JPS62100299A - インタ−ロイキン−２誘導体、その調製および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （従来の技術） ヒトインターロイキン−２（以下、Ｉ［−２と略記する
）は、遺伝子工学の合成法によって容易に得ることがで
きるようになったことにより、近年広汎な研究が行われ
【ぎ−Ｃいる生物活性を右するポリペプチドの一つであ
る。欧州特許出願公開（ＥＰ−Ａ）第９１．５３９号明
細書には、この分子の完全なアミノ酸配列のみならず、
最初のＮ−末端アミノ酸を欠く誘導体についてし記載さ
れている。（非先行的に刊行された）ドイツ国特許出願
公開第３，４１９．９９５号（欧州特許出願公開第１６
３．２４９号、オーストラリア国特許出願第４３．０７
０／８５号）明細書には、既に合成遺伝子によるこのよ
うなＩ　Ｌ、　−２の誘導体を製造する方法が提案され
ている。

（発明の目的） 驚くべきことには、天然のアミノ酸配列の最初の７個の
Ｎ−末端アミノ酸を欠いているＩＬ−２誘導体が生物活
性を右することが見出された。従って、本発明が、これ
らのＮ−末端アミノ酸がないＩＬ−２誘導体、これらの
誘導体の製造法、これらの誘導体を含有する薬剤、およ
びＩＬ−２の生物活性を有する薬剤を調製するためのこ
れらの誘導体の使用、に関するものである。

不発１’ｌは、天然アミノ酸？Ｉｅ列を有する誘導体だ
けに限定されず、アミノ酸配列が自体公知の方法で改変
されてし、か６イの生物活性は本質的し一保持されま１
：、は強化されているポリペプチドにも関する。このタ
イプの改変は、例えば、欧州待ｄ１出願公開第１０９，
７４８号明細占およびドイツ国特許出願公開第３，４１
９．９９５号明細書に記載されている。本明細占に記載
さｔ）だ遺伝子工学的方法は、合成りＮＡ配列、４なわ
ち多数の独自な制限部位を有し、従−）で改変されたア
ミノ酸配列をイ１するポリペプチドの調製に本′α的に
好適な合成りＮＡ配列、を基本とするものである。

短縮されたノアミノ酸配列を右する本発明の［Ｌ−２誘
導体は、多くの利点をイアする。寸なわら、天然のＩ　
Ｌ、　−２と比較すると、短縮されていることを除いて
天然配列に対応するアミノ酸配列を右する本発明による
誘導体は、より高度に発現し、従って収率が高くなる。

史に’１ｍ、水中での溶解１１はほぼ二倍であり、高、
１１ミ液体クロン１−グラノイー上での保持時間は短縮
さｔｌｔいる。これらの改良された物性により、処理が
容易になるので、純粋な生成物の全般的収率が増加する
ことになる。

例えば、同一抽出条件では、処理の第一段階の抽出液に
おける本発明による短縮された生成物の濃度は、天然の
ＩＬ−２では１０〜１５重間％であるのに対して、２７
重１％程度まで増加する。このように溶解度が向、トシ
ているので、再生（ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）も容易
になり、また活性で純粋な生成物の収率も増加する。こ
の生成物の生物活性は、天然生成物の生物活性に対応す
るので、これらの利点は活性の減少という犠牲を払って
得たというものではない。

（発明の詳細な説明） 本発明を、以下の語例において詳細に説明する。

特に断らないかぎり、これらの例における百分率データ
ーは１聞によるものである。

例　　１ １１２を」−ドするＤＮＡ配列■をドイツ国特許出願公
開第３，４１９．９９５号明細書の実施例５ａ）に記載
の方法によって甲離し、次いで制限酵素Ｈｉ　ｎ　ｆ　
■で切断１−る。アミノ酸１０−１３３についてのコー
ドンを含む［Ｌ　−２遺伝子フラグメントを１．５％低
融点アガロースゲル上で分離し、フェノール抽出した後
、回収３ｊる。この遺伝子フラグメントは、次のような
りＮＡ配列（１）を有する。

Ｔｈｒ　　Ｇｌｎ　　Ｔｈｒ　　Ｓｔｐ　　５ｔｐ５′
　　　八ＣＴ　　　　　　ＣＡ＾、１．　　　ΔＣＣＴ
ＧＡ　　　　　　ＴＡＣ３’　　　　　　　（１）３’
　　　　　　　　　　　　　ＧｒＴ　　　　　　ＴＧＧ
　　　　　　ＡＣＴ　　　　　　ＡＴＣＡＧＣＴ　　　
　　５’（ｌｌｉｎｆ　１　）　　　　　　　　　　　
（Ｓａｔ　Ｉ　）配列（１）を、Ｔ’　４　Ｄ　Ｎ　Ａ
リガーゼを用いて、ＤＮＡ配列（２）のリンカ−と連結
する。

Ｍｅｔ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ ５’　　　　Ａへ　　　　　　ＴＴＣ＾１Ｇ　　　　　
へ＾へ　　　　　ＡＡＧ　　　　　　　　　　　　　　
　３’　　　　　　（２）３’　　　　　Ｇ　　ＴＡＣ
ＴＴＴ　　ＴＴＣＴＧＡ　　　５’（Ｅｃｏ　ＲＩ　）
　　　　　　　　（ｆｌｉｎｔ　Ｉ　）次に、連結生成
物をＥｃｏＲＩおよび ３ａｌ　　ｌで切断し、ドイツ国特許出願公１；ｉ第３
．４１９．９９５弓明細ｉηの実施例５ａ）と１一様な
方法で、同じＭ素で開環した発現プラスミドｐＫＫ１７
７．３中に導入する。得られるバーイブリッドプラスミ
ドは、ＤＩＬ−２／２と呼ばれ、これは（ドイツ国特許
出願公開第３．４１９．９９５号明細書第５図の）プラ
スミドｐ１５９／６に対応するものであって、配列ｔ’
１ＬＩＩｊが本発明によって短縮されたＤＮＡ配列によ
って甲に置き代わったものに相当し、上記ＤＮＡ配列（
１）および（２）の連結によって得られるものである。

この本発明による短縮された配列を、上記ドイツ国特許
出願公開明細月の実施例５ｂ）（第６図）と同様に発現
プラスミドｐ　１’　ｒ　ｐ）−１１中に導入すると、
プラスミドｐＩ　Ｌ−２／３が得られる。

例　　２ ハイブリッドプラスミドＤ　Ｉ　Ｌ　−２／２およびｐ
Ｉ　Ｌ　−２／３を、公知の方法で市販の菌株［、ｃｏ
ｌｉ　　Ｗ３１１０へ形質転換し、ＹＴ培地（Ｊ、　Ｍ
ｉｌｌｅｒ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃ＋＞、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇＢａｒｂｅｒ、　１９７２年）中で一晩培養する。

次に、培養液を最小量のＡ培地（Ｊ。

Ｈｉ　ｌ　Ｉｅｒ、上記に引用）中に１：２０の重量化
で移し、６００ｎｍぐの吸光度が０．５となるまで撹拌
フラスニ」（２６０ｒｌ）ｍ）中で３７℃で培養４る。

その後、Ｄ　Ｉ　Ｌ　−２、、／　２で形質転換しノだ
細菌の場合には、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト
ピラノシドで発現させ、ＤＩ＋−−２／３で形質転換し
た細菌の場合にはインドリルアクリル酢酸で発現させ、
培養液に１％グル］−ルによる「アフター−７−１’−
ド（ａｆｔｅｒ　−ｆｅｅｄ）　Ｊを与えて８．３７℃
で更に３藺間娠虐する。

次いで、′８呈の培養液を緩衝液（７Ｍ尿素、１％ドデ
シル１ｉａｌナトリウム（ＳＤＳ）、４％メルカプトエ
タノール、３０ｍＭ１−リス、ｌ（６，８）と混合し、
５分間煮沸し、タンパク質を１５％５ＤＳ−アクリルア
ミドゲル十で分画Ｊ−る。分画したタンパク質Ｃ００Ｉ
ＩｌａＳＳｉｅ　ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　ｂｌｕｅ　（登
録商標）で染色した世、ゲルを脱染色することによって
可視化する。

同じ条件下でプラスミドＩ’３１５９／６　（ドイツ国
特許出願公開第３．４１９，９５５号明細書第５図）を
出いて得たタンパク質を比較すると、Ｉ　Ｌ　−２活性
をイｊするより多くのタンパク質が本発明により生成す
ることが分かる。

出願人代理人　　佐　　藤　　−雄

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アミノ酸配列は本質的に天然のＬ１−２のアミノ酸
   配列に対応しているが、この天然のアミノ酸配列のＮ−
   末端の始めの７個のアミノ酸を欠いているものである、
   ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）の生物活性を有
   するタンパク質。 ２、式 Ｍｅｔ−（ＩＬ−２　８−１３３） を有するタンパク質。 但し、（ＩＬ−２　８−１３３）は、ＩＬ−２のアミノ
   酸８〜１３３を表す。 ３、特許請求の範囲第１項または第２項記載のタンパク
   質をコードするＤＮＡ。 ４、特許請求の範囲第３項記載のＤＮＡを含有するハイ
   ブリッドベクター。 ５、特許請求の範囲第４項記載のベクターを含有する宿
   主細胞。 ６、特許請求の範囲第４項記載のベクターを含有するＥ
   ．ｃｏｌｉ。 ７、特許請求の範囲第５項または第６項の宿主細胞に所
   望のタンパク質を発現させることから成る、特許請求の
   範囲第１項または第２項記載のタンパク質の製造法。 ８、特許請求の範囲第１項または第２項記載のタンパク
   質を含有する薬剤。 ９、ＩＬ−２活性を有する薬剤の調製のための、特許請
   求の範囲第１項または第２項記載のタンパク質の使用。