KR900008571B1

KR900008571B1 - 효모에서 발현된 인체 γ-인터페론의 정제방법

Info

Publication number: KR900008571B1
Application number: KR1019880007647A
Authority: KR
Inventors: 임관열; 송영호; 한규범; 정현호
Original assignee: 주식회사 럭 키; 허신구
Priority date: 1988-06-24
Filing date: 1988-06-24
Publication date: 1990-11-24
Also published as: KR900000384A

Abstract

내용 없음.

Description

효모에서 발현된 인체 γ-인터페론의 정제방법

제1도는 143개의 아미노산으로 구성된 인체 γ-인터페론의 아미노산 서열을 나타내고,

제2도는 본 발명의 정제 과정에 따른 단계별 중간생성물 및 최종 생성물을 15% 소디움도데실설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)한 결과를 나타내며,

제3도는 제2도의 정제과정에 의해 정제된 최종 γ-인터페론을 덴시토미터 스캐닝(Densitometer Scanning)한 결과를 나타낸다.

본 발명은 효모에서 발현된 인체 γ-인터페론의 정제 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 양이온 교환 크로마토그라피 및 겔 여과 크로마토그라피를 이용하여 높은 생리활성을 갖는 인체 γ-인터페론을 고순도와 고역가로 분리하여 정제하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로 인터페론은 세포의 여러기능을 조절해주는 작용을 갖고 있는 단백질의 한 부류로서 그 기능이 매우 다양한 바, 예를들면, 바이러스로부터의 세포보호, 조직배양에서나 골수에서의 세포분열 억제, T 세포 작용의 조절, 자연면역세포(NK 세포)의 기능항진 유도에 의한 식균 작용 상승, 또는 특수 암세포의 분열억제 등의 기능이 있는 것으로 알려져 있으며, 특히 항바이러스제와 항암제로서 유용하다. 이들 인터페론은 α-, β-, γ-인터페론 및 그 밖의 다양한 종류의 인터페론이 알려져 있으나, 그 중에서도 특히 γ-인터페론의 경우에는 항바이러스제 및 항암제로서의 이용가치가 탁월하여 그 중요성이 널리 인식되어 있다.

이와 같은 γ-인터페론은 α- 또는 β-인터페론과는 달리 T.림포사이트에서 생성되며 항원이나 세포분열촉진물질(mitogen)이 그의 생성을 유도한다. 또 면역활성적인 측면에 있어서도 γ-인터페론은 α- 또는 β-인터페론과는 전혀 다른 특이성을 갖는 것으로 알려져 있다(Wheelock et al., 1965, Science, 149, 310∼311 및 Esptein et al., 1976, J.Infect. Dis. 133, A56). 최근에는 관련문헌에 따르면 γ-인터페론이 강력한 항분아성(anti-proliferative)기능 [de lay et al., 1980, Eur. J.Immunol., 10, 877∼883 및 Rubin ＆ Gupta, 1980, Proc. National Acad. Sci. USA, 77, 5928∼5932] 및 면역활성조절(Immuno regulatory)기능 [Basham, Merigan, 1983, J.Immunol., 130, 1492∼1494]이 있다는 보고가 있었으며, 그 밖에도 항암성 등에 관한 많은 연구가 진행되고 있다.

최근에는 인체γ-인터페론 유전자의 염기서열이 P.W. Gray 등(1982, Nature, 295, 503∼508)에 의해 규명되었으며, 인체 γ-인터페론의 구조는 E. Rinderknecht(1984, J.Biol. Chem., 259, 6790∼6797)에 의해 규명되어 졌다. 이러한 연구 결과에 의하면, 종래의 포유동물세포를 자극시켜서 생산을 유도해 내거나 유전자 재조합 방법을 이용하여 적당한 숙주에서 발현시켜서 얻어진 γ-인터페론의 경우 N-말단의 아미노산서열이 시스테인-티로신-시스테인(Cys-Tyr-Cys)으로 시작되었던 것과는 달리, 생리활성을 갖는 γ-인터페론은 그 기본 아미노산 서열에 있어서, N-말단이 Cys-Tyr-Cys 없이 글루타민(Gln)으로 시작되는 것으로 밝혀졌으며, 그 143개 아미노산 서열은 제1도에 나타낸 바와 같다.

또한, 종래의 방법에 의해 생산된 N-말단이 Cys-Tyr-Cys로 시작되는 γ-인터페론은 다중체(polymer)를 형성하려는 경향이 강하여 단일체로 존재하는 γ-인터페론은 매우 낮은 수율로 얻어지게 된다. 이러한 다중체는 설프하이드릴기들 간의 가교결합으로 형성된 것으로서, 설프하이드릴기간의 그 가교결합을 환원시키는 방법에 의해 수율을 증가시키려는 노력이 있었으나, 이 경우 일정한 농도에 이르면 다시 가교결합이 진행되어 다중체를 형성시키게 되므로, N-말단이 Cys-Tyr-Cys로 시작되는 γ-인터페론은 임상적용시의 안정성에 문제가 있게 된다. 반면에 N-말단이 Gln으로 시작되는 인체 γ-인터페론의 경우 Cys-Tyr-Cys가 함유되어 있지 않기 때문에 최적의 생리활성을 유지하는 단일체로 존재함은 물론 그 상태가 안정되게 보존된다.

따라서, 인체 γ-인터페론을 N-말단이 Gln으로 시작되는 형태로 제조 및 분리정제하는 방법이 요구되어 왔으며 그러한 요구에 따라 많은 연구가 진행되어져 왔는 바, 그 결과 포유동물세포를 세포분열촉진물질(mitogen)로 자극하여서 그 생성을 유도시켜줌으로써 N-말단이 Gln으로 시작되는 인체 γ-인터페론을 분리정제해 내는 방법이 확립되게 되었다[Irwin. A. Braude, 1983, preparative Biochemistry, 13(3), 177-190]. 한편, 유전자 재조합 방법을 이용하여 E. coli나 효모로부터 N-말단이 Gln으로 시작되는 γ-인터페론을 발현시키는 대량제조방법이 제시되었으나, 이렇게 대량 발현되어진 N-말단이 Gln으로 시작되는 인체 γ-인터페론을 높은 생리활성을 가지며 임상에 적용가능한 형태로서 대량 정제시키는 방법에는 아직도 많은 문제점이 있었다.

이에 본 발명자들은 이런점에 착안하여 양이온 교환 크로마토그라피와 겔 여과 크로마토그라피를 이용하여서 N-말단이 Gln으로 시작되는 인체 γ-인터페론을 균질하면서도 높은 생리활성을 가지며 임상에 적용시킬 수 있는 정도의 안정성 및 용해성이 유지되도록 정제시킬 수 있는 새로운 방법을 발견하게 되어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 N-말단이 Gln으로 시작되는 인체 γ-인터페론을 높은 생리활성을 가지며 임상에 적용가능하도록 고순도로 대량 정제시키는 방법을 제공하는데 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은, 효모로부터 인체 γ-인터페론을 분리정제함에 있어서, N-말단이 Gln으로 시작되는 인체 γ-인터페론이 발현되어 있는 효모를 PMSF(phenylmethyl sulfonyl fluoride)가 함유된 완충용액에 현탁 및 분쇄시킨 후 세포 잔해물 가용성 물질을 제거하고 난 불용성 단백질을 요소가 함유된 완충용액에 용해시키고 이로부터 불용성 물질을 제거한 다음, 그 상등액인 단백질 용액을 양이온 교환 크로마토그라피하여 인체 γ-인터페론을 조정제시키고, 조정제된 인체 γ-인터페론을 겔 여과 크로마토그라피하여 95% 이상의 순도로 더욱 정제시킨후, 정제된 인체 γ-인터페론을 트리에틸아민/초산 혼합물에 혼합교반시키고 아세톤으로 침전시킨 후, 침전물을 생리 포도당용액에 용해시키고 이를 용매투석하여서 균질한 용액상의 인체 γ-인터페론을 정제시키는 것을 그 특징으로 한다.

이하 본 발명을 첨부한 도면에 의거 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서는 효모로부터 발현되는 높은 생리활성을 갖는 인체 γ-인터페론을 정제하기 위한 방법으로서, 제1도에 나타난 아미노산 서열과 같은 N-말단이 Gln으로 시작되고 C-말단이 Gln인 총 143개의 아미노산으로 구성된 인체 γ-인터페론이 발현되어져 있는 효모를 사용하여서 다음의 방법에 따라 분리 및 정제시켰다.

제1도의 아미노산 서열을 갖는 인체 γ-인터페론이 발현되어 있는 효모를 완충용액[10mM Tris(Tris hydroxymethyl aminomethane), 10mM NaCl, 1mM PMSF(phenylmethyl sulfonyl fluoride), 1mM EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid)]에 현탁시킨 후, 0.5∼0.75㎛의 유리구슬로 다이노밀(Dynomill)에서 세포막을 분쇄시킨다.

이를 약하게 원심분리시켜서 침전된 세포잔해물을 제거하고, 그 상등액을 모아서 다시 강하게 원심분리시켜서 가용성 단백질을 포함한 가용성 물질층을 제거시킨다.

상기와 같이 하여 얻어진 침전되어져 있는 불용성 단백질을 회수하여서 이를 증류수로 세척한 다음, 요소가 함유되어 있는 완충용액에 용해시켜서, 이를 원심분리하여 불용성 침전물을 제거한다.

이렇게 하여 얻어진 상등액인 단백질 용액은 요소의 농도 및 pH를 적당하게 맞춘 후에 양이온 교환 크로마토그라피에 적용시키게 되는데, 이때 겔로는 SP-세파덱스 C-50(Pharmacia사 제품), S-세파로즈(Pharmacia사 제품), CM-세파로즈(Pharmacia사 제품)등을 사용할 수 있다. 상기 컬럼을 통과시켜 유리된 단백질을 제거하고, 겔에 흡착된 단백질을 선형구배의 방법으로 용출시킨다. 용출되어진 각 분획은 전기 영동하여서 인체 γ-인터페론이 적정수준 이상, 바람직하게는 60% 이상의 순도를 갖는 분획만을 모으고 이를 생리식염수로 용매투석하여서 침전물을 얻는다.

상기에 의해 60% 이상의 순도로 정제된 인체 γ-인터페론 침전물을 다시 적당한 농도의 요소와 pH를 갖는 완충용액에 용해시킨 후, 겔 여과 크로마토그라피에 적용시키는 바, 이때 겔로는 세파크릴 S-200(Pharmacia사 제품), 세파크릴 S-300(Pharmacia사 제품)등을 사용할 수 있으며, 여기에서 용출되어진 각 분획을 전기영동하여서 인체 γ-인터페론의 순도가 95% 이상되는 부분을 모은다.

이를 트리에틸아민/초산 혼합물과 혼합하고 아세톤으로 침전시킨 후, 침전물을 회수하여 생리포도당에 용해시키고 용매투석하면 높은 생리활성을 갖는 균질하며 고역가를 갖는 인체 γ-인터페론을 고순도로 정제할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

인체 γ-인터페론이 발현된 효모 150g을 450㎖의 완충용액[10mM Tris, 10mM NaCl, 1mM PMSF, 1mM EDTA; pH 8.0]에 현탁시켜서 0.6㎛의 유리구슬로 다이노밀에서 3분간 분쇄시킨 후, 이를 1,500xg에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하고, 그 상등액을 20,000xg에서 30분간 원심분리하여서 침전물층을 회수하고, 이 침전물을 250㎖의 증류수에 현탁시키고 다시 20,000xg에서 30분간 원심분리하여 침전물층을 회수하였다. 그 다음, 침전물을 500㎖의 완충용액[10M 요소, 25mM Tris, 1mM EDTA; pH 8.0]에 첨가하고 10시간 동안 교반시켜서 용해한 후, 이를 20,000xg에서 30분간 원심분리하여 침전물층을 제거하였다.

상기 상등액을 요소의 농도가 7M이 되도록 증류수로 희석하고 pH 8.0이 되도록 조절한 후에 완충용액[7M 요소, 25mM Tris, 1mM EDTA; pH 8.0]으로 미리 평행시킨 SP-세파덱스 C-50(Pharmacia사 제품, 재질; 덱스트란)컬럼 (5×10㎝)에 0.5㎖/min의 속도로 통과시키면서 흡착시키고, 컬럼에 다시 완충 용액[7M 요소, 25mM Tris, 1mM EDTA; pH 8.0]을 통과시켜서 컬럼내에 유리된 상태로 남아있는 단백질들을 모두 제거하였다. 그 다음, 완충용액[7M 요소, 25mM Tris, 1mM EDTA; pH 8.0] 및 완충용액[7M 요소, 25mM Tris, 1mM EDTA, 1mM NaCl; pH 8.0]을 이용하여서 NaCl의 농도구배가 0부터1M까지 되도록 선형구배시켜서 용출시키며, 이때의 용출속도는 1㎖/min으로 하였다. 용출된 각 분획을 15% SDS-PAGE(소디움도데실설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동)하여 덴시토미터 스캐닝한 결과 인체 γ-인터페론의 농도가 60% 이상이 되는 분획만을 모았다. 이를 0.9%의 식염수에 용매투석하여 침전물을 얻었다.

상기 침전물을 완충용액[8M 요소, 10mM Tris; pH 8.0]에 용해시킨 후, 이를 완충용액[6M 요소, 10mM Tris, 100mM EDTA; pH 8.0]으로 미리 평행시킨 세파크릴 S-200(Pharmacia사 제품, 재질; 크로스 링크드 아가로즈, 분자량; 5,000∼250,000)로 겔 여과 크로마토그라피하였다. 용출된 각 분획을 15% SDS-PAGE하여 덴시토미터 스캐닝한 결과 인체 γ-인터페론의 농도가 95% 이상이 되는 분획만을 모았다(150㎖, 150㎎).

이를 트리에틸아민/초산 혼합물에 혼합한 후 교반시키면서 아세톤을 첨가하여 침전시킨 후, 침전물을 회수하여 2.5% 포도당용액에 용해시키면 2.5% 포도당용액으로 충분히 용매투석시키어 150㎎(역가 : 1.0×107IU/㎎ 이상)의 인체 γ-인터페론을 얻었다.

상기 과정에 따른 단계별 중간생성물 및 최종생성물과 단백질 표준시료를 15% SDS-PAGE한 결과를 제2도에 나타내었는 바, 제1레인(lane)은 단백질 표준시료로서 위로부터 가인산분해효소(phosphorylase)/소의혈청알부민/오발부민(ovalbumin)/탄산탈수효소/라이소자임(lysozyme)이고, 제2레인은 인체 γ-인터페론이 발현된 효모를 나타낸 것이며, 제3레인은 효모세포막을 분쇄시킨 다음에 1,500xg에서 원심분리하여 세포잔해물을 제거하고 난 후의 상등액이며, 제4레인은 제3레인의 상등액을 20,000xg에서 원심분리하고 난 후의 침전물이며, 제5레인은 제3레인의 상등액을 20,000xg에서 원심분리하고 난 후의 상등액이며, 제6레인은 제4레인의 침전물을 10M 요소를 함유한 완충용액에 용해시킨 후 20,000xg에서 원심분리하여 침전물을 제거하고 난 후의 상등액으로서 양이온 교환 크로마토그라피하기 전의 시료이며, 제7레인은 제6레인의 시료를 양이온 교환 크로마토그라피할 때 컬럼에 흡착되지 않고 유리되어 나온 부분이며, 제8레인은 제6레인의 시료를 양이온 교환 크로마토그라피할 때 컬럼에 흡착되어진 단백질을 용출시킨 부분이며, 제9레인은 제8레인의 용출액을 0.9% 식염수에서 용매투석시키고난 후의 상등액이며, 제10레인은 제8레인의 용출액을 0.9% 식염수에서 용매투석시키고난 후의 침전물로서, 겔 여과 크로마토그라피하기 전의 시료이며, 제11레인은 제10레인의 시료를 8M 요소에 용해시켜서 겔여과 크로마토그라피한 다음에 용출시킨 부분이며, 제12레인은 제11레인의 용출액을 2.5% 포도당에서 용매투석시키고난 후의 상등액이며, 제13레인은 정제가 완료된 인체 γ-인터페론이며, 제14레인은 라이소자임이다.

[실시예 2]

양이온 교환 크로마토그라피 컬럼으로서 S-세파로즈[Pharmacia사 제품, 재질 : 크로스 링크드 아가로즈) 컬럼(2.6×10㎝)을 사용하는데 이 경우 분자량 31K 이상의 고분자 단백질이 많이 용출되게 되며, 겔 여과 크로마토그라피 컬럼으로서는 세파크릴 S-200을 사용하여서 실시예 1의 순서에 따라 수행한 결과 실시예 1에서와 같이 95% 이상의 인체 γ-인터페론이 얻어졌다.

[실시예 3]

양이온 교환 크로마토그라피 컬럼으로서 CM-세파로즈(Pharmacia사 제품, 재질; 크로스 링크드 아가로즈) 컬럼(5×10㎝)를 사용하는데 이 경우 분자량 31K 이상의 고분자단백질이 실시예 1의 경우보다는 많이, 실시예 2의 경우보다 적게 용출되며, 겔 여과 크로마토그라피 컬럼으로서는 세파크릴 S-200을 사용하여서 실시예 1의 순서에 따라 수행한 결과 실시예 1에서와 같이 95% 이상의 인체 γ-인터페론이 얻어졌다.

[실시예 4∼6]

실시예 1∼3의 경우에 있어서 양이온 교환 크로마토그라피로 얻어진 γ-인터페론 용출액 분획을 겔 여과 크로마토그라피 컬럼으로서 세파크릴 S-200 대신에 세파크릴 S-300(Pharmacia사 제품, 재질 : 크로스 링크드 아가로즈, 분자량 : 10,000∼1.5×10⁶)을 사용하여서 실시예 1의 순서에 따라 수행한 결과 실시예 1에서와 같이 95% 이상의 인체 γ-인터페론이 얻어졌다.

Claims

효모로부터 인체 γ-인터페론을 분리 정제하는데 있어서, 인체 γ-인터페론이 발현되어 있는 효모를 PMSF(phenylmethyl sulfonyl fluoride)가 함유된 완충용액에 현탁 및 분쇄시킨 후 세포잔해물 및 가용성 물질을 제거하고 난 불용성 단백질을 요소가 함유된 완충용액에 용해시키고 이로부터 불용성 물질을 제거한 다음, 그 상등액인 단백질 용액을 양이온 교환 크로마토그라피하여 인체 γ-인터페론을 조정제시키고, 조정제된 인체 γ-인터페론을 겔 여과 크로마토그라피하여 95% 이상의 순도로 더욱 정제시킨 후, 정제된 인체 γ-인터페론을 트리에틸아민/초산 혼합물에 혼합교반시키고 아세톤으로 침전시킨 후 침전물을 생리포도당에 용해시키고 이를 용매투석시키는 것을 특징으로 하는 효모에 발현된 인체 γ-인터페론의 정제방법.
제1항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그라피가 SP-세파덱스 C-50, S-세파로즈 또는 CM-세파로즈임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 겔 여과 크로마토그라피가 세파크릴 S-200 또는 세파크릴 S-300임을 특징으로 하는 방법.