JPH01502716A - ひとインシュリン遺伝子を含むトランスジェニック・マウス - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 （発明の名称） ひとインシュリン遺伝子を含むトランスジェニック・マウス（発明の分野） この発明は、ひとインシュリンホルモンを発現し得る組換え体トランスジェニッ ク・マウスの作成方法に関するものである。

さらにこの発明は、ひとインシュリンホルモンを発現するマウスに関するもので ある。さらにこの発明は、可能性のある治療剤をトランスジェニック・マウスに 導入し、ひとインシュリン産生の発現をモニターすることを含む、トランスジェ ニック・ひとインシュリン産生マウスにおいて可能性のある治療剤を評価する手 段に関するものである。さらにこの発明は、トランスジェニック動物においてひ と蛋白質に対する治療剤の効果を評価する方法に関するものである。

（先行技術） とから、遺伝子制御および形質発現の有用なインビボ分析システムが登場した。

培養されたは乳類細胞の高い効率での形質転換は細胞核への特定ＤＮＡ配列の直 接マイクロインジェクションにより達成された「カペッチ、「セル」、２２．４ ７９−４８８頁（１９８０年）〕。ゴートン等［「プロシーディングズ・オブ・ ザ・ナシリナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド ・ステープ・オブ・アメリカ」７７．７３８０−７３８４頁（１９７８年）］は 、ＤＮＡがマウス胚にマイクロインジェクションされ得、生じた子孫において見 出され得ることを立証した。すなわち、現時点である種のトランスジェニック・ マウスを製造することができるということについては詳しい記載がなされ、当業 界においてよく知られている。

トランスジェニック・マウスの作成に用いられる基本的方法は、交尾したばかり の雌マウスの卵管からの受精卵の回収を必要とする。マウスへ移植されるべき望 ましい遺伝子を含むＤＮＡを各受精卵の雄性前核にマイクロインジェクションす る。次いでマイクロインジェクションされた卵を、１８擬妊娠マウスの腹を借り てその卵管に移植し、分娩させる［ワグナ−等、「プロシーディングズ・オブ・ ザ・ナシジナル・アカデミ−・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイテッド ・ステープ・才ブ・アメリカ」、７８．６３７Ｂ−６３８０頁（１９８１年）］ 。次に、マイクロインジェクションされたＤＮＡの存在の検出に適した当業界に おける公知手段により、新生マウスをマイクロインジェクションされたＤＮＡの 存在に関して試験する。

本質的にこの方法を用いることにより、ワグナ−等は、うさぎＢ−グロブリンを 発現し得る成熟マウスの作成に成功した。

このマウスは、さらにまたうさぎＢ−グロブリン遺伝子を発現する子孫を生じさ せることができた。さらにクローンされた免疫グロブリン遺伝子をマウス生殖系 列に導入することにより、クローンされた免疫グロブリンを産生ずるトランスジ ェニック・マウスを製造した。［グロスチェドル等、「セル」、３８．６４７− ６５８頁（１９８４年）、プリンスター等、「ネイチャー」、３０６．３３２− ３３６頁（１９８３年）コ。パーミター等［「ネイチャー」、３００．６１１− ６１５頁（１９８２年）］は、ラット成長ホルモンを作る構造遺伝子と融合され たマウス・メタロチオネインＩプロモーターをもうトランスジェニック・マウス を作成した。これらのマウスは、高レベルのラット成長ホルモンを生産し、劇的 に向上した成長を呈することが見出された。

プリンスター等「「セル」、３７．３６７−３７９頁（１９８４年）コは、本質 的に上記方法を用いて、ＳＶ４０初期領域遺伝子およびメタロチオネイン融合遺 伝子をマウス受精卵に注入した。

これらの卵から成長したトランスジェニック・マウスでは、高いパーセンテージ で脈絡膜数内に踵ようが発生した。この病変組織では、５Ｖ４０Ｔ−抗原−ｍＲ ＮＡおよび蛋白質が容易に検出された。しかしながら、５Ｖ４０Ｔ−抗原遺伝子 発現は、非病変組織または明白な疾病に至る前のり患性組織においては殆ど検出 され得なかった。このことは、腫よう発生がＳＶ４０遺伝子の活性化に左右され ることを示す。この実験は、腫ようウィルスをコードする遺伝子をマウス胚へマ イクロインジェクションすることにより、発癌素因を有するマウスを製造するこ とが可能であることを示した。スイット等「「セル」、３８．６３９−６４６頁 （１９８４年）］は、マウスすい臓において高レベルでラットすい臓エラスター ゼＩを作る遺伝子を選択的に発現するトランスジェニック・マウスを作成した。

クローンされた遺伝子は、マウス接合体の前核へのマイクロインジェクションに よりマウス生殖系列に移植され得る。それらのマイクロインジェクションされた 遺伝子は染色体に組み込まれることが多く、成長期間を通して保持され、メンデ ルの法則に従い子孫に伝えられる。（グロスチェドル等、ワグナ−等）。

研究者らは、この方法を用いれば１０〜３０％の効率でトランスジェニック・マ ウスが製造され得ることを報告している。マイクロインジェクションされた外来 遺伝子は、トランスジェニック・マウスにおいて形質発現される傾向を示した（ プリンスター等、スイット等）。しかしながら、そのような発現は推測され得な い。レイシー等［「セル」、３４．３４３−３５８頁（１９８３年）］は、ひと ］Ｂ−グロブリン遺伝を含むトランスジェニック・マウス（一般にこの遺伝子を 発現しない）を開示している。

同様に、ラットおよびひと成長ホルモン遺伝子は、これらの遺伝子を有するトラ ンスジェニック・マウスにおいてそれら自身のプロモーターの制御下では発現さ れないことが見出された（ワグナ−等、ハマー等）。にわとりトランスフェリン 遺伝子の発現性は、にわとりトランスフェリン遺伝子を含むトランスジェニック ・マウスの他の組織よりも、肝臓（通常それが優先的に形質発現される場所）に おいて中程度ではあるが高いことが見出された［マツフナイト等、「セル」、３ ４．３３５−３４１頁（１９８３年）コ。すなわち、トランスジェニック・マウ スの作成方法は技術文献に既に記載されているが、クローン化された遺伝子を正 確に発現する特定のトランスジェニック・マウスの作成能力については依然とし て明確な記載は為されていない。これらの常軌を逸した結果は、クローン化ＤＮ Ａがその発現を変更するマウス染色体の本質的領域に組み込まれたか、またはマ ウス染色体への組み込みプロセスにおいて突然変異もしくは転位が行なわれた可 能性を表すことが理論化された。

単細胞受精卵の核へ入ると、クローン化遺伝子フラグメントはマウス染色体上の 無作為部位に組み込まれるものと信じられている。一旦クローン化ＤＮＡがこれ らの部位に組み込まれると、一般に安定し、これらの遺伝子は子孫マウスへ遺伝 的に伝えられる。すなわち、単純性はう疹ウィルス（ｌ型）遺伝子をもつトラン スジェニック・マウスにおけるチミジンキナーゼの非常に高い可変性発現は、チ ミジンキナーゼ融合遺伝子がマウス染色体に組み込まれた場合に生じる遺伝子転 位の結果であると信じられている［パーミター等、「セル」、３６．８６９−８ ７７頁（１９８４年）］。

トランスジェニック・マウスの一般的製造方法は、ワグナ−等、ヨーロッパ特許 出願第８１５７０号（アメリカ合衆国特許出願第２７３２３９号に対応）に記載 されており、その赤血球においてうさぎベーターグロブリン遺伝子を発現するマ ウスが具体的に開示されている。

ひとインシュリンを作る遺伝子をマウスへ導入する努力は、以前に報告されてい る［イルメンシー等、「ユニクリアー・アンド・ジーン・トランスプランチーシ コン・イン・ザ・マウス」、ブラウン、フォックス編、「デベロップメンタル・ バイオロジー・ユージング・ピユーリファイド・ジーンズ」中、アカデミツク・ プレス、ニューヨーク、６０７−６２９頁（１９８１年）、ブルキ等、「エンボ ・ジャーナルＪｌ、１２７−１３１頁（１９８２年）、ファン・デル・プラテン 等、「モル、ジエン、ジェネティック」１９８．１２Ｂ−１３８頁（１９８４年 ）］。これらの努力の結果、ひとインシュリンホルモン遺伝子配列を含むマウス が製造された。しかしながら、これらの実験により製造されたトランスジェニッ ク・マウスは、ひとインシュリン遺伝子配列をその子孫に伝えることができなか った。ファン・デル・プラテン等は、トランスジェニック・（インシュリン配列 を有する）マウスから誘導された子孫マウスは、インシュリン遺伝子配列領域の 側面に位置するＤＮＡ配列を保持してはいるが、子孫マウスはひとインシネリン 配列を全て欠いていることを示した。

いかにしてインシュリンを作る配列がトランスジェニック・マウスから欠失され 得、かつ側面領域がこれらのマウスにおいて保持されているのかを説明するため に、ファン・デル・プラテン等は、ひとインシュリン配列を特異的に除去する生 殖系列−特異的切除事象を仮定した。ファン・デル・プラテン等は、ひとインシ ュリン遺伝子配列の切除は、トランスジェニック雌性での生殖系列の形成におけ る初期段階中に生じる一般的現象であり得ると（ごう結論に達した。ファン・デ ル・プラテン等により使用された方法は、マイクロインジェクシジン用としてひ とインシュリン遺伝子を含む大きい数の環状ＤＮＡ分子を用いるものであった。

結論として、先行技術は、クローン遺伝子の組織特異的形質発現能力を有するあ る種のトランスジェニック・マウスが作成され得ることを教えている。しかしな がら、先行技術はまた、ひとインシュリン遺伝子を発現するトランスジェニック ・マウスを特異的に製造することの困難さも教えている。ひとインシュリン遺伝 子のＤＮＡ配列を有するトランスジェニック・マウスを製造することは可能であ ったが、これらのマウスがひとインシュリンを生産することは知られておらず、 またこれらのマウスは、ひとインシュリン遺伝子を発現またはこれを有する子孫 を生ずることはできなかった［ファン・デル・プラテン等、「モル、ジエン、ジ ェネティック」、１９８．１２８−１３８頁（１９８４年）］。

従って、ひとホルモンまたはひとホルモン類似体の発現能力を有し、その子孫マ ウスにこのホルモンの発現能力を遺伝的に伝えることができるマウスの製造方法 の開発は非常に興味深いことである。

この発明は、ひとインシュリンを発現するマウスの単離方法に関するものである 。ひとプレプロインシュリン部分をコードするｃＤＮＡフラグメントを用いて、 バクテリオファージ・ラムダ・チャロン４　ｍ［ローン等、「セル」、１５巻１ １５７−１１７４頁（１９７８年）に記載］においてひと遺伝子ライブラリーを プローブした。ひとイン、シュリン遺伝子配列を含むものに関してハイブリダイ ゼーションによる組換え体ファージをスクリーニングすることにより、１２．５ キロ塩基のＥｃｏＲＩフラグメントが得られた。このフラグメントの配列決定を 行うと、クローン化ひとインシュリン遺伝子の完全なヌクレオチド配列を含むこ とが判った［ベル等、「ネイチャー」、２８４．２６−３２頁（１９８０年）コ 。１２．５キロ塩基ＥｃｏＲＩフラグメントを単細胞マウス胚の雄性前核にマイ クロインジェクションした。

次いで、その胚を擬妊娠マウスの借り腹に移植して妊娠させた。

この方法により、サザーン・ハイブリダイゼーション分析により検出されるひと インシュリン遺伝子配列を含む３匹の生存し得るマウスが誕生した。これらの３ 匹のマウスのうち１匹の雄マウスを育てて数百子孫のコロニーを発生させた。ひ とインシュリン遺伝子はメンデルの法則に従い伝えられ、ＰＩおよびＦ２の両子 孫の約５０％が注入されたＤＮＡフラグメントを受け継いでいた。

詳しくは、この発明は、 その細胞がひとプレプロインシュリン、プロインシュリンまたはインシュリン遺 伝子の全部または一部を作る遺伝子配列を含み、受精の結果、その細胞に前記遺 伝子配列が含まれている子孫マウスを生産することができる標的マウスを得る方 法であって、 （ａ）第１雌マウスから受精卵を単離し、（ｂ）ひとプレプロインシュリン、プ ロインシュリンまたはインシュリン遺伝子の全部または一部を含む遺伝子配列を 受精卵に注入し、 （Ｃ）前記遺伝子配列を含む受精卵を擬妊娠第２雌マウスの子宮に移植し、 （ｄ）第２雌マウスを、 （ｉ）前記遺伝子配列を含む受精卵由来の胚により妊娠させ、（ｉ　ｉ）胚を標 的マウスに成長させ、（ｉｉｉ）標的マウスを第２雌マウスから生存し得る状態 で誕生させる （ただし、標的マウスは、ひとプレプロインシュリン、プロインシュリンまたは インシュリンの遺伝子配列を含み、受精の結果、その細胞に前記遺伝子配列が安 定して含まれる子孫マウスを生産し得るものとする） 形で維持すること により構成される方法を包含する。

またこの発明は、その細胞にひとプレプロインシュリン、プロインシュリンまた はインシュリン遺伝子が含まれ、前記遺伝子を有する子孫マウスを生産すること が可能なマウスを提供する。またこの発明は、その細胞にひとプレプロインシュ リン、プロインシュリンまたはインシュリン遺伝子が含まれ、前記遺伝子を有す る子孫マウスを生産することができ、前記遺伝子が安定して形質発現されるマウ スを提供する。

さらにこの発明は、異種蛋白質の発現またはレベルに対する・　薬剤の薬動力学 的効果、治療価値または医薬的重要性の評価方法であって、 （ａ）トランスジェニックは乳類に薬剤を与え（前記は乳類は異種蛋白質遺伝子 を含む）、 （ｂ）は乳類における形質発現またはレベルをモニターすることにより、異種蛋 白質の発現またはレベルに対する薬剤の効果、価値または重要性を調べる ことを含む方法を提供する。

またこの発明は、ひとインシュリンの発現またはレベルに対する薬剤の薬動力学 的効果、治療価値または医薬的重要性の評価方法であつて、 （ａ）その細胞がひとプレプロインシュリン、プロインシュリンまたはインシュ リン遺伝子を含み、かつ安定してそれを発現させるマウスに薬剤を与え、 （ｂ）マウスにおける発現またはレベルをモニターすることにより、ひとインシ ュリンの発現またはレベルに対する薬剤の効果、価値または重要性を調べる ことを含む方法を提供する。

またこの発明は、自然調節的にひとインシュリンを安定して発現することができ るＢ６０３Ｆ１系統のトランスジェニック・マウスを提供する。ひとＣ−ペプチ ド放射線免疫測定キット（ベーリングベルケ・アクチェンゲゼルシャフト、西ド イツ）を用いて、このマウスおよびその子孫におけるひとインシュリン遺伝子の 発現を検出した。この測定法は、ひとＣ−ペプチドに特異的であり、マウスＣ− ペプチドとは殆どまたは全く交叉反応性を示さない。この測定法を用いて、数百 のトランスジェニック・マウスが様々な生理学的環境下で分析され、ひとＣ−ペ プチドを生産することが示されたが、これは即ちこれらのマウスにおけるひとイ ンシュリンホルモンの発現を示している。

これらのマウスにおいて正常なグルコースのホメオスタシスが保存されているこ とが見出されたが、これはひとインシュリン遺伝子の発現が適度に調節されてい ることを示す。トランスジェニック・マウスにおけるひとインシュリンのレベル は、インシュリン発現が、ひとにおけるひとインシュリンまたはマウスにおける ネズミインシュリンの場合と同じ調節および制御下に置かれていることを示した 。

この発明は、ひと以外の動物におけるひとインシュリンホルモンのエフェクター を試験するための動物モデルを提供するという点で意義深く有用である。

（図面の記載） 第１Ａ図は、トランスジェニック゛・マウスの染色体ＤＮＡ内のひとインシュリ ン遺伝子配列の存在を示す。第１Ｂ図は、トランスジェニックおよび対照マウス の組織におけるひとおよびマウスインシュリン會ＲＮＡの存在を示す。

第２図は、グルコース腹腔内注射後のトランスジェニックおよび対照マウスにお ける血清グルコースレベルを示す。

第３図は、トランスジェニックおよび対照マウスに対する静脈内アミノ酸寛容性 試験中におけるひとＣ−ペプチドレベルを示す。

第４図は、トランスジェニックおよび対照マウスに対する腹腔内グルコース寛容 性試験中におけるひとＣ−ペプチドレベルを示す。

第５図は、トランスジェニックおよび対照マウスに対する静脈内トルブタミド注 入試験中におけるひとＣ−ペプチドレベルを示す。

（好ましい実施態様の記載） インシュリンは、有機体の燃料ホメオスタシスの調節において支配的な生理学的 役割を演じるポリペプチドホルモンである。

それは、すい臓のランゲルハンス島のベータ細胞（以後、「島細胞」と記する） により合成される。循環インシュリンレベルは、幾つかの小分子、特にグルコー ス、アミノ酸、脂肪酸およびある種の薬剤により調節される。インシュリンは、 当モル量の成熟インシュリンおよび結合ペプチド（Ｃ−ペプチド）を生じるプロ インシュリンの蛋白質加水分解による開裂から誘導される２つのポリペプチド鎖 （ＡおよびＢ１ジスルフィド結合により結合されている）で構成される。プロイ ンシュリンは、プレプロインシュリンとして知られている前駆体により生成され る。プレプロインシュリンは細胞によりプロインシュリンに合成され、次いで成 熟ホルモン、インシュリンとして細胞から排出される。

すなわち、インシュリンホルモン発現またはレベルは、プレプロインシュリン、 プロインシュリン、インシュリン、Ａ−ペプチド、Ｂ−ペプチドまたは好ましく はＣ−ペプチドの発現またはレベルを測定することにより検定され得る。

この明細書に記載されているｒＦｌ二の語は、マウスの第１代子孫（すなわち、 その「息子および娘」）を指す。この明細書に記載されている「Ｆ２」の語は、 マウスの第２代子孫（すなわち、その「孫」）を指す。

「ひとインシュリン」の語は、天然インシュリンおよびその類似体全てを包含す る。、かかる類似体の例としては、インシュリンを機能的に損なわれた形で生成 させる突然変異遺伝子を含むひとインシュリン遺伝子、通常のひとインシュリン と構造的または機能的に類似した天然ひと蛋白質、またはひとインシュリン遺伝 子のインビトロもしくはインビボ突然変異誘発もしくは修飾により生じる新規イ ンシュリンホルモンの産物がある。さらに「ひとインシュリン」の語は、ひとイ ンシュリンの変異形を包含する。ひとインシュリンの変異形は、自然発生または 病気により発生し、集団全体の中の部分集団に存在するひとインシュリンと分子 構造的または機能的に類似している。

「異種蛋白質」の語は、特定の種類により通常では生産されない蛋白質を包含す る。ひとインシュリン、うさぎＢ−グロブリンは、マウスにおいて生産され得る 異種蛋白質の例である。トランスジェニックは乳類の特徴は、それらが異種蛋白 質の遺伝子を含み、異種蛋白質生産能力を有することである。

「クローン（化された）遺伝子」の語は、単離された後、マウスの受精卵に注入 されることにより、クローン遺伝子配列を含むトランスジェニック・マウスの製 造に使用される興味深いＤＮＡ配列を包含する。

この明細書で使用されている「遺伝子」、ｒＤＮＡ配列」または「遺伝子配列」 の語は同義語であり、自然状態でそのＤＮＡに伴うイントロンまたはエクソンを 全て含むＤＮＡを包含する。遺伝子の一例としては、ひとプレプロインシュリン およびこのＤＮＡ配列に伴う非翻訳介在配列をフードするＤＮＡがある［ベル等 、「ネイチャー」、２８４．２６−３１頁（１９８０年）］。

遺遺伝子列が第２遺伝子配列から誘導されるということは、それが第２遺伝子配 列の正確なコピーである場合、またはそれが第２配列の変形（すなわち、突然変 異、挿入または欠失）の結果である場合を言う。遺伝子配列が「（形質）発現」 されるということは、遺伝子がＲＮＡに転写され、ＲＮＡが蛋白質に翻訳される 場合を言う。

クローン遺伝子またはクローン遺伝子のフラグメントは、当業界でよく知られた 幾つかの方法により製造および精製される。

すなわち、クローン遺伝子は、合成手法、または遺伝子の転写から誘導された＋ ａＲＮＡを逆転写酵素で処理して遺伝子のｃＤＮＡバージョンを製造するか、ま たは遺伝子をゲノム・バンクまたは他の供給源から直接単離することにより製造 され得る。

どの方法で単離されるにせよ、クローン遺伝子は増幅され、他の潜在的汚染分子 から精製される。Ｊａ当なりＮＡ配列、例えばひとプロインシュリン遺伝子、ひ とインシュリンをコードするＤＮＡ配列、またはひとプレプロインシュリンの遺 伝子、好ましくはひとプレプロインシュリン遺伝子を含むプラスミドｐｇＨｌ　 １２．５（ベル等）のＤＮＡが使用され得る。インシュリン、プレプロインシュ リンおよびプロインシュリンの配列はベル等により開示された。

マイクロインジェクション用のマウス受精卵を数時間前に交尾した雌マウスあ卵 管から堆積状態で（ｉｎ　ｃｕ■ｕｌｕｓ）採取する。

マウス系統Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、ＳＪＬ／Ｗｔ、Ｃ３ＨまたはＣ５７／ＳＪＬから の雌マウスの受精卵は使用され得るが、Ｆｌｌママウス交尾したＣ５７／Ｃ３Ｈ Ｆｌｌママウス卵管から胞質内で雄性および雌性前核が独立し、互いに識別可能 な段階）の受精卵を妊娠した（Ｃ５７１０３Ｈ）Ｆ　Ｉ雌マウスの卵管から採取 する。単離された受精卵をＭ１６培養培養中３７℃でインキエベーシジンし［ウ ィッチインガム、「ジェイ、リプロド、ファーティル、サブル、」、１４．７− ２１頁（１９７１年）コ、極微操作まで２−４時間貯蔵する。ライフ・マイクロ マニピュレーターおよびパラフィン油充填ハミルトン注射器を用いることにより 、受精卵を入れるピペットを操作してクローンＤＮＡの注入を行う。これらの胚 に注入されるインシュリンＤＮＡ供給源は、０．５ミリモルのトリス（ｐＨ＝　 ８　）・０．５ミリモルＥＤＴＡ中に存在すべきである。５個または６個の受精 卵を含む培養培地の小滴を顕微鏡スライドに載せ、パラフィン油で覆う。２〜２ ０ｐＱ、好ましくは５ｐ１２の精製インシュリン遺伝子フラグメント、またはイ ンシュリン遺伝子配列を含む共有結合的に閉じたプラスミドを注射用ピペットに 引き入れ、次いで受精卵を含む滴下物と隣接した場所に移す。受精卵をホールデ ィング・ピペット上に置くことにより、雄性前核を注射用ピペットと並置させ、 続いてインシュリン遺伝子溶液を前核に注入する。インシュリン遺伝子配列のコ ピーの有効数、６００〜２００００コピー、好ましくは１０００コピーのインシ ュリン遺伝子配列を各受精卵に注入する。１時間当たり６０−１００個の卵が注 入される。

前核全部へのマイクロインジェクション用、受精卵を顕微鏡スライド上の培地滴 下物から除去し、培養管に入れてワグナ−等の方法に従い着床前成長させる。Ｍ １６緩衝液中３７°で４時間培養後、１８擬妊娠ＩＣＲマウスの腹を借りてその 子宮に１個または２個の受精卵を移植し、出産させる。擬妊娠マウスは、ホッペ 等、「パイオル、リプロド、」８．４２０−４２６頁（１９７３年）の記載に従 い、雌マウスを精管切除した雄マウスと交尾させることにより得られる。これら の雌マウスの借り腹から生まれた新生は乳類の１０−３０パーセントはトランス ジェニックとなる（すなわち、それらの染色体内にクローン遺伝子の配列が組み 込まれている）。

これらの組み込まれた配列の存在は、当業界で知られている特定クローン遺伝子 の検出に適した手段により検出される。すなわち、ポリペプチド生成物を発現す るか、または発現しない遺伝子を検出するため、サザーン・ハイブリダイゼーシ ョン分析が行なわれる。それらの技術および組換え体ＤＮＡ操作に必要とされる 技術は、マニアチス等、［モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・マ ニュアル」（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、ニューヨーク、 １９８２年）に記載されており、以後、その内容を引用して説明の一部とする。

その存在がポリペプチド、例えばインシュリンの生成により検出可能であると予 想されるクローン遺伝子は、クローン遺伝子産物と内在性遺伝子産物とを識別し 得る（例えば、ひとインシュリンをねずみインシュリンと区別し得る）手段、例 えば、放射線免疫測定、酵素測定または当業界においてよく知られている他の手 段により検出され得る。

任意の適当な手段を用いてトランスジェニック・マウスにおけるクローン遺伝子 の発現を検出することはできるが、放射線免疫測定法、例えばひとＣ−ペプチド に特異的であり、マウスＣ−ペプチドとは殆どまたは全く交叉反応性を示さない ため、ひとインシュリンと内在性マウスインシュリンの発現の識別に適している ひとＣ−ペプチド放射線免疫測定キット（ベーリングベルケ・アクチェン・ゲゼ ルシャフト（西ドイツ）から市販）を使用するのが好ましい。

一旦トランスジェニック・マウスが同定されると、組込まれたクローン遺伝子の 安定した維持および伝達は、遺伝学分野でよく知られている古典的なメンデルの 実験により確認される。

マウスが別のマウスから誘導されるということは、そのマウスが遺伝的に識別不 可能である場合、または一方のマウスが他方のマウスの子孫である場合を言う。

トランスジェニック・マウスが安定してクローン遺伝子配列を含む、または安定 してクローン遺伝子の遺伝子産物を発現するということは、トランスジェニック ・マウスの場合と実質的に類似した形または非トランスジェニックは乳類の場合 と実質的に識別可能な形で、トランスジェニック・マウスのＦｌまたはＦ２子孫 の中にクローン遺伝子配列を含むか、または（各々の）クローン遺伝子産物を発 現するものがある場合を言う。

一般的に、クローン化されたひとインシュリン遺伝子は、ある組織、すなわちク ローンひとインシュリン遺伝子がその天然宿主有機体において自然に発現される 組織に相当する組織でのみ発現されるのが望ましい。組織特異性を立証するため には、トランスジェニック・マウスから得られた様々な組織部分を分析してこれ らの組織がクローン遺伝子産物を発現するか否かを決定すれば充分である。すな わち、様々な組織に由来する蛋白質は、放射線免疫検定法またはクローン遺伝子 産物の存在の検定を目的とする他の手段により測定され得る。別法として、ＲＮ Ａは幾つかの組織から製造され、当業界で周知の手段により、１１ｐまたは他の 放射能標識（またはビオチニル化）したニックトランスレーションによるひとイ ンシュリンｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼーシヨンされ得る（マニアチス等 ）。

クローンひとインシュリン遺伝子配列の発現は、好ましくはその天然宿主、ひと における場合と同様、トランスジェニック・マウスにおいて同じ機構により「自 然調節」される。

「自然調節（された）」の語は、遺伝子が生理学的に適当な方法で調節されるこ とを意味する。それ故、遺伝子の発現は構造性ではあり得ないが、トランスジェ ニック・マウスの必要条件、活性およびエフェクターに応じて変化する。「自然 調節」は、クローンひとインシュリン遺伝子が、マウスの全組織および器官では なく、その天然宿主においてクローンインシュリン遺伝子を発現させた組織およ び器官でのみ発現され得ることを必要とする。さらに、かかる「自然調節」は、 インシュリン遺伝子配列、それらの対応するｍＲＮＡ転写情報およびこれらの転 写情報から生成された蛋白質に対して「自然プロセッシング」が行なわれること を必要とする。「自然プロセッシング（された）」の語は、例えばａＲＮＡ転写 、スプライシングおよび蛋白質前駆体分子（例えば、プレプロインシュリンまた はプロインシュリン）の蛋白質加水分解開裂の段階を包含する。さらに、「自然 調節」は、インシュリン遺伝子発現レベルを異常な範囲ではなく通常見出される 生理学的範囲内に治めさせる。マウスにおけるインシュリン濃度の生理学的に正 常な範囲は０−１００μＩＪ／ｗＱである。

すなわち、例えば、（１）発現がマウスのすい臓の高細胞でのみ行なわれた場合 、（２）生成されたプレプロインシュリンに対し自然プロセッシングが行なわれ てプロインシュリンとなり、さらに自然に生成されたプロインシュリンに対し自 然プロセッシングが行なわれてインシュリンとなり、これがマウスの循環系に自 然に分泌された場合、（３）生成されたプレプロインシュリン、プロインシュリ ンおよびインシュリンの量が正常な生理学的範囲内に含まれた場合、（４）イン シュリン発現の作動子（例えばグルコースまたはアミノ酸）の存在により、マウ スにおけるねずみプレプロインシュリン、プロインシュリンおよびインシュリン 、またはひとにおけるひとプレプロインシュリン、プロインシュリンまたはイン シュリンの場合と本質的に同じ状況で、ひとプレプロインシュリン、プロインシ ュリンおよびインシュリンの量および濃度が変化する場合、トランスジェニック ・マウスにおけるひとプレプロインシュリン遺伝子の発現は自然調節されている ことになる。

ひとインシュリンホルモンを産生ずるトランスジェニック・マウスは製薬業界に とって特に有用である。それらのマウスは、まず、ひとインシュリンレベルに対 する薬品または他の薬剤の効果を評価するためのインビボ非ひと動物モデルを提 供する。

一般に、そのような評価をする作業は全てボランティアまたは患者を必要とする 。ひと対象を用いる研究において遭遇する倫理的制約により、ひとインシュリン −治療剤相互作用の研究の性質および範囲は大きく制限されている。

薬剤をトランスジェニックは乳類に投与し、トランスジェニックは乳類により生 成された異種蛋白質の発現およびレベルに対する薬剤の潜在的効果を評価するこ とにより、正確に類似した状況で薬剤の薬理効果、治療価値および医薬的重要性 を測定することができる。すなわち、例えば、主に脈絡膜層において異種蛋白質 を生産するトランスジェニックは乳類を作成した場合（スイット等が行った）、 異種蛋白質の発現を検査することにより、脈絡膜層に対する薬剤の作用または薬 剤の脈絡膜層に入る能力を評価することができる。それ故この発明は１、インシ ュリン発現の研究に対するトランスジェニックは乳類の使用以上のことを教えて いる。この発明は、薬理および医薬の一般研究におけるトランスジェニックは乳 類および特にトランスジェニック・マウスの利用を開示するものである。

ひとインシュリンの類似体を発現するトランスジェニック・マウスの作成が可能 であれば、インシュリンホルモンの構造および機能の研究が行える。以前なら、 それらの類似体を発現する個体が稀であり、またそれらの対象または患者におい て生産されるホルモンの量が非常に限られているため、それらの研究の実施は困 難であった。反対に、ひとインシュリン類似体を発現するトランスジェニック・ マウスの作成ができれば、それらの類似体の精製および特性分析も可能となる。

入手可能な天然類似体の量は、研究で使用されるマウスのコロニーの大きさによ ってのみ制限される。さらに、インシュリン遺伝子配列をインビトロ操作し、そ れらの配列をマウスに導入することにより新規インシュリンホルモンを発現する トランス２エニツク・マウスを作成することができるということは、ホルモン構 造および機能間の関係を研究するための異例の手段が提供されるということであ る。

プラスミドｐｇＨＩ　１２．５を含むエシェリヒア・コリ株は、ベル等により記 載されている。

以上、この発明を総括的に記載したが、一層この発明に関する理解は深めるため 、次に具体的実施例を提供する。それらの実施例は説明を目的としているだけで 、特記しない限りこの発明を限定する意図はないものとする。

実施例１ クローン化されたインシュリンフラグメントの製造。

インシュリン鳳ＲＮＡをすい臓細胞から単離し、ｃＤＮＡプローブの製造に使用 した（ローン等、ベル等）。バクテリオファージ・ラムダ・チャロン４Ａにおけ るひと遺伝子ライブラリーをｃＤＮＡプローブの存在下でインキュベージロンし た。約１０６個のうち２個のファージをプローブとハイブリダイゼーションした 。これらのクローンの１個は、クローン化ひとプレプロインシュリン遺伝子の完 全なヌクレオチド配列を含む１２．５キロ塩基ＥｃｏＲＩフラグメントを含んで いた。この１２．５キロ塩基フラグメントをプラスミドｐＢＲ３２２中にサブク ローンし、ｐｇＨ１１２，５（と名付けた）を細菌エシェリヒア・コリ、ＤＫＩ 株に導入することにより、増幅した。増幅後、１２．５キロ塩基フラグメントを プラスミドから切除し、精製した。このフラグメントの約１０００のコピーを単 細胞マウス胚の雄性前核にマイクロインジェクシジンし、次いで擬妊娠マウスの 借り腹に移植して出産させた。一連の注入後に生まれた４６匹のマウスのうち３ 匹（約７％）は、サザーン・ハイブリダイゼーション分析による検出結果として ひとインシュリン遺伝子配列を含んでいた。１匹の雄マウスは、ｌ単相ゲノム当 たり５〜ｌＯのひとインシュリン遺伝子フラグメントコピーを含むことが見出さ れ、さらに特性分析がなされた。このマウスを育てて数百子孫から成るコロニー を発生させると、ひとインシュリン遺伝子配列がメンデルの法則に従い伝えられ 、ＦｌおよびＦ２の両子孫の約５０％が注入されたＤＮＡフラグメントを受け継 いでいることが判った。トランスジェニック・ひとインシュリン産生マウスであ ることが判明したマウス１６番を８６Ｃ３Ｆ１系統の雌マウスと交尾させて妊娠 マウスを゛製造した。これらのマウスにおけるひとインシュリン生産を測定し、 選択的にひとインシュリン−産生きようだい（ｓｉｂｌｉｎｇ）をかけ合わせる ことにより、ホモ接合ひとインシュリン産生マウスのコロニーが得られた。ホモ 接合ひとインシュリン産生マウスをＢ６Ｃ３Ｐ１／ヒューミングと名付けた。

トランスジェニック・マウスの特徴分析を第１Ａ図に示す。

幾つかのマウスから得られた染色体ＤＮＡを試験して、マウスがひとインシュリ ンＤＮＡ配列を有するか否かを調べた。ＤＮＡ試料をＰｖｕＩＩにより消化し、 プローブとして放射能標識１５９４ｂｐＰｖｕｌｌフラグメント（１２，５キロ 塩基ひとインシュリンＤＮＡフラグメント内に含まれる）を用いてサザーン・ハ イブリダイゼーション分析（マニアチス等）により分析した。レーン１．２お上 び５は、プローブおよびトランスジェニック・マウスのゲノム配列間のハイブリ ダイゼーションを示す。レーン３は、プローブおよび非トランスジェニックきょ うだいマウスのゲノム配列間のハイブリダイゼーションの非存在を示す。レーン ４は、プローブおよびひと対照のゲノムＤＮＡ間のハイブリダイゼーションを示 す。サザーン・プロット分析の場合、各マウスにおける全ゲノムＤＮＡ８μ９を ＰｖｕＩＩにより消化し、０．９％アガロースゲルによる電気泳動を行い、ニト ロセルロースに移した。次いでフィルターを一夜前ハイブリダイゼーシロンし、 ｓ＊Ｐ標識ゲノムひとインシュリンプローブとハイブリダイゼーションし、洗浄 し、エックス線フィルムに晒した。ゲノムインシュリンプローブは、ひとインシ ュリン遺伝子の転写開始部位に関して−１６９のＢｇｌ　Ｉ［部位から＋６４４ のＡｖａＩ部位に及ぶフラグメントであった。プロモーター配列に加えて、この フラグメントは、第１介在配列、第１エクソン（シグナルペプチド、Ｂ−ペプチ ドおよびＣ−ペプチドの一部をコードする配列を含む）および第２介在配列の一 部を含んでいた。ゲノムひとインシュリンプローブは、内在性マウスインシュリ ン遺伝子との限られたクロス・ハイブリダイゼーションを示した。

実施例２ マウスにおけるクローンひとインシュリンホルモン遺伝子の発現の確認。

ひとインシュリン遺伝子配列を含むＤＮＡの存在は、サザーン・ハイブリダイゼ ーション分析の使用によりマウスＢ６Ｃ３Ｆｌ／ヒューミングにおいて検出され た。トランスジェニック・マウスにおけるひとインシュリン遺伝子発現の組織特 異性を測定するために、ＲＮＡ分析およびすい臓「島」機能試験の両方を行った 。幾つかの組織から得られた全ＲＮＡは、トランスジェニック・マウスおよび非 トランスジェニックきようだいから製造された。１．２％アガロース−ホルムア ルデヒド電気泳動によりこのＲＮ　Ａを分離し、ニトロセルロースに移し、３８ Ｐ標識ニツク翻訳ひとインシュリンｃＤＮＡプローブとハイブリダイゼーション した。この実験の結果を第１Ｂ図に示す（レーン１１非トランスジエニツク・マ ウスの肝臓由来のＲＮＡ；レーン２、非トランスジェニック・マウスのすい臓由 来のＲＮＡ：レーン３、トランスジェニック・マウスの肝臓由来のＲＮＡ、レー ン４、トランスジェニック・マウスのすい臓由来のＲＮＡ）。ただし、トランス ジェニックおよび対照マウスの両者由来のすい臓ＲＮＡはひとインシュリンｃＤ ＮＡプローブとハイブリダイゼーションし、トランスジェニックおよび対照マウ スの肝臓、ひ臓、脳、腎臓、心臓、腸、肺および筋肉由来のＲＮＡはハイブリダ イゼーションを示さなかった。マウスインシュリンｃＤＮＡも遺伝子配列も共に 検出されなかったが、ラットおよびひとインシュリンｍＲＮＡのコード領域は８ １％の配列相同性を示すため（ベル等）、トランスジェニックおよび対照のすい 臓ＲＮＡは共にひとプローブとハイブリダイゼーションすることが予想された。

これらの結果は、ひとインシュリン遺伝子がＢ６Ｃ３Ｆ　１／ヒネーミング系統 のトランスジェニック・マウスのすい臓においてのみ発現され、試験された他の 組織では一切発現されないことを示した。すい臓以外のトランスジェニック組織 では検出可能なレベルのインシュリンＲＮＡの発現は見出されなかったため、ト ランスジェニックおよび対照の両すい臓におけるインシュリンの発現を試験する ことにより、トランスジェニックすい臓がひとインシュリン発現部位であるか否 かを調べた。６匹のトランスジェニック・マウスおよび６匹の対照マウスから得 られたすい臓ランゲルハンス島をコラゲナーゼ消化により単離し［レイシー等、 「ダイアベーラ」、１６．３５−３９頁（１９６７年）］、約８Ｏ−１００ｒ島 」細胞／組織培養ウェルの群で培養した。翌日、培地のアリコートを採取し、ひ とＣ−ペプチドレベルを測定した。トランスジェニック・マウスのすい臓由来の 「島」細胞を含む組織培養ウェルから得られた試料は、２５０−６５０ｎ９／ｘ ＱのひとＣ−ペプチドを含んでいたが、対照マウスのすい臓由来の「島」細胞を 含む組織培養ウェルは検出可能なひとＣ−ペプチドを含んでいなかった。培養さ れたトランスジェニック「島」細胞は数日間ひとＣ−ペプチドの発現を続けた。

これらの実験から、Ｂ６Ｃ３Ｆ１／ヒューミング系統のトランスジェニック・マ ウスにおける主なひとインシュリン発現部位は、内分泌器官のすい臓であること が決定された。

モルモット抗ぶたインシュリン抗体およびやぎ抗ひとＣ−ペプチド抗体を用いて 、トランスジェニックおよび対照のすい臓に免疫ペルオキシダーゼ染色を行った 。抗ぶたインシュリン抗体は、ひとおよびマウスインシュリンの両方と交差反応 し、トランスジェニック・マウスおよび対照マウスの両者から得られた「島」細 胞を染色する。「島」細胞の大きさ、分布および数は、トランスジェニックおよ び対照の両マウスの場合と本質的に同じであった。重要なことに、対照マウスの 「島」細胞ではなくトランスジェニック・マウスの「島」細胞のみが抗ひとＣ− ペプチド抗体により染色された。これは、抗ひとＣ−ペプチド抗体がマウスＣ− ペプチドと殆どまたは全く交差反応しないという事実を示す。免疫組織化学デー タはノーザン分析および上記「島」機能試験と一致し、８６Ｃ３Ｆ１／ヒ二−ミ ング系統のトランスジェニック・マウスの「島」細胞がひとインシュリンを特異 的に発現していることを立証した。

実施例３ トランスジェニック・マウスにおけるグルコースおよびひとインシュリンレベル の生理学的調節の試験。

Ｂ６Ｃ３Ｆ　１／ヒニーミング系統のトランスジェニック・マウスにおけるグル コースおよびひとＣ−ペプチドレベルを様々な生理学的条件下で試験することに より、正常なグルコースホメオスタシスが保たれているか否か、およびひとイン シュリン遺伝子の発現がこれらのマウスにおいて適当に調節されているか否かを 調べた。血液グルコース調節を研究するため、グルコース寛容性試験を行った。

マウス１６番のトランスジェニック子孫および非トランスジェニックきようだい を一夜絶食させ、グルコースの腹腔内注射（１１９７９Ｃ体重））を行い、注射 後様々な時点で採血して血清グルコースレベルを測定した。トランスジェニック ・マウスによるグルコース寛容性曲線は、対照マウスの場合と類似している（第 ２図）。（各マウスは、注射実施の５．１Ｏ１２０，３０，４５，６０または９ ０分後のうち一時点で血清試料用として任意に選ばれた（実線で示す）。４匹の マウスにはグルコースを与えずに採血して絶食血清グルコースレベルを測定した （点線）。市販されているキット（ベーリングベルケ・アクチェン・ゲゼルシャ フト、西ドイツ）を用いて製造会社の薦める条件下で、これらのマウスの血清に おけるひとＣ−ペプチドレベルを測定した。これらのトランスジェニック・マウ スの血清ひとＣ−ペプチドレベルを第３図に実線で示す。

対照マウスの場合は点線で示す）。特に重要なのは、絶食中および最大限に刺激 されたグルコースレベル並びに基底グルコースレベルへのリターン反応速度がト ランスジェニックおよび対照動物の場合と類似していることである。さらに、グ ルカゴンの静脈内投与により１５分以内でトランスジェニックおよび対照マウス の両方における血清グルコースレベルが約５０％増加した。結局、これらの結果 は、血清グルコースレベルがトランスジェニック・マウスにおいて適当に変調さ れることを強く示唆している。トランスジェニック・マウスの体重、成長速度、 食物摂取行動、生殖能力および長命性は正常である。

トランスジェニック・マウスでの血液グルコースレベルの調節におけるひとイン シュリンの役割については、−トランスジェニックおよび対照マウスに対するグ ルコース寛容性試験を実施することにより研究した（第４図）。ひとＣ−ペプチ ドは、絶食トランスジェニック・マウスの血清では検出され得なかった。

しかしながら、グルコースの腹腔内投与後１０分以内に、ひとＣ−ペプチドが血 清に現れ、ピーク・レベルは約２０分で得られる。グルコース注射の４５分後ま でに、ひとＣ−ペプチドレベルは刺激前または基底レベルに近い値に下がった。

ひとＣ−ペプチド発現のこのパターンは、前記グルコース寛容性曲線と密接に相 関し、Ｂ６Ｃ３Ｆ１／ヒエーミング系統のトランスジェニック・マウスでは、血 清ひとインシュリンレベルがグルコースにより適度に調節されたことを示してい る。さらに、これらのデータは、マウスおよびひとに関して以前に報告されたグ ルコース寛容性結果［ラーキンズ、「ダイアベーラ」、２２．２５１−２５５頁 （１９７３年）、ルーベンスタイン、「エンドフライノロジー」、第２巻（編集 者デグルート等）９５１−９５７頁（グルーンおよびストラットン、出版１９７ ９年）コと類似していた。

対照マウスは検出可能なひとＣ−ペプチドを一切発現しなかったが、これはひと 遺伝子がトランスジェニック・マウスにおけるひとＣ−ペプチドの供給源でなけ ればならないことを示している。

インシュリンは、アミノ酸およびある種の薬剤を含む幾つかの他の要素により調 節される。静脈内アミノ酸注入試験を絶食トランスジェニック・マウスおよび対 照マウスにおいて実施し、血清中のひとＣ−ペプチドレベルを測定した。ピーク ひとＣ−ペプチドレベルはアミノ酸注入後５分以内に見られ、次の４０分間に互 って徐々に下降した。Ｂ６Ｃ３Ｆ１／ヒューミング系統のトランスジェニック・ マウスおよび対照マウスを一夜絶食させ、０．５ｍｇのアルギニンおよび０　、 ５　ｍｇのロイシンを注入と、ひとＣ−ペプチド測定に関して定められた時点で 採血した。この実験の結果を第４図に示す。各時点は、４動物から得られた平均 値を表す。実線はトランスジェニック・マウスから得られたデータを示す。点線 は対照マウスから得られたデータを示す。

同様に、血清ひとＣ−ペプチドレベルは、トルブタミド、すなわちインシュリン 放出を促すことが知られているスルホニル尿素誘導体にも応答する［ガング等、 「ダイアベーラ」、２４．３５４−３６１頁（１９７５年）］。トランスジェニ ック・マウスおよび対照マウスを一夜絶食させ、０．５ｚｇのトルブタミド（ジ ・アブプジｅン・カンパニー、ミシガン）を注入し、ひとＣ−ペプチド測定に関 して定められた時点で採血した（第５図）。各時点は２動物から得られた平均値 を表す。トランスジェニック・マウスによるデータは実線で示す。対照マウスに よるデータは点線で示す。

正常対象では、血清インシュリン（またはＣ−ペプチド）レベルはトルブタミド 誘発性ピークから正常値に急速に戻るが、インスリノーマ患者では、高いインシ ュリンレベルが維持されるため［ファジャンズ等、「ジェイ、ラボ、シリン。メ ト、」、５４．８１１頁（１９５９年）コ、トルブタミドはインスリノーマの診 断に臨床的に使用されている。トルブタミドの静脈内投与後２０分以内に、血清 ひとＣ−ペプチドレベルはピークに達し、次の１０分間に互って急速に低下した 。

Ｂ６Ｃ３Ｆ１／ヒエーミング系統のトランスジェニック・マウスが基底血清ひと Ｃ−ペプチドレベルを迅速に回復するという事実は、それらのインシュリン発現 がしっかりと調節されたという結論を立証している。上述のトルブタミドによる 結果は、インシュリン薬理学者にとって重要な含蓄を宵する。現在ひとインシュ リン合成、分泌、作用またはクリアランスに作用すると考えられる薬剤をインビ ボ動物系で試験することができる。

ひと遺伝子発現および蛋白質機能に対する様々な薬剤のインビボ効果をひと以外 の設定で評価することが可能である。

この発明についてその実施態様と関連させて記載したが、さらに修正が可能であ ること、および、総じて発明の原理に従い、この発明が属し、前述の本質的特徴 に該当し得、後記請求の範囲に従う当技術分野内における周知または慣用的実践 範囲内に入るこの開示からの新たな進展を含めて、この発明の変形、用途または 適用が全てこの出願に包含されるべきである−ことは明らかである。

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Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. （１）その細胞がひとプレプロインシュリン、プロインシュリンまたはインシュ リンの遺伝子を含み、前記遺伝子を有する子孫マウスを生産することができるマ ウス。
2. （２）遺伝子が安定して形質発現される請求項１記載のマウス。
3. （３）ひとインシュリンの発現が自然調節されている、請求項２記載のマウス。
4. （４）その細胞がひとプレプロインシュリン、プロインシュリンまたはインシュ リン遺伝子の全部または一部を作る遺伝子配列を含み、受精の結果、その細胞に 前記遺伝子配列が含まれている子孫マウスを生産することができる標的マウスを 得る方法であって、 （ａ）第１雌マウスから受精卵を単離し、（ｂ）ひとプレプロインシュリン、プ ロインシュリンまたはインシュリン遺伝子の全部または一部を含む遺伝子配列を 前記受精卵に移し、 （ｃ）前記遺伝子配列を含む受精卵を擬妊娠第２雌マウスの子宮に移植し、 （ｄ）第２雌マウスを、 （ｉ）記記遺伝子配列を含む受精卵由来の胚により前記第２雌マウスを妊娠させ 、 （ｉｉ）前記胚を前記標的マウスに発生させ、（ｉｉｉ）前記標的マウスを第２ 雌マウスから生存し得る状態で誕生させる （ただし、標的マウスは、ひとプレプロインシュリン、プロインシュリンまたは インシュリンの遺伝子配列を含み、受精の結果、その細胞に前記遺伝子配列が安 定して含まれる子孫マウスを生産し得るものとする） 形で維持すること により構成される方法。
5. （５）ひとプレプロインシュリン、プロインシュリンまたはインシュリンの遺伝 子配列が安定して形質発現される、請求項４記載の方法。
6. （６）ひとインシュリンの形質発現が自然調節されている、請求項５記載の方法 。
7. （７）上記第１雌マウスがマウスＣ５７／Ｃ３Ｈ系統に属するものである、請求 項４記載の方法。
8. （８）受精卵に移植される遺伝子配列がプラスミドｐｇＨＩ１２．５に由来する ものである、請求項４記載の方法。
9. （９）Ｂ６Ｃ３Ｆ１／ヒューミング系統である請求項１記載のマウス。
10. （１０）ひとインシュリンの形質発現またはレベルに対する薬剤の薬動力学的効 果、治療価値または医薬的重要性の評価方法であって、 （ａ）請求項１、２または３のいずれか１項記載のマウスに薬剤を与え、 （ｂ）上記マウスにおける形質発現またはレベルをモニターすることにより、上 記ひとインシュリンの形質発現またはレベルに対する薬剤の効果、価値または重 要性を調べることを含む方法。
11. （１１）マウスがＢ６Ｃ３Ｆ１／ヒューミング系統に由来するものである、請求 項１０記載の方法。
12. （１２）異種蛋白質の形質発現またはレベルに対する薬剤の薬動力学的効果、治 療価値または医薬的重要性の評価方法であって、（ａ）トランスジェニックほ乳 類に薬剤を与え（前記ほ乳類は異種蛋白質遺伝子を含む）、 （ｂ）ほ乳類における形質発現またはレベルをモニターすることにより、異種蛋 白質の形質発現またはレベルに対する薬剤の効果、価値または重要性を評価する ことを含む方法。
13. （１３）トランスジェニックほ乳類がトランスジェニック・マウスである、請求 項１２記載の方法。
14. （１４）前記遺伝子が安定して形質発現されている、請求項１２記載の方法。
15. （１５）前記異種蛋白質の形質発現またはレベルが自然調節されている、請求項 １２、１３または１４のいずれか１項記載の方法。