CN103940870A - 一种基于酶催化的细胞内嘌呤电化学检测方法 - Google Patents

一种基于酶催化的细胞内嘌呤电化学检测方法 Download PDF

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Abstract

一种基于酶催化的细胞内嘌呤电化学检测方法，它涉及一种细胞内嘌呤碱基的检测方法。本发明要解决采用现有技术无法获得细胞内核苷酸代谢过程中嘌呤单质含量的问题。本发明方法：一、绘制标准曲线：通过电化学检测仪得到电化学信号计算峰面积，绘制每个标准品标准曲线；二、裂解液的二次电化学检测：待检测细胞的裂解液经第一次电化学检测，得到黄嘌呤-鸟嘌呤混合信号峰和腺嘌呤-次黄嘌呤混合信号峰；加入黄嘌呤氧化酶溶液后经第二次电化学检测，得到鸟嘌呤信号峰和腺嘌呤信号峰；三、计算单嘌呤的含量：用加黄嘌呤氧化酶前得到的峰面积减去加黄嘌呤氧化酶后得到的峰面积，结合标准曲线，求出每种嘌呤碱基的含量。本发明用于细胞检测领域。

Description

一种基于酶催化的细胞内嘌呤电化学检测方法
技术领域
本发明涉及一种细胞内嘌呤碱基的检测方法，尤其涉及黄嘌呤氧化酶催化的细胞内嘌呤电化学检测。
背景技术
近十年新兴起的细胞电化学是基于电化学原理、实验方法与细胞分子生物学技术相结合的一个新的前沿领域，它通过检测细胞内具有电活性物质的电化学信号，反映其含量的变化。目前，虽然理论和方法还不完善，但凭借其简单、快速、灵敏、无毒、费用低等特点已成为细胞分析的一个重要手段。
作为一个新的研究领域，细胞的电化学响应机理还很不明确，2005年鞠熀先提出完整细胞伏安响应可能是细胞质中的鸟嘌呤快速通过细胞膜到达电极表面而产生的。并将此电化学信号用于抗癌药物的药敏试验。2009年，佳木斯大学武冬梅教授在《Studies on theorigin of the voltammetric response of the PC-3cell suspension》（Talanta,2009,78,602）一文中进一步确认，细胞悬浮液中检测到的0.7V左右的电化学信号为黄嘌呤和鸟嘌呤的混合信号峰。2012年，武冬梅课题组在《Detection of the cell viability and proliferation usingtwo-signal electrochemical method》（Analyst,2012,137,3230）一文中，采用离子液体/多壁碳纳米管修饰电极，首次在1.0V和0.7V左右检测出细胞的两个电化学信号峰，分别归属于鸟嘌呤/黄嘌呤的混合信号峰和腺嘌呤/次黄嘌呤的混合信号峰，并且证明此两个混合信号峰能够反映细胞活性，可用于抗癌药物的筛选。
虽然目前已能够检测出细胞的两个电化学信号峰，并将此两个电化学信号峰用于抗癌药物的药敏试验，然而此两个信号峰仍为黄嘌呤/鸟嘌呤和腺嘌呤/次黄嘌呤的混合信号峰，无法反映细胞内核苷酸代谢过程中嘌呤单质含量的变化，进而更精确地表现细胞的生理状态。
发明内容
本发明的目的是为了解决采用现有技术无法获得细胞内核苷酸代谢过程中嘌呤单质含量的问题，而提供了一种基于酶催化的细胞内嘌呤电化学检测方法。
本发明的一种基于酶催化的细胞内嘌呤电化学检测方法，按下述步骤实现：
一、标准曲线的绘制
将标准品配置成浓度为5×10-6mol/L～15×10-6mol/L的溶液，得到标准品溶液，使用电化学检测仪检测标准品溶液的电化学信号峰，经分析得到标准品的峰面积，绘制标准品标准曲线；
步骤一中所述的标准品为鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤或黄嘌呤氧化酶；
步骤一中所述的标准曲线以标准品的电化学信号峰面积为纵坐标，标准品的浓度为横坐标；
二、裂解液的二次电化学检测
①、向含有3×105个/皿～5×105个/皿待检测细胞的60mm培养皿中加入500μL的PBS缓冲溶液，然后在温度为45℃～55℃的条件下裂解25min～40min，得到裂解液B，将得到的裂解液B使用电化学检测仪进行第一次电化学检测，得到待检测细胞中黄嘌呤-鸟嘌呤的混合信号峰和腺嘌呤-次黄嘌呤的混合信号峰；
步骤二①中所述的PBS缓冲溶液是将17.5g～17.9g的Na2HPO4·12H2O和6.5g～6.8g的KH2PO4溶解到250mL的双蒸水中，混合均匀后得到的溶液，所述的PBS缓冲溶液pH值为7.0～7.4；
②、向裂解液B中加入1μL～5μL浓度为0.35U/mL～0.45U/mL黄嘌呤氧化酶标准品溶液，然后在温度为20℃～30℃的条件下孵育40min～48min，得到经酶催化反应后裂解液C，将得到的裂解液C使用电化学检测仪进行第二次电化学检测，得到待检测细胞中鸟嘌呤信号峰和腺嘌呤信号峰；
三、计算单嘌呤的含量
根据步骤二①得到的待检测细胞中黄嘌呤-鸟嘌呤的混合信号峰和腺嘌呤-次黄嘌呤的混合信号峰以及步骤二②得到的待检测细胞中鸟嘌呤信号峰和腺嘌呤信号峰，经分析得出黄嘌呤-鸟嘌呤的混合信号峰的峰面积、腺嘌呤-次黄嘌呤的混合信号峰的峰面积、鸟嘌呤信号峰的峰面积和腺嘌呤信号峰的峰面积；
将得到的黄嘌呤-鸟嘌呤的混合信号峰的峰面积与鸟嘌呤信号峰的峰面积做差得到黄嘌呤信号峰的峰面积；
将得到的腺嘌呤-次黄嘌呤的混合信号峰的峰面积与腺嘌呤信号峰的峰面积做差得到次黄嘌呤信号峰的峰面积；
由得到的单嘌呤的峰面积，再结合步骤一得到的鸟嘌呤标准品标准曲线、次黄嘌呤标准品标准曲线、腺嘌呤标准品标准曲线或黄嘌呤标准品标准曲线，得到裂解液B中次黄嘌呤的浓度、黄嘌呤的浓度、鸟嘌呤的浓度和腺嘌呤的浓度，最后通过裂解液B的体积分别计算出待检测细胞中鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤和腺嘌呤的含量。
本发明的有益效果：
1、现有技术中由于电极敏感性的限制，仅检测出细胞的两个电化学信号，分别是0.7V左右的黄嘌呤/鸟嘌呤混合信号峰以及1.0V左右的腺嘌呤/次黄嘌呤混合信号峰。而本发明所建立的酶催化检测细胞内嘌呤含量的方法，通过黄嘌呤氧化酶将次黄嘌呤催化黄嘌呤，再将黄嘌呤催化为尿酸，使细胞裂解液中的嘌呤碱基由四种减少到两种（分别为鸟嘌呤和腺嘌呤），两个电化学信号峰由混合峰变成单体峰，通过加酶前后电化学信号变化，分别求得四种嘌呤碱基含量。采用酶催化法，将混合信号变成单质信号，改变了电化学检测细胞中嘌呤含量的策略，突破了长期以来电化学仅能检测到两个混合嘌呤碱基电化学信号的限制，实现了细胞内四种嘌呤碱基含量的电化学法同时检测。
2、采用本发明的方法对细胞内四种嘌呤碱基含量测定的精度提高了5%～10%。
附图说明
图1实施例1黄嘌呤氧化酶催化法检测细胞内嘌呤含量的电化学图；其中，线1为MCF-7细胞裂解液的电化学曲线图；线2为MCF-7细胞裂解液与黄嘌呤氧化酶混合液的电化学曲线图的电化学曲线图；线3为黄嘌呤与次黄嘌呤混合液的电化学曲线图；线4为黄嘌呤、次黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶混合液的电化学曲线图；线5为鸟嘌呤、腺嘌呤与黄嘌呤氧化酶混合液的电化学曲线图；线6为鸟嘌呤与腺嘌呤混合液的电化学曲线图；线7为黄嘌呤氧化酶的电化学曲线图；线8为尿酸的电化学曲线图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式中一种基于酶催化的细胞内嘌呤电化学检测方法，按下述步骤实现：
一、标准曲线的绘制
将标准品配置成浓度为5×10-6mol/L～15×10-6mol/L的溶液，得到标准品溶液，使用电化学检测仪检测标准品溶液的电化学信号峰，经分析得到标准品的峰面积，绘制标准品标准曲线；
步骤一中所述的标准品为鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤或黄嘌呤氧化酶；
步骤一中所述的标准曲线以标准品的电化学信号峰面积为纵坐标，标准品的浓度为横坐标；
二、裂解液的二次电化学检测
①、向含有3×105个/皿～5×105个/皿待检测细胞的60mm培养皿中加入500μL的PBS缓冲溶液，然后在温度为45℃～55℃的条件下裂解25min～40min，得到裂解液B，然后将得到的裂解液B使用电化学检测仪进行第一次电化学检测，得到待检测细胞中黄嘌呤-鸟嘌呤的混合信号峰和腺嘌呤-次黄嘌呤的混合信号峰；
步骤二①中所述的PBS缓冲溶液是将17.5g～17.9g的Na2HPO4·12H2O和6.5g～6.8g的KH2PO4溶解到250mL的双蒸水中，混合均匀后得到的溶液，所述的PBS缓冲溶液pH值为7.0～7.4；
②、向裂解液B中加入1μL～5μL浓度为0.35U/mL～0.45U/mL黄嘌呤氧化酶标准品溶液，然后在温度为20℃～30℃的条件下孵育40min～48min，得到经酶催化反应后裂解液C，将得到的裂解液C使用电化学检测仪进行第二次电化学检测，得到待检测细胞中鸟嘌呤信号峰和腺嘌呤信号峰；
三、计算单嘌呤的含量
根据步骤二①得到的待检测细胞中黄嘌呤-鸟嘌呤的混合信号峰和腺嘌呤-次黄嘌呤的混合信号峰以及步骤二②得到的待检测细胞中鸟嘌呤信号峰和腺嘌呤信号峰，经分析得出黄嘌呤-鸟嘌呤的混合信号峰的峰面积、腺嘌呤-次黄嘌呤的混合信号峰的峰面积、鸟嘌呤信号峰的峰面积和腺嘌呤信号峰的峰面积；
将得到的黄嘌呤-鸟嘌呤的混合信号峰的峰面积与鸟嘌呤信号峰的峰面积做差得到黄嘌呤信号峰的峰面积；
将得到的腺嘌呤-次黄嘌呤的混合信号峰的峰面积与腺嘌呤信号峰的峰面积做差得到次黄嘌呤信号峰的峰面积；
由得到的单嘌呤的峰面积，再结合步骤一得到的鸟嘌呤标准品标准曲线、次黄嘌呤标准品标准曲线、腺嘌呤标准品标准曲线或黄嘌呤标准品标准曲线，得到裂解液B中次黄嘌呤的浓度、黄嘌呤的浓度、鸟嘌呤的浓度和腺嘌呤的浓度，最后通过裂解液B的体积分别计算出待检测细胞中鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤和腺嘌呤的含量。
本实施方式中步骤一中所述的电化学检测、步骤二①中所述的电化学检测和步骤二②中所述的电化学检测中所涉及的检测参数相同。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同之处是，步骤一中所述的电化学检测仪为三电极体系的电化学检测仪。其它参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二的不同之处是，步骤一中所述的三电极体系为离子液体/多壁碳修饰电极为工作电极、银/氯化银为参比电极和铂丝为对极。其它参数与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一的不同之处是，步骤二①中所述的PBS缓冲溶液是将17.9g的Na2HPO4·12H2O和6.8g的KH2PO4溶解到250mL的双蒸水中，混合均匀后得到的溶液，所述的PBS缓冲溶液pH值为7.4。其它参数与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一的不同之处是，步骤二①中所述的第一次电化学检测方法为循环伏安法或差示脉冲法。其它参数与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一的不同之处是，步骤二②中所述的第二次电化学检测方法为循环伏安法或差示脉冲法。其它参数与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一的不同之处是，步骤二①中所述的电化学检测仪为三电极体系的电化学检测仪。其它参数与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一的不同之处是，步骤二①中所述的三电极体系为离子液体/多壁碳修饰电极为工作电极、银/氯化银为参比电极和铂丝为对极。其它参数与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一的不同之处是，步骤二②中所述的电化学检测仪为三电极体系的电化学检测仪。其它参数与具体实施方式一至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一的不同之处是，步骤二②中所述的三电极体系为离子液体/多壁碳修饰电极为工作电极、银/氯化银为参比电极和铂丝为对极。其它参数与具体实施方式一至九之一相同。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例1：本实施例中一种基于酶催化的细胞内嘌呤电化学检测方法，按下述步骤实现：
一：标准曲线的绘制
将标准品配置成浓度为5×10-6mol/L的溶液，得到标准品溶液，使用电化学检测仪检测标准品溶液的电化学信号峰，经分析得到标准品的峰面积，绘制标准品标准曲线；
步骤一中所述的标准品为鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺嘌呤或黄嘌呤氧化酶；
步骤一中所述的三电极体系为离子液体/多壁碳修饰电极为工作电极、银/氯化银为参比电极和铂丝为对极；
二：裂解液的二次电化学检测
①、向含有5×105个/皿待检测细胞的60mm培养皿中加入500μL的PBS缓冲溶液，然后在温度为50℃的条件下裂解30min，得到裂解液B，然后将得到的裂解液B使用电化学检测仪采用三级电极体系进行第一次电化学检测，得到待检测细胞中黄嘌呤-鸟嘌呤的混合信号峰以及腺嘌呤-次黄嘌呤的混合信号峰；
②、向裂解液B中加入1μL浓度为0.45U/mL黄嘌呤氧化酶标准品溶液，孵育40min，得到经酶催化反应后裂解液C，将得到的裂解液C使用电化学检测仪采用三级电极体系进行第二次电化学检测，得到待检测细胞中鸟嘌呤信号峰和腺嘌呤信号峰；
步骤二①中所述的PBS缓冲溶液是由17.9g的Na2HPO4·12H2O和6.8g的KH2PO4溶解到250mL的双蒸水中，混合均匀后得到的溶液，所述的PBS缓冲溶液pH值为7.4；
步骤二①中所述的待检测细胞为MCF-7细胞（人乳腺癌细胞）；
三、计算单嘌呤的含量
根据步骤二①得到的待检测细胞中黄嘌呤-鸟嘌呤的混合信号峰以及腺嘌呤-次黄嘌呤的混合信号峰和步骤二②得到的待检测细胞中鸟嘌呤信号峰和腺嘌呤信号峰，经分析得出黄嘌呤-鸟嘌呤的混合信号峰的峰面积、腺嘌呤-次黄嘌呤的混合信号峰的峰面积、鸟嘌呤信号峰的峰面积和腺嘌呤信号峰的峰面积；
将得到的黄嘌呤-鸟嘌呤的混合信号峰的峰面积与鸟嘌呤信号峰的峰面积做差得到黄嘌呤信号峰的峰面积；
将得到的腺嘌呤-次黄嘌呤的混合信号峰的峰面积与腺嘌呤信号峰的峰面积做差得到次黄嘌呤信号峰的峰面积；
由得到的单嘌呤的峰面积，再结合步骤一得到的鸟嘌呤标准品标准曲线、次黄嘌呤标准品标准曲线、腺嘌呤标准品标准曲线或黄嘌呤标准品标准曲线，得到裂解液B中次黄嘌呤的浓度、黄嘌呤的浓度、鸟嘌呤的浓度和腺嘌呤的浓度，最后通过裂解液B的体积分别计算出待检测细胞中鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤和腺嘌呤的含量。
图1为本实施例黄嘌呤氧化酶催化法检测细胞内嘌呤含量的电化学图；其中，线1为MCF-7细胞裂解液的电化学曲线图；线2为MCF-7细胞裂解液与黄嘌呤氧化酶混合液的电化学曲线图的电化学曲线图；线3为黄嘌呤与次黄嘌呤混合液的电化学曲线图；线4为黄嘌呤、次黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶混合液的电化学曲线图；线5为鸟嘌呤、腺嘌呤与黄嘌呤氧化酶混合液的电化学曲线图；线6为鸟嘌呤与腺嘌呤混合液的电化学曲线图；线7为黄嘌呤氧化酶的电化学曲线图；线8为尿酸的电化学曲线图。
本验证试验中采用的酶催化法检测细胞内四种嘌呤碱基含量，从图1可以看出：步骤二①分别为0.7V左右的黄嘌呤/鸟嘌呤的混合信号峰（信号I）以及0.9V左右的腺嘌呤/次黄嘌呤混合信号峰（信号II）。向裂解液B中加入黄嘌呤氧化酶后，峰面积均减小，说明向裂解液B中加入的黄嘌呤氧化酶，黄嘌呤氧化酶将次黄嘌呤催化黄嘌呤，再将黄嘌呤催化为尿酸，使细胞裂解液中的嘌呤碱基由四种减少到两种，分别为鸟嘌呤和腺嘌呤，使混合信号峰变成了鸟嘌呤和腺嘌呤的嘌呤单体信号峰。利用此种酶催化反应，可以方便地检测到细胞中嘌呤单体的含量。
本实施例的实验结果：
本实施例通过向裂解液B中加入的黄嘌呤氧化酶将信号I的黄嘌呤和信号II的次黄嘌呤均氧化为尿酸，此催化反应在40min～48min内完成，与加黄嘌呤氧化酶前相比，信号I（黄嘌呤/鸟嘌呤混合信号峰）峰面积减少1.158×10-6，信号II（腺嘌呤/次黄嘌呤混合信号峰）峰面积减少9.58×10-6，说明信号I和信号II中的黄嘌呤和次黄嘌呤被黄嘌呤氧化酶氧化为尿酸，仅剩下鸟嘌呤和腺嘌呤的信号峰，通过数学处理，根据标准曲线，求出四种嘌呤的含量如下表。
表1加酶前后细胞中嘌呤含量变化
注：峰面积（黄嘌呤）=峰面积（黄嘌呤+鸟嘌呤）-峰面积（鸟嘌呤）；
峰面积（次黄嘌呤）=峰面积（次黄嘌呤+腺嘌呤）-峰面积（腺嘌呤）。

Claims (10)

1.一种基于酶催化的细胞内嘌呤电化学检测方法，其特征在于基于酶催化的细胞内嘌呤电化学检测方法，按下述步骤实现：
一、标准曲线的绘制
将标准品配置成浓度为5×10-6mol/L～15×10-6mol/L的溶液，得到标准品溶液，使用电化学检测仪检测标准品溶液的电化学信号峰，经分析得到标准品的峰面积，绘制标准品标准曲线；
步骤一中所述的标准品为鸟嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤或黄嘌呤氧化酶；
步骤一中所述的标准曲线以标准品的电化学信号峰面积为纵坐标，标准品的浓度为横坐标；
二、裂解液的二次电化学检测
①、向含有3×105个/皿～5×105个/皿待检测细胞的60mm培养皿中加入500μL的PBS缓冲溶液，然后在温度为45℃～55℃的条件下裂解25min～40min，得到裂解液B，将得到的裂解液B使用电化学检测仪进行第一次电化学检测，得到待检测细胞中黄嘌呤-鸟嘌呤的混合信号峰和腺嘌呤-次黄嘌呤的混合信号峰；
步骤二①中所述的PBS缓冲溶液是将17.5g～17.9g的Na2HPO4·12H2O和6.5g～6.8g的KH2PO4溶解到250mL的双蒸水中，混合均匀后得到的溶液，所述的PBS缓冲溶液pH值为7.0～7.4；
②、向裂解液B中加入1μL～5μL浓度为0.35U/mL～0.45U/mL黄嘌呤氧化酶标准品溶液，然后在温度为20℃～30℃的条件下孵育40min～48min，得到经酶催化反应后裂解液C，将得到的裂解液C使用电化学检测仪进行第二次电化学检测，得到待检测细胞中鸟嘌呤信号峰和腺嘌呤信号峰；
三、计算单嘌呤的含量
根据步骤二①得到的待检测细胞中黄嘌呤-鸟嘌呤的混合信号峰和腺嘌呤-次黄嘌呤的混合信号峰以及步骤二②得到的待检测细胞中鸟嘌呤信号峰和腺嘌呤信号峰，经分析得出黄嘌呤-鸟嘌呤的混合信号峰的峰面积、腺嘌呤-次黄嘌呤的混合信号峰的峰面积、鸟嘌呤信号峰的峰面积和腺嘌呤信号峰的峰面积；
将得到的黄嘌呤-鸟嘌呤的混合信号峰的峰面积与鸟嘌呤信号峰的峰面积做差得到黄嘌呤信号峰的峰面积；
将得到的腺嘌呤-次黄嘌呤的混合信号峰的峰面积与腺嘌呤信号峰的峰面积做差得到次黄嘌呤信号峰的峰面积；
由得到的单嘌呤的峰面积，再结合步骤一得到的鸟嘌呤标准品标准曲线、次黄嘌呤标准品标准曲线、腺嘌呤标准品标准曲线或黄嘌呤标准品标准曲线，得到裂解液B中次黄嘌呤的浓度、黄嘌呤的浓度、鸟嘌呤的浓度和腺嘌呤的浓度，最后通过裂解液B的体积分别计算出待检测细胞中鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤和腺嘌呤的含量。
2.根据权利要求1所述的一种基于酶催化的细胞内嘌呤电化学检测方法，其特征在于步骤一中所述的电化学检测仪为三电极体系的电化学检测仪。
3.根据权利要求2所述的一种基于酶催化的细胞内嘌呤电化学检测方法，其特征在于所述的三电极体系为离子液体/多壁碳修饰电极为工作电极、银/氯化银为参比电极和铂丝为对极。
4.根据权利要求1所述的一种基于酶催化的细胞内嘌呤电化学检测方法，其特征在于步骤二①中所述的PBS缓冲溶液是将17.9g的Na2HPO4·12H2O和6.8g的KH2PO4溶解到250mL的双蒸水中，混合均匀后得到的溶液，所述的PBS缓冲溶液pH值为7.4。
5.根据权利要求1所述的一种基于酶催化的细胞内嘌呤电化学检测方法，其特征在于步骤二①中所述的第一次电化学检测方法为循环伏安法或差示脉冲法。
6.根据权利要求1所述的一种基于酶催化的细胞内嘌呤电化学检测方法，其特征在于步骤二②中所述的第二次电化学检测方法为循环伏安法或差示脉冲法。
7.根据权利要求1所述的一种基于酶催化的细胞内嘌呤电化学检测方法，其特征在于步骤二①中所述的电化学检测仪为三电极体系的电化学检测仪。
8.根据权利要求7所述的一种基于酶催化的细胞内嘌呤电化学检测方法，其特征在于步骤二①中所述的三电极体系为离子液体/多壁碳修饰电极为工作电极、银/氯化银为参比电极和铂丝为对极。
9.根据权利要求1所述的一种基于酶催化的细胞内嘌呤电化学检测方法，其特征在于步骤二②中所述的电化学检测仪为三电极体系的电化学检测仪。
10.根据权利要求9所述的一种基于酶催化的细胞内嘌呤电化学检测方法，其特征在于步骤二②中所述的三电极体系为离子液体/多壁碳修饰电极为工作电极、银/氯化银为参比电极和铂丝为对极。
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