CN104345097B - 生物组织样品中2,3-吲哚醌的浓度的测定方法 - Google Patents
生物组织样品中2,3-吲哚醌的浓度的测定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104345097B CN104345097B CN201310333153.3A CN201310333153A CN104345097B CN 104345097 B CN104345097 B CN 104345097B CN 201310333153 A CN201310333153 A CN 201310333153A CN 104345097 B CN104345097 B CN 104345097B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- biological tissue
- sample
- tissue samples
- concentration
- indolinedione
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明涉及一种生物组织样品中2,3-吲哚醌的浓度的测定方法,包括：生物组织样品前处理步骤：在0～4℃下，按质量比1：（3～5）混合动物给予2,3-吲哚醌后采集的生物组织样品和生理盐水制得生物组织匀浆样品，然后按体积比为1：4混合所述生物组织匀浆样品和内标物甲醇溶液，涡旋30～90秒后离心取上清液；以及通过液相色谱-质谱联用分离经前处理的生物组织样品中的2,3-吲哚醌、并测定生物组织样品中2,3-吲哚醌的浓度的检测步骤。
Description
技术领域
本发明属于生物医药检测领域，涉及一种内源性活性化合物2，3-吲哚醌的生物体内组织器官样品(生物组织样品)中的浓度的测定方法。
背景技术
2,3-吲哚醌(2,3-Indolinedione，Isatin，ISA)，又名靛红，是近年发现存在于人和动物体内的一种内源性活性因子，具有多种生物活性。
液相色谱与质谱联用技术(LC-MS)，尤其是其中的液相色谱-大气压电离质谱联用技术(LC-API-MS)，是目前分析生物样品中痕量物质的首选。它兼具了液相色谱与质谱两种技术的优点，具有高灵敏度和专一性，，并大大缩短分析时间。
目前，已有报道的2,3-吲哚醌测定方法有ECL、GC-MS、LC-MS以及HPLC等方法，这些方法大多样品前处理复杂，有些需要对生物样品进行多步纯化处理，实验操作过程比较繁琐，而且样品分析时间较长，被用于2,3-吲哚醌的体内药代动力学研究中大批生物样品的分析测试方法还很少，且存在以上问题，因此在处理药代动力学研究中所产生的大量样品就需要开发高通量的快速分析方法，特别是样品前处理简便、检测手段灵敏的快速分析方法。例如中国专利CN102735764A公开一种血浆中利巴韦林含量的测定方法，该方法使用较为简便的血浆预处理方法，并使用LC-MS法检测，灵敏度较高。但是目前关于生物组织样品中2,3-吲哚醌浓度的快速简便灵敏的测定方法还鲜有报道。
发明内容
基于2,3-吲哚醌的临床前药代动力学研究中存在的生物样品浓度分析方法中的问题，本发明的目的在于提供一种高通量快速检测生物组织样品中2,3-吲哚醌浓度的一种液质联用分析方法。
在此，本发明提供一种生物组织样品中2,3-吲哚醌的浓度的测定方法，包括：
生物组织样品前处理步骤：在0～4℃下，按质量比1：(3～5)混合动物给予2,3-吲哚醌后采集的生物组织样品和生理盐水制得生物组织匀浆样品，然后按体积比为1：4混合所述生物组织匀浆样品和内标物甲醇溶液，涡旋30～90秒后离心取上清液；以及
通过液相色谱-质谱联用分离经前处理的生物组织样品中的2,3-吲哚醌、并测定生物组织样品中2,3-吲哚醌的浓度的检测步骤；
其中，液相色谱条件包括：色谱柱为XBridgeC18,5μm，2.1×50mm；色谱流动相A为浓度为0.1％甲酸水溶液，流动相B为浓度为0.1％甲酸甲醇，以流动相A先减少后增加且流动相B先增加后减少的双梯度进行洗脱；
质谱条件包括：质谱扫描类型为正离子多反应监测；离子源为电喷雾离子源；雾化气压力为40psi；气体流速为8L／min；毛细管电压为5500V；离子源温度为550℃，内标法定量。
本发明通过甲醇蛋白沉淀法处理生物组织样品，用液相色谱质谱联用仪器分析生物组织样品中2,3-吲哚醌的浓度。因此，本发明的方法具有前处理简便、检测手段灵敏专一、检测速度快的优点。本发明的方法的准确度、精密度及检测限符合生物样品分析方法学验证要求，能够满足2,3-吲哚醌的药代动力学研究中生物组织样品的浓度测定需要。
本发明中，生物组织样品可为脾脏、心脏、胃、肾脏、肺、肌肉、睾丸、胰腺和／或脂肪，此时生物组织样品和生理盐水的质量比可为1：3。
本发明中，生物组织样品还可为肝、脑样、卵巢、子宫、前列腺、大肠、小肠、皮肤和／或膀胱，此时生物组织样品和生理盐水的质量比可为1：5。
在所述生物组织样品前处理步骤中，所述内标物甲醇溶液优选为50ng／mL的奎硫平甲醇溶液。
在所述检测步骤中，所述液相色谱条件还包括：柱温为为40℃、自动进样器温度为4℃、流速为500μL／min、进样量为1μL。
又，在所述检测步骤中，液相色谱的洗脱梯度可为：
| 进样时间(分钟) | 流动相A(体积百分含量，％) | 流动相B(体积百百分含量，％) |
| 0 | 95 | 5 |
| 0.50 | 35 | 65 |
| 1.50 | 35 | 65 |
| 1.51 | 95 | 5 |
| 3.0 | 95 | 5 |
在所述检测步骤中，所述质谱条件还包括：用于定量分析的离子对为：2,3-吲哚醌：148→65.1；奎硫平：384.1→253.1。
本发明中，所述测定方法的最低检测限为10ng/mL。能够满足于低含量2,3-吲哚醌的检测。
本发明中，所述测定方法的相对误差和相对标准偏差均在15％以内，重现性和可靠性较高，具有较高的稳定性。
具体实施方式
以下，结合下述实施方式和具体的实施例进一步说明本发明。应理解这些实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明。
本发明提供了一种高通量快速检测生物组织中2,3-吲哚醌浓度的一种液质联用分析方法，涉及：(1)生物组织样品前处理方法；(2)生物组织样品中2,3-吲哚醌标准曲线的制备；(3)液相色谱分离方法；(4)质谱检测方法；(5)结果的计算。
本发明通过甲醇蛋白沉淀法处理生物组织样品，用液相色谱质谱联用仪器分析生物组织样品中2,3-吲哚醌的浓度。本方法的准确度，精密度及检测限符合生物样品分析方法学验证要求，能够满足2,3-吲哚醌的药代动力学研究中生物样品的浓度测定需要。
作为一个示例，本发明的方法可涉及以下方面。
(1)生物组织样品的前处理：
取生物组织样品与生理盐水混合均匀，制得生物组织匀浆样品，再与内标物甲醇溶液(例如喹硫平甲醇溶液)混合，涡旋30～90秒后离心取上清液。整个前处理过程在4℃(或冰上(约为0～4℃))下进行。生物组织样品可以是从哺乳动物(例如大鼠或犬)中取出的生物组织，将其直接置于冰上进行上述前处理，也可以将从哺乳动物中取出的新鲜生物组织预先保存在-80℃冰箱中，需要用的时候从-80℃冰箱中取出样品，在4℃(或冰上(约为0～4℃))自然溶化后涡旋30秒后再与内标溶液混合。所述生物组织基质包括大鼠和犬的生物组织，大鼠的尿，粪，胆汁及组织器官(脑、心、肺、肝、胃、脾、肾、骨骼肌、腹部脂肪、睾丸(卵巢)、子宫、膀胱、胰腺、小肠、大肠、皮肤和前列腺)，但不限于以上内容。
在优选的示例中，从冰箱中取出生物样品(-80℃)，其中血浆和脑脊液在4℃(冰上)自然溶化涡旋30秒，脾脏、心脏、胃、肾脏、肺、肌肉、睾丸、胰腺和脂肪样品按1：3的比例加入生理盐水后匀浆，肝、脑样、卵巢、子宫、前列腺、大肠、小肠及膀胱样品按1：5的比例加入生理盐水后匀浆；取50μL血浆、脑脊液或生物组织匀浆样品至1.5mL离心管中，加入200μL内标溶液(50ng／mL喹硫平甲醇溶液)，涡旋60秒后离心5分钟(离心力12880g，4℃)；以上操作均在冰上进行，取上清液100μL至Agilent色谱进样小瓶中。
(2)2，3-吲哚醌的定量分析标准曲线样品的配制：
a)2,3-吲哚醌储备液(StockA)的配制：精密称取2,3-吲哚醌标准品1.30mg，置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度为260μg／mL的2,3-吲哚醌储备液(StockA)，储存在4℃冰箱中待用；
b)2,3-吲哚醌标准溶液的配制：将2,3-吲哚醌储备液(StockA)用50％甲醇稀释到200μg／mL，然后用50％甲醇逐级稀释，配制成2,3-吲哚醌浓度为100，50，20，10，2，1，0.5，和0．2μg／mL的标准溶液，如表1，其中表1中的CSS表示标准曲线样品添加溶液(CalibrationStandardSpikingSolution)；
表1，2,3-吲哚醌标准溶液配制：
c)2,3-吲哚醌标准曲线样品的配制：
将步骤b)所得的2,3-吲哚醌标准溶液各10μL平行加入到190μL大鼠空白组织匀浆液中，制得2,3-吲哚醌浓度为5000，2500，1000，500，100，50，25和10ng／mL的标准曲线样品如表2，其中STD表示标准曲线样品(CalibrationStandardSample)，
表2，2,3-吲哚醌标准曲线样品配制：
(3)质控样品的配制：
a)2,3-吲哚醌储备液(StockB)的配制：精密称取2,3-吲哚醌标准品1.355mg，置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度为271μg／mL的2,3-吲哚醌储备液(StockB)，作为2,3-吲哚醌质控储备液，储存在4℃冰箱中待用；
b)2,3-吲哚醌质控溶液的配制：将320μμL2,3-吲哚醌储备液(StockB)和222μL甲醇混合，得2,3-吲哚醌浓度为160μg／mL的高质控样品添加液(QSS-High)。将高质控样品添加液(QSS-High)用甲醇稀释，配制成2,3-吲哚醌浓度为80和1.2μg／mL的质控溶液，如表3，其中QSS表示质控样品添加溶液(QualityControlSpikingSolution)，
表3，质控溶液配制：
c)2,3-吲哚醌质控样品的配制：将步骤b)所得的质控标准溶液各10μL平行加入到190μL空白大鼠组织匀浆液中，制得2,3-吲哚醌浓度为4000，2000和30ng／mL的质控样品，如表4，其中QC表示质控样品(QualityControlSample)，然后各取50μL分别加至至1.5mL离心管中，加入200μL内标溶液(50ng／mL喹硫平甲醇溶液)，涡旋60秒后离心5分钟(离心力12880g，4℃)；取上清液100μL至Agilent色谱进样小瓶中；
表4：质控样品配制：
(4)奎硫平储备液(ISStockA，内标)的配制：精密称取奎硫平标准品2.72mg，置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度为543.7μg／mL的奎硫平储备液(ISStockA，内标)，储存在4℃冰箱中待用。
(5)LC／MS／MS检测：
其中，液相色谱分离方法可以是：色谱柱(XBridgeC18,5μm，2.1×50mm)；色谱流动相：A为为水／0.1％甲酸；B为甲醇／0.1％甲酸，可以以流动相A先减少后增加且流动相B先增加后减少的双梯度进行洗脱，一个示例色谱梯度如表5；柱温40℃；自动进样器温度4℃；进样量1μL；
表5：色谱梯度：
又，质谱检测方法可以是：质谱扫描类型为正离子多反应监测(MRM)；离子源：电喷雾离子源(ESI)；毛细管电压：5500v；气体流速：8L／min：离子源温度：550℃；雾化气压力：40psi；其他参数可如下表6所示：
表6：质谱检测部分参数：
| 化合物 | Q1(amu) | Q3(amu) | 保留时间(msec) | 电压(v) | CE(v) | 极性(v) |
| 吲哚醌 | 148 | 65.1 | 200 | 100 | 29 | 正 |
| 奎硫平(IS) | 384.1 | 253.1 | 200 | 100 | 21 | 正 |
(6)检测结果的计算：
a)将上述标准曲线样品通过上述LC／MS／MS检测方法进行检测，并根据检测结果以峰面积为y轴，以药物浓度为x轴制作标准曲线；
b)以经过步骤(1)所述那样的前处理的生物组织样品经上述LC／MS／MS检测方法检测所得的值通过所述标准曲线的线性回归方程计算对应的2,3-吲哚醌的浓度，峰面积比和浓度之间的线性关系用由2,3-吲哚醌的回归方程所得的相关系数(R2)来表示。
[方法可靠性验证实验]
本发明的方法可通过以下方式进行可靠性验证实验。
1.最低定量下限样品配制：取2,3-吲哚醌质控储备液(StockB)，用甲醇溶液稀释成0.2μg／mL的标准溶液。取上述生物组织匀浆各190μL×6份，分别加入上述0.2μg／mL标准溶液10μL，配制质量浓度为10ng／mL的最低定量限样品，按照生物组织前处理方法进行处理。对上述最低定量限样品进行分析，结果所用样品的相对误差(RE)和相对标准偏差(RSD)都在15％以内。
2.选择性样品配制：空白基质样品(不加内标)：取上述生物组织匀浆各50μL，加入250μL50％甲醇，涡旋60秒后离心，取100μL上清液；零浓度基质样品(空白加内标)：取上述生物组织样品各50μL，按照生物组织样品前处理方法进行处理。结果表明在待测物(2,3-吲哚醌)和内标物(奎硫平)的出峰处，没有干扰峰或能影响定量的干扰峰，药物干扰峰＜LLOQ相应的20％，内标干扰峰＜内标相应的5％。
3.系统残留空白样品配制：按照空白基质样品(不加内标)配制方法配制空白基质样品，于标准曲线最高点之后分析，考察系统残留。对在最高定量限(ULOQ为5000ng／mL)后分析的空白样品进行分析。空白样品中没有干扰峰或能影响定量的干扰峰，药物干扰峰＜LLOQ相应的20％，内标干扰峰＜内标相应的5％。
4.基质效应样品和回收率样品配制：对基质效应和回收率的评价，将通过以下配制的样品考察：
质控样品配制：取三个水平的质控样品各6份，按照上述生物组织前处理方法进行处理后分析；
回收率样品配制：取上述生物组织样品各190μL×3份，分别用1000μL内标溶液沉淀蛋白，涡旋60秒，分别加入5μμL三个水平的质控样品添加液，涡旋60秒后离心，取100μL进样分析，每一浓度水平平行处理6份；
基质效应样品配制：取5μL三个水平的质控样品添加液加入995μL甲醇，涡旋60秒，取100μL进样分析，每一浓度水平取6份；
通过质控样品与回收率样品药物峰面积响应的比较评价方法的回收率；通过回收率样品与基质效应峰面积响应的比较评价方法的基质效应。计算公式如下：
基质效应和回收率计算结果表明回收率接近100％，有一定的基质效应。
5.线性：按照上述生物样品中吲哚醌定量分析标准曲线的制作方法，每天配制两份标准曲线，按生物样品前处理方法处理，并分别于当天方法学验证的开始和结束时进样分析。当天所有标准曲线样品结果同时拟合成一条标准曲线。结果表明所有标准曲线上的线性点的相对误差和相对标准偏差在15％以内，曲线相关系数R2均在0.994以上。
6.准确度和精密度质控样品配制：从冰箱(-80℃)中取出质控池样品，按生物样品前处理方法处理并进样分析。每个浓度水平平行处理6份。结果显示质控样品的相对误差和相对标准偏差都在15％以内。
7.稳定性样品配制
冻融稳定性：将配制好的质控样品(QC-Low、QC-Mid、QC-High，每一浓度6份)，存放于-80℃冰箱中24h后取出，室温下自然融解，当样品完全溶解后再次存放于-80℃冰箱冷冻；如此反复冷冻融解，在第3次融解以后，按照上述生物样品前处理方法进行处理，进样分析；
处理后样品稳定性：将当天处理后的质控样品(QC-Low、QC-Mid、QC-High，每一浓度6份)，在自动进样器小瓶板上6℃放置24h后重新进样分析，使用第二天标准曲线定量分析；
样品4℃(冰上)稳定性：将当天配制好的质控样品(QC-Low、QC-Mid、QC-High，每一浓度6份)，4℃(冰上)放置4h后，按照上述生物组织样品前处理方法进行处理，进样分析；
长期稳定性：将储存在-80℃冰箱中的质控样品(QC-Low、QC-Mid、QC-High，每一浓度6份)，按生物样品前处理方法处理后进样分析。质控样品配制时间与分析测定时间相隔24天；
储备液稳定性：重新称量和配制(相隔24天)待测物2,3-吲哚醌储备液(StockC)。用50％甲醇稀释，稀释后2,3-吲哚醌浓度为40ng／mL；
结果显示，样品的相对误差(RE)和相对标准偏差(RSD)在15％以内，说明该样品在规定的储存条件下和时间内是稳定的。
下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的参数也仅是合适范围中的一个示例，即、本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
(试验材料)
药物及试剂：
吲哚醌对照品：上海新生源医药研究有限公司提供，批号为090601；
内标物奎硫平：美迪西普亚(上海)生物医药有限公司提供；
甲醇(Burdick＆Jackson，HPLCgrade)，乙腈(Burdick&Jackson，HPLCgrade)，甲酸(ACROSORGANICS，HPLCgrade)，水为超纯水。
实验仪器：
TGL-16高速台式冷冻离心机由湘仪离心机厂出品。LC系统为安捷伦1200系列，质谱系统为安捷伦6410B，数据采集及控制系统软件为Masshunter(安捷伦科技有限公司)。微型旋涡混合器(XW-80A，上海精科实业有限公司)；微量分析天平(XP26，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；微孔过滤超纯水仪；Biospec珠磨式研磨器(MiniBeadbeater，USA)。
试验方法
储备液配制：精密称取吲哚醌标准品1.30mg，置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度为260μg／mL的吲哚醌储备液(StockA)。精密称取吲哚醌标准品1．355mg，置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度为271μg／mL的吲哚醌质控储备液(StockB)。精密称取奎硫平标准品2.72mg，置于5mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度为543.7μg／mL的奎硫平储备液(ISStockA)。储备液储存在4℃冰箱中待用。
色谱分离条件
色谱柱：XBridgeC18,5μm，2.1×50mm
色谱流动相：A为为水／0.1％甲酸；B为甲醇／0.1％甲酸，色谱梯度如表2；柱温40℃；自动进样器温度4℃；进样量1μL。色谱梯度如下：
质谱检测条件：正离子多反应监测(MRM)；离子源：电喷雾离子源(ESI)；毛细管电压：5500v；气体流速：8L／min：离子源温度：550℃；雾化气压力：40psi；其他参数如下：
| 化合物 | Q1(amu) | Q3(amu) | Dwell time(msec) | Fragmentor(v) | CE(v) | Polarity(v) |
| 吲哚醌 | 148 | 65.1 | 200 | 100 | 29 | Positive |
| 奎硫平(IS) | 384.1 | 253.1 | 200 | 100 | 21 | Positive |
生物样品前处理方法(生物样品前处理均保持在4℃或冰上进行)：
从冰箱中取出样品(-80℃)，血浆和脑脊液在4℃(冰上)自然溶化涡旋30秒；脾脏，心脏，胃，肾脏，肺，肌肉，睾丸，胰腺和脂肪样品按1：3的比例加入生理盐水后匀浆；肝，脑样，卵巢，子宫，前列腺，大肠，小肠及膀胱样品按1：5的比例加入生理盐水后匀浆；取50μL血浆及组织匀浆样品至1．5mL离心管中，加入200μL内标溶液(50ng／mL喹硫平甲醇溶液)，涡旋60秒后离心5分钟(离心力12880g，4℃)；取上清液100μL至Agilent色谱进样小瓶中。
生物样品中吲哚醌定量分析标准曲线的制作：
将2,3-吲哚醌储备液用50％甲醇稀释到200μg／mL，然后用50％甲醇逐级稀释，配制成浓度为100，50，20，10，2，1，0.5，和0.2μg／mL的标准溶液，取标准溶液各10μL平行加入到190μL大鼠空白组织匀浆液中，制得浓度为5000，2500，1000，500，100，50，25和10ng／mL的标准曲线样品；在190μL空白大鼠组织匀浆液中加入10μL2,3-吲哚醌的质控工作液；然后取50μL按照“样品处理方法”项下所述方法处理。
实施例1：大鼠生物组织样品中吲哚醌浓度测定方法的验证与结果
方法可靠性验证实验：
1.线性：按照上述生物样品中吲哚醌定量分析标准曲线的制作方法，每天配制两份标准曲线，按生物样品前处理方法处理，并分别于当天方法学验证的开始和结束时进样分析。当天所有标准曲线样品结果同时拟合成一条标准曲线；
2.准确度和精密度质控样品配制：从冰箱(-80℃)中取出质控池样品，按生物样品前处理方法处理并进样分析。每个浓度水平平行处理6份；
大鼠生物组织样品中2，3-吲哚醌浓度的测定方法的可靠性验证结果：
1.标准曲线：所有标准曲线样品同时拟和为一标准曲线，结果标准曲线上的线性点的相对误差和相对标准偏差在15％以内，曲线相关系数R2均在0.994以上，如表7：
表7：测定大鼠不同组织匀浆样品中2，3-吲哚醌浓度的线性回归方程
| 生物样品 | 回归方程 | 浓度范围(ng／g,ng／mL) | R2 |
| 脑 | Y=-0.00272*x+0.00057 | 25~5000 | 0.9963 |
| 心 | Y=0.00469*x+0.000625 | 10~5000 | 0.9987 |
| 肝 | Y=0.0104*x+0.000466 | 10~5000 | 0.9952 |
| 脾 | Y=0.00724*x+0.000571 | 10~5000 | 0.9971 |
| 肺 | Y=0.00164*x+0.0006 | 10~5000 | 0.9965 |
| 肾 | Y=0.0027*x+0.000589 | 25~5000 | 0.9982 |
| 胃 | Y=-0.0111*x+0.000308 | 10~5000 | 0.9947 |
| 小肠 | Y=0.0109*X+0.000506 | 25~5000 | 0.9949 |
| 大肠 | Y=0.00548*x+0.000618 | 10~5000 | 0.9984 |
| 胰腺 | Y=-0.00147*x+0.00057 | 10~5000 | 0.9980 |
| 膀胱 | Y=-0.00363*x+0.000552 | 10~5000 | 0.9973 |
| 骨骼肌 | Y=0.00487*x+0.000587 | 10~5000 | 0.9989 |
| 皮肤 | Y=0.00128*x+0.000583 | 10~5000 | 0.9985 |
| 脂肪 | Y=0.00345*x+0.000715 | 10~5000 | 0.9990 |
| 前列腺 | Y=0.000573*x+0.0035 | 10~5000 | 0.9950 |
| 睾丸 | Y=0.000524*x-0.0094 | 50~5000 | 0.9936 |
| 卵巢 | Y=-0.00508*x+0.00133 | 10~5000 | 0.9977 |
| 子宫 | Y=0.0045*x+0.00063 | 10~5000 | 0.9980 |
| 甲状腺 | Y=0.00293*x+0.00125 | 10~5000 | 0.9975 |
| 血浆 | Y=0.000511*x+0.0094 | 10~5000 | 0.9971 |
；
2.精密度与准确度：考察了部分组织样品分析方法的精密度和准确度，对三个浓度的质控样品进行分析，结果显示质控样品的相对误差和相对标准偏差都在15％以内，如表8；
表8：大鼠生物组织样品精密度与准确度分析结果
实施例2：SD大鼠给药2，3-吲哚醌的组织分布研究的药物浓度测定
材料与方法
1、试验动物：
SpragueDawley(SD)大鼠，雌雄各半，体重208.6～238.5g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供，许可证号SCXK(沪)2008-0016。
2、给药方案：
称取适量吲哚醌，根据给药剂量和给药体积配制到所需浓度，灌胃以1．25％西黄耆胶水溶液配制。动物给药前禁食10～14h，自由饮水。健康SD大鼠36只，雌雄各半。随机分成6个时间组，每一时间组6只，以50mg／kg的剂量灌胃给予2,3-吲哚醌，给药体积为5mL／kg，6组受试大鼠分别于给药后0.25，0.5，1，2，4和8h取血后处死，立即解剖采集脑、心、肺、肝、胃、脾、肾、骨骼肌、腹部脂肪、睾丸(卵巢)、子宫、膀胱、胰腺、小肠、大肠、皮肤和前列腺，用生理盐水冲洗，滤纸吸干，称重，置-80℃冰箱保存，待测。胃、小肠、大肠和膀胱需剪开，冲洗内腔，滤纸吸干。血浆采集方法：动物吸入二氧化碳安乐死后，心脏取血1m1，肝素钠抗凝，采集时间点同前。血液样本采集后置于冰上，并于30分钟之内离心分离血浆(离心条件：8000转／分钟，6分钟，4℃)。脑脊液：大鼠取血后，股动脉放血，从枕骨大孔采集脑脊液。收集的生物组织分析前存放于-80℃。
3、生物组织样品测定方法：
采用上述LC／MS／MS方法测定大鼠给药后不同时间点生物组织中吲哚醌的浓度。
结果：
SD大鼠灌胃给予50mg／kg2,3-吲哚醌后，0.25，0.5，1h，2h，4h和8h组织中药物的浓度分别见下表：
表9-12,3-吲哚醌在大鼠组织分布浓度(取样点0.25h)
表9-22,3-吲哚醌在大鼠组织分布浓度(取样点0.25h)
表10-12,3-吲哚醌在大鼠组织分布浓度(取样点0.5h)
表10-22,3-吲哚醌在大鼠组织分布浓度(取样点0.5h)
表11-12，3-吲哚醌在大鼠组织分布浓度(取样点1h)
表11-22，3-吲哚醌在大鼠组织分布浓度(取样点1h)
表12-12，3-吲哚醌在大鼠组织分布浓度(取样点2h)
表12-22，3-吲哚醌在大鼠组织分布浓度(取样点2h)
表13-12，3-吲哚醌在大鼠组织分布浓度(取样点4h)
表13-22，3-吲哚醌在大鼠组织分布浓度(取样点4h)
表14-12，3-吲哚醌在大鼠组织分布浓度(取样点8h)
表14-22，3-吲哚醌在大鼠组织分布浓度(取样点8h)
Claims (8)
1.一种生物组织样品中2,3-吲哚醌的浓度的测定方法，其特征在于，所述测定方法包括：
生物组织样品前处理步骤：在0～4℃下，按质量比1：(3～5)混合动物给予2,3-吲哚醌后采集的生物组织样品和生理盐水制得生物组织匀浆样品，然后按体积比为1：4混合所述生物组织匀浆样品和内标物甲醇溶液，涡旋30～90秒后离心取上清液；以及通过液相色谱-质谱联用分离经前处理的生物组织样品中的2,3-吲哚醌、并测定生物组织样品中2,3-吲哚醌的浓度的检测步骤；其中，液相色谱条件包括：色谱柱为XBridgeC18,5μm，2.1×50mm；色谱流动相A为浓度为0.1％甲酸水溶液，流动相B为浓度为0.1％甲酸甲醇，以流动相A先减少后增加且流动相B先增加后减少的双梯度进行洗脱；
质谱条件包括：质谱扫描类型为正离子多反应监测；离子源为电喷雾离子源；雾化气压力为40psi；气体流速为8L/min；毛细管电压为5500V；离子源温度为550℃，内标法定量；
其中，液相色谱的洗脱梯度为：
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述生物组织样品为脾脏、心脏、胃、肾脏、肺、肌肉、睾丸、胰腺和/或脂肪，所述质量比为1：3。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述生物组织样品为肝、脑样、卵巢、子宫、前列腺、大肠、小肠、皮肤和/或膀胱，所述质量比为1：5。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的测定方法，其特征在于，在所述生物组织样品前处理步骤中，所述内标物甲醇溶液为50ng/mL的奎硫平甲醇溶液。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的测定方法，其特征在于，液相色谱条件还包括：柱温为40℃、自动进样器温度为4℃、流速为500μL/min、进样量为1μL。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述质谱条件还包括：用于定量分析的离子对为：2,3-吲哚醌：148→65.1；奎硫平：384.1→253.1。
7.根据权利要求1～3中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述测定方法的最低检测限为10ng/mL。
8.根据权利要求1～3中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述测定方法的相对误差和相对标准偏差均在15％以内。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310333153.3A CN104345097B (zh) | 2013-08-02 | 2013-08-02 | 生物组织样品中2,3-吲哚醌的浓度的测定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310333153.3A CN104345097B (zh) | 2013-08-02 | 2013-08-02 | 生物组织样品中2,3-吲哚醌的浓度的测定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104345097A CN104345097A (zh) | 2015-02-11 |
| CN104345097B true CN104345097B (zh) | 2016-05-25 |
Family
ID=52501153
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310333153.3A Active CN104345097B (zh) | 2013-08-02 | 2013-08-02 | 生物组织样品中2,3-吲哚醌的浓度的测定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104345097B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110470757A (zh) * | 2019-08-14 | 2019-11-19 | 无锡济民可信山禾药业股份有限公司 | 一种醒脑静注射液脑组织中冰片与麝香酮含量测定方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101157651A (zh) * | 2007-09-19 | 2008-04-09 | 吴江梅堰三友染料化工厂 | 一种靛红的制备方法 |
-
2013
- 2013-08-02 CN CN201310333153.3A patent/CN104345097B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101157651A (zh) * | 2007-09-19 | 2008-04-09 | 吴江梅堰三友染料化工厂 | 一种靛红的制备方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 2,3-吲哚醌在大鼠体内的药代动力学研究;张继国 等;《中国实用医药》;20110731;第6卷(第19期);28-31 * |
| ed electrode.《Analytica Chimica Acta》.2006,第577卷(第2期), * |
| Haihong Xu et al..Determination of isatin and monoamine neurotransmitters in rat brain with liquid chromatography using palladium hexacyanoferrate modifi * |
| HPLC法测定尿液中2,3-吲哚醌的含量;李冬梅 等;《青岛大学医学院学报》;20051231;第41卷(第4期);348-349 * |
| Quantitative liquid chromatography-mass spectrometry determination of isatin in urine using automated on-line extraction;Matthias Unger et al.;《Journal of Chromatography B》;20020215;第767卷(第2期);245-253 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104345097A (zh) | 2015-02-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102012409B (zh) | 动物血液样品中痕量烟草特有N-亚硝胺（TSNAs）的分析方法 | |
| Baranowska et al. | Rapid UHPLC method for simultaneous determination of vancomycin, terbinafine, spironolactone, furosemide and their metabolites: application to human plasma and urine | |
| CN104020241A (zh) | 动物血、脑样品中痕量烟碱及其主要代谢物的同步分析方法 | |
| Timofeeva et al. | Stepwise injection potentiometric determination of caffeine in saliva using single-drop microextraction combined with solvent exchange | |
| CN107367562A (zh) | 硫酸多黏菌素b的分析检测方法及应用 | |
| CN102072942A (zh) | 一种离子对色谱法测定吡咯并喹呤醌含量的分析方法 | |
| CN109060972A (zh) | 兔血在制备人疾病体外诊断试剂盒中的应用 | |
| CN110146620A (zh) | 一种uplc-ms/ms法同时检测血浆中五种抗结核药物的方法 | |
| CN104215730A (zh) | 一种吲唑磺菌胺及其代谢物it-4残留量的检测方法 | |
| CN113804746A (zh) | 一种对尿液中的合成卡西酮类毒品进行快速定量的方法 | |
| CN110133169A (zh) | 一种采用液质联用检测人血浆中呋塞米的方法及应用 | |
| CN104251897A (zh) | 一种同时测定土壤中五种不同结构除草剂残留量的方法 | |
| Zhang et al. | Investigation of the ultrasound effect and target analyte selectivity of dispersive liquid–liquid microextraction and its application to a quinocetone pharmacokinetic study | |
| CN104345097B (zh) | 生物组织样品中2,3-吲哚醌的浓度的测定方法 | |
| CN105424853A (zh) | 一种lc-ms/ms检测唾液中尼古丁及其代谢物的试剂盒 | |
| CN106483230B (zh) | 一种尿液羟基多环芳烃的快速检测方法 | |
| CN103487539B (zh) | 利用超快速液相色谱-串联三重四级杆质谱测定家蚕血淋巴中阿苯达唑及代谢物含量的方法 | |
| CN102621267B (zh) | 一种测定血浆或尿液中d-山梨醇浓度的方法 | |
| CN103940918A (zh) | 一种同时检测动物血浆中青蒿琥酯及二氢青蒿素含量的方法 | |
| CN111122727A (zh) | 人血浆中同时测定伊马替尼及伊马替尼代谢物浓度的方法 | |
| CN108982680A (zh) | 一种硫酸氢氯吡格雷中硫酸二甲酯含量的测定方法 | |
| CN104391071A (zh) | 一种人体尿液中8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和8-异构前列腺素F2α的分析方法 | |
| CN104655757B (zh) | Bc-02的液相色谱检测方法 | |
| CN106093230A (zh) | 一种测定血浆中n1‑甲基尼克酰胺浓度的lc‑ms‑ms方法 | |
| CN105806985B (zh) | 一种马钱子苷元生物样品的测定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 201203 Shanghai Bing Pudong New Area free trade zone 67 Lane Road, No. 5 Applicant after: Shanghai Medicilon Co., Ltd. Address before: Bing Lu Pudong New Area Zhangjiang hi tech park Shanghai 201203 Lane 67 Building No. 5 Applicant before: Shanghai Medicilon Inc. |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| GR01 | Patent grant |