JP6441534B2 - 発光酵素タンパク質 - Google Patents
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Description
本発明は、発光酵素タンパク質に関する。
発光酵素（ルシフェラーゼ）とは、発光基質（ルシフェリン）を酸化する酵素の総称であり、その酸化過程において、発光を生ずるものである。発光酵素及び発光基質が関わる生物発光にはルシフェリン-ルシフェラーゼ型（LL型）、フォトプロテイン型、分子間エネルギー移動型、及び分子内エネルギー移動型の4つの類型が知られる（非特許文献１）。
LL型の場合は、発光基質と発光酵素とが反応し、基質が光のエミッターとなる。フォトプロテイン型では、発光基質がアポ型発光酵素に内在し、複合体を形成しており、例えば、カルシウムイオン濃度上昇等がトリガーとなって活性化され、基質が光のエミッターとなる。分子間エネルギー移動型は、LL型もしくはフォトプロテイン型を基本としながら、生み出された光が発光酵素−基質複合体の近傍にある蛍光タンパク質を励起し、長波長側へシフトした発光を起こす。分子内エネルギー移動型では、発光基質と発光酵素とが反応することで生じるエネルギーが発光酵素に内在する基質とは別のエミッターを励起し発光を起こす。
LL型のものは、最もシンプルな反応様式であり、レポーターアッセイや生体イメージング等への活用に向いており、実際、ホタル、ウミホタル、ヒカリコメツキムシ、鉄道虫等に由来するものが市販、利用されている。例えば、プロメガ社からは、ホタル発光系利用したシングルレポーターアッセイ系（特許文献１及び２）、ホタルとウミシイタケ発光系を組み合わせて利用したデュアルレポーターアッセイ系（特許文献３）、トゲオキヒオドシエビ（Oplophorus gracilirostris）分発光系を利用した低分子発光酵素による高発光型のレポーターアッセイ系（特許文献４、非特許文献２）などが販売されている。アトー社からは、ウミホタル分泌発光系を利用したハイスループット型レポーターアッセイ系が販売されている（非特許文献３、特許文献５）。New England BioLab社からは、カイアシ類ガウシア及びウミホタルのいずれも分泌型発光系を利用したルシフェラーゼアッセイ系が販売されている（非特許文献４）。東洋紡社からは、イリオモテボタル及び鉄道虫発光系を改変利用した単一発光酵素による同時３色レポーターアッセイ系（非特許文献５、特許文献６及び７）及びヒカリコメツキムシ発光系を利用した高安定性かつ高強度なレポーターアッセイ系（非特許文献６）が販売されている。
これらはいずれもLL型反応による生物発光を利用したものであり、甲虫類ではいわゆるホタルルシフェリンが発光基質として共通に利用され、ウミホタルにあっては、ウミホタルルシフェリンが、ガウシア及びウミシイタケにあってはいずれもセレンテラジンが発光基質として利用されている。ウミホタルルシフェリンとセレンテラジンとは異なる分子であるが、いずれもイミダゾピラジノン構造をその主たる骨格として持つ（非特許文献７及び８）。プロメガ社のトゲオキヒオドシエビ由来発光酵素には発光基質として新規に作製されたフリマジンが用いられるが、これもイミダゾピラジノン構造を有する分子である。
マルチレポーターアッセイ系は発光波長の異なる発光系を組み合わせることにより実現しているが、現在のところ利用可能な波長域は、ホタルルシフェリン系では５３０から６３０ nmであり、ウミホタルリシフェリン及びセレンテラジン系では４６０から４９０ nmである。一般に外洋性の発光生物は４５０から４９０ nmの最大発光波長を示すものが多く、陸棲のものは５５０から５８０ nmの最大発光波長を示すものが多い。一方で、５００ nm付近の発光は、頻度は低いものの沿岸性の発光生物において見られる（非特許文献９）。しかしながら、これまで、５００ nm付近の発光系は遺伝子クローニングの例がなく、従ってレポーターアッセイ系などで実用化されていない。特に、５１０ nm付近はこれまでに利用されている４９０ nmと５３０ nmとの中間に位置し、他の発光系と組み合わせて利用する上で有用性が高い波長域である。
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本発明は新規な発光酵素タンパク質を提供することを目的とする。
当業者らによって広く利用されている生物発光系は上記のごとくであり、発光基質、発光酵素及びその遺伝子、また発光反応によって生み出される発光波長は限られたものである。特に、酵素及び基質等の改変により発光スペクトル等の発光特性に改変が加えられているものを含めて、最大発光波長５１０nm付近の発光色を持つものは特定されておらず、その波長領域における全く新しい発光酵素及びその発光基質による生物発光系の開発が望まれている。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、シリス科ゴカイであるオドントシリス・ウンデシムドンタ由来の発光酵素タンパク質が５１０ｎｍ付近の発光色を有し、かつ、安定性、発光強度等種々の実用上重要な性質を有することを見出した。本発明は斯かる発見に基づいて更なる検討を重ねて完成したものである。
本発明は、以下の態様を包含する。
項１．下記いずれかの発光酵素タンパク質：
（i）配列番号２のアミノ酸配列を含む発光酵素タンパク質、
（ii）配列番号２のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸残基が置換、付加又は欠失したアミノ酸配列を含み、かつルシフェラーゼ活性を有する発光酵素タンパク質、
（iii）配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸を含む発光酵素タンパク質、
（iv）配列番号１０の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含む発光酵素タンパク質、
（v）配列番号１０の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、付加又は欠失した塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、かつルシフェラーゼ活性を有する発光酵素タンパク質、
（vi）配列番号１０の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含む発光酵素タンパク質、及び
（vii）配列番号１０の塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、かつルシフェラーゼ活性を有する発光酵素タンパク質。
（i）配列番号２のアミノ酸配列を含む発光酵素タンパク質、
（ii）配列番号２のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸残基が置換、付加又は欠失したアミノ酸配列を含み、かつルシフェラーゼ活性を有する発光酵素タンパク質、
（iii）配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸を含む発光酵素タンパク質、
（iv）配列番号１０の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含む発光酵素タンパク質、
（v）配列番号１０の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、付加又は欠失した塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、かつルシフェラーゼ活性を有する発光酵素タンパク質、
（vi）配列番号１０の塩基配列と７０％以上の同一性を有する塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含む発光酵素タンパク質、及び
（vii）配列番号１０の塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、かつルシフェラーゼ活性を有する発光酵素タンパク質。
項１−１．下記いずれかの発光酵素タンパク質：
（ii）配列番号２のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸残基が置換、付加又は欠失したアミノ酸配列を含み、かつルシフェラーゼ活性を有する発光酵素タンパク質、
（iii）配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上かつ１００％未満の同一性を有するアミノ酸を含む発光酵素タンパク質、
（v）配列番号１０の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、付加又は欠失した塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、かつルシフェラーゼ活性を有する発光酵素タンパク質、
（vi）配列番号１０の塩基配列と７０％以上かつ１００％未満の同一性を有する塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含む発光酵素タンパク質、及び
（vii）配列番号１０の塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、かつルシフェラーゼ活性を有する発光酵素タンパク質。
（ii）配列番号２のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸残基が置換、付加又は欠失したアミノ酸配列を含み、かつルシフェラーゼ活性を有する発光酵素タンパク質、
（iii）配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上かつ１００％未満の同一性を有するアミノ酸を含む発光酵素タンパク質、
（v）配列番号１０の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、付加又は欠失した塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、かつルシフェラーゼ活性を有する発光酵素タンパク質、
（vi）配列番号１０の塩基配列と７０％以上かつ１００％未満の同一性を有する塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含む発光酵素タンパク質、及び
（vii）配列番号１０の塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、かつルシフェラーゼ活性を有する発光酵素タンパク質。
項２．ピーク強度の発光波長が、４９０〜５３０ｎｍである、項１又は、項１−１に記載の発光酵素タンパク質。
項３．項１、項１−１又は２のいずれか１項に記載の発光酵素タンパク質をコードする核酸。
項３−１．イントロンを含まないｃＤＮＡである、項３に記載の核酸。
項４．項１又は２に記載の発光酵素タンパク質をコードする核酸を含む、遺伝子構築体。
項４−１．核酸がイントロンを含まないｃＤＮＡである、項４に記載の遺伝子構築体。
項５．項４又は項４−１に記載の遺伝子構築体が導入された細胞。
本発明により、新規な発光酵素タンパク質が提供される。本発明の好ましい態様においては、従来の発光酵素では達成できなかった、これまでに利用されている４９０ｎｍと５３０ｎｍとの中間、特に、５１０ｎｍ付近にピーク強度の発光波長を有する発光酵素タンパク質が提供され、それ単独での新たな発光系の構築が可能なことに加え、他の発光系と組み合わせて使用することで同時多色発光系を構築することができる。
本発明の発光酵素タンパク質（以下、単に「発光酵素」と記載する場合がある）は、下記の態様を包含する：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む発光酵素タンパク質、
（ii）配列番号２のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸残基が置換、付加又は欠失したアミノ酸配列を含み、かつ発光酵素活性を有する発光酵素タンパク質、
（iii）配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の相同性若しくは同一性を有するアミノ酸を含む発光酵素タンパク質、
（iv）配列番号１０の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含む発光酵素タンパク質、
（v）配列番号１０の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、付加又は欠失した塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、かつ発光酵素活性を有する発光酵素タンパク質、
（vi）配列番号１０の塩基配列と７０％以上の相同性若しくは同一性を有する塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含む発光酵素タンパク質、及び
（vii）配列番号１０の塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、かつ発光酵素活性を有する発光酵素タンパク質。
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む発光酵素タンパク質、
（ii）配列番号２のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸残基が置換、付加又は欠失したアミノ酸配列を含み、かつ発光酵素活性を有する発光酵素タンパク質、
（iii）配列番号２のアミノ酸配列と７０％以上の相同性若しくは同一性を有するアミノ酸を含む発光酵素タンパク質、
（iv）配列番号１０の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含む発光酵素タンパク質、
（v）配列番号１０の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、付加又は欠失した塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、かつ発光酵素活性を有する発光酵素タンパク質、
（vi）配列番号１０の塩基配列と７０％以上の相同性若しくは同一性を有する塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含む発光酵素タンパク質、及び
（vii）配列番号１０の塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、かつ発光酵素活性を有する発光酵素タンパク質。
なお、本明細書において「アミノ酸配列を含む」及び「塩基配列を含む」とは、全長アミノ酸配列若しくは全長塩基配列の一部に当該アミノ酸配列若しくは当該塩基配列を含む態様、及び、全長が実質的に当該アミノ酸配列若しくは当該塩基配列である当該アミノ酸配列若しくは当該塩基配列からなる態様（全長が当該アミノ酸配列若しくは当該塩基配列である、当該アミノ酸配列若しくは当該塩基配列のみからなる態様も含まれる）を包含する。
本発明における発光酵素活性とは、発光酵素と基質による酵素反応の活性を表し、基質が発光酵素との酵素反応によって励起状態になった後、基底状態に戻る際に発する光（発光スペクトル）を検出することによって測定される。基底状態に戻る際に発する光は、公知のルミノメータ（例えば、アトー社製AB-2350フェリオス、東洋紡社製カラフルックアナライザーなど）、スペクトロフォトメータ（例えば、アトー社製AB-1850ルミフルスペクトルキャプチャーなど）を用いて検出することができる。
上記（ii）において、置換、付加又は欠失する１又は複数のアミノ酸残基の数は、１以上の整数であれば特にとくに限定されない。例えば、１〜数十個程度、好ましくは１〜１５個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個程度、特に好ましくは１、２、３若しくは４個程度とすることができる。なお、当該態様は配列番号２のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸残基が置換、付加又は欠失しているため、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質は含まれない。
ある態様において、置換、付加又は欠失する１又は複数のアミノ酸残基の数は、配列番号２のアミノ酸配列とのアミノ酸配列の同一性が７０％以上となるように１〜９８個程度、好ましくは同一性が８０％以上となるように１〜６５個程度、より好ましくは同一性が９０％以上となるように１〜３２個程度、さらに好ましくは同一性が９５％以上となるように１〜１６個程度、特に好ましくは同一性が９８％以上若しくは９９％以上となるように１〜６個程度若しくは１〜３個程度とすることができる。
上記（iii）におけるアミノ酸配列の相同性若しくは同一性は、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上若しくは９９％以上とすることができる。アミノ酸配列の相同性若しくは同一性は、１００％未満とすることができる。アミノ酸配列間の相同性及び同一性は、ＢＬＡＳＴなどの公知のアルゴリズムを用いて決定することができる。
上記（v）において置換、付加又は欠失する１又は複数の塩基の数は、１以上の整数であれば限定されない。例えば、１〜数十個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１５個程度、さらに好ましくは１〜１０個程度、特に好ましくは１〜５個程度とすることができる。
ある態様において、置換、付加又は欠失する１又は複数の塩基の数は、配列番号１０の塩基配列とのアミノ酸配列の同一性が７０％以上となるように１〜２９６個程度、好ましくは同一性が８０％以上となるように１〜１９７個程度、より好ましくは同一性が９０％以上となるように１〜９８個程度、さらに好ましくは同一性が９５％以上となるように１〜４９個程度、特に好ましくは同一性が９８％以上若しくは９９％以上となるように１〜１９個程度若しくは１〜９個程度とすることができる。
上記（vi）における塩基配列の相同性若しくは同一性は、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上若しくは９９％以上とすることができる。塩基配列の相同性若しくは同一性は、１００％未満とすることができる。塩基配列間の相同性及び同一性は、ＢＬＡＳＴなどの公知のアルゴリズムを用いて決定することができる。
上記（vii）において「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが生じ、非特異的なハイブリダイゼーションが生じないような条件を言う。このような条件は、「１×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍ クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ ＮａＣｌ，０，２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中の４２℃でハイブリダイズさせ、さらに４２℃で０．５×ＳＳＣにより洗浄する」条件が、本発明のストリンジェントな条件の１例として挙げられるが、これに限定されるものではない。
本発明の発光酵素タンパク質は、天然由来のアミノ酸配列を有していても、天然由来のアミノ酸配列に改変を加えたアミノ酸配列を有していてもよい。本発明の一つの態様において、発光酵素は非天然（天然由来以外）のものである。
本発明の発光酵素が天然由来のアミノ酸配列を有する場合、本発明の好ましい態様の一つは、シリス科（Syllidae）のゴカイであるオドントシリス・ウンデシムドンタ（Odontosyllis undecimdonta）に由来する配列番号２に示すアミノ酸配列（３２９アミノ酸残基）及び配列番号１０に示す塩基配列（９８７塩基）がコードする発光酵素である。その他、オドントシリス・ウンデシムドンタ以外のシリス科（Syllidae）のゴカイ（特にオドントシリス（Odontosyllis）属のシリス科ゴカイ）に由来する、配列番号２に示すアミノ酸配列または配列番号１０に示す塩基配列がコードする発光酵素のホモログも本発明に含まれる。
発光酵素のホモログは、例えば、ウキゴカイ科（Alciopidae）、オヨギゴカイ科（Tomopteridae）、シリス科（Syllidae）、ゴカイ科（Nereidae）、ツバサゴカイ科（Chaetopteridae）、ミズヒキゴカイ科（Cirratulidae）、フサゴカイ科（Terebellidae）に由来するものであることができる。シリス科発光ゴカイとしては、カリフォルニアに産するオドントシリス・フォスフォレア、カリブ海に産するオドントシリス・エノプラ、富山に産するオドントシリス・ウンデシムドンタなどが例示される。
本発明の発光酵素は、天然由来の発光酵素に限定されず、天然由来の発光酵素のアミノ酸配列に改変が加えられた発光酵素（以下、単に「改変体」と記載する場合がある）であることもできる。改変の態様は、発光酵素がルシフェラーゼ活性を有する限り限定されない。
改変の態様としては、以下のものが例示されるが、これに限定されない。
例えば、発光スペクトル（例えば、最大吸収波長）、発光強度などの発光特性を天然型とは異なるものとするためのアミノ酸配列への改変が例示される。
また、a)余分な転写因子が結合しないように、塩基配列を変えること、b）天然型（すなわち、シリス科（Syllidae）ゴカイ）のコドンユーセージ（コドンの使用頻度の偏り）を所望の生物（例えば、ヒトなどの哺乳類、大腸菌などのバクテリア）のコドンユーセージに変えることなどの、発現細胞における発光酵素の翻訳効率を向上させ発現量を増大させるための塩基配列の改変も例示できる。さらには、使用上の制限となりうる塩基配列に含まれる制限酵素切断部位を変えることも例示される。
本発明の発光酵素には、天然由来のアミノ酸配列若しくはその改変体のＮ末端若しくはＣ末端に第２のタンパク質、シグナル配列、タグ配列などが結合した融合タンパク質も含まれる。また、天然由来のアミノ酸配列に含まれるシグナル配列の一部または全部を欠失させたアミノ酸配列からなる発光酵素であることもできる。
第２のタンパク質としては、本発明の発光酵素、及び、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質などの他の発光タンパク質；マルトース結合タンパク質などが例示される。
シグナル配列としては、PEST配列又はユビキチン又はこれらの生物学的に活性な断片又はこれらの変異体若しくは誘導体などのタンパク質不安定化シグナル；核局在化シグナル、膜局在化シグナル、細胞質局在化シグナミトコンドリア局在化シグナル、ＥＲ局在化シグナルなどの細胞内局在化シグナルなどが例示される。また、大腸菌等においてはペリプラズム分泌シグナルなどが例示される。
タグ配列としては、Hisタグ配列、FLAGタグ配列、Aviタグ配列などが例示される。
本発明の発光酵素は、好ましい実施態様において、ピーク（極大）強度の発光波長が、４９０〜５３０ｎｍ、好ましくは５００〜５２０ｎｍ、より好ましくは５０５〜５１５ｎｍ、特に好ましくは５１０ｎｍ程度である。従来このような極大（ピーク）波長を有する発光酵素は知られておらず、既知の発光酵素と組み合わせて、多色発光系を構築することができる。
本発明の発光酵素と組み合わせて用いる基質（発光基質）は、天然由来のもの又は人工的に合成した基質を使用することができる。天然由来の発光基質は、例えば実施例に記載のように、発光ゴカイ（例えば、オドントシリス・ウンデシムドンタ（Odontosyllis undecimdonta））を適当な温度の有機溶剤（例えば、メタノール、エタノール、ブタノール等のアルコール）、又は、発光ゴカイに内在する発光酵素を不活性化させるに十分な高温のバッファー溶液中で破砕し、遠心等の方法により、破砕物残渣と上清を分離することで、上清に発光基質を含む粗抽出液を得ることができる。人工的に合成する場合は、有機合成法により製造することができる。
本発明の発光酵素タンパク質は、天然由来のものを使用することも、人工的に製造したものを使用することもできる。
天然由来の発光酵素は、例えば実施例に記載のように、発光ゴカイ（例えば、オドントシリス・ウンデシムドンタ（Odontosyllis undecimdonta））を適当なバッファー溶液中で破砕し、遠心等の方法により、破砕物残渣と上清とを分離することで、上清に発光酵素を含む粗抽出液を得ることができる。なお、粗抽出液には発光基質も含まれるため、例えば発光アッセイに用いる場合は、抽出液に含まれる発光基質が発光反応によりほぼ完全に消費されるまで適宜保管することが好ましい。
天然由来の発光酵素は、破砕した抽出液から、必要に応じて粗精製若しくは精製して得ることができる。
人工的に製造した発光酵素は、細胞内において組換え体として合成した後に、精製することによって得ることができる。具体的な例として、文献：日本国特開２００６−５５０８２に記載された野生型ルシフェラーゼの製造法と同様の方法を参照して実施することが出来る。
本発明の発光酵素の製造において採用される宿主は、一般的にタンパク質の製造に用いられる宿主であれば特に限定されることはない。例えば、原核細胞（例えば、大腸菌）又は哺乳類、昆虫、植物等に由来する真核生物の細胞を宿主として使用することができる。昆虫、植物体などの生物個体そのものを宿主として発光酵素を製造させることもできる。
また、細胞を用いない無細胞発現系を用いて発光酵素を製造することもできる。
発光酵素の製造に使用するベクターとしては、宿主細胞において発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。大腸菌を宿主細胞として用いる際の具体的なベクターの例としては、pBluescript、pET21、pTrc99A、pCA24N、pUC18、pUC19、pBR322、pCold、pBadなどが挙げられる。好ましい態様の一つとして、はサプレッサーlacIqを含み、IPTGによって誘導可能なPT5-lacプロモーターを持つベクター群が挙げられる。また、別の好ましい態様として、低温誘導プロモーターやアラビノース誘導型プロモーターを持つベクター群が挙げられる。
発光酵素の製造に使用する発現ベクターの大腸菌への導入は、公知の方法を用いて実施することが可能であり、塩化カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。
該発現ベクターで形質転換された大腸菌の培養は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが、例示される。無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスターチ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また、所望により他の栄養素（例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。培養は、当業界において知られている方法により行われる。培養条件、例えば温度、培地のｐＨ及び培養時間は、本発明の、変異型ルシフェラーゼが大量に生産されるように適宜選択される。
本発明の、発光酵素は、上記培養により得られる培養物より以下のようにして取得することができる。すなわち、本発明のタンパク質が宿主細胞内に蓄積する場合には、遠心分離、ろ過などの操作により宿主細胞を集め、これを適当な緩衝液（例えば濃度が１０〜１００ｍＭ程度のトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液などの緩衝液。ｐＨは用いる緩衝液によって異なるが、ｐＨ５〜９程度（例えば、ｐＨ５．０〜９．０）の範囲が望ましい）に懸濁した後、用いる宿主細胞に適した方法で細胞を破壊し、遠心分離により宿主細胞の内容物を得る。一方、本発明のタンパク質が宿主細胞外に分泌される場合には、遠心分離やろ過などの操作により宿主細胞と培地を分離し、培養ろ液を得る。宿主細胞破壊液、または培養ろ液はそのまま、あるいは硫安沈殿と透析を行なった後に、本発明の発光酵素の精製、単離に供することができる。
本発明の、発光酵素は、Hisタグ、マルトース結合タンパク質などとの融合体として、Ni、Coなどの金属イオン（例えば、Hisタグを用いる場合）、アミロースなど（例えば、マルトース結合タンパク質を用いる場合）をリガンドとしたアフィニティカラムを利用して精製を行うことができる。アフィニティカラムとしては、例えば、Niセファロース、アミロース結合ゲル等を使用できる。
アフィニティカラムからの溶出は、イミダゾールを使用するのが好ましい。イミダゾールの濃度は、通常１００〜１０００ｍＭ程度、好ましくは２００〜３００ｍＭ程度である。
上記の発光酵素をコードする核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ（特に、ｍＲＮＡ））及び当該核酸を含む遺伝子構築体も本発明の態様に含まれる。また、上記の発光酵素をコードする核酸の相補鎖も本発明に包含される。本発明の核酸の具体例として、ｃＤＮＡが挙げられる。後述の実施例において説明するように、本発明のｃＤＮＡはイントロンを含まないため、天然には生じない。本発明の核酸は、一本鎖及び二本鎖のいずれであることができる。
本発明の遺伝子構築体の１つの好ましい態様において、遺伝子構築物には発光酵素をコードする核酸（以下、「発光酵素遺伝子」と記載する場合がある）及び発光酵素遺伝子の上流側にプロモーター配列が配置されている。好ましくは、プロモーターの活性に基づいて発光酵素遺伝子が発現可能に（「動作可能に」と換言することもできる）なるように、プロモーター配列と発光酵素遺伝子とが連結されている。プロモーターとしては、ＣＭＶ、βアクチンなどの恒常発現プロモーター、アッセイ対象遺伝子のプロモーターなどが例示される。プロモーターに替えて、プロモーターを挿入可能なクローニングサイトが配置されていることもできる。クローニングサイトは、１又は複数の制限酵素切断部位を有することができる。
本発明の遺伝子構築体の１つの好ましい態様において、翻訳を効率化するエレメント、ｍＲＮＡの安定化エレメントなどが配置されていることができる。翻訳を効率化するエレメントとしては、ｋｏｚａｋ配列（Ｋｏ）などが例示される。ｍＲＮＡの安定化エレメントとしては、β−ｇｌｏｂｉｎ ｉｎｔｒｏｎ ＩＩなどが例示される。さらにクローニングサイト（例えば、マルチクローニングサイト）、エンハンサ配列、ＩＲＥＳ配列、ポリＡ付加配列（例えば、SV40由来のポリＡ付加配列）、薬剤耐性遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ）など）などの選択マーカーが配置されていることもできる。
本発明の遺伝子構築体は、ベクター（組換えベクター）であることもできる。本発明のベクターは、例えば、発光酵素遺伝子又は上記の遺伝子構築物を適当な公知のベクターに挿入して得ることができる。本発明のベクターは、１つの態様においては、非天然の核酸配列を含むものである。この場合のベクターは、天然には生じない。ベクターは宿主内で複製可能なものであれば特に限定されず、例えばプラスミド、シャトルベクター、ヘルパープラスミド等が挙げられる。また該ベクター自体に複製能がない場合には、宿主の染色体に挿入すること等によって複製可能となるDNA断片であってもよい。
プラスミドDNAとしては、大腸菌由来のプラスミド(例えばpBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等）、枯草菌由来のプラスミド(例えばpUB110、pTP5等）、酵母由来のプラスミド(例えばYEp13等のYEp系、YCp50等のYCp系等）等が挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ等が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
上記の遺伝子構築体が導入された細胞（好ましくは、哺乳類細胞）も本発明の態様に含まれる。遺伝子構築体を細胞へ導入する方法としては、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、カチオニックリポソーム法などの化学的手法；アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、HVJリポソームなどの生物学的手法；エレクトロポレーション、DNA直接注射、遺伝子銃などの物理的手法などが例示される。導入する細胞に応じて、適切な導入方法を選択することができる。
遺伝子構築体は、導入された細胞のゲノム外に存在していることも（すなわち、一過的な遺伝子導入）、相同組換えなどにより細胞のゲノム中に挿入されている（染色体に組み込まれている）ことも（すなわち、安定的な遺伝子導入）できる。
哺乳類としては、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル、ブタ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌが挙げられ、好ましくはヒトである。
本発明の発光酵素とその発光基質との発光反応は、従来の発光酵素に準じて行うことができる。
本発明の発光酵素の好ましい態様においては、発光酵素はピーク（極大）強度の発光波長が４９０〜５３０ｎｍであり、相互に分別可能な光を発光する他の発光酵素（ルシフェラーゼ）と組み合わせて、多色発光系を構築することができる。ここで、「相互に分別可能」とは、例えばフィルター（カラーフィルター、バンドパスフィルターなど）を用いて相互の光の発光量の比率を測定可能であることを意味する。相互の光の発光量の比率を測定可能であるためには、フィルターの性能や各発光スペクトルのピーク形状にもよるが、最大発光波長が通常２０ｎｍ以上、好ましくは３０ｎｍ以上、より好ましくは４０ｎｍ以上、特に好ましくは５０ｎｍ以上離れているのが好ましい。この程度の最大発光波長の分離があれば、例えば各最大波長間のフィルターを使用し、フィルターの前後での各発光の透過率を測定して換算することで、各発光の発光量を同時に定量することができる。
組み合わせて使用することができるその他の発光酵素（ルシフェラーゼ）としては、鉄道虫由来の緑〜赤（その変異体を含む、最大発光波長：５３５〜６３５ｎｍ、例えば５４０〜６３０ｎｍ）のルシフェラーゼ；ヒカリコメツキムシのオレンジ〜緑（その変異体を含む、最大発光波長：５３０〜６００ｎｍ）のルシフェラーゼ；イリオモテホタルのオレンジ〜緑（その変異体を含む、最大発光波長：５５０〜５９０ｎｍ）のルシフェラーゼ；ウミホタル、ウミシイタケ、ガウシア、トゲオキヒオドシエビ由来の青（その変異体を含む、最大発光波長：４６０〜４９０ｎｍ）のルシフェラーゼなどが挙げられる。
本発明は、上記の発光酵素タンパク質、遺伝子構築体（例えば、ベクター）及び細胞からなる群から選択される少なくとも１つを含む生物発光に使用するためにキットをも提供する。本発明のキットは、さらに発光基質、細胞培養に用いるための培地、細胞破砕を行うための溶液（緩衝液）、発光反応を行うための溶液（緩衝液）を含めることができる。また、生物発光を行うための手順書を含めることもできる。
本発明のキットは、常法に従い、必要に応じて上記成分を備えることで作製することができる。
以下、本発明を、実施例を挙げてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１：発光ゴカイから抽出した発光酵素及び発光基質粗抽出液による発光反応
発光ゴカイ、オドントシリス・ウンデシムドンタ（Odontosyllis undecimdonta）は富山湾で採取し、ドライアイスにて凍結したのち、超低温フリーザにて保存したものを使用した。
発光ゴカイ、オドントシリス・ウンデシムドンタ（Odontosyllis undecimdonta）は富山湾で採取し、ドライアイスにて凍結したのち、超低温フリーザにて保存したものを使用した。
凍結ゴカイ５個体を２００ μLの５０ mM酸緩衝溶液（pH８．０）中で、ピペット先端で押しつぶすように破砕したのち、冷却微量高速遠心機にて相対重力２００００gにて４℃にて遠心し、上清を回収し、冷蔵庫にて一晩保管したものを発光酵素粗抽出液とした。また、凍結ゴカイ５０個体を１．５ mLの９９．５％エタノールに浸漬し、上記同様に遠心したのち、その上清を回収し、これを発光基質粗抽出液とした。
１００ μLの３００ mM塩化ナトリウム、２０ mM硫酸マグネシウムを含む５０ mMリン酸緩衝溶液（pH８．０）に、発光酵素粗抽出液５ μLのみを添加しルミノメーター（東洋紡社製CLX-101）にて測定したところ、測定開始から３０秒間以上にわたり相対発光光度（Relative Luminescent Units; RLU）として２０前後の数値を示した。この混合液にさらに発光基質粗抽出液２ μLを添加し、素早く混和しルミノメータにて測定したところ、測定開始から３０秒間以上に渡り１４万RLU前後の数値を示した。さらに、該発光酵素粗抽出液はセレンテラジン、ウミホタルルシフェリン、フリマジンといった既知の発光基質との間では交差反応活性を示さなかった。こうした結果から、オドントシリス・ウンデシムドンタの発光はLL型のものであり、さらに、その発光基質は既知のものとは構造を異にする可能性が強く示唆された。
実施例２：発光ゴカイ発光液に含まれる発光酵素の解析
従来行われてきたカラム等による精製を経て順次高純度の発光酵素を得る手法を適用するためには初発の試料を大量に確保する必要があり、今日的には現実的ではない。そこで、本発明者らは、鋭意検討を重ね、発光ゴカイの分泌する発光液中のタンパク質成分としては、発光酵素が極めて純度高く、かつ、多量に含まれており、精製の過程を経ずとも量及び質ともに十分な発光酵素の取得が可能であることを見出し、以下のとおり、発光液そのものから直接発光酵素を同定した。
従来行われてきたカラム等による精製を経て順次高純度の発光酵素を得る手法を適用するためには初発の試料を大量に確保する必要があり、今日的には現実的ではない。そこで、本発明者らは、鋭意検討を重ね、発光ゴカイの分泌する発光液中のタンパク質成分としては、発光酵素が極めて純度高く、かつ、多量に含まれており、精製の過程を経ずとも量及び質ともに十分な発光酵素の取得が可能であることを見出し、以下のとおり、発光液そのものから直接発光酵素を同定した。
発光ゴカイ、オドントシリス・ウンデシムドンタを軽く指先で刺激し、その発光液のみを回収し、SDS-PAGE法により該発光液中のタンパク質を分離し、クマシーブリリアントブルーにて染色後、約３２kDaンのタンパク質を含むゲル片をカッターナイフで切り出して回収した。図１にオドントシリス・ウンデシムドンタの発光液のSDS-PAGEによる泳動図を示す。
得られた断片をバッファーに添加し、発光基質粗抽出液を加えたところ、発光活性が認められ、該断片に発光酵素が含まれることが確認された。別途ゲル片を細断し５０％アセトニトリルを加え振とうして脱染色を行ったのち、２０ mM DTTを含む１００ mM酸水素アンモニウム水溶液に入れて５６℃にて３０分間反応させた。さらに１００ mM炭酸水素アンモニウム溶液を加え、２０分間振とうして溶液を捨てたのち、アセトニトリルを添加しゲル片を脱水し、次いで真空遠心機にて乾燥させた。乾燥ゲル片を０．２μgのトリプシンを含む１００ ｍM炭酸水素アンモニウム溶液にて膨潤させ、３７℃にて一晩おき、タンパク質の消化を行った。さらに、０．１５％トリフルオロ酢酸を含む５０％アセトニトリル溶液を加え２０分間振とうし、ペプチドの抽出を行った。ペプチド断片はミリポア社製ZipTip C18にて脱塩を行い、質量分析に供した。質量分析にはブルカー・ダルトニクス社製のultra TOF/TOFを用いた。
図２に質量分析の解析結果を示す。測定質量（m／z）が、９７０．５１５及び１０７５．４９３に強いピークが見られ、さらにMS／MS測定により、それぞれ、アスパラギン-バリン-バリン-プロリン-ロイシン-トリプトファン-セリン-アルギニン（NVVPLWSR、配列番号１１）及びトリプトファン-グルタミン酸-アスパラギン酸-トリプトファン-バリン-アスパラギン-アラニン-アルギニンのアミノ酸配列（WEDWVNAR、配列番号１２）を持つペプチド断片の存在が推定された。
実施例３：発光ゴカイ由来mRNAの解析及びcDNAのクローニング
発光ゴカイ、オドントシリス・ウンデシムドンタの凍結試料からTrizol試薬（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）を用いて、製品プロトコルに従って、トータルRNAを抽出し、MicroPoly(A) Purist Kit（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）を用いて、製品プロトコルに従って、mRNAを回収した。さらに、NEB社製NEBNext mRNA Library Prep Master Mix Set for Illuminaを用いて、製品プロトコルに従って、RNA-seq解析に供する試料ライブラリを作製した。試料ライブラリはイルミナ社製MiSeqにMiSeq Reagent Kit v3 (600-cycles)を装備してシーケンス解析に供した。得られた配列は国立遺伝学研究所の提供するNGS解析プラットフォームによって解析を行い、実施例２で得られたペプチド断片配列及びその類縁配列を含む単一のタンパク質をコードする可能性のある配列番号１に示す核酸配列を見出した。この配列は、１２５２塩基からなり、配列番号２に示す３２９残基からなるポリペプチドをコードするORF（Open Reading Frame）を持ち、そのほか５'UTRと予想される５７塩基及び３'UTRと予想される２０５塩基を有していた。
発光ゴカイ、オドントシリス・ウンデシムドンタの凍結試料からTrizol試薬（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）を用いて、製品プロトコルに従って、トータルRNAを抽出し、MicroPoly(A) Purist Kit（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社製）を用いて、製品プロトコルに従って、mRNAを回収した。さらに、NEB社製NEBNext mRNA Library Prep Master Mix Set for Illuminaを用いて、製品プロトコルに従って、RNA-seq解析に供する試料ライブラリを作製した。試料ライブラリはイルミナ社製MiSeqにMiSeq Reagent Kit v3 (600-cycles)を装備してシーケンス解析に供した。得られた配列は国立遺伝学研究所の提供するNGS解析プラットフォームによって解析を行い、実施例２で得られたペプチド断片配列及びその類縁配列を含む単一のタンパク質をコードする可能性のある配列番号１に示す核酸配列を見出した。この配列は、１２５２塩基からなり、配列番号２に示す３２９残基からなるポリペプチドをコードするORF（Open Reading Frame）を持ち、そのほか５'UTRと予想される５７塩基及び３'UTRと予想される２０５塩基を有していた。
該ORFを米国NCBIの提供するBLASTにより、約７７００万遺伝子配列を有するnon-redundantデータベースに対するホモロジー検索を行ったところ既知の発光酵素はヒットせず、さらに、保存されたドメインも有意な相同性を示す遺伝子も見出されず、最も高いE-valueを示したものはメキシカンテトラ（Astyanax mexicanus）のpredicted:CMRF35-like molecule 4-likeであり、その数値は2.3であった。
また、クローンテック社製SMART cDNA Library construction kit を用いて作製したオドントシリス・ウンデシムドンタ由来cDNAライブラリを鋳型に、配列番号３及び４のプライマ及びExTaq（タカラ社製）を用いて、９８℃にて１０秒、５５℃にて３０秒、７２℃にて１分のサイクルを３０回繰り返して行うPCRにより５'末端にNdeI、３'末端にXbaIの認識配列を付加した該ORF領域の増幅を行った。得られたDNA断片をpCR4.0-Topoベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に挿入し該ORF領域を有するプラスミドを取得した。
PCRプライマ：
catatgaagt tagcactgtt actcagc （配列番号３）
tctagactgt tgtaggttat acatctcagc （配列番号４）。
catatgaagt tagcactgtt actcagc （配列番号３）
tctagactgt tgtaggttat acatctcagc （配列番号４）。
実施例４：発光ゴカイ発光酵素をコードするゲノム領域の解析
発光ゴカイ、オドントシリス・ウンデシムドンタ凍結試料から、キアゲン社製DNeasy Plant mini Kitを用いて、製品プロトコルに従って、ゲノムDNAの精製を行った。得られたゲノムDNAを鋳型として、配列番号３及び４のプライマ及びExTaq（タカラ社製）を用いて９８℃にて１０秒、５５℃にて３０秒、７２℃にて６分のサイクルを３０回繰り返して行うPCRにより該生物がゲノムDNAに有する実施例３のcDNAをコードする領域を増幅した。得られたDNA断片をpCR4.0-Topoベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に挿入し該ゲノム領域を有するプラスミドを取得した。該プラスミドの塩基配列解析を行い、全長領域を解析した結果、ゲノム上では該cDNAは配列番号５に示す４８０４塩基のゲノムDNAに８つのオペロンとしてコードされていることが明らかとなった。
発光ゴカイ、オドントシリス・ウンデシムドンタ凍結試料から、キアゲン社製DNeasy Plant mini Kitを用いて、製品プロトコルに従って、ゲノムDNAの精製を行った。得られたゲノムDNAを鋳型として、配列番号３及び４のプライマ及びExTaq（タカラ社製）を用いて９８℃にて１０秒、５５℃にて３０秒、７２℃にて６分のサイクルを３０回繰り返して行うPCRにより該生物がゲノムDNAに有する実施例３のcDNAをコードする領域を増幅した。得られたDNA断片をpCR4.0-Topoベクター（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に挿入し該ゲノム領域を有するプラスミドを取得した。該プラスミドの塩基配列解析を行い、全長領域を解析した結果、ゲノム上では該cDNAは配列番号５に示す４８０４塩基のゲノムDNAに８つのオペロンとしてコードされていることが明らかとなった。
図３にオペロン構造の模式図を示す。表１〜４に配列番号５のゲノム配列とオペロン領域がコードする配列番号２のアミノ酸配列との対応関係を示している。なお、７番目と８番目とのオペロンの間にTTAでコードされるLeuがまたがって存在していると考えられる
実施例５：哺乳類細胞用ベクターの構築
実施例３で取得したプラスミドを鋳型として配列番号６及び７に示すプライマ及びKOD plus neo（東洋紡社製）を用いて９４℃にて２分処理したのち、９８℃にて１０秒、６８℃にて３０秒、のサイクルを３０回繰り返して行うPCRにより約１千塩基長の５'末端にHindIII、３'末端にSmaIの認識配列を付加したDNA断片を得た。この断片をHindIII及びSmaI（いずれもタカラ社製）にて処理し、アガロースゲル電気泳動により約１千塩基長のバンドをゲルから切り出し、精製した。一方で、哺乳類細胞発現用ベクターとして、pFLAG-CMV-２（シグマ・アルドリッチ社製）を用い、HindIII及びSmaI（いずれもタカラ社製）にて処理し、アガロースゲル電気泳動により４．７千塩基長のバンドを切り出し、精製した。得られたインサート断片及びベクター断片をタカラ社製DNA ligation kit<Mighty Mix>によりライゲーションを行うことで、発現用プラスミドpFLAG-GoLucを得た。さらに、このプラスミドからFLAG配列を除去したプラスミドを作製するために、配列番号８及び９に示すプライマ及びKOD plus neo（東洋紡社製）を用いて９４℃にて２分処理したのち、９８℃にて１０秒、６８℃にて３分、のサイクルを３０回繰り返して行うインバースPCRにより約５．７千塩基長のDNA断片を得た。得られた断片はT4 Polynuceotide kinase（東洋紡社製）にて5'末端をリン酸化したのち、DNA ligation kit<Mighty Mix>によりライゲーションを行うことで、発現用プラスミドpΔFLAG-GoLucを得た。
実施例３で取得したプラスミドを鋳型として配列番号６及び７に示すプライマ及びKOD plus neo（東洋紡社製）を用いて９４℃にて２分処理したのち、９８℃にて１０秒、６８℃にて３０秒、のサイクルを３０回繰り返して行うPCRにより約１千塩基長の５'末端にHindIII、３'末端にSmaIの認識配列を付加したDNA断片を得た。この断片をHindIII及びSmaI（いずれもタカラ社製）にて処理し、アガロースゲル電気泳動により約１千塩基長のバンドをゲルから切り出し、精製した。一方で、哺乳類細胞発現用ベクターとして、pFLAG-CMV-２（シグマ・アルドリッチ社製）を用い、HindIII及びSmaI（いずれもタカラ社製）にて処理し、アガロースゲル電気泳動により４．７千塩基長のバンドを切り出し、精製した。得られたインサート断片及びベクター断片をタカラ社製DNA ligation kit<Mighty Mix>によりライゲーションを行うことで、発現用プラスミドpFLAG-GoLucを得た。さらに、このプラスミドからFLAG配列を除去したプラスミドを作製するために、配列番号８及び９に示すプライマ及びKOD plus neo（東洋紡社製）を用いて９４℃にて２分処理したのち、９８℃にて１０秒、６８℃にて３分、のサイクルを３０回繰り返して行うインバースPCRにより約５．７千塩基長のDNA断片を得た。得られた断片はT4 Polynuceotide kinase（東洋紡社製）にて5'末端をリン酸化したのち、DNA ligation kit<Mighty Mix>によりライゲーションを行うことで、発現用プラスミドpΔFLAG-GoLucを得た。
PCRプライマ：
acaagcttat gaagttagca ctgttactc （配列番号６）
aacccgggtt actgttgtag gttatacat （配列番号７）
atgaagttag cactgttact c （配列番号８）
ggtagatcaa ttctgacggt t （配列番号９）。
acaagcttat gaagttagca ctgttactc （配列番号６）
aacccgggtt actgttgtag gttatacat （配列番号７）
atgaagttag cactgttact c （配列番号８）
ggtagatcaa ttctgacggt t （配列番号９）。
実施例６：哺乳類細胞を用いた発光ゴカイ組換え発光酵素の生産および活性測定
哺乳類細胞で生産した発光ゴカイ組換え発光酵素の発光活性を評価した。
哺乳類細胞で生産した発光ゴカイ組換え発光酵素の発光活性を評価した。
哺乳類細胞COS-1を6ウェルプレートに1ウェルあたり2.5×105細胞播種し、37℃、5％ CO2インキュベーター中で培養を行った。80%コンフルエントまで細胞が増殖した時に、Lipofectamine（登録商標）3000 (Thermo Fisher scientific)を用いて、実施例５で作成した発現用プラスミドpFLAG-GoLucおよびpΔFLAG-GoLucをそれぞれ4μgずつCOS-1に形質導入した。形質導入24時間後、PBSで細胞を洗浄し、無血清のDulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）2 mL を加え、インキュベーター中で20時間細胞培養を行った。培養上清を回収し、上清100μLにNaClおよびMgCl2をそれぞれ最終濃度230mM、15mMとなるように加えた混合液に、発光基質粗抽出液1μLを加え、30秒間の積算発光活性値を測定した。活性測定は、ATTO社のLuminescencer-Octa AB-2270を用いた。細胞は、無血清のDMEMで洗浄後、10mM Trisバッファーを加え超音波破砕を行った。破砕液を遠心して上清を回収し、上清100μL中の活性を測定した。
図４に結果を示す。培養上清で確認された発光活性はわずか１％程度で、生産された発光酵素のほとんどが細胞内に蓄積していることが示された。また、FLAGタグ付発現ベクターを導入した細胞では、タグなしの発現ベクターに比べ、約8分の1の発光活性を示した
実施例７：発光ゴカイ組換え発光酵素の発光スペクトルの測定
30μLの10mM Trisバッファーに、発光酵素粗抽出液1μLとNaClおよびMgCl2をそれぞれ最終濃度230mM、15mMとなるように加えた混合液に発光基質粗抽出液1μLを添加した
30μLの10mM Trisバッファーに、発光酵素粗抽出液1μLとNaClおよびMgCl2をそれぞれ最終濃度230mM、15mMとなるように加えた混合液に発光基質粗抽出液1μLを添加した
発光スペクトルは、ATTO AB1850 spectrophotometerを用いて測定を行った。測定は30秒間行った。
結果を図５上段に示す。図５上段に示すとおり、510nm付近に発光極大のあるスペクトルが得られた。
また、pΔFLAG-GoLucをCOS-1細胞に形質導入後、実施例6と同様にして調整した細胞破砕上清30μLにNaCl、MgCl2、発光基質粗抽出液を加えて測定した。
結果を図５下段に示す。発光酵素粗抽出液とほぼ同じ510nm付近に発光極大のあるスペクトルが得られた。発光ゴカイから抽出した発光酵素と動物細胞で生産した組換え発光酵素ともに、ほぼ同じ発光スペクトルを示した。
Claims (5)
- 下記いずれかの発光酵素タンパク質：
（i）配列番号２のアミノ酸配列を含む発光酵素タンパク質、
（ii）配列番号２のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸残基が置換、付加又は欠失したアミノ酸配列を含み、かつルシフェラーゼ活性を有する発光酵素タンパク質、
（iii）配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸を含む発光酵素タンパク質、
（iv）配列番号１０の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含む発光酵素タンパク質、
（v）配列番号１０の塩基配列において１又は複数の塩基が置換、付加又は欠失した塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、かつルシフェラーゼ活性を有する発光酵素タンパク質、及び
（vi）配列番号１０の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含む発光酵素タンパク質。 - ピーク強度の発光波長が、４９０〜５３０ｎｍである、請求項１に記載の発光酵素タン
パク質。 - 請求項１又は２に記載の発光酵素タンパク質をコードする核酸。
- 請求項１又は２に記載の発光酵素タンパク質をコードする核酸を含む、遺伝子構築体。
- 請求項４に記載の遺伝子構築体が導入された細胞。
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