编码基因的表达载体pPICBMDH5N1LTB示意图

图2显示了融合蛋白编码基因的表达产物的纯化和蛋白电泳分析的鉴定结果，其中左边第1道为蛋白分子量标准，第2道为发酵培养液上清，第3道为用50％饱和度硫酸铵沉淀纯化后的样品，第4道为用金属鏊合层析纯化后的样品，左边第4道为配制成疫苗制剂后的样品；右边第4道为用金属鏊合层析纯化后的样品的Western印迹的结果，右边第5道为配制成疫苗制剂后的样品的Western印迹的结果。

本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。

具体实施方式

以下所述实验方法，没有具体说明的，均按照《分子克隆实验指南》，2002年，第三版，科学出版社)所述方法进行。

实施例一融合蛋白基因的来源

整个融合蛋白的编码基因按毕赤酵母偏好的密码子人工设计，并分四段(按编码蛋白从氨基端到羧基端的顺序，分别命名为HAM2-1片段(其具有序列为SEQ ID No.1中第1-603位的核苷酸序列)、HAM2-2片段(其具有序列为SEQ ID No.1中第598-1161位的核苷酸序列)、HAM2-3片段(其具有序列为SEQ ID No.1中第1156-1773位的核苷酸序列)、PLTB片段(其具有序列为SEQ ID No.1中第1768-2087位的核苷酸序列)交由上海英俊生物技术公司合成，SEQ ID No.1中2088-2151位的核苷酸序列是由Invitrogen公司的载体pPICZalphaA的1277-1340位的核苷酸序列提供的。HAM2-1片段两端分别设计了EcoRI(5’端)和BglII(3’端)限制性内切酶位点，HAM2-2片段两端分别设计了BglII(5’端)和SalI(3’端)限制性内切酶位点，HAM2-3片段两端分别设计了SalI(5’端)和BamHI(3’端)限制性内切酶位点，PLTB片段两端分别设计了BamHI(5’端)和XbaI(3’端)限制性内切酶位点。上海英俊生物技术公司把这四个片段合成好后分别克隆到pMD18T载体上，转化大肠杆菌，分别提取测序正确后，把这四个含有分别命名为pMD18T-HAM2-1、pMD18T-HAM2-2、pMD18T-HAM2-3、pMD18T-PLTB重组质粒的大肠杆菌寄给本公司。

实施例二融合蛋白酵母表达载体的构建

将含有命名为pMD18T-HAM2-1、pMD18T-HAM2-2、pMD18T-HAM2-3、pMD18T-PLTB重组质粒的四个大肠杆菌菌株，接种到含氨苄青霉素50mg/L的10mlLB培养基中，将含有毕赤酵母分泌表达载体pPICZalpha A(购自Invitrogen公司)的大肠杆菌菌株，接种到含含25mg/L Zeocin低盐LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按照Qiagen公司质粒提取试剂盒使用手册，分别提取质粒。含融合片段编码基因的重组质粒分别用片段两端对应的限制性内切酶进行处理，毕赤酵母分泌表达载体pPICZalpha A用EcoRI和XbaI处理，具体处理条件：10l反应体系，体系内加入2l质粒，各限制性内切酶分别使用5个活性单位(New England biolabs)，加入10×缓冲液1l，用去离子水补齐，37℃酶切2小时。酶切结束后，加11200mM EDTA终止反应。在1％琼脂糖凝胶电泳中，电泳30分钟。在紫外灯下，分别切下电泳凝胶中载体pPICZalpha A对应的约3.6kb条带和HAM2-1、HAM2-2、HAM2-3片段各自对应的约600bp条带，以及PLTB各自对应的约300bp条带，按照Qiagen公司凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收。按照载体和片段1∶1～3的比例将4个片段和表达载体混合，反应体系15l，由T4 DNA连接酶进行连接，4℃或16℃连接过夜。按照常规方法(氯化钙法)转化大肠杆菌Top10F’感受态细胞，铺于含Zeocin 25mg/L的低盐LB平板，37℃倒置过夜。

低盐LB的配制：蛋白胨10g，酵母抽提物5g，氯化钠5g，加水900ml溶解，用1N氢氧化钠调节pH值到7.5，补水到1000ml，高压灭菌；

低盐LB平板的配制：蛋白胨10g，酵母抽提物5g，氯化钠5g，琼脂15g，加水900ml溶解，用1N氢氧化钠调节pH值到7.5，补水到1000ml，高压灭菌，待冷却至55～60℃时，加入Zeocin至终浓度25mg/L，铺平板，保存于4℃备用；

挑取平板上的单克隆，接种于低盐LB培养基中，过夜培养，按照常规方法提取质粒，EcoRI和XbaI进行双酶切鉴定。酶切鉴定阳性的克隆，留存甘油菌种，储存于超低温冰箱中。同时进行序列测定，以确保克隆正确无误。筛选得到的酵母分泌表达载体命名为：pPICBMDH5N1LTB(见图1)。

实施例三融合蛋白表达菌株的构建与筛选

接种上述阳性克隆至50ml含25mg/L Zeocin低盐LB培养基中，8-12小时后，转接于500-1000ml含25mg/L Zeocin低盐LB培养基中，过夜培养，大量提取质粒，备用。

线性化DNA的制备：在1001反应体系中，加入20g上述提取的DNA，加入Pme I 20∪(New England biolabs)，去离子水补齐。37℃酶切3小时。取2l酶切产物，1％琼脂糖凝胶电泳，观察酶切是否完全。确认线性化完全后，将余下的酶切产物加入2l 200mM EDTA，终止反应。

线性化DNA的纯化：在上述酶切体系中，加入100l去离子水，加入等体积酚/氯仿，剧烈振荡混匀，13000rpm高速离心10分钟，将上层转入新管，加入1/10体积3M醋酸钠，再加入2.5倍体积无水乙醇，混匀，-70℃冰箱中放置1小时，4℃离心，13000rpm，15分钟，弃液体，以80％乙醇洗涤一次，空气中晾干，重新溶解在10l去离子水中，准备电融合。

酵母菌感受态细胞的准备：在5ml YPD培养基中接种Pichia pastoris宿主菌(购自Invitrogen公司)KM71H、GS115和X-33，30℃振荡培养过夜，次日转接入500ml新的YPD培养基中，转接量约0.1～0.5ml(根据酵母菌生长状态)，30℃继续培养，直至OD₆₀₀达到1.3～1.5为止。离心收菌，4℃条件下，1500rpm，离心8分钟，弃上清，以预冷的500ml无菌去离子水，重新悬浮，再次离心，条件同上，以250ml预冷的无菌去离子水，重新悬浮，离心，再以20ml预冷的无菌去离子水，重新悬浮，离心，最后重新用1ml预冷的1M山梨醇悬浮，置冰上，待用。

酵母菌的电融合：将80l上述感受态细胞与5l(约10g)线性化DNA混合均匀，转入预冷的0.2cm电融合杯中，冰上放置5分钟。电融合条件如下：1500V，25F，20Ω。电击后，立即加入1ml预冷的1M山梨醇，混合，再转入一个15ml培养管中，30℃孵育2小时。取200l分别铺于含不同浓度Zeocin的YPDS平板上(含Zeocin 200g/ml，500g/ml，1000g/ml)，倒置，30℃培养2天。

培养基和平板准备：

YPD培养基：900ml水中溶解10g酵母抽提物，20g蛋白胨(peptone)，高压灭菌，待冷却至55～60℃时，加入100ml 20％葡萄糖(Dexture)，储存于4℃。

YPDS平板(含Zeocin 100g/ml为例)：900ml水中溶解10g酵母抽提物，20g蛋白胨(peptone)，182.2g山梨醇，20g琼脂，高压灭菌，待冷却至55～60℃时，加入100ml 20％葡萄糖(Dexture)，加入1ml 100mg/ml的Zeocin，铺平板，储存于4℃。

克隆筛选：挑取各高浓度Zeocin平板上的克隆10个，接种于100ml BMGY培养基中，30℃振荡培养16～18小时，当OD₆₀₀达到2～6之间时，离心收菌，3000g，8分钟，弃上清，用20ml BMGY培养基重新悬浮，继续培养，并加入100％甲醇0.1ml至终浓度0.5％，每隔24小时补加一次，每次0.1ml。在加入甲醇后的48小时、72小时和144小时，分别取样2ml，离心，取上清50 l，与等量的SDS-PAGE 2x上样缓冲液混合，100℃煮沸10分钟，13000rpm，离心10分钟，取15 l，行10％SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色，观察结果。挑取高表达克隆进行表型鉴定。用H5型HA阳性血清进行Western鉴定，用GM₁-ELISA进行LTB部分结构和功能检测。最后筛选得到高效分泌表达融合蛋白疫苗的工程菌，命名为：pPICBMDHAM2eLTB/GS115。

实施例四工程菌的发酵

对高效分泌表达融合蛋白疫苗的工程菌pPICBMDHAM2eLTB/GS115的生长表达条件进行了优化，确定了有利于工程菌生长和表达的培养基、补料培养基、碳源(0.5％甘油)、培养基和补料培养基的碳氮比、pH(4～6.5，较佳的为5.5)、诱导剂甲醇的最适浓度范围(0.5％)等。成功的建立了工程菌pPICBMDHAM2eLTB/GS115的溶氧反馈高密度发酵工艺，使疫苗的理论分泌表达水平达到1.7～2.3克/升发酵液。

实施例五融合蛋白的纯化

发酵上清中的重组疫苗蛋白在近中性环境中，用30～75％饱和度硫酸铵沉淀；沉淀的蛋白用10～50mM pH7.0～9.0的Tris-HCl充分复溶；然后用金属鏊合亲和层析进行进一步纯化，分离介质一般选用Co²⁺、Zn²⁺或Gu²⁺金属鏊合亲和分离介质，可以采用pH梯度洗脱和咪唑梯度洗脱，一般选择咪唑梯度洗脱；经过纯化的目的蛋白再经过脱盐柱或透析处理进行脱盐并将重组疫苗蛋白的缓冲液换成PBS；再通过稀释或浓缩将重组疫苗蛋白调整到合适浓度后，进行制剂配制，再过滤除菌，最后分装，或直接储藏备用，或真空冷冻干燥后储藏备用。

具体实施中的纯化工艺为：发酵上清中的重组疫苗蛋白在近中性环境中，用50％饱和度硫酸铵沉淀；沉淀的蛋白用20mM pH7.0～9.0的Tris-HCl充分复溶；然后用Zn²⁺金属鏊合亲和分离介质，采用咪唑梯度洗脱，一般选择咪唑梯度洗脱；经过纯化的目的蛋白再经过脱盐柱脱盐并将重组疫苗蛋白的缓冲液换成PBS；再通过稀释或浓缩将重组疫苗蛋白调整到合适浓度后，进行制剂配制，再过滤除菌，最后分装，或直接储藏备用(纯化结果见图2)。经过该工艺处理后的重组疫苗蛋白，蛋白纯度大于95％，终产率在1.1～1.5克/升发酵液，终产品达到无菌无热源，而且稳定性良好。后又通过H5N1阳性血清ELISA(检测抗原部分)和GM₁-ELISA(检测LTB部分)跟踪检测，确定的疫苗冻干和稳定保护剂，建立了冻干工艺。

GM₁-ELISA检测LTB部分与神经节苷脂的结合方法如下：

96孔板用5mg/L的GM₁(Sigma，美国)50μl 4℃包被过夜，用含0.05％Tween20的PBS洗板后用1％BSA200μl室温封闭4h，洗板，加入浓度适当的待检样品，同时设立阳性[CT(霍乱毒素)标准品]、阴性(牛血清白蛋白标准品)及试剂空白对照，37℃ 2h，洗板后加入1∶200兔抗LTB抗血清100μl，37℃ 2h，洗板后加入1∶20000 HRP(辣根过氧化物每)标记的羊抗兔IgG抗血清(武汉博士德生物工程有限公司)100μl，37℃ 2h，洗板后显色(OPD作为底物)数分钟，2.5％H₂SO₄终止显色。测定A₄₉₂值，实验组A₄₉₂/阴性对照A₄₉₂＞2.1视为阳性结果。

实施例六重组粘膜疫苗免疫对SPF鸡的免疫效力研究

将4周龄SPF鸡随机分为组，25只/组，第一组经口、鼻腔分两等份接种20微克(200μL，0.1mg/mL)重组疫苗，第二组经腿部分两点肌肉注射接种20微克(200μL，0.1mg/mL)重组疫苗，第3组为对照组，注射200μL PBS溶液。

免疫后21d采血后，随机挑5只试验鸡进行扑杀，采集完整的小肠，制备肠道粘膜样品：去除多余的脂肪，于5mL PBS(含100mg/L PMSF)中用剪刀将肠道剖开，剪成1cm小段，置100mL盐水瓶中剧烈摇振5min，4℃8000转/min离心20min，取上清采用血凝抑制试验(Hemagglutination inhibition，HI)方法测定其相应的抗体滴度。

免疫后第28天，将各组鸡一分为二随机分到两个隔离器中，分别用100倍的半数致死剂量(50％Lethal Dose，LD₅₀)的GD/1/96(H₅N₁)和KP(H₇N₁)株HPAIV(高致病性禽流感病毒)经胸部肌肉注射接种到鸡体内，0.2mL/只，攻毒后3周内每天观察记录鸡只的发病和死亡情况，并根据死亡数统计死亡率。临床发病判断标准：精神沉郁、垂头蜷缩、食欲不振或废绝、腹泻、头部水肿、呼吸困难、神经症状、可视粘膜或无毛皮肤发绀、出血等。

免疫和攻毒后每周采集其翅静脉血，分离血清，采用血凝抑制试验(Hemagglutination inhibition，HI)方法测定其相应的抗体滴度。

病毒分离与滴定  在攻毒后第5天采集每组鸡的泄殖腔拭子和喉头拭子，将每个拭子10倍连续稀释至适当稀释度，每个稀释度经尿囊腔接种3枚9～11日龄鸡胚，0.1mL/枚，48h收集尿囊液，微量血凝法检测病毒，并根据其不同稀释度的血凝结果用Reed-Muench法计算其病毒分离的滴度。

保护率＝[(攻毒对照组死亡率一疫苗免疫组死亡率)/攻毒对照组死亡率]×100％]。

试验结果：

免疫后，对照组SPF鸡未检测到HI抗体.两个免疫组在免疫后第7天就可检测到一定的HI抗体，HI抗体在第14天到第21天之间达到并维持最高水平，然后缓慢下降；在攻毒后的第二周又达到一个高峰。重组粘膜疫苗免疫组与各对照组差异显著(P＜0.01)，显示该疫苗能够有效刺激受试动物产生针对HA的免疫反应。重组粘膜疫苗免疫试验鸡后的HI抗体的动态变化见(结果见表1A)。在激发全身抗体免疫应答方面，两个重组粘膜疫苗免疫组和空白对照组之间均存在极显著差异(P＜0.01)，两个重组粘膜疫苗免疫组之间无显著差异。

HI试验的结果表明，经口鼻免疫组和注射免疫组均可在肠道检测到很高的粘膜抗体效价，但经口鼻免疫组比注射免疫组高；但血清抗体效价则较注射免疫组低。单因素方差分析的结果表明，在激发粘膜抗体免疫应答方面，两个重组粘膜疫苗免疫组与空白对照组之间均存在极显著差异(P＜0.01)，两个重组粘膜疫苗免疫组之间存在显著差异(P＜0.05)(结果见表1B)。

对照组在攻毒后第2天开始出现精神沉郁、食欲废绝、腹泻、鸡冠和足部皮下出血等典型发病症状，并于2～6d内全部死亡。而在H₅N₁攻毒后三周内，所有重组粘膜疫苗蛋白免疫组均无临床发病症状，保护率为100％；在H₇N₁攻毒后三周内，经口、鼻腔饲喂免疫组有5只鸡发病，保护率为60％，注射免疫组有4只鸡发病，保护率为70％(结果见表1C)。该试验显示该疫苗能够有效刺激受试动物产生针对H5型禽流感病毒的免疫保护反应，同时对其它类型禽流感病毒也能够产生较强的免疫保护反应。

在攻毒后第4天采集每组鸡的泄殖腔拭子和喉头拭子接种鸡胚进行病毒，结果：H₅N₁攻毒后，两个试验组都没有分离到病毒。而采用H₇N₁攻毒，经口、鼻腔饲喂免疫组病毒阳性率达到50％，注射免疫组病毒阳性率达到33.3％(结果见表1D)。

表1重组H₅N₁粘膜免疫疫苗对SPF鸡的免疫和保护效力研究结果

A.SPF试验鸡免疫和攻毒后HI抗体(log2)的动态变化

组别	免疫前	免疫后				攻毒后
										1	2	3	4		1	2	3
		对照组	0	0	0	0	0		-									-	-
-	-									-
									经口鼻免疫组		0	1.82±0.63	5.84±0.081	6.19±0.86	5.93±0.92		5.14±0.95a	6.87±1.23a	5.98±0.87a
6.31±1.25b	8.79±1.75b	9.23±0.95b
			注射免疫组	0	2.45±0.70	7.52±0.77	7.81±0.82	7.27±0.79		6.79±1.05a							8.03±1.47a	7.32±1.23a
7.85±1.16b	9.77±1.92b	9.83±0.97b

注：-表示在攻毒后试验鸡全部死亡，带有a符号的表示免疫鸡用HAPI H₅N₁攻毒，带有b符号的表示免疫鸡用HAPI H₇N₁攻毒

B.SPF试验鸡免疫后血清小肠粘膜HI抗体(log2)水平

组别	平均HI抗体效价(log2)
			小肠粘膜样	血清样品
	对照组	1.57±0.57			1.82±0.72
经口鼻免疫组			7.28±0.92	6.23±0.84
	注射免疫组	4.78±0.69			7.89±0.96

C.SPF试验鸡免疫后用致死剂量的HAPI H₅N₁、H₇N₁攻击后发病和死亡情况

组别	攻毒毒株	发病率(％)	死亡率(％)	保护率(％)
					对照组	H5N1	(10/10)100	(10/10)100	0
H7N1	(10/10)100	(10/10)100	0
				经口鼻免疫组		H5N1	(10/10)0	(10/10)0	100
H7N1	(5/10)50	(4/10)40	60
					注射免疫组	H5N1	(10/10)0	(10/10)0	100
H7N1	(4/10)20	(3/10)30	70

D、SPF试验鸡免疫后用HAPI H₅N₁、H₇N₁攻击后病毒分离情况

组别	攻毒毒株	阳性检出数/总数	病毒滴度(logEID50)	检出率(％)
					对照组	H5N1	5/5	2.75	100
H7N1	2/2	3.28	100
				经口鼻免疫组		H5N1	0/10	＜0.9	0
H7N1	4/8	1.78	50
					注射免疫组	H5N1	0/10	＜0.9	0
H7N1	3/9	2.14	33.3

注：把该方法最低的阳性判别点所对应的病毒滴度定为0.9

序列表

<110>北京宝麦德生物医药科技有限公司

<120>禽流感H5N1新型黏膜免疫疫苗及其应用

<160>14

<210>1

<211>2151

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>禽流感H5N1黏膜免疫疫苗DNA编码序列

<222>(1)...(2151)

<400>

gaattctctt tgttgactga agttgaaact ttgactagaa acgaatggga atgtaagtgt tctgattctt    70

ctgatccatc tttcgaaaga tttgaaatct ttccaaagga gtctgatcaa atctgtattg gttaccatgc   140

taacaactct actgaacaag ttgatactat catggagaag aacgttactg ttactcatgc tcaagacatc   210

ttggagaaga ctcataacgg taagttgtgt gatttggatg gtgttaagcc attgatcttg agagattgtt   280

ctgttgctgg ttggttgttg ggtaacccaa tgtgtgatga gttcatcaac gttccagaat ggtcttacat   350

tgttgagaag gcttctccag ctaacgattt gtgttaccca ggtgacttca acgactacga agagttgaag   420

catttgttgt caagaatcaa ccatttcgag aagattcaga tcattccaaa gtcttcttgg tctaaccatg   490

aggcttcttc tggtgtttct tctgcttgtc catacttggg taagtcttct ttcttcagaa acgttgtttg   560

gttgatcaag aagaactcta cttacccaac tatcaagaga tcttacaaca acactaacca agaagacttg   630

ttggtcttgt ggggtattca tcatccaaac gatgctgctg aacaaactag attgtaccag aacccaacta   700

cttacatttc tgttggtact tctactttga accagagatt ggttccaaag attgctacta gatccaaggt   770

taacggtcaa tctggtagaa tggagttctt ctggactatc ttgaagccaa acgatgctat caacttcgaa   840

tctaacggta acttcattgc tccagagtac gcttacaaga ttgttaagaa gggtgattct gctatcatga   910

agtctgagtt ggagtacggt aactgtaaca ctaagtgtca gactccaatg ggtgctatca actcttctat   980

gccattccat aacattcatc cattgactat tggtgagtgt ccaaagtacg tcaagtctaa cagattggtc  1050

ttggctactg gtttgagaaa ctctccacaa agagaaagaa gaagaaagaa gagaggtttg tttggtgcta  1120

ttgctggttt cattgaaggt ggttggcaag gtatggtcga cggttggtac ggttaccatc attctaacga  1190

acaaggttct ggttacgctg ctgacaagga atctactcag aaggctattg atggtgttac taacaaggtc  1260

aactctatca ttgataagat gaacactcag ttcgaagctg ttggtagaga gttcaacaac ttggaaagaa  1330

gaattgagaa cttgaacaag aagatggaag atggtttctt ggatgtttgg acttacaacg ctgagttgtt  1400

ggttttgatg gagaacgaaa gaactttgga cttccatgat tctaacgtta agaacttgta cgacaaggtt  1470

agattgcagt tgagagacaa cgctaaggaa ttgggtaacg gttgttttga gttctaccat aagtgtgata  1540

acgaatgtat ggaatctgtt agaaacggta cttacgatta cccacagtac tctgaagaag ctagattgaa  1610

gagagaagag atttctggtg ttaagttgga atccattggt acttctttcg aaagattcga aatctttcca  1680

aaggagttgt tgactgaagt tgaaactcca actagaaacg gttgggaatg tagatgttct gattcttctg  1750

atccaggtgg ttctggtgga tccgctccac aaactatcac tgagttgtgt tctgagtaca gaaacactca  1820

aatctacact atcaacgaca agattttgtc ctacactgag tctatggctg gtaagagaga gatggtcatc  1890

attactttca agtctggtga aactttccaa gttgaggttc caggttctca acatatcgat tctcagaaga  1960

aggctattga gagaatgaag gatactttga gaatcactta cttgactgag actaagattg ataagttgtg  2030

tgtttggaac aacaagactc caaactccat tgctgctatc tctatgaaga atctagaaca aaaactcatc  2100

tcagaagagg atctgaatag cgccgtcgac catcatcatc atcatcattg a 2151

<210>2

<211>716

<212>蛋白质

<213>人工设计

<220>

<221>禽流感H5N1黏膜免疫疫苗氨基酸序列

<222>(1)...(716)

<220>

<221>禽流感病毒M2蛋白胞外区(ectodomain)氨基酸序列(SEQ ID No.4)

<222>(3)...(26)

<220>

<221>T细胞抗原决定族氨基酸序列

<222>(27)...(37)

<220>

<221>禽流感病毒H5型HA氨基酸序列

<222>(38)...(551)

<220>

<221>T细胞抗原决定族氨基酸序列

<222>(552)...(562)

<220>

<221>禽流感病毒M2蛋白胞外区(ectodomain)氨基酸序列(SEQ ID No.6)

<222>(563)...(585)

<220>

<221>连接肽

<222>(586)...(590)

<220>

<221>LTB氨基酸序列

<222>(592)...(694)

<220>

<221>Tag氨基酸序列

<222>(695)...(716)

<400>

Glu Phe Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Leu Thr Arg Asn Glu Trp Glu Cys Lys Cys  20

Ser Asp Ser Ser Asp Pro Ser Phe Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Asp Gln  40

Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys  60

Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys  80

Asp Leu Asp Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu 100

Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val Glu Lys 120

Ala Ser Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys 140

His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp 160

Ser Asn His Glu Ala Ser Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Lys Ser Ser 180

Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile Lys Arg 200

Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn 220

Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr 240

Ser Thr Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln 260

Ser Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn Phe Glu 280

Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser 300

Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met 320

Gly Ala Ile Asn Ser Ser Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys 340

Pro Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser Pro Gln 360

Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly 380

Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser 400

Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val 420

Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn 440

Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp 460

Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp 480

Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu 500

Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val 520

Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg Glu Glu 540

Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr Ser Phe Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro 560

Lys Glu Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Gly Trp Glu Cys Arg Cys Ser 580

Asp Ser Ser Asp Pro Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Pro Gln Thr Ile Thr Glu Leu Cys 600

Ser Glu Tyr Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr Glu 620

Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys Ser Gly Glu Thr Phe Gln 640

Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys 660

Asp Thr Leu Arg Ile Thr Tyr Leu Thr Glu Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn 680

Asn Lys Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser Met Lys Asn Leu Glu Gln Lys Leu Ile 700

Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His 716

<210>3

<211>72

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>禽流感病毒M2蛋白胞外区(ectodomain)DNA编码序列

<222>(1)...(72)

<400>

tctttgttga ctgaagttga aactttgact agaaacgaat gggaatgtaa gtgttctgat tcttctgatc    70

ca  72

<210>4

<211>24

<212>多肽(Polypeptide)

<213>禽流感病毒(Influenza A virus)

<220>

<221>禽流感病毒M2蛋白胞外区(ectodomain)氨基酸序列

<222>(1)...(24)

<400>

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Leu Thr Arg Asn Glu Trp Glu Cys Lys Cys Ser Asp 20

Ser Ser Asp Pro 24

<210>5

<211>69

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>禽流感病毒M2胞外区(ectodomain)DNA编码序列

<222>(1)...(69)

<400>

ttgttgactg aagttgaaac tccaactaga aacggttggg aatgtagatg ttctgattct tctgatcca     69

<210>6

<211>23

<212>多肽(Polypeptide)

<213>禽流感病毒(Influenza A virus)

<220>

<221>禽流感病毒M2胞外区(ectodomain)氨基酸序列

<222>(1)...(23)

<400>

Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Gly Trp Glu Cys Arg Cys Ser Asp Ser 20

Ser Asp Pro 23

<210>7

<211>1542

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>禽流感病毒H5型HA DNA编码序列

<222>(1)...(1542)

<400>

tctgatcaaa tctgtattgg ttaccatgct aacaactcta ctgaacaagt tgatactatc atggagaaga    70

acgttactgt tactcatgct caagacatct tggagaagac tcataacggt aagttgtgtg atttggatgg   140

tgttaagcca ttgatcttga gagattgttc tgttgctggt tggttgttgg gtaacccaat gtgtgatgag   210

ttcatcaacg ttccagaatg gtcttacatt gttgagaagg cttctccagc taacgatttg tgttacccag   280

gtgacttcaa cgactacgaa gagttgaagc atttgttgtc aagaatcaac catttcgaga agattcagat   350

cattccaaag tcttcttggt ctaaccatga ggcttcttct ggtgtttctt ctgcttgtcc atacttgggt    420

aagtcttctt tcttcagaaa cgttgtttgg ttgatcaaga agaactctac ttacccaact atcaagagat    490

cttacaacaa cactaaccaa gaagacttgt tggtcttgtg gggtattcat catccaaacg atgctgctga    560

acaaactaga ttgtaccaga acccaactac ttacatttct gttggtactt ctactttgaa ccagagattg    630

gttccaaaga ttgctactag atccaaggtt aacggtcaat ctggtagaat ggagttcttc tggactatct    700

tgaagccaaa cgatgctatc aacttcgaat ctaacggtaa cttcattgct ccagagtacg cttacaagat    770

tgttaagaag ggtgattctg ctatcatgaa gtctgagttg gagtacggta actgtaacac taagtgtcag    840

actccaatgg gtgctatcaa ctcttctatg ccattccata acattcatcc attgactatt ggtgagtgtc    910

caaagtacgt caagtctaac agattggtct tggctactgg tttgagaaac tctccacaaa gagaaagaag    980

aagaaagaag agaggtttgt ttggtgctat tgctggtttc attgaaggtg gttggcaagg tatggtcgac   1050

ggttggtacg gttaccatca ttctaacgaa caaggttctg gttacgctgc tgacaaggaa tctactcaga   1120

aggctattga tggtgttact aacaaggtca actctatcat tgataagatg aacactcagt tcgaagctgt   1190

tggtagagag ttcaacaact tggaaagaag aattgagaac ttgaacaaga agatggaaga tggtttcttg   1260

gatgtttgga cttacaacgc tgagttgttg gttttgatgg agaacgaaag aactttggac ttccatgatt   1330

ctaacgttaa gaacttgtac gacaaggtta gattgcagtt gagagacaac gctaaggaat tgggtaacgg   1400

ttgttttgag ttctaccata agtgtgataa cgaatgtatg gaatctgtta gaaacggtac ttacgattac   1470

ccacagtact ctgaagaagc tagattgaag agagaagaga tttctggtgt taagttggaa tccattggta   1540

ct 1542

<210>8

<211>514

<212>蛋白质

<213>禽流感病毒(Influenza A virus)

<220>

<221>禽流感病毒H5型HA氨基酸序列

<222>(1)...(514)

<400>

Ser Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val Asp Thr Ile  20

Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gin Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly  40

Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly  60

Trp Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile  80

Val Glu Lys Ala Ser Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn Asp Tyr Glu 100

Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys 120

Ser Ser Trp Ser Asn His Glu Ala Ser Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly 140

Lys Ser Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr 160

Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His 180

His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser 200

Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val 220

Asn Gly Gln Ser Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile 240

Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile Val Lys Lys 260

Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln 280

Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile 300

Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn 320

Ser Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 340

Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu 360

Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr 380

Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu 400

Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu 420

Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp 440

Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn 460

Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met 480

Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu E Ala Arg Leu Lys   500

Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr 514

<210>9

<211>309

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>LTB DNA编码序列

<222>(1)...(309)

<400>

gctccacaaa ctatcactga gttgtgttct gagtacagaa acactcaaat ctacactatc aacgacaaga     70

ttttgtccta cactgagtct atggctggta agagagagat ggtcatcatt actttcaagt ctggtgaaac    140

tttccaagtt gaggttccag gttctcaaca tatcgattct cagaagaagg ctattgagag aatgaaggat    210

actttgagaa tcacttactt gactgagact aagattgata agttgtgtgt ttggaacaac aagactccta    280

attccattgc tgctatctct atgaagaat  309

<210>10

<211>103

<212>蛋白质

<213>猪(Pocine)

<220>

<221>LTB氨基酸序列

<222>(1)...(103)

<400>

Ala Pro Gln Thr Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr Arg Asn Thr Gln Ile Tyr Thr Ile  20

Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr Glu Ser Met Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile  40

Thr Phe Lys Ser Gly Glu Thr Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser  60

Gln Lys Lys Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr Tyr Leu Thr Glu Thr  80

Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro Asn Ser Ile Ala Ala Ile Ser 100

Met Lys Asn 103

<210>11

<211>33

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>T细胞抗原决定族DNA编码序列

<222>(1)...(33)

<223>y＝t或c

<400>

tcyttygaaa gattcgaaat  ctttccaaag  gag 33

<210>12

<211>12

<212>多肽(Polypeptide)

<213>人工合成

<220>

<221>T细胞抗原决定族氨基酸序列

<222>(1)...(11)

<400>

Ser Phe Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu 12

<210>13

<211>66

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>Tag DNA编码序列

<222>(1)...(66)

<400>

ctagaacaaa aactcatctc agaagaggat ctgaatagcg ccgtcgacca tcatcatcat catcat      66

<210>14

<211>22

<212>多肽(Polypeptide)

<213>人工设计

<220>

<221>Tag氨基酸序列

<222>(1)...(22)

<400>

Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His  20

His His 22

Claims (15)

1.一种用于粘膜免疫的融合蛋白，其含有禽流感病毒H5N1亚型的M2蛋白膜外区段、禽流感病毒H5N1亚型的血细胞凝集素(HA)、大肠杆菌不耐热毒素B亚单位(LTB)和T细胞抗原表位。

2.权利要求1所述的融合蛋白，其中所述的M2蛋白膜外区段的氨基酸序列选自SEQ ID No.4和6；其中所述的HA的氨基酸序列为SEQ ID No.8；其中所述的LTB的氨基酸序列为SEQ ID No.10；其中所述的T细胞抗原表位的氨基酸序列为SEQ ID No.12。

3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其进一步含有纯化标签和/或接头肽。

4.如权利要求3所述的融合蛋白，其中所述的纯化标签的氨基酸序列为SEQ ID No.14所示的氨基酸序列。

5.如权利要求3所述的融合蛋白，其含有一个或几个M2蛋白膜外区段、一个或几个T细胞抗原表位、1个HA、1个大肠杆菌不耐热毒素B亚单位和1个纯化标签，其中纯化标签连接在大肠杆菌不耐热毒素B亚单位的C端。

6.如权利要求3所述的融合蛋白，其氨基酸序列

a)如SEQ ID No.2所示；

或b)是对SEQ ID No.2所示的序列插入、缺失或取代一个或几个氨基酸残基而得的氨基酸序列。

7.一种核酸分子，其编码权利要求1-6之任一所述的融合蛋白。

8.权利要求7所述的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

9.一种载体，其含有权利要求7或8所述的核酸分子。

10、一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求9所述的载体，或者所述细胞已用权利要求7或8所述的核酸分子转化或转染。

11、一种制备权利要求1-6之任一所述融合蛋白的方法，其包括以下步骤：用权利要求10的宿主细胞表达权利要求1-6之任一所述的融合蛋白，并分离所述的融合蛋白。

12、一种用于粘膜免疫的药物组合物，包括权利要求1-6之任一所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体。

13、权利要求12所述的药物组合物，其为注射剂型、喷雾剂型或作为饲料添加剂的剂型。

14、权利要求1-6之任一所述的融合蛋白在制备预防禽流感的药物中的应用。

15、权利要求12所述的药物组合物在制备预防禽流感的药物中的应用。

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