CN101329298A

CN101329298A - 一种在醇类溶液中测量甲醇浓度的方法及装置

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Publication number: CN101329298A
Application number: CNA2007101119126A
Authority: CN
Inventors: 巫鸿章; 钱瑞龙; 陈建孝; 林毕修平
Original assignee: Development Center for Biotechnology
Current assignee: Development Center for Biotechnology
Priority date: 2007-06-20
Filing date: 2007-06-20
Publication date: 2008-12-24

Abstract

本发明提供一种在醇类溶液中测量甲醇含量的方法及装置。本发明是以酶反应为基础的电化学甲醇检测用生物微传感器，并可针对真实酒类样品中甲醇的含量，进行快速且灵敏的检测，可达到省时省成本的效果，并大幅提升使用上的方便性。本发明可直接用于假酒的筛检，进而达到避免假酒中毒事件发生的目的。

Description

一种在醇类溶液中测量甲醇浓度的方法及装置

【技术领域】

本发明涉及一种检测醇类溶液中的甲醇含量的方法与装置，并尤其涉及利用双酵素系统检测酒类溶液中的甲醇含量的方法与装置。

【背景技术】

假酒中毒事件时有所闻，主要原因乃在于酒中掺入了高浓度甲醇，以致于有些人饮用后失明，甚至是死亡。甲醇又称木精或工业用酒精，常作为溶剂或许多其它工业上用途；甲醇也可用作燃料、制作私酒、油漆除去剂及变性剂，但真酒中也含有微量的甲醇。

甲醇在肝脏中因醇类脱氢酶的催化反应，逐步氧化为甲醛与甲酸。然而，甲醛毒性约为甲醇的33倍，甲酸则约为甲醇的6倍。急性甲醇中毒的症状主要有三：(1)中枢神经的抑制。(2)严重的代谢性酸中毒。(3)视神经变化。当甲醇中毒时，一般可给予摄取大量的乙醇，因乙醇可和甲醇竞争醇类脱氢酶，因而使身体有足够时间来排除未经变化的甲醇，同时阻止甲醇经代谢作用后产生甲醛及甲酸。因此真酒(乙醇)可治療假酒(甲醇)中毒。

目前有相当多量测酒中甲醇含量的测定方法，主要包括：比色/呈色法及气相层析法。其中最普偏使用的方法为铬变酸氧化呈色法，此法为农业化学家协会(Association of Official Agricultural Chemists，AOAC)公定标准方法。然而，此法有着必须严格的控制反应条件才能获得良好的定量结果，且检品中若存在醣类会导致分析结果产生正偏差的缺点。除此之外，此法样品需经过蒸馏等麻烦的前处理，分析一个样品需耗4小时以上，且使用的药品及试剂具有高毒性，对健康及环境的影响甚大，并不适合推广到一般大众。

气相层析法虽可对酒类样本提供各成份精确的检测，然而由于其前处理及分析步骤极为冗长；加以仪器本身价格昂贵、体积庞大，且需要经过专业训练的人员才能操作，导致检测成本过高，基本上并不符合贩卖商与一般大众实时筛检的需求。

生物传感器(biosensor)主要是由生物辨认组件及信号传输组件所构成。由传统酶电极的概念加以放大，目前举凡牵涉到生物催化与生物亲和力者都可在生物传感器的应用范围内。生物传感器更具有下列诸多的优点，可克服传统分析方法的缺失，因此深具发展潜力。生物传感器的优点包括：(1)经由固定化技术的应用，生物辨认组件可重复使用，降低成本；(2)生物辨认组件专一性高，可避免非标的物干扰；(3)操作简易；(4)灵敏度高，所需样品量低；(5)应答快速，降低分析时间；(6)数位信号输出，达到微小化，易携带，可用于现场检测。

有鉴于此，开发一个能够快速筛检甲醇浓度，同时兼具可携带、操作简便与廉价特性的生物微传感器(Micro-biosensor)，成为抑制假酒中毒事件扩散的利器。

目前市面上甲醇/乙醇快速检测仪器也属于生物传感器的种。其主要利用醇类氧化酶(Alcohol Oxidase，AOX)可氧化甲/乙醇，产生H₂O₂，进而利用外加电压(或结合过氧化酶)的模式，将H₂O₂氧化，释出电子，由产生的电流信号变化来量化甲/乙醇的浓度。此法主要的缺点在于醇类氧化酶除了可对甲醇作用之外，也同时可氧化乙醇，也即无法辨别甲/乙醇共存的情况，因此无法用于假酒的筛检。

NADH是生物细胞内的高还原性化合物，主要作为生物细胞内酶的辅酶(coenzyme)，提供酶反应必要的氢原子，然后氧化为NAD⁺。一般的氧化还原酶都需以NAD(H)作为辅酶，才能驱使反应的进行。恋臭假单胞菌(Pseudomonas putida)非麸氨基硫(glutathione-independent)相关的甲醛脱氢酶(formaldehydedehydrogenase，FDH)有着不需透过麸氨基硫作为辅酶，直接将NAD⁺(nicotinamide adenine dinucleotide)与甲醛转化成甲酸与高价NADH的优点。由于NADH具备高还原性，可广泛的应用在工业与民生用途之中。台湾专利申请号第096116235号专利，则透过对甲醛脱氢酶基因序列进行突变，造成胺基酸序列出现改变，达到提升酶活性与提升对基质专一性的效果，同时降低酶使用成本。

因此，本发明将分子生物技术与电化学式酶生物传感器的概念相结合，开发生物微传感器来检测液态或酒类样本中的甲醇/甲醛含量。应用本发明所生产的传感器产品可供检验单位、酒类贩卖商乃至于一般家庭民众直接用于市面上假酒的筛检，进而达到避免假酒中毒事件发生的目的。

【发明内容】

本发明的目的在于提供一种在(醇类)溶液中测量甲醇含量的方法，其包括：利用醇类氧化酶(AOX)将该溶液中的甲醇氧化成甲醛；在NAD⁺共同参与下，利用甲醛脱氢酶(FDH)将该甲醛氧化成甲酸，并将NAD⁺还原成NADH；并以一电子媒介物与该NADH发生反应，将该NADH氧化为NAD⁺，同时该电子媒介物经还原后进行自氧化反应而释出电子，形成氧化电流；再量测氧化电流，并将该所量测的电流代入预先建立的甲醇浓度与电流线性方程式中，以决定该溶液中的甲醇含量。

本发明的另一目的在于提供一种甲醇测量装置，其用于测量溶液中甲醇的含量，而该装置包括：一基板；位于该基板上的参考电极；位于该基板上且不接触至该参考电极的工作电极，而该工作电极包括工作区域，该工作区域中包括有醇类氧化酶、甲醛脱氢酶、以及电子媒介物以及位于所述基板上且不接触至所述参考电极与所述工作电极的活性区域，而该活性区域中包括有NAD⁺。

本发明的又一目的在于提供一种利用甲醇测量装置测量待测样品中的甲醇浓度的方法，而该方法包括：(1)用该甲醇测量装置接触起始电解质溶液，并测量该起始电解质溶液的起始电流值(Ii)；(2)加入预定量的待测样品至该起始电解质溶液中，并测量最终电流值(If)；(3)计算该起始电流值与该最终电流值的差异值(Ii-If)而得到ΔI值；(4)将该ΔI值代入预先建立的甲醇浓度与电流方程式中，以决定该样品中甲醇浓度。

本发明的优点在于提供结合分子生物技术、酶固定与电化学相关技术，利用改质过的甲醛脱氢酶提升其对于甲醛的专一性，因而应用于以酶反应为基础的电化学甲醇检测用生物微传感器，并可针对真实酒类样品中甲醇的含量进行快速且灵敏的检测，可达到实时且低成本传感器的目的，并大幅提升使用上的方便性。本发明的检测装置可直接用于假酒的筛检，进而达到避免假酒中毒事件发生的目的。并可供检验单位、酒类贩卖商，乃至于一般民众进行酒类质量的控管，达到人体健康维护的目的。

经由下述详述的说明书并参照相关图式，本发明在前述及其它相关目的、特征和优点会而更显清楚。

【附图说明】

图1用以说明依据本发明测量甲醇含量的方法。

图2用以说明依据本发明SPE电极的结构与例示尺寸。

图3A用以说明依据本发明针对固定浓度甲醇，未使用雷氏盐制备SPE电极连续测量甲醇含量的电流输出信号图。

图3B用以说明依据本发明针对固定浓度甲醇，使用雷氏盐制备SPE电极连续测量甲醇含量的电流输出信号图。

图4A至图4C用以说明依据本发明以不同的MB-RS∶碳胶比例固定，测试其在不同甲醇浓度下的电流差值图。

图5用以说明依据本发明针对不同比例AOX/FDH制备的电极，于相同NAD⁺与甲醇浓度条件下测量的电流输出信号图。

图6用以说明依据本发明将NAD⁺以不同体积加入待测溶液中，所得的甲醇对电流变化图。

图7A用以说明依据本发明针对不同浓度的NADH进行批次电流差值测量的NADH浓度与电流差值的关系图。

图7B用以说明依据本发明针对不同浓度的NADH进行连续式电流差值测量的NADH浓度与电流差值的关系图。

图8用以说明依据本发明利用三组不同批次制造的SPE电极量测甲醇浓度与电流输出信号关系图。

图9用以说明依据本发明在不同操作电压下，甲醇浓度与电流差值的关系图。

图10用以说明依据本发明针对大范围不同浓度的乙醇测量的电流输出信号变化图。

图11用以说明依据本发明固定乙醇浓度，不同浓度的甲醇测量的电流输出信号变化图。

图12用以说明依据本发明测量甲醇含量的流程图。

主要组件标记说明：

200SPE电极

202基板

204参考电极

206工作电极

208工作区域

210活性区域

212绝缘层

【具体实施方式】

如前所述，在现有技术中，甲醇生物检测方法主要是利用醇类氧化酶对甲醇催化产生H₂O₂，再借助外加电压氧化H₂O₂放出电子，产生电流来定量甲醇浓度。此方法的主要缺点在于醇类氧化酶不仅可催化甲醇，也对乙醇具有相同的催化能力，因而无法辨别甲醇与乙醇。也即此法并无法应用于假酒筛检。反观本发明为结合醇类氧化酶与甲醛脱氢酶的两种酶系统，并借助量测电子媒介物与NADH作用产生的氧化电流而测量甲醇含量的生物检测方法。

本发明利用结合醇类氧化酶与甲醛脱氢酶的两酶系统来取代在先前技术中所使用的单一醇类氧化酶做为生物辨认组件。请参见图1，其用以说明本发明测量甲醇含量的方法。首先，在步骤102中，利用醇类氧化酶将量测溶液中的甲醇氧化，产生甲醛与H₂O₂；在步骤104中，在NAD⁺共同参与下，利用甲醛脱氢酶将该甲醛氧化成甲酸，并将NAD⁺还原成NADH；在步骤106中，以一电子媒介物(例如麦尔多拉蓝)与该NADH发生反应，将该NADH氧化为NAD⁺；同时在步骤108中，该电子媒介物经还原后进行自氧化反应而释出电子，形成氧化电流；最后，再量测该氧化电流，并将该所量测的电流代入预先建立的甲醇浓度与电流线性方程式中，以决定该溶液中的甲醇含量，达到利用生物辨认组件来检测甲醇的目的。

上述所使用的电子媒介物，举凡可将NADH氧化者皆适用于本发明，例如：麦尔多拉蓝(Meldola Blue，MB，8-dimethylamino-2，3-benzophenoxazine)、普鲁士蓝(Prussian Blue，potassium hexacyanoferrate)、二氯酚靛基酚(dichlorophenolindopheno1)、对苯二酮(p-benzoquinone)、邻苯二胺(o-phenylenediamine)、3，4二羟苯甲醛(3，4-dihydroxybenzaldehyde)等。优选地，在本发明中使用麦尔多拉蓝做为电子媒介物。

上述该预先建立的甲醇浓度与电流线性方程式，为一标准参考的甲醇浓度与电流方程式，其是借助将本发明的方法测量不同已知甲醇浓度的溶液，并将该些甲醇浓度与所测量的电流关系建立一线性方程式而获得的。

本发明设计下列各实施例来证实检测甲醇含量的效果。实施例1用以说明SPE电极制备与酶固定方法。实施例2用以说明MB高水溶性与MB-RS比例对电流输出信号的影响。实施例3用以说明酶的最适化比例。实施例4用以说明NADH的浓度检量线。实施例5用以说明甲醇浓度与电流输出信号的关系。实施例6用以说明乙醇干扰的扣除。实施例7是结合以上实施例说明甲醇浓度量测步骤。此等实施例将会在下述中详尽讨论之。

除非另行定义，本发明在此所使用的所有技术和科学用语的含义是本领域技术人员所通常知晓的。本领域技术人员也能体会任何相似或相同在此所描述的方法和材料，也可使用于实施或测试本发明。

此外，在说明书和权利要求中使用的成分、反应条件、比例等表达数量的所有数字，除非另有指示，则以「约」字来修饰。在说明书和权利要求中数值参数的设定会改变本发明所需条件的近似值。

下述实施例说明本发明。实施例仅为示例性的且不应理解为本发明的限制。

实施例1 SPE电极制备与酶固定

在电极的制备方面，本发明可采用的电极材料，其包括：氧化铟、玻璃、金、白金、钯、石墨及碳黑等。在电极结构方面，无论是平板电极、实心针状电极或镂空针状电极，只要能够达到本发明的目的而不具有不良结果者均可应用在本发明；在电极表面处理上，优选以酸、碱、物理研磨或超音波处理得到干净的电极表面。本研究的实施例1以网印电极(screen printing electrode，SPE)作为一示范实施例。

本研究所采用的SPE电极购自泰博(巧瑩)科技股份有限公司，其结构如图2所示。SPE电极200包括一PVC材质的基板202；位于该基板202上的参考电极204；位于该基板202上且不接触至该参考电极204的工作电极206，而该工作电极206包括一工作区域208，该工作区域208中包括有醇类氧化酶、甲醛脱氢酶、以及一电子媒介物，以及位于该基板202上且不接触至该参考电极204与该工作电极206的活性区域210，而该活性区域210中包括有NAD+。最后再覆盖上一蓝色PVC绝缘层212。由图2中，可明显看出刻意放大工作区域208的面积，其主要的原因在于增加酶与电子媒介物的固定量，以提升电流输出信号，同时降低检测极限的下限。

在酶固定方面，先将SPE电极200以超音波震荡仪处理20分钟。接着，则须将醇类氧化酶、甲醛脱氢酶、以及一电子媒介物(在本实施例中为MB)固定至SPE电极200的工作区域208上。固定方法如下：首先将MB以CV模式电聚合至工作区域208上，再将一定活性单位比例的醇类氧化酶/甲醛脱氢酶(AOX/FDH)与10％的gelatin溶液相混合，取一定量滴至工作区域208上；最后，滴上2.5％的glutaraldehyde进行胶联，风干后作为测试用的电极。在电极制备过程中，本发明并未将NAD⁺与醇类氧化酶、甲醛脱氢酶、以及一电子媒介物一起固定至工作区域208上，而改采另外固定于活性区域210的分离模式，主要原因在于若为相同区域固定，NAD⁺本身极容易还原成NADH，进而影响电极保存期限、稳定性及再现性。

需要注意的是，虽然本实施例是将NAD⁺以独立方式设置于甲醇测量装置之上，但是本发明并不限于此种组态。为了达成本发明的甲醇测量功能，也可不将NAD⁺设置于甲醇测量装置，而改以其它方法将NAD⁺加入至待测溶液中，例如将含有NAD⁺的锭剂加入至待测溶液等，而仍然可以达成本发明的功能。然而可以了解的是，本实施例并非用以限制本发明的范畴。

实施例2 MB高水溶性与MB-RS比例对电流输出信号的影响

图3A是依据本发明针对固定浓度甲醇，使用SPE电极连续测量甲醇含量的情形。图3A中可明显看出随着测量次数增加氧化电流信号持续下降，同时量测管中的溶液颜色逐次由无色转成蓝色，也即MB溶解于量测溶液中所呈现的颜色。此等结果显示MB具有高水溶性，并且对于电极的稳定性影响极大。

为克服MB水溶性过高的问题，本发明先将0.1M的MB先与0.1M的雷氏盐(Reinecke salt)混合进行反应，生成水溶性低的MB-RS络合物沉淀，加以离心收集后，烘干约30分钟后，磨成粉末状，再与一定比例的碳胶混合后，直接黏合至工作区域208上。而后重复实施例1的步骤，将AOX与FDH固定在前述所制备SPE电极200的工作区域208上。而图3B为将此电极进行多次甲醇连续检测的电流信号图。由图3B中可看出此时电流信号变得相当稳定，同时在量测过程中溶液颜色变化缓和，也即解决MB高水溶性的问题。

图4A至4C是依据本发明以不同的MB-RS∶碳胶比例，将MB-RS固定至SPE电极200的工作区域208表面上，分别测试其在不同甲醇浓度下的电流差值图。图4A，其MB-RS∶碳胶的重量比例是5∶1。图4B，其MB-RS∶碳胶的比例为1∶1。图4C，其MB-RS∶碳胶的比例为1∶10。如图4A至图4C所显示，当MB-RS∶碳胶在1∶0.2至1∶10之间皆呈线性关系。当MB-RS∶碳胶的比例约为1∶10时，所制成的电极具有较佳的表现。

实施例3 酶之最适化比例

本实施例针对不同比例AOX/FDH制备的电极，于相同NAD⁺与甲醇浓度条件下测量其电流输出信号，结果如图5所示。电流输出信号502其AOX∶FDH的体积比为1∶20。电流输出信号504其AOX∶FDH的体积比为1∶10。电流输出信号506其AOX∶FDH的体积比为1∶5。电流输出信号508其AOX∶FDH的体积比为1∶1。在本实施例中NAD⁺添加量为1.3mg，而AOX活性浓度约为1020U/ml，FDH活性浓度约为550U/ml，将不同体积比例的活性浓度表列至表1中。当AOX∶FDH的活性比例约介于1U∶0.5～11U之间时，均能有效达成本发明所宣称的效果。需要注意的是，即使AOX∶FDH的活性比例约为1∶0.5U的条件下，FDH仍为过量反应，因此该活性比例范围应能进一步扩大。理论上，AOX∶FDH的活性比例约介于1∶0.1～1∶20之间应能达成本发明的目的。

表1

AOX∶FDH体积比	AOX∶FDH的活性浓度比例
AOX∶FDH体积比	AOX∶FDH的活性浓度比例	1∶20	1.02U∶11U
1∶10	1.02U∶5.5U	1∶20	1.02U∶11U
1∶10	1.02U∶5.5U	1∶5	1.02U∶2.75U
1∶1	1.02U∶0.55U	1∶5	1.02U∶2.75U

图6是NAD⁺以不同体积加入待测溶液中，其所检测得到的甲醇对电流变化图。图中显示对于不同浓度的NAD⁺其电流信号均呈线性，显示利用本发明的双酵素系统时，可允许的NAD⁺浓度范围并无特别限制，均可得到线性的测量结果。

实施例4 NADH的浓度检量线

本实施例的目的为确认本发明的甲醇测量方法所产生的氧化电流，会造成电流信号差值。首先，利用实施例1所制备的MB-RS SPE电极200，针对不同浓度的NADH进行电流差值测量，并以电流差值与NADH的浓度相关性作图，如图7A与图7B所示。图7A是采用批次测量模式进行，而图7B是采用连续式测量模式进行。「批次测量」的量测方法是每次测量完一组数据便将量测管中所有溶液更新，并将电极以二次去离子水清洗干净后，重新架设仪器后方进行下一个测量点。而「连续式测量」的量测方法是待电流信号平稳后，每隔一段时间连续加入不同浓度的NADH，用以探讨每一电极的可重复使用性及NADH浓度累积性。在批次测量时，每一个测量数据至少重复三次实验平均取得，连续式测量则为单一次的数据。由图7A与图7B可显示，无论是哪种测量模式，测量所得的电流差值均随着NADH浓度增加而上升。显示NADH确实可与SPE电极200的工作区域208上的MB作用，放出电子至工作电极206上，因而产生氧化电流，造成输出信号的变化。

实施例5 甲醇浓度与电流输出信号的关系

图8是以三组不同批次制造的SPE电极200量测甲醇浓度与电流输出信号关系图。由图8中显示，不同批次制备的SPE电极，在甲醇浓度介于0-300mg/L的情况下，电流输出信号的差值均会随着甲醇浓度增加而呈线性升高。整体观之，不同批次制造的SPE电极200的电流信号变化趋势均相当接近。

若在不同操作电压下，针对大范围的甲醇浓度进行检测，结果如图9所示。结果当操作电压在约在400mV时，当甲醇浓度约介于0-325mg/L，则电流输出信号差值是一线性关系。在本发明中，甲醇与电流输出信号相关式的线性范围约在0-300mg/L，参照现行酒中甲醇含量的管制标准为1,000-3,000mg/L，因此在进行真实酒品中甲醇浓度的筛检时，优选是以稀释的方法控制甲醇浓度落于此范围之内。也即在酒品筛检时至少需先将样品稀释约10倍，即可进行甲醇含量的检测。

实施例6 乙醇干扰的扣除

若比较甲醇与乙醇在相同浓度下(例如：20mg/L)的电流信号差值，甲醇为3.0×10^-7A而乙醇为2×10^-8A，此数据显示甲醇的电流输出信号高达乙醇者的数十倍，也即在本发明中所采用的FDH具有相当高的专一性。

为探讨乙醇的存在对本发明甲醇测量的影响，针对大范围不同浓度的乙醇测量其相对应电流输出信号变化，结果如图10所示。由图10可看出电流输出信号先随着乙醇浓度增加而快速升高，而当浓度高过1,000mg/L之后，电流信号的上升趋势变得极为缓和，甚至可视为定值。此定值表示，虽然本发明所使用的经改质甲醛脱氢酶对于甲醛具有高度专一性，但是由于酒类溶液中的乙醇浓度远高于甲醇浓度，因此经过醇类氧化酶所氧化的乙醛仍会产生一定的背景噪声。然而从图10也可以看出，当乙醇浓度高于1,000mg/L之后，此电流信号即趋于定值，而在一般酒类溶液中乙醇浓度至少大于1,000mg/L三到四个数量级，在此种情况下，可将乙醇的干扰信号视为定值而扣除。

图11是依据本发明在固定乙醇浓度的情况下，外加不同浓度(0-500mg/L)的甲醇进行电流输出信号的测量。由图11显示在甲醇浓度在0-300mg/L时，随着甲醇浓度的增加，其电流输出信号仍持续线性增加，也即甲、乙醇的电流差值具有加成性。此结果表示乙醇的存在，并不会影响甲醇信号的表现，也即可将乙醇电流信号扣除后，再行估算甲醇浓度。

实施例7 甲醇浓度测量步骤

图12是一测量甲醇含量的流程图。在步骤1202中，先将实施例1的SPE电极200置入量测管中，并将电位仪的工作电极与对电极的接头分别接于SPE电极200的相应位置上；在步骤1204中，在量测管中加入定量的电解质溶液(例如：PBS-KCl缓冲液)，待电极稳定后，在步骤1206中，测量该起始电解质溶液的起始电流值(Ii)；在步骤1208中，加入预定量的待测样品至该起始电解质溶液中，并测量最终电流值(If)；在步骤1210中，计算该起始电流值与该最终电流值的差异值(Ii-If)；在步骤1212中，将所述Ii-If值扣掉乙醇电流干扰值(Ie)而得到ΔI，其中所述乙醇电流干扰值为一定值，例如从图11所获得的定值；在步骤1214中，将该ΔI值代入预先建立的甲醇浓度与电流线性方程式中，以决定该样品中甲醇浓度。

而上述的甲醇浓度与电流线性方程式，是先加入不同已知浓度的甲醇(例如：0-300mg/L)，确定电极稳定后，计算甲醇加入前后氧化电流信号的差值，并利用此电流差值与已知的甲醇浓度做出变化图(例如图9)，得此电极的甲醇浓度检量线，以换算出甲醇浓度与电流线性方程式。

需要注意的是，虽然在本实施例中的ΔI值是先将乙醇干扰值扣除，然而如图11所示，此乙醇干扰值与甲醇信号具有加成性，因此也可不需先将乙醇干扰值扣除，而直接将Ii-If代入修正后的甲醇浓度与电流线性方程式(例如将乙醇干扰值的因素加入该线性方程式，或者在进行建立该线性方程式的实验时，即以高浓度的乙醇做为溶剂，以得到含有乙醇干扰值的线性方程式)，也可得到相同的结果。

上述实施例仅为示例性的且不应视为本发明的限制。上述教导可应用在其它类型装置。说明书内容旨在更详尽说明本发明，并不应以此限制本发明的权利要求。

Claims

1.一种在醇类溶液中测量甲醇含量的方法，其包括：

(1)利用醇类氧化酶将该溶液中的甲醇氧化成甲醛；

(2)在NAD⁺共同参与下，利用甲醛脱氢酶将该甲醛氧化成甲酸，并将NAD⁺还原成NADH；

(3)使电子媒介物与该NADH发生反应，将该NADH氧化为NAD⁺，同时该电子媒介物经还原后进行自氧化反应而释出电子，形成氧化电流；以及

(4)测量该氧化电流，并将该所量测的电流代入预先建立的甲醇浓度与电流线性方程式中，以决定该溶液中的甲醇含量。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述电子媒介物选自：麦尔多拉蓝、普鲁士蓝、二氯酚靛基酚、对苯二酮、邻苯二胺、3，4二羟苯甲醛及它们的混合物。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述醇类氧化酶∶甲醛脱氢酶的活性比例介于1∶0.1至1∶20之间。

4.一种甲醇测量装置，其用以在溶液中测量甲醇的含量，该装置包括：

基板；

参考电极，其位于该基板上；以及

工作电极，其位于该基板上且不接触至该参考电极，该工作电极包括工作区域，该工作区域中包括有醇类氧化酶、甲醛脱氢酶以及电子媒介物。

5.如权利要求4所述的甲醇测量装置，其中所述电子媒介物选自：麦尔多拉蓝、普鲁士蓝、二氯酚靛基酚、对苯二酮、邻苯二胺、3，4二羟苯甲醛及它们的混合物。

6.如权利要求5所述的甲醇测量装置，其中所述工作电极的所述工作区域还包括雷氏盐。

7.如权利要求6所述的甲醇测量装置，其中所述工作区域中的该电子媒介物为麦尔多拉蓝，该麦尔多拉蓝与所述雷式盐形成络合物，且该麦尔多拉蓝与雷氏盐的比例为1∶1。

8.如权利要求7所述的甲醇测量装置，其中所述工作电极的所述工作区域还包括碳胶。

9.如权利要求8所述的甲醇测量装置，其中所述碳胶∶该络合物的重量比例介于1∶0.2至1∶10之间。

10.如权利要求4所述的甲醇测量装置，其中还包括一活性区域，其位于所述基板上且不接触至所述参考电极与所述工作电极，且该活性区域中包括有NAD⁺。

11.如权利要求10所述的甲醇测量装置，其中所述活性区域邻近所述工作电极的工作区域。

12.如权利要求4所述的甲醇测量装置，其中所述工作区域中所述醇类氧化酶∶甲醛脱氢酶的活性比例介于1∶0.1至1∶20之间。

13.一种利用甲醇测量装置测量待测样品中的甲醇浓度的方法，该甲醇测量装置包括基板；参考电极，其位于该基板上；工作电极，其位于该基板上且不接触至该参考电极，该工作电极包括工作区域，该工作区域中包括有醇类氧化酶、甲醛脱氢酶以及电子媒介物；所述参考电极与所述工作电极分别连接至电位仪的对应终端，该方法包括：

(1)用该甲醇测量装置接触起始电解质溶液，并测量该起始电解质溶液的起始电流值(I_i)；

(2)在NAD⁺存在下，加入预定量的待测样品至该起始电解质溶液中，并测量最终电流值(I_f)；

(3)计算该起始电流值与该最终电流值的差异值(I_i-I_f)而得到ΔI值；

(4)将该ΔI值代入预先建立的甲醇浓度与电流线性方程式中，以决定该样品中甲醇浓度。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述甲醇测量装置还包括：活性区域，其位于所述基板上且不接触至所述参考电极与所述工作电极，该活性区域中包括有NAD⁺。

15.如权利要求13所述的方法，其中所述预先建立的甲醇浓度与电流线性方程式是预先以该甲醇测量装置测量具有不同已知浓度的甲醇溶液而建立。

16.如权利要求13所述的方法，其中所述甲醇浓度与电流线性方程式的线性范围在甲醇浓度介于0-300mg/L之间。

17.如权利要求13所述的方法，其中所述步骤(3)还包括：将所述I_i-I_f值减去乙醇电流干扰值(I_e)而得到ΔI；其中所述乙醇电流干扰值为一定值。