ES2228730T3 - Fesfomevalonato cinasas de plantas. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para identificar principios activos herbicidas, en el que (a) se pone en contacto una fosfomevalonato cinasa vegetal con al menos un compuesto químico, (b) se compara la actividad enzimática de la fosfomevalonato cinasa en presencia del compuesto químico con la actividad de la fosfomevalonato cinasa en ausencia del compuesto químico, y (c) se determina el compuesto químico, en presencia del cual la actividad enzimática de la fosfomevalonato cinasa se inhibe.
Description
Fosfomevalonato cinasas de plantas.
La invención se refiere a ácidos nucleicos, que
codifican para polipéptidos vegetales con la actividad biológica de
fosfomevalonato cinasas, a los polipéptidos codificados a partir de
ellos, así como a su utilización como objetivo para herbicidas y a
su utilización para identificar nuevos compuestos eficaces como
herbicidas, así como al procedimiento para localizar moduladores de
estos polipéptidos.
El crecimiento de plantas no deseado puede
evitarse mediante la utilización de herbicidas. A este respecto, los
requisitos de un herbicida en cuanto a su eficacia, su coste y su
compatibilidad con el medio ambiente han aumentado de manera
constante. Por eso, existe una necesidad de nuevas sustancias, que
puedan desarrollarse para dar nuevos herbicidas potentes. En general
es habitual buscar este tipo de nuevas estructuras directrices en
pruebas de invernadero. Sin embargo, este tipo de pruebas son
intensivas en cuanto al trabajo y caras. La cantidad de sustancias
que pueden probarse en el invernadero está limitada de manera
correspondiente.
En las rutas de biosíntesis esenciales, se buscan
puntos de acción ventajosos para los herbicidas. Así, la biosíntesis
de isoprenoides en plantas conduce, entre otros, a la síntesis de
carotinoides así como de las cadenas laterales de la plastoquinona y
de la clorofila. Estos productos son indispensables para el
crecimiento fotosintético de las plantas. La inhibición de una etapa
en esta ruta de biosíntesis conduce a la terminación del crecimiento
de una planta. Además, a partir de isoprenoides se forman hormonas
vegetales como ácido giberélico, ácido abscísico y brasinoesteroide
y componentes de membrana (fitoesteroles), que también son
esenciales para el crecimiento de la planta.
El isopentildifosfato (IPP) es el punto de
ramificación a partir del cual se forman los diferentes
isoprenoides. Por tanto, la producción de IPP es un punto crítico en
el metabolismo vegetal. En las plantas, el IPP se produce por dos
rutas metabólicas distintas en diferentes compartimentos. En el
retículo endoplásmico (RE) y en el citosol, la síntesis de IPP
transcurre por la ruta metabólica clásica de acetato / mevalonato,
como también ocurre en el organismo animal. Por el contrario, en los
cloroplastos se sintetiza el IPP por la ruta metabólica alternativa
de gliceraldehído fosfato / piruvato. Ambas rutas metabólicas son
esenciales, ya que se forman distintos metabolitos isoprenoides en
los diferentes compartimentos. Además, aún no se ha aclarado en qué
medida son autónomas estas dos rutas metabólicas o tiene lugar un
intercambio de metabolitos entre los compartimentos (Heinze et
al., 1990, Kleinig, 1989).
La clomazona es un compuesto herbicida conocido
que disminuye el contenido de carotinoides y clorofila en la hoja.
Durante mucho tiempo se supuso que la clomazona actúa sobre la
inhibición de la ruta metabólica de los isoprenoides. Norman et
al. (1990) habían mostrado que el lugar de acción debería
situarse entre mevalonato y geranilgeranil pirofosfato. Esto fijaría
el lugar de acción sobre una de las cinco enzimas que se encuentran
entre lo anterior, de las cuales una es la fosfomevalonato cinasa.
Trabajos algo más nuevos de Weimer et al. (1992) y Rodney
Croteau (1992) indican que realmente el punto de acción de la
clomazona debe buscarse en otro sitio.
En el marco de la presente invención, se aisló un
ADNc de Arabidopsis thaliana cv. Columbia con homología con
la fosfomevalonato cinasa, en lo sucesivo abreviada por PMVK, de
Saccharomyces cerevisiae (figura 1). Este gen pudo inducirse
mediante tratamiento con el herbicida clorosulfurona (10 g/ha) en
Arabidopsis thaliana cv. Columbia.
La homología entre la PMVK de Saccharomyces
cerevisiae (= ERG8) y el ADNc aislado de A. thaliana
tenía un 44% de similitud o un 35% de identidad (véase la figura 1,
Bestfit (ajuste perfecto) con el paquete Wisconsin versión 10.1).
Esto se corresponde, por ejemplo, con la homología entre la
mevalonato cinasa de Saccharomyces cerevisiae y la mevalonato
cinasa de Arabidopsis thaliana con una similitud del 45% y
una identidad del 35%. Para la mevalonato cinasa de Arabidopsis
thaliana, la función pudo demostrarse mediante complementación
del mutante correspondiente de Saccharomyces cerevisiae.
Además, el ADNc aislado en el marco de la presente invención
presenta una identidad del 69% con una secuencia de PMVK parcial de
Pinus radiata según SEQ ID NO:5, que es interesante para la
modificación del contenido de isoprenoides, la composición de
isoprenoides y el metabolismo de los isoprenoides en plantas (WO
00/36 081). Otros ADNc parciales, vegetales (Medicago
trunculata, número de acceso AA660847, véase SEQ ID NO:3 y
Gossypium hirsutum, número de acceso AI727861, véase SEQ ID
NO:4) se han aislado como presuntas PMVK. En los bancos de datos se
encuentran a partir de diversos proyectos de secuenciación diversas
secuencias (secuencias EST y genómicas) de Arabidopsis spp.,
que se corresponden con la secuencia de PMVK aislada aquí o con
partes de ésta, sin embargo no se ofrecen datos sobre la función o
el significado de estas secuencias o fragmentos de secuencia.
La fosfomevalonato cinasa de Catharanthus
roseus también se ha descrito ya (Schulte et al. (1999):
"Purification and characterization of phosphomevalonate kinase
from Catharanthus roseus" Phytochemistry 52(6),
975-983) y se ha investigado la dependencia de la
actividad enzimática de la fosfomevalonato cinasa con respecto a
cationes.
Mediante la presente invención, se pone ahora a
disposición la secuencia completa de ADNc de una fosfomevalonato
cinasa vegetal y se describe su uso o el uso de los polipéptidos
codificados a partir de ella para la identificación de nuevos
principios activos herbicidas.
En el marco de la presente invención, se
describen por tanto ácidos nucleicos que codifican para la
fosfomevalonato cinasa vegetal completa, también las secuencias de
ácidos nucleicos parciales conocidas de Medicago trunculata
según SEQ ID NO:3, de Gossypium hirsutum según SEQ ID NO:4 y
de Pinus radiata según SEQ ID NO:5.
Así, en el marco de la presente invención, se
describen ácidos nucleicos que codifican para la fosfomevalonato
cinasa de Arabidopsis thaliana y que se describen en SEQ ID
NO:1 y/o que codifican para un polipéptido según SEQ ID NO:2 o
fragmentos activos del mismo.
En cuanto a estos ácidos nucleicos, se trata
especialmente de ácidos desoxirribonucleicos (ADN) o ácidos
ribonucleicos (ARN) de una cadena o de cadena doble. Las formas de
realización preferidas son fragmentos de ADN genómico que pueden
contener intrones y ADNc.
En cuanto a estos ácidos nucleicos, se trata
preferiblemente de fragmentos de ADN que se corresponden con el ADNc
de la planta Arabidopsis.
De manera especialmente preferida, los ácidos
nucleicos descritos en el marco de la presente invención engloban
una secuencia seleccionada de
a) la secuencia según SEQ ID NO:1,
b) secuencias que codifican para un polipéptido
que engloba la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:2,
c) secuencias parciales, con una longitud de al
menos 14 pares de bases, de las secuencias definidas en a) o b),
d) secuencias que hibridan con las secuencias
definidas en a) o b) a una temperatura de hibridación de
35-52ºC.
e) secuencias que presentan una identidad de al
menos el 70%, preferiblemente del 85%, prefiriéndose especialmente
del 90%, prefiriéndose de manera especialmente preferida una
identidad del 95% con las secuencias definidas en a),
f) secuencias que presentan una identidad de al
menos el 70%, preferiblemente del 80%, prefiriéndose especialmente
del 90%, prefiriéndose de manera especialmente preferida una
identidad del 95% con las secuencias definidas en b),
g) secuencias que son complementarias a las
secuencias definidas en a) o b), y
h) secuencias que debido a la degeneración del
código genético, codifican para la misma secuencia de aminoácidos
como las secuencias definidas en de a) a f).
En lo anterior, merecen una especial atención los
ácidos nucleicos que representan una molécula de ADNc con la
secuencia según SEQ ID NO:1.
La expresión fosfomevalonato cinasa
"completa" tal como se utiliza en el presente documento,
describe la fosfomevalonato cinasa que se codifica por una región de
codificación completa de una unidad de transcripción que empieza con
el codón de iniciación ATG y que engloba todas las zonas de exones
portadoras de información del gen que codifica para la
fosfomevalonato cinasa y que está presente en el organismo de
origen, así como las señales necesarias para una correcta
terminación de la transcripción.
El término "gen", tal como se utiliza en el
presente documento, es una designación para una porción del genoma
de una célula, que es responsable de la síntesis de una cadena
polipeptídica.
El término "hibridar", tal como se utiliza
en el presente documento, describe el proceso por el cual una
molécula de ácido nucleico de una única cadena lleva a cabo un
apareamiento de bases con una cadena complementaria. De esta manera,
partiendo de la información sobre secuencias publicada en el
presente documento, pueden aislarse, por ejemplo, fragmentos de ADN
de otras plantas distintas a Arabidopsis, que codifican para
las fosfomevalonato cinasas, que presentan propiedades iguales o
similares que las cinasas con la secuencia de aminoácidos según SEQ
ID NO:2.
El término "ADNc", tal como se utiliza en el
presente documento, es la designación para la copia de cadena
sencilla o doble de una molécula de ARN y por eso, como copia de
ARNm biológicamente activo, está libre de intrones, es decir, que
todas las regiones que codifican de un gen están contenidas en forma
continua.
Las condiciones de hibridación se calculan de
manera aproximada según la siguiente fórmula:
Temperatura de fusión Tf = 81,5ºC + 16,6
log[c(Na^{+})] + 0,41(%G + C)) – 500/n (Lottspeich y
Zorbas, 1998).
En lo anterior, c es la concentración y n la
longitud de la porción de secuencia que hibrida en pares de bases.
Para una secuencia >100 pb desaparece el término 500/n. Con la
máxima astringencia, se lava a una temperatura de
5-15ºC por debajo de la Tf y una fuerza iónica de 15
mM de Na^{+} (equivale a 0,1 x SSC). Si se utiliza una sonda de
ARN para hibridar, entonces el punto de fusión es unos
10-15ºC más elevado.
Las condiciones de hibridación preferidas se dan
a continuación:
Solución de hibridación: DIG Easy Hyb (empresa:
Roche)
Temperatura de hibridación:
35-52ºC, preferiblemente 42ºC
(ADN-ADN) o 50ºC (ADN-ARN).
Primera etapa de lavado: 2x SSC, 2 veces durante
5 min a temperatura ambiente;
Segunda etapa de lavado: 2 veces durante 15 min
en 1x SSC, a 50ºC; preferiblemente 0,5x SSC, a 65ºC; prefiriéndose
especialmente 0,2x SSC, a 65ºC.
El porcentaje de identidad de los ácidos
nucleicos se determina preferiblemente con ayuda del programa NCBI
BLASTN versión 2.0.14. (Altschul et al., 1997).
En el marco de la presente invención, se
describen además constructos de ADN que engloban uno de los ácidos
nucleicos mencionados anteriormente y un promotor homólogo o
heterólogo.
El término "promotor homólogo", tal como se
utiliza en el presente documento, se refiere a un promotor que
controla la expresión del gen correspondiente en el organismo de
origen.
El término "promotor heterólogo", tal como
se utiliza en el presente documento, se refiere a un promotor que
presenta otras propiedades que el promotor que controla la expresión
del gen correspondiente en el organismo de origen.
La selección de promotores heterólogos depende de
si se utilizan células procariotas o eucariotas o sistemas
acelulares para la expresión. Ejemplos de promotores heterólogos son
el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor para células
vegetales, el promotor de la alcoholdeshidrogenasa para células de
levadura, los promotores T3, T7 o SP6 para células procariotas o
sistemas acelulares.
Como vectores que contienen uno de los ácidos
nucleicos mencionados, una región reguladora o un constructo de ADN,
pueden utilizarse todos los fagos, plásmidos, fagémidos, fásmidos,
cósmidos, YAC, BAC, cromosomas artificiales o partículas utilizados
en los laboratorios de biología molecular que son adecuados para un
bombardeo de partículas.
Los vectores preferidos son pBIN (Bevan, 1984) y
sus derivados para células vegetales, pFL61 (Minet et al.,
1992) o por ejemplo, la serie de vectores p4Xxprom. (Mumberg et
al.) para células de levadura, los vectores pSPORT (empresa Life
Technologies) para células bacterianas, lambdaZAP (empresa
Strategene) para fagos o los vectores Gateway (empresa Life
Technologies) para diversos sistemas de expresión en células
bacterianas o en Baculovirus.
En el marco de la presente invención, también se
describen células huésped que contienen uno de los ácidos nucleicos,
constructos de ADN o vectores según la invención, mencionados
anteriormente.
El término "célula huésped", tal como se
utiliza en el presente documento, se refiere a células que no
contienen los ácidos nucleicos según la invención de manera
natural.
Son adecuadas como células huésped tanto células
procariotas, preferiblemente E. coli, como también células
eucariotas, como células de Saccharomyces cerevisiae,
Pichia pastoris, insectos, plantas, oocitos de rana y líneas
celulares de mamíferos.
En el marco de la presente invención, se
describen también polipéptidos con la actividad biológica de las
fosfomevalonato cinasas que se codifican por los ácidos nucleicos
mencionados anteriormente.
El término "polipéptido", tal como se
utiliza en el presente documento, se refiere tanto a cadenas cortas
de aminoácidos, que se designan normalmente como péptidos,
oligopéptidos u oligómeros, como también a cadenas largas de
aminoácidos, que se designan normalmente como proteínas. Engloba
cadenas de aminoácidos, que pueden modificarse mediante procesos
naturales, como el procesamiento postraduccional, o mediante
procedimientos químicos que son el estado de la técnica. Tales
modificaciones pueden producirse en diversos lugares y varias veces
en un polipéptido, como por ejemplo, en el esqueleto de los
péptidos, en la cadena lateral de los aminoácidos, en el extremo
amino-terminal y/o carboxi-terminal.
Engloban por ejemplo, acetilaciones, acilaciones,
ADP-ribosilaciones, amidaciones, enlaces covalentes
con flavinas, grupos hemo, nucleótidos o derivados de nucléotidos,
lípidos o derivados de lípidos o fosfatidilinositol, ciclaciones,
formaciones de puentes disulfuro, desmetilaciones, formaciones de
cistina, formilaciones, gamma-carboxilaciones,
glucosilaciones, hidroxilaciones, yodaciones, metilaciones,
miristoilaciones, oxidaciones, procesamientos proteolíticos,
fosforilaciones, selenoilaciones y adiciones de aminoácidos mediadas
por ARNt.
Estos polipéptidos pueden presentarse en la forma
de proteína "madura" o como partes de proteínas mayores, por
ejemplo como proteína de fusión. Además, pueden presentar secuencias
de secreción o "leader", prosecuencias, secuencias que
posibilitan una purificación fácil, como varios restos de histidina
o que presentan aminoácidos adicionales que estabilizan.
Estos polipéptidos, especialmente el polipéptido
según SEQ ID NO:2, no tiene que representar fosfomevalonato cinasas
vegetales completas, sino que pueden también ser fragmentos de
ellas, mientras que presenten al menos aún la actividad biológica de
la fosfomevalonato cinasa vegetal completa. Polipéptidos que
desempeñan una actividad biológica similar a una fosfomevalonato
cinasa con una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:2, también
se consideran relevantes. En lo anterior, estos polipéptidos no
tienen por qué derivarse de fosfomevalonato cinasas de
Arabidopsis. También se consideran con posibilidad de uso
polipéptidos, que se corresponden con fosfomevalonato cinasas o
fragmentos de éstas que todavía pueden desempeñar la actividad
biológica de éstas, por ejemplo de las siguientes plantas: tabaco,
maíz, trigo, cebada, avena, arroz, centeno, tomates, leguminosas,
plantas de patata, Lactuca sativa, otras brasicáceas, plantas
de tallo leñoso, Physcomitrella patens.
A diferencia de la región correspondiente de las
fosfomevalonato cinasas naturales, los polipéptidos pueden presentar
deleciones o sustituciones de aminoácidos, mientras que desempeñen
al menos todavía la actividad biológica de la cinasa completa. Se
prefieren las sustituciones conservadoras. Tales sustituciones
conservadoras engloban variaciones en las que un aminoácido se
sustituye por otro aminoácido del siguiente grupo:
1. Restos pequeños alifáticos, apolares o poco
polares: Ala, Ser, Thr, Pro y Gly;
2. Restos polares, cargados negativamente y sus
amidas: Asp, Asn, Glu y Gln;
3. Restos polares, cargados positivamente: His,
Arg y Lys;
4. Restos grandes alifáticos, apolares: Met, Leu.
Ile, Val y Cys; y
5. Restos aromáticos: Phe, Tyr y Trp.
La siguiente lista muestra las sustituciones
conservadoras preferidas:
En el marco de la presente invención, se
consideran por consiguiente también polipéptidos relevantes,
aquellos que desempeñan al menos la reacción bioquímica de la
formación de 5-pirofosfomevalonato a partir de
5-fosfomevalonato como la fosfomevalonato cinasa y
que engloban una secuencia de aminoácidos que presenta al menos el
60% de identidad, preferiblemente el 80% de identidad, prefiriéndose
especialmente el 90% de identidad, prefiriéndose más especialmente
el 97-99% de identidad, con la secuencia según SEQ
ID NO:2 sobre su longitud total.
El porcentaje de identidad de las secuencias de
aminoácidos se determina preferiblemente con ayuda del programa
BLASTP + BEAUTY versión 2.0.14. (Altschul et al., 1997).
Una forma de realización preferida de los
polipéptidos según la invención es la fosfomevalonato cinasa (PMVK)
con la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO:2.
La secuencia de aminoácidos de PMVK tiene en la
zona de los aminoácidos 177 a 186 un posible lugar de unión de ATP
típico para cinasas.
El término "actividad biológica de una
fosfomevalonato cinasa", tal como se utiliza en el presente
documento, significa la capacidad para transformar
5-fosfomevalonato en
5-pirofosfomevalonato con consumo de ATP y la
formación de ADP.
Los ácidos nucleicos mencionados anteriormente
pueden producirse de la manera habitual. Por ejemplo, las moléculas
de ácidos nucleico pueden sintetizarse de manera completamente
química. También se pueden sintetizar trozos cortos de los ácidos
nucleicos según la invención químicamente y marcar tales
oligonucleótidos radiactivamente o con un colorante de
fluorescencia. Los oligonucleótidos marcados también pueden
utilizarse para investigar los bancos de ADNc producidos a partir de
ARNm vegetal. Clones con los que hibridan los oligonucleótidos
marcados, se seleccionan para aislar los fragmentos de ADN
correspondientes. Después de la caracterización del ADN aislado, se
obtienen de manera sencilla los ácidos nucleicos descritos.
Los ácidos nucleicos también pueden producirse
mediante procedimiento de PCR utilizando oligonucleótidos
sintetizados químicamente.
El término "oligonucleótido(s)", tal
como se utiliza en el presente documento, designa moléculas de ADN
que están compuestas por de 10 a 50 nucleótidos, preferiblemente por
de 15 a 30 nucleótidos. Se sintetizan químicamente y pueden
utilizarse como sondas.
En el marco de la presente invención, también son
interesantes polipéptidos con actividad fosfomevalonato cinasa que
se codifican por un ADN mencionado anteriormente.
Es conocido para el experto que los polipéptidos
mencionados pueden obtenerse por diversas rutas, por ejemplo
mediante métodos químicos como el método en fase sólida. Para
obtener cantidades mayores de proteínas es aconsejable el uso de
métodos recombinantes. La expresión de un gen de fosfomevalonato
cinasa clonado o de fragmentos del mismo puede tener lugar en una
serie de células huésped compatibles, que son conocidas para el
experto. Con este fin, se introduce un gen de la fosfomevalonato
cinasa en una célula huésped con ayuda de métodos conocidos.
Preferiblemente, para la integración del gen de
fosfomevalonato cinasa clonado en el cromosoma de la célula huésped,
se introducen el gen o fragmentos del mismo en un plásmido y se
empalman funcionalmente las regiones que codifican del gen de
fosfomevalonato cinasa o fragmentos del mismo con un promotor
constitutivo o inducible.
Las etapas básicas para la producción de la
fosfomevalonato cinasa recombinante son:
1. Obtención de un ADN natural, sintético o
semisintético que codifica para la fosfomevalonato cinasa.
2. Introducción de este ADN en un vector de
expresión que sea apropiado para expresar la fosfomevalonato cinasa,
o bien sola o bien como proteína de fusión.
3. Transformación de una célula huésped
compatible, preferiblemente procariota, con este vector de
expresión.
4. Cultivo de estas células huésped transformadas
de una manera que es apropiada para expresar la fosfomevalonato
cinasa.
5. Recogida de las células y purificación de la
fosfomevalonato cinasa mediante métodos conocidos, adecuados.
En lo anterior, la región que codifica de la
fosfomevalonato cinasa puede expresarse en E. coli con los
métodos habituales. En el comercio, están disponibles sistemas de
expresión adecuados para E. coli, de la misma manera que los
vectores de expresión de la serie pET, por ejemplo, pET3a, pET23a,
pET28a con His-Tag o pET32a con
His-Tag para la purificación fácil y fusión de
tiorredoxina para aumentar la solubilidad de la enzima expresada,
así como pGEX con fusión de glutationsintetasa, así como los
vectores pSPORT. Los vectores de expresión se transforman en las
cepas de E. coli lisógenas de \lambda DE3, por ejemplo BL21
(DE3), HMS 174(DE3) o AD494(DE3). Después del cultivo
de las células en las condiciones habituales familiares para el
experto, se induce la expresión con IPTG. Tras la inducción de las
células, se incuba durante de 3 a 24 horas a temperaturas de desde
18 hasta 37ºC. Las células se disgregan mediante sonicación en
tampón de disgregación (fosfato de sodio de 10 a 200 mM, NaCl de 100
a 500 mM, pH de 5 a 8). La proteína expresada puede purificarse por
métodos cromatográficos, en el caso de proteína expresada con
His-Tag mediante cromatografía en una columna de
Ni-NTA.
La expresión de la proteína en cepas de levadura
disponibles comercialmente (por ejemplo, Pichia pastoris) o
en cultivos de células de insectos (por ejemplo, células Sf9)
representa otro planteamiento favorable.
Alternativamente, las proteínas también pueden
expresarse en plantas.
Objeto de la presente invención son
procedimientos para encontrar compuestos químicos que se unen a los
polipéptidos mencionados anteriormente y que cambian sus
propiedades. Debido a las funciones variadas de los terpenoides que
hacen necesaria la formación de su precursor
isopentil-difosfato y con ello la función de la
fosfomevalonato cinasa descrita anteriormente, los moduladores que
influyen la actividad de la enzima representan nuevos principios
activos herbicidas o reguladores del crecimiento. Los moduladores
pueden ser agonistas o antagonistas, a saber, activadores o
inhibidores.
En el marco de la presente invención, también se
describe el uso de fosfomevalonato cinasas vegetales como puntos de
acción para herbicidas y su uso en procedimientos para encontrar
moduladores de este polipéptido. En tales procedimientos, las
fosfomevalonato cinasas pueden añadirse directamente, en extractos o
de manera purificada, o formarse indirectamente a través de la
expresión del ADN que codifica para ello.
El uso de los ácidos nucleicos que codifican para
PMVK vegetal, de constructos de ADN que los contienen, de células
huésped que los contienen o de anticuerpos que se unen a la PMVK
para encontrar moduladores de la PMVK se describen en el marco de la
presente invención.
El término "agonista", tal como se utiliza
en el presente documento, se refiere a una molécula que acelera o
refuerza la actividad de la fosfomevalonato cinasa.
El término "antagonista", tal como se
utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula que
ralentiza o impide la actividad de la fosfomevalonato cinasa.
El término "modulador", tal como se utiliza
en el presente documento, representa el término genérico para
agonista o antagonista. Los moduladores pueden ser pequeñas
moléculas organoquímicas, péptidos o anticuerpos que se unen a los
polipéptidos descritos anteriormente. Además, los moduladores pueden
ser pequeñas moléculas organoquímicas, péptidos o anticuerpos que se
unen a una molécula que a su vez se une a estos polipéptidos y de
esta manera influye en su actividad biológica. Los moduladores
pueden representar sustratos y ligandos naturales, o miméticos
estructurales o funcionales. El término "modulador" no engloba
sin embargo los sustratos naturales como ATP.
Preferiblemente, en cuanto a los moduladores, se
trata de pequeños compuestos organoquímicos.
La unión de los moduladores a las fosfomevalonato
cinasas descritas anteriormente puede modificar los procesos
celulares de una manera que conduce a la muerte de la plantas
tratadas con ellos.
Los procedimientos según la invención incluyen
selección de alto rendimiento ("high throughput screening";
HTS). Para ello, pueden utilizarse tanto células huésped como
también preparaciones acelulares que contienen los ácidos nucleicos
descritos anteriormente y/o los polipéptidos descritos
anteriormente.
Para encontrar moduladores de los polipéptidos
mencionados anteriormente, puede incubarse una mezcla de reacción
sintética (por ejemplo, productos de la transcripción in
vitro) o un componente celular, como un extracto bruto de
célula, o cualquier otra preparación que contenga ese polipéptido,
junto con un sustrato o ligando marcado de los polipéptidos en
presencia y ausencia de una molécula candidata que puede ser un
agonista o antagonista. La capacidad de la molécula candidata para
aumentar o inhibir la actividad de un polipéptido descrito podrá
reconocerse por una unión elevada o disminuida del ligando marcado o
por una transformación elevada o disminuida del sustrato marcado.
Las moléculas que se unen bien y que conducen a una actividad
elevada de los polipéptidos son agonistas. Las moléculas que se unen
bien pero que no desencadenan la actividad biológica de los
polipéptidos son probablemente buenos antagonistas.
La detección de la actividad biológica de los
polipéptidos puede mejorarse mediante un denominado sistema
informador (sistema "reporter"). En este sentido, los sistemas
informadores engloban, pero no se limitan a, sustratos marcados
colorimétricamente que se transforman en un producto o un gen
informador (gen "reporter") que responde a variaciones de la
actividad o de la expresión de los polipéptidos u otras pruebas de
unión conocidas.
Los moduladores de los polipéptidos descritos
anteriormente pueden también encontrarse a través de pruebas
enzimáticas. Puede medirse la variación de la actividad enzimática o
bien directamente mediante moduladores correspondientes o bien
indirectamente en una prueba enzimática acoplada. La medición puede
realizarse por ejemplo, a través de la variación de la absorción
mediante la disminución o el aumento de un compuesto ópticamente
activo.
Otro ejemplo para un procedimiento con el que
pueden encontrarse moduladores de los polipéptidos descritos
anteriormente es una prueba de sustitución en la que, en condiciones
apropiadas para ello, se reúnen los polipéptidos y un posible
modulador con una molécula, que se une a estos polipéptidos de
manera conocida, como un sustrato o ligando natural o un mimético de
sustrato o de ligando. Los propios polipéptidos pueden marcarse, por
ejemplo radiactiva o colorimétricamente, de manera que la cantidad
de polipéptidos que se unen a un ligando o que han participado en
una transformación, puede determinarse de manera exacta. De esta
manera, puede medirse la eficacia de un agonista o antagonista.
Con ayuda del método de la "Supression
substractive hybridization" (Hibridación sustractiva por
supresión) (Diatchenko et al., 1996) se aisló varias veces un
fragmento de 370 pb de la PMVK de material de la hoja de las plantas
Arabidopsis thaliana cv. Columbia.
La "Supression substractive hybridization"
representa un método para aislar genes expresados de manera
diferencial. Las dos muestras que debían compararse eran por un
lado, plantas de Arabidopsis que se había recogido 24 horas
después de un tratamiento con un herbicida (clorosulfurona, 10 g/ha)
y por otro lado, plantas de Arabidopsis que se habían
recogido 24 horas después de un tratamiento de control. El fragmento
de PMVK de 370 pb se aisló de las plantas tratadas con
clorosulfurona, en las que la transcripción de la PMVK se había
inducido posiblemente mediante el tratamiento.
El fragmento obtenido se clonó en el vector pTAdv
(empresa Clontech) y se transformó en la cepa TOP10F' de E.
coli. El fragmento de la PMVK se utilizó además como sonda para
Northern Blot virtuales (empresa Clontech) y se usó como sonda para
aislar el ADNc completo de PMVK.
Se estudió una biblioteca de ADNc de
Arabidopsis de la empresa Life Technologies en un vector
plasmídico pSPORT con ayuda del kit Cloncapture de la empresa
Clontech según indicaciones del fabricante. Sin embargo, al
contrario de las indicaciones del fabricante, la marcación con
biotina del fragmento de PMVK utilizado como sonda se realizó no
mediante PCR sino con ayuda del kit Biotin High Prime de la empresa
Boehringer.
El ADN plasmídico enriquecido con PMVK se
transformó en células de E. coli y se sembró en placas
durante la noche. Las colonias obtenidas se analizaron mediante PCR
de colonias con cebadores específicos del gen de la PMVK y se
identificaron colonias positivas.
De las colonias positivas, se prepararon cultivos
con los métodos conocidos para el experto, se aisló el ADN
plasmídico y a continuación se secuenció el ADN.
Para comprobar una expresión diferencial de la
PMVK en reacción a la clorosulfurona, se realizaron los denominados
análisis virtuales de Northern Blot.
En un Northern Blot virtual, se produce ADNc a
partir de ARN completo con el método SMART de la empresa Clontech
(véanse las indicaciones del fabricante) y se amplifica con PCR. Se
utilizan solamente tan pocos ciclos de PCR que la amplificación se
encuentra todavía en la zona lineal de la PCR. En el presente caso
se mostró un óptimo entre 15 y 18 ciclos. El ADNc producido con
SMART se separa sobre un gel de agarosa según los métodos conocidos
para el experto, se transfiere sobre una membrana de nylon y se
hibrida con una sonda marcada con DIG. Este método permite la
investigación de la expresión incluso de genes solamente poco
expresados.
El resultado mostró una ligera inducción de la
expresión de PMVK mediante clorosulfurona.
Un posible sistema de prueba para identificar
moduladores de la fosfomevalonato cinasa se basa en la comprobación
de ADP de la prueba acoplada de piruvato cinasa / lactato
deshidrogenasa.
El fosfoenolpiruvato se transforma mediante la
piruvato cinasa en piruvato, a continuación éste se transforma en
lactato por la lactato deshidrogenasa con consumo de NADH. El
consumo de NADH puede seguirse por medio de la disminución de la
absorción a 340 nm.
En la reacción de la PMVK se forma ADP, que puede
comprobarse en el marco de las pruebas descritas. La influencia de
los moduladores de la PMVK sobre esta reacción puede determinarse
también mediante un aumento o disminución del contenido en ADP.
Determinación de la homología entre la
fosfomevalonato cinasa, según la invención, de A. thaliana
según SEQ ID NO:2 y de la fosfomevalonato cinasa conocida de S.
cerevisiae (BESTFIT) mediante ajuste perfecto (paquete Wisconsin
versión 10.1 (CGC)). La similitud era del 44%, la identidad del
35%.
SEQ ID NO:1
Secuencia de ácidos nucleicos que codifican para
la fosfomevalonato cinasa de A. thaliana.
SEQ ID NO:2
Secuencia de aminoácidos de la fosfomevalonato
cinasa de A. thaliana.
SEQ ID NO:3
Fragmento de ácidos nucleicos de Medicago
trunculata (supuesta PMVK) con el número de acceso AA
660847.
SEQ ID NO:4
Fragmento de ácidos nucleicos de Gossypium
hirsutum (supuesta PMVK) con el número de acceso AI 727861.
SEQ ID NO:5
Fragmento de ácidos nucleicos de Pinus
radiata (que codifica para PMVK según el documento WO
00/36081).
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<110> Bayer AG
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Fosfomevalonato cinasas de
plantas
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Le A 35 018
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2396
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (685) .. (2199)
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 505
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 611
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Medicago truncatula
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 728
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Gossypium hirsutum
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 571
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pinus radiata
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (3)
1. Procedimiento para identificar principios
activos herbicidas, en el que
(a) se pone en contacto una fosfomevalonato
cinasa vegetal con al menos un compuesto químico,
(b) se compara la actividad enzimática de la
fosfomevalonato cinasa en presencia del compuesto químico con la
actividad de la fosfomevalonato cinasa en ausencia del compuesto
químico, y
(c) se determina el compuesto químico, en
presencia del cual la actividad enzimática de la fosfomevalonato
cinasa se inhibe.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque,
(a) el ADP producido en la reacción de la
fosfomevalonato cinasa se transforma en ATP con ayuda de una
piruvato cinasa,
(b) el piruvato producido en lo anterior se
transforma en lactato con ayuda de una lactato deshidrogenasa con
consumo de NADH, y
(c) se observa el consumo del NADH mediante un
cambio en la absorción.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2,
caracterizado porque, en cuanto a la fosfomevalonato cinasa
vegetal, se trata de un polipéptido con la secuencia según SEQ ID
NO:2 o un polipéptido con al menos una identidad del 70% con la
secuencia según SEQ ID NO:2.
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