JP6688499B2 - 安定性が増加したウミシイタケ(Renillareniformis)由来ルシフェラーゼ変異体 - Google Patents
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Description
すなわち、本発明は以下を包含する。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列(Rlucのアミノ酸配列)において、第75番目のイソロイシン、第116番目のフェニルアラニン、第137番目のイソロイシン、第178番目のアスパラギン、第264番目のアスパラギン及び第287番目のセリンから成る群より選択される1以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質;
(b)(a)記載のタンパク質のアミノ酸配列において、第75番目、第116番目、第137番目、第178番目、第264番目及び第287番目のアミノ酸から成る群より選択される1以上のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成るタンパク質であって、ルシフェラーゼ活性を有し、且つ配列番号2に示されるアミノ酸配列から成るタンパク質と比較して高い熱安定性及び有機溶媒耐性を有する、前記タンパク質。
(A)第75番目のイソロイシンからアラニンへの置換;
(B)第116番目のフェニルアラニンからロイシンへの置換;
(C)第137番目のイソロイシンからバリンへの置換;
(D)第178番目のアスパラギンからアスパラギン酸への置換;
(E)第264番目のアスパラギンからセリンへの置換;
(F)第287番目のセリンからプロリンへの置換。
(3)(A)〜(F)の全てのアミノ酸置換を含む、(2)記載のルシフェラーゼ変異体。
(8)(7)記載の組換えベクターを有する形質転換体。
本発明に係るルシフェラーゼ変異体は、以下の(a)又は(b)のタンパク質である。
(a)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、第75番目のイソロイシン、第116番目のフェニルアラニン、第137番目のイソロイシン、第178番目のアスパラギン、第264番目のアスパラギン及び第287番目のセリンから成る群より選択される1以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列から成るタンパク質;
(b)(a)記載のタンパク質のアミノ酸配列において、第75番目、第116番目、第137番目、第178番目、第264番目及び第287番目のアミノ酸から成る群より選択される1以上のアミノ酸以外の位置で、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列から成るタンパク質であって、ルシフェラーゼ活性を有し、且つ配列番号2に示されるアミノ酸配列から成るタンパク質と比較して高い熱安定性及び有機溶媒耐性を有する、前記タンパク質。
(1)第75番目のイソロイシン:アラニン、非極性疎水性アミノ酸への置換;
(2)第116番目のフェニルアラニン:ロイシン、非極性疎水性アミノ酸への置換;
(3)第137番目のイソロイシン:バリン、非極性疎水性アミノ酸への置換;
(4)第178番目のアスパラギン:アスパラギン酸、酸性若しくは塩基性アミノ酸への置換;
(5)第264番目のアスパラギン:セリン、非解離極性アミノ酸への置換;
(6)第287番目のセリン:プロリン、非極性疎水性アミノ酸への置換。
(A)第75番目のイソロイシンからアラニンへの置換(以下、「I75A」と称する場合がある);
(B)第116番目のフェニルアラニンからロイシンへの置換(以下、「F116L」と称する場合がある);
(C)第137番目のイソロイシンからバリンへの置換(以下、「I137V」と称する場合がある);
(D)第178番目のアスパラギンからアスパラギン酸への置換(以下、「N178D」と称する場合がある);
(E)第264番目のアスパラギンからセリンへの置換(以下、「N264S」と称する場合がある);
(F)第287番目のセリンからプロリンへの置換(以下、「S287P」と称する場合がある)。
1. 材料及び方法
1-1. Rluc由来のルシフェラーゼ変異体の作製
1-1-1. ランダム変異
Rluc遺伝子(配列番号3)を含むベクターpETlucを鋳型にして、フォワードプライマー5'-gTgCCgCgCggCAgCCATATg-3'(配列番号4)及びリバースプライマー5'-CgggCTTTgTTAgCAgCCggATCCTTA-3'(配列番号5)とGene tag (NIPPON GENE)を用いてエラープロンPCRによりRluc遺伝子領域を増幅した。配列番号3に示す塩基配列における当該Rluc遺伝子領域は、野生型Rluc遺伝子(配列番号1)と多少異なる(相同性99%)が、サイレント変異を有するものであり、同一の野生型Rluc(配列番号2)をコードするものである。
上記ベクターpETluc 50 ngを鋳型にして、Quik Change site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いてフォワードプライマー5'-gCgCggTgTATTgCACCAgACCTTATTgg-3'(配列番号6)とリバースプライマー5'-CCAATAAggTCTggTgCAATACACCgCgC-3'(配列番号7)によりRluc遺伝子にI75Aに相当する変異を導入した。得られたベクターを大腸菌から抽出し、塩基配列を確認した。
また、当該部位指定変異方法に準じて、ランダム変異で得られたRluc変異体以外のその他のRluc変異体も同様に作製した。
ルシフェラーゼの活性を、Luminescencer-PSN AB-2200を用いて測定した。サンプル5μl (0.4 ng)を295 μlの反応液(0.1 M リン酸カリウム緩衝液 (pH 7.6)、33 μMセレンテラジン-h、0.5 M 食塩、1.0 mM EDTA)に加え、25℃、10秒間の発光を計測した。
サンプル (0.1 mg/ml)を、15 mMトリス緩衝液 (pH7.8)、1 mM EDTA、0.2 M食塩で透析した後、30〜55℃で5分間暖めた。そのサンプルを5分間氷冷した後、活性測定を行った。コントロールとして4℃で保存した活性を100%にした。
また、Jasco J820Q4 spectropolarimeterにより円二色性スペクトロメトリーを測定した。0.2 mg/mlのサンプルを0.1 cmのセルに入れ、30℃/hの割合で温度を上昇させた。測定は220 nmで行った。
Thermal shift assaysを、StepOnePlus Real Time PCR System (Applied Biosystems)を用いて行った。これはタンパク質の変性による疎水基の露出を蛍光色素が結合することで測定することが出来る。サンプル(2 ng)を、2.5μlの250倍に希釈したProtein Thermal Shift Dye (Applied Biosystems)、2μlの有機溶媒(DMSOのみ4μl)、〜20μl 0.5 M食塩と1.0 mM EDTAを含んだ0.1 Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.6)に加え、氷上で1時間後、0.015℃/secで温度を上昇させながら測定した。
図1〜4において、略号は以下の通りである。WT:野生型Rluc、N264SS287P:N264S及びS287Pの置換を有するRluc変異体、F116LI137V:F116L及びI137Vの置換を有するRluc変異体、N178D:N178Dの置換を有するRluc変異体、I75A:I75Aの置換を有するRluc変異体、N264SS287PF116LI137V:N264S、S287P、F116L及びI137Vの置換を有するRluc変異体、N264SS287PF116LI137VN178D:N264S、S287P、F116L、I137V及びN178Dの置換を有するRluc変異体、m6:I75A、F116L、I137V、N178D、N264S及びS287Pの置換を有するRluc変異体。
Claims (7)
- 配列番号2に示されるアミノ酸配列において、以下の(A)〜(F)の全てのアミノ酸置換を含むアミノ酸配列から成り、ルシフェラーゼ活性を有し、且つ配列番号2に示されるアミノ酸配列から成るタンパク質と比較して高い熱安定性及び有機溶媒耐性を有する、ルシフェラーゼ変異体。
(A)第75番目のイソロイシンからアラニンへの置換;
(B)第116番目のフェニルアラニンからロイシンへの置換;
(C)第137番目のイソロイシンからバリンへの置換;
(D)第178番目のアスパラギンからアスパラギン酸への置換;
(E)第264番目のアスパラギンからセリンへの置換;
(F)第287番目のセリンからプロリンへの置換。 - 有機溶媒が-1.47〜1.29のlog Powを有する有機溶媒である、請求項1記載のルシフェラーゼ変異体。
- 有機溶媒が、酢酸エチル、1,4-ジオキサン、アセトニトリル、2-プロパノール、ジメチルホルムアミド、ビスエーテル、1,2-ジメトキシエタン、DMSO、ジエチレングリコール及びエチレングリコールから成る群より選択される、請求項2記載のルシフェラーゼ変異体。
- 請求項1〜3のいずれか1項記載のルシフェラーゼ変異体をコードする遺伝子。
- 請求項4記載の遺伝子を含む組換えベクター。
- 請求項5記載の組換えベクターを有する形質転換体。
- 請求項1〜3のいずれか1項記載のルシフェラーゼ変異体、請求項4記載の遺伝子、請求項5記載の組換えベクター及び請求項6記載の形質転換体から成る群より選択される構成成分を含む、ルシフェラーゼアッセイキット。
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