JPH08506014A

JPH08506014A - トランスジェニック哺乳動物

Info

Publication number: JPH08506014A
Application number: JP6517125A
Authority: JP
Inventors: ロビンソン，ミユレー・オー; ハント，パメラ; ボツセルマン，ロバート・エー
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date: 1993-01-19
Filing date: 1994-01-14
Publication date: 1996-07-02
Also published as: AU6088894A; CA2153502A1; EP0607925A3; US5489743A; WO1994016556A1; EP0607925A2

Abstract

(57)【要約】トランスジェニックマウス、及び該マウスの作製方法を開示する。この発明のトランスジェニックマウスは血小板数が低く、及び／または巨核球白血病の症状を呈する。

Description

【発明の詳細な説明】トランスジェニック哺乳動物発明の背景発明の分野本発明は、外来DNAが導入された哺乳動物に係わり、その導入によるトランスジェニック哺乳動物の発生に係わる。本発明は特に、血小板数（platelet count ）が低下した状態か、巨核球白血病の状態か、またはこれらの状態の両方を有するトランスジェニック哺乳動物の発生に係わる。関連技術の説明トランスジェニック哺乳動物の作製では、哺乳動物の１個以上の染色体に新規な核酸配列を挿入する。そのDNAは典型的には卵の前核に送達され、そこで胚のD NA中に取り込まれる。次に、上記胚を妊娠期間のために“仮親受容者（surrogat e host）”に移植する。仮親受容者の子を、新規な核酸配列の存在に関して評価する。新規なDNA配列もしくはトランスジーン（transgene）の発現は、哺乳動物に新しい表現型をもたらし得る。挿入された１個以上の核酸配列、及び哺乳動物における発現レベルに応じて、哺乳動物は特定疾患または一連の疾患に罹患しやすくなったりしにくくなったりし得る。このようなトランスジェニック哺乳動物は、上記疾患の治療や予防に有用であり得る化合物のin vivoスクリーニング及び試験、及び／または上記疾患の診断に有用な方法の開発に役立つ。トランスジェニック哺乳動物は従来技術に開示されている。Wagner等の米国特許第4,873,191号は、哺乳動物接合体へのDNAのマイクロインジェクションによって導入された外因性DNAを有する哺乳動物を教示している。 Leder等の米国特許第4,736,866号はトランスジェニック哺乳動物を教示しており、この哺乳動物の生殖細胞及び体細胞は発生初期［一細胞期または受精胚（fe rtilized em-bryo）期］の該哺乳動物またはその祖先に導入された、活性化されたオンコジーン配列を有する。前記のような形質転換によって動物は、通常よりも新生物を発生させやすくなる。 Evans等の米国特許第4,870,009号は、哺乳動物の受精卵にDNA構築物を挿入し、この受精卵を妊娠のために仮親受容者（host mother）に移植することによって幾つかの哺乳動物ホルモンを生産することを教示している。DNA構築物には、生産したい哺乳動物ホルモンをコードする配列と融合させた哺乳動物メタロチオネイン遺伝子プロモーター配列を持たせる。形質転換した哺乳動物の血液を収集し、所期のホルモンを単離する。 1991年９月５日付で公開されたNoble等の国際特許出願公開第91/13150号、及びProc．Natl．Acad．Sci．USA 88,pp．5096-5100，1991所載のJat等の論文は、主要組織適合複合体Ｉプロモーター（H-2Kb）と連結されたSV40 large T抗原遺伝子突然変異体（SV40 tsA58突然変異体）を含むDNA構築物を有するマウスの作製を教示している。上記特異的プロモーターは、きわめて様々な組織において幾つかのインターフェロンによって誘導されるトランスジーンの発現を容易にするのに用いられる。この例で作製されるマウスは形質転換細胞系の発生源として用いられる。 Leder等の米国特許第5,175,383号には、尿生殖組織においてint-2遺伝子を発現させ、その結果良性前立腺過形成または肥大となる雄のトランスジェニックマウスが開示されている。 Krimpenfort等の米国特許第5,175,384号には、成熟T細胞レベルの低いトランスジェニックマウスが開示されている。 Wagner等の米国特許第5,175,385号には、ヒトβ型インターフェロン遺伝子を発現させるトランスジェニックマウスが開示されている。 Ravid等はProc．Nat1．Acad．Sci．USA 88，pp．1521-1525，1991において、 β-ガラクトシダーゼ遺伝子と連結された血小板第４因子（PF4）プロモーターを含むトランスジーン構築物を有するマウスについて検討しており、またRavid等はMol．Cell Biol．11，pp．6116-6127，1991に、PF4プロモーターの様々なドメインを教示している。 Palmiter等はNature 316，pp．457-460，1985に、72塩基対の反復SV40エンハンサー及びlarge T抗原のDNA配列を有するマウスにおける脈絡膜叢腫瘍の形成を教示している。DNA構築物にSV40エンハンサー要素が含まれない場合は他の病態も観察される。 Brinster等はCell 37，pp．367-379，1984に、SV40初期領域遺伝子及びメタロチオネイン融合遺伝子を含む構築物を有するマウスの作製を教示している。作製されたマウスのうちの数匹は脈絡膜叢腫瘍及び／または胸腺肥大を発症した。所与の哺乳動物種の血中血小板レベルが正常レベルを下回る障害である血小板減少症は、罹患個体の凝血能に悪影響を及ぼす。出血の増加はこの障害の一徴候である。加えて、血小板減少症は化学療法を受けている患者に頻発する副作用である。この障害の治療法で唯一現在有効なものは血小板輸血であるが、これは困難でかつ元来危険な操作である。 JacksonはBlood Cells 15，pp．237-253，1989に、血小板の少ないラット系統について述べている。 Peters等はBLood 76，pp．745-754，1990に、マウスにおける常染色体劣性突然変異について述べており、この突然変異が起こったマウスは貧血と血小板減少との合併症に罹患する。巨核球白血病は、巨核球に類似する表現型形質を有する癌性細胞の生成を特徴とする状態である。このような白血病は現在、骨髄移植によって治療されている。血小板減少症及び巨核球白血病が破壊的な結果をもたらすとの観点から、当技術分野では前記疾患の研究、並びに前記疾患の治療及び／または予防に用い得る化合物の研究用のin vivoモデル系を提供する適当な動物が必要とされている。従って本発明は、血小板減少症及び／または巨核球白血病に罹患する傾向を非トランスジェニックの哺乳動物の場合に比較して増大させる遺伝子型を有するトランスジェニック哺乳動物の提供を目的とする。このような哺乳動物は、上記疾患の治療その他の目的で用いる化合物のスクリーニングに有用である。本発明は更に、上記のような遺伝子型を有するトランスジェニック哺乳動物を作製する方法を提供すること、及びそのような哺乳動物を作製することも目的とする。本発明の上記以外の目的は、当業者には容易に明らかとなろう。発明の概要本発明は、ラットPF4プロモーターによって調節されたSV40初期領域tsA58突然変異体をコードする核酸構築物が意外にも様々なレベルの血小板減少症及び／または巨核球白血病を発症させるという驚くべき発見に基づく。本発明によればマウスが、上記疾患の治療及び／または予防に有用な化合物のスクリーニング用に新規で有用な系を提供する。本発明はその好ましい一実施態様において、トランスジーンを有する哺乳動物とその子孫とを提供する。別の好ましい実施態様では、トランスジーンを有するマウスとその子孫とを提供する。更に別の好ましい実施態様では、当該哺乳動物の種の正常な血小板数を下回る血小板レベルを有する哺乳動物を作製する方法を提供し、この方法は（ａ）受精胚に、血小板前駆細胞または巨核球プロモーターと作動可能に連結されたSV40初期領域tsA58突然変異体をコードする核酸を含むベクターを導入すること、及び（ｂ）形質転換した胚を仮親受容者に移植することを含む。本発明のこの具体例の付加的な態様において、生まれた子は血小板数の低下に関してスクリーニングすることが可能である。更に別の好ましい実施態様では、巨核球白血病の症状を呈する哺乳動物の作製方法を提供し、この方法は（ａ）胚に、血小板前駆細胞または巨核球プロモーターと作動可能に連結された SV40初期領域tsA58突然変異体をコードする核酸配列を含むベクターを導入すること、及び（ｂ）形質転換した胚を仮親受容者に移植することを含む。生まれた子は巨核球白血病に関してスクリーニングすることが可能である。他の好ましい実施態様では、トランスジェニック哺乳動物の骨髄、リンパ節及び牌臓など幾つかの組織に由来する細胞系を提供する。図面の簡単な説明第１図はトランスジェニックマウスのゲノムに組み込むDNA構築物の概略的説明図である。この配列は、SV40ウイルスゲノムのtsA58突然変異体の初期領域と連結された約1.1kbのSprague-DawleyラットPF4プロモーター配列を含む。第２図は新規に配列決定したSprague-Daw1eyラットPF4プロモーターの核酸配列（配列番号１）を示す説明図である。第3A図は始祖（founder）トランスジェニックマウスの血小板数のグラフである。第3B図はトランスジーンに関してヘミ接合またはホモ接合であるF₂マウスの血小板数のグラフである。第3C図はF₁マウスにおけるアセチルコリンエステラーゼ活性（巨核球に関するマーカー）対血小板数のグラフである。第４図はFisherラットのPF4プロモーター配列（下方の配列）とSprague-Daw1e yラットのPF4プロモーター配列（上方の配列）とを比較して示す説明図である。両配列は、その相同性が最大となるように並べた。核酸配列の相違が示してある。発明の詳細な説明本発明の説明では次の語を、以下に定義した意味で用いてある。本明細書中に用いた“ベクター”という語は、適当な構成要素が細胞に取り込まれるか、またはマイクロインジェクションもしくは他の技術によって細胞に挿入され得るように当該構成要素を含み、かつそのような順序で構成された核酸配列を意味する。このような配列は、細胞の全体または一部に天然に存在してもしなくてもよい。典型的には、ベクターは１個以上のプロモーターと、ベクターでトランスフェクトした細胞または生物（宿主）に移入し、かつそこで発現させるべき構造遺伝子と、翻訳開始配列及びポリアデニル化配列を含めた、転写配列のプロセッシング及び翻訳を可能にする配列などの、宿主における遺伝子移入及び／または発現に必要な他の要素とを含む。本発明で用いるベクターは環状であっても直線状であってもよいが、胚に挿入してトランスジェニック哺乳動物を発生させるためには直線状の方が好ましい。本明細書中に用いた“プロモーター”という語は、対応する核酸コーディング配列もしくは構造遺伝子の転写を調節する核酸配列を意味する。本発明の文脈において“プロモーター”という語は、エンハンサー、リプレッサー、１個以上の転写開始部位、及び対応する構造遺伝子の転写を調節するというプロモーターの総合的機能に関わる他の要素を包含し得る。本発明の好ましいプロモーターには、例えばPF4プロモーター（Ravid等，supra，1992）及びM PLプロモーター（Wendling等，Blood 80，p．246a，1992）などの、主に血小板前駆細胞、巨核球及び／または巨核球前駆細胞において活性であるプロモーターが含まれる。本明細書中に用いた“作動可能に連結された”という語は、ベクター上でプロモーターが、用いられた１個以上の目的の構造遺伝子に対して取る配向を表わす。プロモーターは、該プロモーター自体が１個以上の構造遺伝子の発現を制御または調節し得るような位置に配置される。 “血小板前駆細胞プロモーター”及び“巨核球プロモーター”という語は、主に血小板前駆細胞及び／または巨核球並びに巨核球前駆細胞において活性である（即ちプロモーターと作動可能に連結された構造遺伝子の発現を促進し得る）プロモーターを意味する。このようなプロモーターは、他の種類の組織や細胞では最小限の活性しか示さない。 “トランスジーン”という語は、（1）遺伝子操作するべき哺乳動物において天然に見出されない遺伝子、（2）前記哺啼乳動物において天然に見出される遺伝子の突然変異形態、（3）前記哺乳動物において見出されるのと同じであるかもしくは類似する遺伝子の付加的コピーの作製に有用である遺伝子、（4）異常細胞系で発現するように指令を受ける遺伝子、または（5）その発現が誘導されるサイレントな内因性遺伝子を意味する。“突然変異形態”という語は、遺伝子配列中に野生型配列もしくは天然配列と異なる、即ち前記配列を置換するヌクレオチドを１個以上含む遺伝子を意味する。この遺伝子は他の場合には、または上記に加えて、ヌクレオチド挿入部または欠失部を有し得る。 “SV40 tsA58初期領域”、“SV40 T抗原”及び“tsA58突然変異体”という語は、サルウイルス初期領域遺伝子をコードする核酸であって、初期領域核酸配列中にコードされたlarge T抗原が突然変異、即ちtsA58突然変異を起こし、その結果TegtmeyerがJ．Virol．15，pp．613-618，1975に述べているように天然の野生型large T抗原遺伝子に比べて変化した活性を有するようになった核酸を意味する。本明細書では、上記三つの語を相互交換可能にSV40初期領域のlarge T抗原配列の意味でも初期領域配列全体の意味でも用い得る。 “哺乳動物”という語は、哺乳類綱に属するヒト以外のあらゆる動物を意味する。好ましくは、この語はヒトを除いた哺乳類綱の全構成員を包含する。更に好ましくは、この語はウサギ、ラット、マウス及びハムスターなどの齧歯動物の全系統を包含する。本発明で特に好ましく用いるのはラット、ハムスター及びマウスである。最も好ましいのはマウス、特に核収量（nuclear yield）が高く、前核の可視性に優れ、in vitro生存率が高く、かつ成体の生殖適応度が高い系統、即ち健康であると看做される系統である。 “子孫”及び“トランスジェニック哺乳動物の子孫”という語は、最初に形質転換した哺乳動物から生じた各世代のあらゆる子を意味する。 “始祖系”、“始祖マウス”及び“始祖”という語は、マイクロインジェクションまたは他の技術によってトランスジーンを導入した胚の成熟物である哺乳動物、即ちDNAを挿入して１匹以上の仮親受容者に移植した胚から成長した哺乳動物を意味する。 “血小板減少症”という語は、血液の血小板数が正常な血小板数より低下することを意味する。そのような低下は本明細書では、用いた特定哺乳動物種にとって正常と決定されたレベルを下回る任意レベルを包含するものとする。血小板減少症は哺乳動物発生のいかなる段階にも発症し得、また一時的でも永続的でもあり得る。一時的である場合、この疾患は哺乳動物の生活環の任意時点に再発し得る。血小板減少症は、該疾患を持つよう影響を受けた哺乳動物の子に遺伝する場合もしない場合も有る。 “巨核球白血病”及び“巨核球性白血病”という語は、哺乳動物の１個以上の細胞が非制御下に分裂して病態をもたらした状態を説明するものである。上記細胞は、血小板第４因子と呼称されるマーカー、フォン・ビルブラント因子と呼称されるマーカー、及び血小板に対して産生される抗血清と免疫反応性である他のタンパク質から成るマーカーを非限定的に含めた巨核球系のマーカーを発現させる。加えて、上記細胞は、このような細胞の同定のための標準的規準を用いて形態学的に巨核球と同定可能であり得る。 “哺乳動物細胞系”という語は、適当な培養条件下に生存及び／または分裂し得る、哺乳動物の組織または腫瘍に由来する細胞を意味する。本明細書中に用いたこの語は、最初に組織または腫瘍から得た細胞の後続世代を総て包含する。 “哺乳動物の受精胚”という語は、卵母細胞と精子との融合がもたらした早期接合体、特に単一細胞を意味する。 “仮親受容者”及び“仮親（surrogate mother）は相互交換可能に用い得る語で、１個以上のトランスジーンを導入した受精胚が移植される、好ましくは雌の哺乳動物を意味する。仮親受容者は、典型的には胚と同じかまたは類似する種であり、必要に応じて適宜行なわれるホルモンでの処理、及び／または精管切除した雄との交尾によって胚受容性となる。しかし、本明細書中に用いた上記二つの語は、胚を同一または類似種の哺乳動物への移植に替えて、または加えてin vit roで成熟及び発生させるための容器として用い得る試験管、皿、及び／またはインキュベーターもしくは他の適当な器具も包含するものとする。Ａ．形質転換用構築物の調製１．トランスジーンの選択用いるトランスジーンを、細胞周期の制御及び調節に影響する能力、及び／または細胞の成長及び／または分裂を促進する能力によって選択する。ただ１個の胚に挿入するべく２個以上のトランスジーンを同時に用いることは本発明の範囲内である。本明細書では、その遺伝子を導入した哺乳動物及び／またはそのような哺乳動物の子において血小板レベルを変化させる遺伝子が好ましいトランスジーンである。構造遺伝子は、ウイルス性生物、単細胞原核もしくは真核生物、脊椎もしくは無脊椎動物、または植物を含めた任意の供給源から取得可能である。脊椎動物の哺乳類から取得する場合、構造遺伝子は同類の供給源由来（即ち或るマウスに由来する構造遺伝子を別のマウスに移植）であっても非同類の供給源由来（即ちウサギに由来する構造遺伝子をマウスに移植）であってもよい。トランスジーンはトランスジェニック哺乳動物の表現型に対して付加的な影響を及ぼし得、それらの影響は血小板レベルに関連したりしなかったりし得る。本発明で好ましく用いるトランスジーンには、myc 、myb、E2F（J．R．Nevins，Science 258,pp．424-429，1992）、ab1、ras、pim.1 、src、E1A（Nevins,supra）、HPVE7（ヒト乳頭腫ウイルスE7；Nevins，su pra ）、SV40初期領域、SV40 large T抗原、SV40 large T抗原tsA58突然変異体、並びにこれらの突然変異体及び断片が含まれる。より好ましい遺伝子は、myc、E2F、SV40初期領域及びSV40初期領域ts A58突然変異体などである。最も好ましい遺伝子は、SV40初期領域tsA58突然変異体である。２．プロモ-ターの選択本発明の実施に有用なプロモーターは、活性に関して時間的にも空間的にも高度に調節されるプロモーターである。即ち、適当なプロモーターは特定種類の組織や細胞、好ましくは血小板、血小板前駆細胞及び／または巨核球においてのみ活性であるプロモーターである。プロモーター源は任意の単細胞原核もしくは真核生物、任意の脊椎もしくは無脊椎動物、または任意の植物由来であり得る。プロモーターを哺乳動物から得る場合、その哺乳動物は同類（トランスフェクトするべき哺乳動物と同じ種）であっても非同類（別の種）であってもよい。本発明の好ましいプロモーターは、主に血小板、及び巨核球などの血小板前駆細胞において発現を実現するプロモーターである。本発明で好ましく用いるのはPF4プロモーター、α-IIBインテグリンプロモーター（Marguerie等，7th International Symposiumon the Biology of Vascu1ar Cells ，p．18，San diego,CA，1992）、糖タンパク質GPＩbプロモーター（Uzan等，J． Biol.Chem．266 ，pp．8932-8939，1991）、血小板糖タンパク質GPIIbプロモーター（Wenger等，Biochem．Biophys.Res．Comm．166，pp．389-395，1988）、M2PT P遺伝子のプロモ-ター（P1utzsky等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89,pp．1123 -1127，1992）及びMPLプロモーター（Wend1ing等，Blood 80，p．246a，1992）で、これらはいずれも任意の供給源から取得可能である。最も好ましいのはラットPF4プロモーターである。３．その他のベクター構成要素プロモーター及び１個以上の構造遺伝子に加えて、本発明のベクターは好ましくは、このベクターを挿入した哺乳動物において該ベクターが最適に機能するのに役立つその他の要素も含む。そのような要素は当業者に良く知られており、かつ例えばSambrook等，Cold Spring Harbor Labo-ratory Press，1989に述べられている。４．ベクターの構築哺乳動物の胚の形質転換に用いるベクターを、例えばSambrook，Fritsch及びM aniatis編，Molecular Cloning:A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Lab oratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，1989）に述べられている制限エンドヌクレアーゼ消化、連結、プラスミド並びにDNA及びRNA精製、DNA配列決定等の標準的技術を非限定的に含めた、当業者に良く知られている方法を用いて構築する。本発明で好ましく用いるベクターは、後述のようにATCCに寄託した、第１図に示したプラスミド4Cである。Ｂ．トランスジェニック哺動物の作製本発明の実施に用いる任意の哺乳動物種の特定系統を、全体に健康であり、胚収量が高く、胚中の前核の可視性に優れ、かつ生殖適応度が高いことによって選択する。例えば、トランスジェニックマウスを作製しようとする場合はC57/BL6 ×DBA2 F₁交雑などの系統やFVB系統を用いる（Charles River Labsから市販されている）。胚を得るのに用い、また仮親受容者として用いる哺乳動物の年齢は採用種次第で異なるが、当業者には容易に決定できる。例えば、マウスを用いる場合は前成熟期（pre-pu-beral）の雌が、より多くの胚を提供し、かつホルモン注入により良く応答するので好ましい。同様に、種牡として用いるべき雄の哺乳動物は通常、なによりも性的成熟年齢を基準に選択する。排卵（egg production）、交尾、及び／または胚の再移植に備えて雌を準備するのにホルモンまたは他の化合物の投与が必要である場合が有る。ホルモン／補因子の種類及び用量、並びにホルモン投与時期は哺乳動物種毎に様々である。このような考慮点は当業者には直ちに明らかとなろう。典型的には、下準備を終えた雌（即ち受精可能な卵を排出する雌）を種牡と交尾させ、生じた受精胚を１個以上のトランスジーンの導入のために取り出す。あるいは他の場合には、卵及び精子を適当な雌及び雄から得、これらをin vitro受精に用いてトランスジーンの導入に適した胚を作製することも可能である。通常、受精胚は適当な媒質中で、前核が現われるまでインキュベートする。前核が現われたほぼその時点に、選択したトランスジーンを含む外因性核酸を雌性または雄性前核に導入する。マウスなど幾つかの種では雄性前核の方が好ましい。核酸の導入は、例えばマイクロインジェクションなどの、当業者に公知の任意手段で行ない得る。核酸を導入した胚は、in vitroで様々な時間インキュベートするか、仮親受容者に再移植するか、または前記のようにインキュベートしかつ再移植することが可能である。in vitroでインキュベートして成熟させることは本発明の範囲内である。通常の一方法では、胚をin vitroで１〜７日間インキュベートしてから仮親受容者に再移植する。再移植は標準的な方法を用いて行なう。普通、仮親受容者に麻酔を掛け、胚を輸卵管に挿入する。特定の受容者に移植する胚の数は様々であるが、普通は当該種が天然に産む子の数に匹敵させる。仮親受容者のトランスジェニック子は、任意の適当方法によってトランスジーンの存在に関しスクリーニングし得る。スクリーニングはしばしば、トランスジーンの少なくとも一部と相補的であるプローブを用いるサザン法またはノザン法分析によって行なう。代替の、または付加的なスクリーニング方法として、トランスジーンがコードするタンパク質に対する抗体を用いるウェスタン法分析を用いることも可能である。典型的にはトランスジーンを最高レべルで発現させると考えられる組織または細胞を試験するが、この分析にはいかなる種類の組織または細胞も用い得る。トランスジーンの存在を評価する代替の、または付加的な方法には、酵素アッセイ及び／または免疫アッセイや、特定マーカーまたは酵素活性に関する組織染色などの適当な生化学的アッセイが非限定的に含まれる。血小板減少症の評価には血球計数データが有用である。トランスジェニック哺乳動物の子孫は、トランスジェニック哺乳動物を適当な相手と交尾させることによってか、またはトランスジェニック哺乳動物から得た卵及び／または精子のin vitro受精（または授精）によって得ることができる。 in vitro受精を採用する場合、受精胚は仮親受容者に移植するか、in vitroでインキュベートするか、または前記のように移植しかつインキュベートすることが可能である。交尾を採用してトランスジェニック子孫を産ませる場合は、トランスジェニック哺乳動物を親系統と戻し交雑し得る。いずれの方法を採用して得た子孫も、先に述べた方法かまたは他の適当方法を用いてトランスジーンの存在に関して評価することが可能である。本発明の形質転換哺乳動物、その子孫、及び細胞系には、当業者には直ちに明らかとなる幾つかの重要な用途が有る。上記哺乳動物及び細胞系は特に、血小板減少症及び／または巨核球白血病に対する予防的または治療的処置物質としての可能性を有する化合物のスクリーニングに有用である。トランスジェニック哺乳動物の場合、候補化合物のスクリーニングは、試験するべき１種以上の化合物を哺乳動物に一連の投与量で投与し、前記化合物に対する哺乳動物の生理学的応答を経時的に評価することによって行なう。投与は、評価する化合物の化学特性次第で経口であっても、また適当な注射によってもよい。場合によっては、化合物を該化合物の効力を高めるような補因子と組み合わせて投与することが適当であり得る。血小板減少症及び／または巨核球白血病の治療に有用な化合物に関して細胞系をスクリーニングする際には、細胞培養培地に化合物を適当時点に添加して該化合物に対する細胞の応答を、適当な生化学的及び／または組織学的アッセイを用いて経時的に評価する。場合によっては、試験するべき化合物を該化合物の効力を高めるような補因子と組み合わせて培地に適用することが適当であり得る。本発明は、以下の実施例を参照することによって更に良く理解されよう。これらの実施例は決して、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきでない。実施例Ａ．血小板第４因子（PF4）プロモータークローニング Sprague-DawleyゲノムDNAライブラリーから得た血小板第４因子（“PF4”）遺伝子の5'領域の1.1kb以下の断片を、5'（遠位末端部）に関してはGCTTGAATTCCTT TACTCTGCG（配列番号２）、3'（近位末端部）に関してはGGAATTCAAGCTTGATATCCA AGGGCTACCTCGG（配列番号３）の相補的オリゴヌクレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅によってクローン化した。得られたDNA断片を制限エンドヌクレアーゼEcoRＩで消化し、DNAの重複末端を、標準的な方法を用いてDNAポリメラーゼのクレノウフラグメントで平滑化した。この断片をベクターpBluescrip t II KS⁺（Stratagene，LaJolla，CA）に、pBluescriptベクターを制限エンドヌクレアーゼEcoRVで消化し、挿入体とベクターとをDNAリガーゼで連結することにより挿入してクローン化した。得られたクローンを単離し、これで大腸菌DH5α 細胞を形質転換してプラスミド増幅を図った。細胞からプラスミドを、標準的なアルカリ溶菌法を用いて精製した。このクローンをプラスミド“4A”と呼称することにした。Fisherラット由来の公表配列（Ravid等，supra，1991）と、配列決定したクローンとの間に20を越える相違点を確認した。これらの相違点は第４図において確認される。Ｂ．tsA58 SV40クローニング制限酵素KpnＩ及びBamHＩでの消化によって生成させた、野生型SV40ウイルス初期領域を含むDNA断片を、予め制限エンドヌクレアーゼKpnＩ及びBamHＩで消化したpB1ue-script II KS⁺ベクター中に連結した。このようにして得た、上記SV4 0挿入体を含む連結ベクターをHpaＩで消化して、SV40初期領域の3733位から2666 位までの1.1kb以下のDNA断片を除去した。Tegtmeyerが前出誌で述べているtsA58 突然変異（3505位のアラニンがバリンとなる）を有するSV40クローンから得た同じ断片をベクター中に連結した。得られたベクターで大腸菌DH5α細胞を形質転換してプラスミド増幅を図った。上記細胞から所望のプラスミドを単離し、これをプラスミド“4B”と呼称することにした。Ｃ．PF4−tsA58 SV40融合遺伝子先に述べたクローン4Aを制限酵素EcoRＶ及びSpeＩで消化し、PF4プロモーター含有断片である1.1kb以下の断片を標準的な方法を用いて単離した。このプロモーター断片の重複末端を、標準的な技術を用いてDNAポリメラーゼのクレノウフラグメントで平滑化した。クローン4Bを5187位において制限酵素AvrIIで直線状とし、その末端をDNAポリメラーゼのクレノウフラグメントで平滑化し、上記PF4プロモーター含有断片を、PF4プロモーターの転写方向がSV40初期領域構造遺伝子の転写方向と同じとなる部位に連結した。PF4プロモーター含有配列を第２図に示す。このクローンをプラスミド“4C”と呼称することにした。得られた融合遺伝子を制限酵素NotＩ及びEcoRＩでベクター配列から単離して、マウスの授精胚に注入した。プラスミド4Cは、該プラスミドで形質転換した大腸菌DH5α細胞の形態でATCCに寄託してあり、受託番号ATCC 69182 の下に入手可能である。Ｄ．胚の調製及びマイクロインジェクション卵胞刺激ホルモン（“FSH”）を供給する妊娠馬血清（“PMS”）をBDF2系統の雌のマウス（Charles River Labs）に、マイクロインジェクションを行なう日の前の約３日間に投与した。PMS（Sigma Chemicalsから入手）をリン酸緩衝食塩水中に加えて50I.U./ml溶液とし、これを動物１匹当たり0.1ml（5I.U.）の用量で腹腔内注射した。PMS注射の45〜48時間後、黄体形成ホルモン（“LH”）を供給するヒト絨毛性性腺剌激ホルモン（“HCG”）を投与した。HCGもPBS中に加えて50I.U./ml溶液とし、これを動物１匹当たり0.1mlの用量でIP（腹腔内）注射した。HCG注射の直後に雌を、同じ系統の種牡と一緒にした。交尾後、雌を交尾栓に関して検査した。不透明な白色の栓の出現が交尾の成功を示した。交尾に成功した雌を頚管転移（cervical dislocation）によって殺し、両輸卵管を迅速に取り出してM2培地（Hogan等編，Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual，pp．249-257，Cold Spring Harbor Laboratory Press，198 6）中に置いた。輸卵管をM2培地から丸底解剖スライド（dissection slide）内の、300μg/mlのヒアルロニダーゼ（Sigma Corp.，St．Louis，MO）を含有するP BSに個々に移した。輸卵管を裂いて胚を取り出し、卵丘細胞（cu-mulus cells）が胚から分離するにつれて胚がスライド底部に沈澱するようにした。卵丘塊が（約５分で）分解してから胚をM2培地流に２回潜らせ、授精胚を非授精胚及び異常胚から分離した。その後、授精胚を５％ C0₂平衡M16培地（Ho-gan等，supra）に潜らせ、パラフィン油下にM16培地を収容した平衡マイクロドロップ皿（microdr op dishes）に入れ、インキュベーターに戻した。Ｅ．注入操作授精胚をM16培地中で選択し、前核が現われるまで37℃で約５時間インキュベートした。次に、胚をパラフィン油下に浅い凹状スライド（depression slide）内のM2培地中に移し、顕微鏡下に置いた。前核は倍率200倍で容易に目視できた。保持用ピペットへの吸引を利用して、ただ１個の胚を選択し、かつ雄性前核が保持用ピペットから遠ざかるように回転した。DNA構築物を約１μg/mlの量で含有する溶液約200plを一方の前核、好ましくは雄性前核に注入した。注入後、胚を18時間のインキュベーションに戻し、翌日（Hogan等，supra，pp．132-145に述べてあり、かつ本明細書でも後述するようにして調製した）仮親の（foster）偽妊娠雌に再移植した。Ｆ．再移植解剖顕微鏡を用いて、麻酔を掛けたC57/BL6×DBA2 F₁交雑系統のマウスへの再移植を行なった。偽妊娠させた雌のマウスに、0.017〜0.020ml/g体重のアベルチンをIP注射して麻酔を掛けた。マウスを解剖顕微鏡下に置き、切開域を70％エタノールで消毒した。卵巣を外在化し、卵巣及び輸卵管を取り巻く滑液嚢を慎重に引き開いた。卵巣と輸卵管とを分離して、輸卵管の開口部（infindibulumと呼称）を露出した。次に、生存する胚をインキュベーターから取り出し、再移植用ピペット内に装填した。ピペットの先端をinfindibulumに数ミリメートル挿入し、低圧力を用いて胚を輸卵管内へ送り込んだ。マウス１匹当たり約10〜20個の胚を移植したところ、一腹仔数は５〜12となった。その後、卵巣を腹腔内に戻して体壁を、次いで皮膚を縫合した。Ｇ．トランスジェニックマウスの同定胚注入後に生まれた109匹のマウスのうちの20匹は、先の“Ａ”節に述べたオリゴヌクレオチドを用いる特異的PCR増幅によってアッセイされるトランスジーンを有した。このような結果は、PCR分析に用いたオリゴヌクレオチドから作製したDNAプローブを用いるサザン法分析（Sambrook等，1989）によって確認した。これらのトランスジェニックマウスを“始祖マウス”と呼称する。これらのマウスのうちの２匹は意外にも、尾部生検後に移しく出血して死亡した。残りの18 匹のマウスを尾静脈切開（nick）によって出血させ、血液試料をEDTA粉末の入ったチューブに収容した。Ｈ．血液細胞含量の分析各トランスジェニック始祖マウスの血液細胞含量を、Sysmex^TM細胞分析装置（ T0A Medical Electronics，Kobe， Japan）を用いて分析した。各マウスから得た20μlの血液を、製造元指定の分析用稀釈剤に添加した。血小板数、白血球数、赤血球数及び平均血小板体積の総てがこの装置において得られた。血小板数以外はいずれの血液細胞パラメーターも、対照の（トランスジェニックでない）同腹マウスに関して観察される範囲内に有った。マウスにとっての正常な血小板数は800,000〜1,200,000細胞/μl血液である。トランスジェニックマウスの血小板数を第3A図に示す。図示のように、始祖マウスPS14、PS27、PS77、PS81及びPS102は対照の５〜25％の血小板レベルを有し、始祖マウスPS2、PS7、PS64、PS71及びPS95は対照の25〜60％の血小板レベルを有し、マウスPS22、PS24、PS25、PS28、PS29、PS32、PS43及びPS61は対照マウスのレベルに匹敵する血小板レベルを有した。即ち、過半数のトランスジェニックマウスは血小板減少症であった。Ｉ．F₁世代マウスの作製血小板表現型がトランスジーン構築物の存在及び活性と直接的に相関することを確認するべく、PS28、PS43及びPS61以外の全系統からヘミ接合及びホモ接合F₁ 世代トランスジェニックマウスを派生させた。このF₁世代は、各系統を C57/BL6×DBA2 F₁交雑マウス系統と戻し交雑することによって得た。各マウスの尾部組織から得たDNAに、RNA/DNΛハイブリダイゼーションアッセイ（Hunt等，Blood 80，pp．904-911,1992）を行なった。このアッセイではSV40 T抗原プローブと、マウス幹細胞因子（SCF）RNAプローブとの両方を用いた。T 抗原シグナルとSCFシグナルとの比を用いてマウスの接合状態を確認した。各マウスの血液分析を、先に述べたSysmex^TMシステムを用いて行なった。トランスジェニックF₁集団の巨核球レベルをアッセイするべく、PS2、PS7、PS 14、PS22、PS25、PS29、PS32及びPS77系統から骨髄細胞を得た。骨髄細胞の取得は、LevineのCATCH緩衝液（A．Levine及びM．Fedorko，J．Cell Biol.69，p．15 9，1976）を用いて後肢の長骨から骨髄を溢流させることによって行なった。得られた細胞をメイーグリュンワルドギームザ染色液で、巨核球のマーカーであるアセチルコリンエステラーゼ（Burstein等，J．Ce11．Physiol.122，pp．159-16 5，1985）に関して染色した。結果を第3C図に示す。図示のように、血液の血小板数と骨髄の巨核球数との間には逆相関関係の傾向が有る。加えて、上記系統のマウスから得た脾臓細胞を分散させ、かつアセチルコリンエステラーゼ活性に関して染色したとことろ、PS14系統のアセチルコリンエステラーゼ陽性染色細胞数が対照マウスにおいて観察される数の約４倍であることが観察された。 PS2、PS7、PS14及びPS77系統から得た末梢血スミアの検査は、対照に比較して低下した血小板レベルを示し、かつ大型の非顆粒血小板（agranular platelets ）の存在を明らかにした。同じ系統から得た骨髄スミアは、異常な形状及び寸法の巨核球を示した。Ｊ．F₂世代マウスの作製遺伝子投与量が血小板表現型に及ぼす影響を調べるべく、PS2、PS7、PS22及び PS29系統についてヘミ接合F₁マウス同士で繁殖させて、トランスジーンに関しホモ接合性である前記血小板数を示す第3B図において、塗り潰した棒はトランスジーンに関してヘミ接合性であることを示し、斜線を施した棒はトランスジーンに関してホモ接合性であることを示す。PS22系統以外では、ホモ接合マウスの方がヘミ接合マウスより甚だしい血小板欠乏表現型を示した。Ｋ．巨核球白血病の確認様々なトランスジェニックマウスの死亡原因を調べた。PS22系統の始祖マウスに由来する組織を固定及び切断して、肝臓、腸及び牌臓に白血病細胞の存在を観察した。試験した細胞の多くは、マウス血小板に対するポリクローナル抗体で陽性に染色されており、白血病細胞の核はSV40 T抗原に対する抗体に対して免疫反応性であった。加えて、PS14、PS24及びPS71系統のマウスは８ヵ月齢となる前に死亡した。これらの動物の検死から、脾臓が甚だしく肥大し、かつ肝臓に有色斑が生じていたことが判明し、白血病であったことが示唆された。Ｌ．細胞系の調製トランスジェニックマウスを、死が迫っていることを示す瀕死の様相に関して検査する。逆立った柔毛、低下した活動レベル、膨満した腹部、及び／または触知可能な脾臓といった徴候が観察されたらマウスを安楽死させて脾臓、骨髄及びリンパ節組織を採取する。組織は直ちに、ウシ胎児血清などの補充血清を５〜25 ％（v/v）含有し、かつインターロイキン３及び／または幹細胞因子を非限定的に含めた適当な成長因子を適当レベルで含有するRPMI 1640などの適当培地中に分散させる。細胞のインキュベーションを33℃、37℃または39℃で行なう。培地を規則的に交換する。細胞の分離に適した時間の経過後、細胞を巨核球及び／または（巨核球に関する）アセチルコリンエステラーゼなどの血小板マーカーの存在に関してアッセイする。寄託物 SV40初期領域tsA58突然変異体と連結されたSprague-DawleyラットPF4プロモーターを含むプラスミド4Cを、ブダペスト条約の規定下に大腸菌DH5α宿主細胞に導入した形態で、American Type Culture Collection（“ATCC”），12301 Park lawn Drive，Rockville，MD 20852に1993年１月７日付で寄託した。上記細胞の試料は当業者には、受託番号ATCC 69182の下に入手可能である。本明細書中に引用した文献は総て特定的に、本明細書に参考として含まれる。配列表配列番号：１配列の長さ：1264塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列配列番号：２配列の長さ：22塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列配列番号：３配列の長さ：34塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列配列番号：４配列の長さ：1160塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列配列番号：５配列の長さ：1142塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年８月１８日【補正内容】【図４Ｂ】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ハント，パメラアメリカ合衆国、カリフオルニア・91362、サウザンド・オークス、マツクレア・ロード・2431 (72)発明者ボツセルマン，ロバート・エーアメリカ合衆国、カリフオルニア・91362、サウザンド・オークス、バツカラツト・ストリート・3301

Claims

【特許請求の範囲】１．血小板前駆細胞プロモーターまたは巨核球プロモーターと作動可能に連結されたSV40初期領域tsA58突然変異体をコードする核酸を含むベクター。２．プロモーターがPF4及びMPLの中から選択されることを特徴とする請求項１に記載のベクター。３．PF4及びMPLの中から選択されたプロモーターと作動可能に連結されたSV40初期領域tsA58突然変異体をコードするDNAを自身のDNA中に有する哺乳動物。４．請求項３に記載の哺乳動物の子孫。５．マウスであることを特徴とする請求項３に記載の哺乳動物。６．血小板前駆細胞プロモーターまたは巨核球プロモーターと作動可能に連結されたSV40初期領域tsA58突然変異体をコードする前記DNAの組み込みによって血小板減少症となることを特徴とする請求項３に記載の哺乳動物。７．血小板前駆細胞プロモーターまたは巨核球プロモーターと作動可能に連結されたSV40初期領域tsA58突然変異体をコードする前記DNAの組み込みによって巨核球白血病となることを特徴とする請求項３に記載の哺乳動物。８．マウスであることを特徴とする請求項６に記載の哺乳動物。９．マウスであることを特徴とする請求項７に記載の哺乳動物。 10．請求項８に記載のマウスの子孫。 11．請求項９に記載のマウスの子孫。 12．血小板前駆細胞プロモーターまたは巨核球プロモーターと作動可能に連結されたSV40初期領域tsA58をコードするDNAを自身のDNA中に有する哺乳動物細胞系。 13．牌臓、骨髄及びリンパ節の中から選択されたマウス組織に由来することを特徴とする請求項12に記載の細胞系。 14．血小板数の低下した哺乳動物を作製する方法であって、ａ）哺乳動物の受精胚に、血小板前駆細胞プロモーターまたは巨核球プロモーターと作動可能に連結されたSV40初期領域tsA58突然変異体をコードする核酸を含むベクターを導入し、ｂ）この胚を仮親に移植して子を産ませ、ｃ）生まれた子を血小板数の低下に関してスクリーニングすることを含む方法。 15．哺乳動物がマウスであることを特徴とする請求項14に記載の方法。 16．胚に核酸をマイクロインジェクションで導入することを特徴とする請求項15 に記載の方法。 17．巨核球白血病に罹患した哺乳動物を作製する方法であって、ａ）哺乳動物の受精胚に、血小板前駆細胞プロモーターまたは巨核球プロモーターと作動可能に連結されたSV40初期領域tsA58突然変異体をコードする核酸を含むベクターを導入し、ｂ）前記のように形質転換した胚を仮親受容者に移植して子を産ませ、ｃ）生まれた子を巨核球白血病に関してスクリーニングすることを含む方法。 18．第２図のラットPF4プロモーター配列をコードする核酸配列。 19．請求項18に記載の配列に含まれる、ラットPF4プロモーター活性をコードする核酸配列。