CN109073662A - 用于鉴定与抗磷脂综合征相关的狼疮抗凝物(la)的方法和试剂盒 - Google Patents

用于鉴定与抗磷脂综合征相关的狼疮抗凝物(la)的方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本文所述的发明涉及用于诊断患者的抗磷脂综合征的方法和试剂盒，其中在磷脂依赖性凝血试验中，凝血抑制剂和正常的混合血浆的混合物降低了患者血浆的因子缺乏影响以及患者血浆中的凝血抑制剂干扰，并且提高了检测患者的血液中的狼疮抗凝物的特异性和灵敏度。

Description

用于鉴定与抗磷脂综合征相关的狼疮抗凝物(LA)的方法和试 剂盒
技术领域
本发明涉及临床诊断(特别是凝血障碍诊断)领域，更具体而言，本发明涉及通过鉴定患者血液中的狼疮抗凝物(LA)从而诊断人类患者中被称为抗磷脂综合征(APS)的凝血障碍的方法和试剂盒，所述鉴定利用了降低凝血因子缺乏的影响并降低凝血抑制剂干扰的方法和试剂盒，这些影响和干扰通常存在于现有的检测LA的方法和试剂盒中。
背景技术
抗磷脂综合征(APS)为临床止血障碍，通常表现为静脉血栓形成、动脉血栓形成、习惯性流产、早产或流产。APS的同义词包括狼疮抗凝物综合征，因为其偶尔与系统性红斑狼疮病相关。APS目前是抗磷脂综合征的优选术语，并将在下面使用。
与APS相关的典型实验室结果包括所谓的抗磷脂抗体(又被称为狼疮抗凝物)的持续升高，即，针对膜阴离子磷脂的抗体，例如抗心磷脂抗体或其相关的血浆蛋白，例如β-2-糖蛋白；或被称为LA试验的磷脂依赖性凝血试验中的异常。
APS改变凝血的正常稳态并且在临床上在患者体内表现为高凝状态的机制尚未明确。高凝状态原因的机理包括循环蛋白与因细胞损伤而暴露的细胞膜磷脂相结合。例如，循环β-2-糖蛋白与暴露的细胞膜磷脂相结合从而形成蛋白-磷脂复合物。一些理论认为，蛋白-磷脂复合物可能会暴露复合物上的配体，这些配体可作为特定自身抗体的靶标。
关于APS的其他提出的机制包括自身抗体的产生增加、针对凝血因子的抗体的产生、提高的血小板活性和用于血小板结合的内皮细胞的活化。所有这些提出的机制都是患者的高凝状态和病理性血栓形成的基础。
APS诊断需要进行许多实验室测试的证明，必须长期重复这些测试以确认诊断。通过分析被称为狼疮抗凝物(LA)试验的磷脂依赖性凝血时间试验来鉴定狼疮抗凝物。据认为，异常的LA结果是对APS最可靠的测试。狼疮抗凝物针对血浆凝血因子。狼疮抗凝物的存在表现为凝血时间的反常延长。由于凝血因子抑制剂和缺乏凝血因子也会延长凝血时间，因此患者的血浆样品中这些抑制剂的存在和缺乏使APS的诊断复杂化。凝血因子抑制剂包括(例如)几个大类：如针对凝血因子VIII和V的特异性抗体、非特异性抑制剂(如肝素)以及特异性抑制剂(如凝血酶抑制剂和直接因子Xa的抑制剂)。
LA检测必须排除由存在因子缺乏或因子抑制剂而造成的影响。为了辅助评价因子抑制剂或因子缺乏的作用，进行了混合研究，将具有凝血因子正常补体的贫血小板正常血浆与患者样品混合并重复凝血测试，以排除异常凝血因子的缺乏作为延迟凝血的根本原因。如果在向患者的血浆中添加正常血浆之后凝血时间正常化，则该患者缺乏凝血因子。使用正常的(混合)血浆稀释患者血浆样品的混合研究对于APS的诊断是存在问题的，因为患者样品中的狼疮抗凝物被稀释了。因此，LA弱阳性的患者血浆样品可能被充分稀释，从而不可能检测到低的LA。因此，在混合研究中忽略了LA弱阳性的患者。用于鉴定狼疮抗凝物的混合研究的低灵敏度是下面描述的本发明所解决的问题之一。
测定凝血时间的用于检测凝血障碍的典型测试包括磷脂依赖性试验，例如，活化部分凝血活酶时间(APTT)，如基于APTT的二氧化硅凝血时间(SCT)、稀释的鲁塞尔氏蝰蛇毒液时间(dRVVT)、稀释的凝血酶原时间(dPT)、基于APTT的高岭土凝血时间(KCT)、基于APTT的血小板中和试验(PNP)、基于APTT的六角相磷脂中和试验。如上面所简述的，目前通过延长的磷脂依赖性凝血测试结果来确认LA的存在，而延长的凝血时间的原因可能为混合研究未能纠正延长的凝血时间(将正常血浆混入测试血浆以代替凝血因子)、对高水平的磷脂存在下的凝血时间的标准化以及不存在凝血因子抑制剂。
APTT筛选和dRVVT筛选(如上所述的几种LA筛选试验中的两种)为磷脂依赖性凝血试验，其在患者的血浆的试验中使用非常低的磷脂浓度。因此，这些测试对抗磷脂抗体非常敏感。通过重复试验(称为确认试验)来确认对于抗磷脂抗体的敏感性，由此将高浓度磷脂添加到用于筛选的同一磷脂依赖性试验中，以压倒抗磷脂抗体的作用。通过将凝血时间降低回到正常范围而确定的凝血抑制作用的降低支持了测试血浆样品中LA的存在。
LA筛选试验的结果表示为如下定义的筛选比率(Rs)(在低水平磷脂存在下进行的试验)、确认比率(Rc)(在高水平磷脂的存在下进行的试验)、筛选与确认比率(R)和标准化筛选与确认比率(NR)：
NR：Rs/Rc
发明内容
本发明涉及临床诊断(特别是凝血障碍诊断)领域，更具体地而言，本发明通过鉴定患者血液中的狼疮抗凝物(LA)从而诊断人类患者的抗磷脂综合征(APS)的方法和试剂盒，所述鉴定利用了降低凝血因子缺乏的影响并降低凝血抑制剂干扰的方法和试剂盒，而这些影响和感染存在于当前的用于检测LA的方法和试剂盒中。本文公开的发明的实施方案至少具有以下共同特征：凝血抑制剂、低浓度磷脂试剂、高浓度磷脂试剂和磷脂依赖性凝血时间试验。
在一个方面，本发明涉及一种用于检测人类患者体内与抗磷脂综合征(APS)相关的狼疮抗凝物(LA)的方法。该方法包括多个步骤，例如但不限于以下步骤。在步骤(a)中，通过磷脂依赖性凝血试验检测来自处于APS风险中的患者的血浆的凝血时间，其在至少一种凝血抑制剂和低磷脂浓度的存在下进行测定。在本发明方法的各种实施方案中，低磷脂浓度包括约0.002(g/l)至约0.2(g/l)的范围，优选0.002(g/l)至0.15(g/l)的范围，更优选0.010(g/l)至0.10(g/l)的范围，并且最优选0.04(g/l)至0.08(g/l)的范围。
在步骤(b)中，由步骤(a)的磷脂依赖性凝血试验检测来自处于APS风险中的患者的血浆的凝血时间，该试验在步骤(a)的凝血抑制剂和高磷脂浓度的存在下进行测定，该高磷脂浓度高于步骤a)中的低磷脂浓度。在本发明的方法的各种实施方案中，高磷脂浓度优选包括约0.2(g/l)至5.0(g/l)的范围，更优选0.5(g/l)至3.0(g/l)的范围，并且最优选1.0(g/l)至2.0(g/l)的范围。
确定在步骤a)中的患者血浆中检测到的凝血时间与在步骤b)中的患者血浆中检测到的凝血时间的比率。将患者比率与优选以至少40名正常的健康受试者来确定的参考区间和截止值进行比较。参考区间的平均值用于对LA试验进行标准化，并且将患者样品比率与截止值进行比较。如当前LA指南中所建议的那样确定截止值，该值为正常样品分布的99％以上或者为正常样品的参数分布的平均值+2SD区间。如果该比率大于截止值，则患者可能具有与APS相关的LA，并且建议在12周后重复测试以确认循环抗磷脂抗体的持续存在。在本发明的方法的各种实施方案中，示例性截止比率表示为比率NR，其为1.00至1.20，优选1.00至1.15，更优选1.00至1.10。
通过进行混合试验来确定可能由凝血因子缺乏或凝血抑制剂(如患有心律失常的患者或处于脑梗塞风险中的患者所服用的药剂)的存在而造成的对凝血的影响。在混合试验中，使用正常的混合血浆稀释患者的血浆，并重复进行磷脂依赖性凝血试验。混合研究将确定患者的凝血障碍是否与凝血因子的缺乏有关。在本发明的方法的各种实施方案中，可以使用正常的混合血浆(例如)以1:1、1:2、1:3或1:4稀释患者的血浆样品。
在磷脂依赖性凝血试验中，向患者血浆中添加凝血抑制剂和正常的混合血浆降低了由血浆中存在凝血因子缺乏或凝血抑制剂而造成的干扰，并且提高了用于检测狼疮抗凝物的方法的特异性和灵敏度。
用于本发明的方法的磷脂依赖性凝血试验可以选自由下列组成的组：活化部分凝血活酶时间(APTT)、稀释的鲁塞尔氏蝰蛇毒液时间(dRVVT)、基于APTT的血小板中和试验(PNP)、基于APTT的六角相的磷脂中和试验、基于APTT的高岭土凝血时间(KCT)、基于APTT的二氧化硅凝血时间(SCT)和稀释的凝血酶原时间(dPT)，仅举几例此类磷脂依赖性凝血试验。
在本发明的方法的一个具体实施方案中，凝血抑制剂为凝血抑制剂的组合，例如，多于一种的凝血酶抑制剂、多于一种的Xa抑制剂或者一种或多种凝血酶抑制剂和一种或多种因子Xa抑制剂。
在根据本发明的方法的一个实施方案中，至少一种凝血抑制剂为凝血酶抑制剂。
凝血酶抑制剂可以选自由下列物质组成的组：D-苯丙氨酰基-L-脯氨酰基-L-精氨酸-氯甲基酮(PPACK)、I-2581、水蛭素、水蛭素衍生物、重组水蛭素、地西卢定、水蛭素类似物、比伐卢定、阿加曲班、美拉加群、达比加群以及它们的组合。
在本发明的方法的另一个实施方案中，至少一种凝血抑制剂为因子Xa抑制剂。
因子Xa抑制剂可以选自由下列物质组成的组：利伐沙班、阿哌沙班、依度沙班、贝曲西班、安他心、蜱抗凝血蛋白(TAP)以及它们的组合。
在另一方面中，本发明涉及用于检测患者血浆样品中与抗磷脂综合征相关的狼疮抗凝物的试剂盒。在本发明的一个实施方案中，试剂盒包括至少一种凝血抑制剂和正常的混合血浆。或者，试剂盒包括磷脂依赖性凝血试剂，其包含低的磷脂浓度、至少一种凝血抑制剂；以及包含磷脂浓度的磷脂依赖性凝血试剂，其所包含的磷脂浓度高于所述低的磷脂浓度。在试剂盒的各种实施方案中，低的磷脂浓度包括约0.002(g/l)至约0.2(g/l)的范围。在试剂盒的各种实施方案中，高的磷脂浓度包括约0.2(g/l)至约5.0(g/l)的范围。
在根据本发明的试剂盒的各种实施方案中，磷脂依赖性凝血试剂包括下列中的至少一者：APTT、dRVVT、基于APTT的血小板中和试验(PNP)、基于APTT的六角相磷脂中和试验、基于APTT的高岭土凝血时间(KCT)、基于APTT的二氧化硅凝血时间(SCT)和稀释的凝血酶原时间(dPT)。
在根据本发明的试剂盒的一个实施方案中，根据本发明的试剂盒的凝血抑制剂包括至少一种凝血酶抑制剂。
凝血酶抑制剂可以选自由下列组成的组：D-苯丙氨酰基-L-脯氨酰基-L-精氨酸-氯甲基酮(PPACK)、I-2581、水蛭素、水蛭素衍生物(例如，重组水蛭素和地西卢定)、水蛭素类似物(例如，比伐卢定)、阿加曲班、美拉加群、达比加群以及它们的组合。
在根据本发明的试剂盒的可替代的实施方案中，至少一种凝血抑制剂包括至少一种因子Xa抑制剂。因子Xa抑制剂可以选自由下列物质组成的组：利伐沙班、阿哌沙班、依度沙班、贝曲西班、安他心、蜱抗凝血蛋白(TAP)以及它们的组合。
如上文对于本发明的方法以及应用于本文所述的试剂盒的讨论，通过进行混合试验来确定可能由凝血因子缺乏或凝血抑制剂(如患有心律失常的患者或处于脑梗塞风险中的患者所服用的药剂)的存在所造成的对凝血的影响。在试剂盒的内容物中提供的混合试验中，将患者的血浆与正常的混合血浆进行混合，然后重复进行磷脂依赖性试验。混合试验将鉴定患者的血浆中凝血因子的缺乏。在根据本发明的试剂盒的各种实施方案中，试剂盒中可以包括正常的混合血浆，其具有足够的体积用于使用正常的混合血浆以1:1、1:2、1:3或1:4稀释患者的血浆样品。
本发明考虑了试剂盒中试剂和容器的各种组合和排列。例如，将凝血抑制剂和具有第一低磷脂浓度的磷脂依赖性凝血试剂装在一个容器中作为试剂盒的一部分。或者，将凝血抑制剂和包含高磷脂浓度的第二磷脂依赖性凝血试剂装在一个容器中，可以将正常的混合血浆与凝血抑制剂装在同一容器中，或者可以将所有试剂装在试剂盒中的单独的容器中。容器是指(但不限于)用于容纳粉末形式或液体形式的试剂的小瓶、封套或管。
通过参考以下描述和权利要求，本文所述的发明的这些和其他目的以及优点和特征将变得显而易见。此外，应该理解的是，本文所述的各种实施方案的特征不是相互排斥的，并且可以存在各种组合和排列。
如本文所用，“测试的患者血浆”和“正常的混合血浆”(NPP)均为贫血小板血浆。
如本文所用，术语“比较”包括将凝血时间或对血浆样品测定的凝血时间的比率与本文其他地方规定的合适的截止比率进行比较。本发明方法的“比较”步骤可以手动进行或通过计算设备进行，如自动临床分析仪，例如ACL系列(InstrumentationLaboratory Company，Bedford，MA)。将血浆比率和截止比率的值彼此进行比较，并且可以由执行用于比较的算法的计算机程序自动地进行比较。计算机程序将以合适的输出格式提供所需的评价。对于计算机辅助比较，可以将确定量的值与由计算机程序存储在数据库中的合适的截止值所对应的值进行比较。计算机程序可以进一步评价比较的结果，即，以合适的输出格式自动提供所需的评价。
如本文所用，术语“凝血时间的比率”包括以正常的健康受试者的合适的参考值标准化的凝血时间的比率。合适的参考值应当是指对于利用一组正常的健康受试者而确定的参考区间的平均凝血时间、对于来自一组正常的健康受试者的样品的凝血时间，或由此类凝血时间计算的比率。可以由待一同(即与测试(患者)血浆样品同时、随后或至少时间上相近)分析的参考血浆样品来确定合适的参考值。
如本文所用，截止比率应当是指上限比率，例如，其能够将样品划分在具有狼疮抗凝物的一组血浆样品中，或划分在不具有狼疮抗凝物的一组血浆样品中。此类截止比率可以为将两组区分开的阈值或截止值。通过应用当前LA指南中推荐的标准统计方法，可以基于本文所述的试验的均值或平均值，计算来自一组未鉴定为具有APS的正常患者的血浆的截止比率。
如本文所用，术语“试剂盒”是指组分的集合，所述组分优选单独提供或在单个容器内提供。组分包括但不限于试剂，其包括化学品、血浆或缓冲液，其可以(例如)在容器内的小瓶中单独提供。或者，可以在(例如)容器内的小瓶中将两种或多种组分组合在一起。容器还包括使用容器内的至少一些组分进行LA试验的说明书，所述LA试验具有或没有来自另外来源(例如，不同的试剂盒)的组分。试剂盒还可以包括标准，其反映了如本文其他地方所述和提及的参考量。
如本文所用，APTT试剂是指测量凝血时间的磷脂依赖性活化部分凝血活酶时间试剂，例如，二氧化硅凝血时间(Instrumentation Laboratory Company)。
如本文所用，dRVVT试剂是指测量凝血时间的磷脂依赖性稀释的鲁塞尔氏蝰蛇毒液时间试剂，例如，dRVVT筛选和确认试验(Instrumentation LaboratoryCompany)。
如本文所用，术语“试验”和“测试”可互换使用。
附图简要说明
图1示出了根据本发明的一个实施方案的D-苯丙氨酰基-L-脯氨酰基-L-精氨酸-氯甲基酮(PPACK)浓度对基于APTT的二氧化硅凝血(SCT筛选)的凝血时间和基于APTT的二氧化硅凝血时间确认(SCT确认)的作用。浓度渐增的PPACK对正常血浆样品和LA阳性血浆样品的SCT筛选测试表现出不同的作用，但对SCT确认测试没有作用。
图2以图表形式示出了根据本发明的一个实施方案的PPACK浓度对SCT试验的筛选/确认比率的作用。渐增的PPACK浓度使LA阳性样品的筛选/确认比率从1.09提高至1.82。正常的混合血浆(NPP)的筛选/确认比率保持不变。
图3以图表形式示出了根据本发明的一个实施方案的PPACK浓度对SCT试验的标准化比率(NR)的作用。在自动混合研究中(使用NPP/PPACK材料以1:1稀释)，在1000ng/mlPPACK的条件下，3种浓度的LA阳性样品(未稀释、使用NPP以1:1或1:3稀释)的NR分别为2.34、1.82和1.46。即使是最稀的样品(使用NPP将原始样品有效稀释8倍)仍然保持阳性的LA结果。
图4A至图4B以图表形式示出了根据本发明的一个实施方案的PPACK浓度对dRVVT筛选测试和dRVVT确认测试的凝血时间的作用。图4A示出了浓度渐增的PPACK对正常血浆样品和LA阳性血浆样品的dRVVT筛选测试表现出不同的作用。图4B示出了浓度渐增的PPACK对dRVVT确认测试没有表现出不同的作用。
图5以图表形式示出了PPACK浓度对dRVVT测试的筛选/确认比率的作用。渐增的PPACK浓度使LA阳性样品的筛选/确认比率从1.42提高至1.58，同时其将NPP的筛选/确认比率从1.02降低至0.91。
图6以图表形式示出了PPACK浓度对dRVVT测试的NR的作用。在自动混合研究中(使用NPP/PPACK材料以1:1稀释)，在1000ng/ml PPACK的条件下，3种浓度的LA阳性样品(未稀释、使用NPP以1:1或1:3稀释)的NR分别为1.76、1.42和1.19。即使是最稀的样品(使用NPP将原始样品有效稀释8倍)仍然保持阳性的LA结果。
图7A至图7B以图表形式示出了根据本发明的一个实施方案的I-2581以及组合使用I-2581和PPACK对dRVVT试验的筛选/确认比率和NR的作用。图7A示出了在没有PPACK的情况下，在I-2581的存在下I-2581对LA阳性样品和NPP样品两者的筛选/确认比率均具有相似的略微降低的作用。在存在350nM PPACK的情况下，I-2581对于LA阳性样品和NPP样品的筛选/确认比率的作用保持相似。图7B示出了在组合使用或不组合使用PPACK的情况下，I-2581有助于标准化比率的轻微降低。
图8A至图8B以图表形式示出了根据本发明的一个实施方案的水蛭素、阿加曲班以及它们的组合使用对dRVVT试验的筛选/确认比率的作用。图8A示出了水蛭素提高了NPP样品(从没有水蛭素时的筛选/确认比率1.02提高至含有1000ng/ml水蛭素时的筛选/确认比率1.18)和LA阳性样品(从没有水蛭素时的筛选/确认比率1.41提高至含有1000ng/ml水蛭素时的筛选/确认比率2.14)两者的筛选/确认比率，尽管对于NPP样品的作用相当小。图8B示出了当使用阿加曲班作为抑制剂时，筛选/确认比率以不同的模式响应：LA阳性样品(正方形)的比率没有变化，而NPP(十字形)的比率显著降低(从没有阿加曲班时的筛选/确认比率1.06降低至含有500ng/ml阿加曲班时的筛选/确认比率0.9)。当水蛭素和阿加曲班一起使用时表现出协同效应(NPP样品为三角形，LA阳性样品为菱形)。其他凝血抑制剂例如PPACK和利伐沙班的组合可能发生协同作用。
图9A至图9B以图表形式示出了根据本发明的一个实施方案的水蛭素、阿加曲班以及它们的组合使用对dRVVT试验的标准化比率的作用。图9A示出了对于LA阳性样品，标准化比率从1.39(没有使用凝血酶抑制剂)提高至1.81(在含有1000ng/ml水蛭素时)。图9B示出了阿加曲班通过降低NPP筛选/确认比率而将标准化比率从1.34提高至1.57(在含有500ng/ml阿加曲班时，方形)。当水蛭素和阿加曲班一起使用时，LA阳性样品(菱形)的标准化比率从1.72(只有200ng/ml的水蛭素)降低至1.66(200ng/ml水蛭素和500ng/ml阿加曲班)。
具体实施方式
抗凝血酶和因子Xa的抗凝物通过有效降低反应混合物中这些因子的可用量来延长LA试验中的凝血时间。然而，抗凝物对LA阴性血浆试样和LA阳性血浆试样的影响不同。LA试验中的凝血抑制剂(例如凝血酶抑制剂和因子Xa抑制剂)提高了对LA抗体的灵敏度，其使得能够进行可靠的混合研究以解决由因子缺乏或内源性凝血因子所造成的干扰。这种差异提供了这样的方法，其用于在使用正常血浆稀释测试血浆样品以使凝血因子正常化时以及不使用正常血浆稀释测试血浆样品时改进对LA试验的解读。因此，使用添加有抗凝物的试剂可以显著提高LA灵敏度(例如，检测弱LA阳性血浆)，而不会牺牲LA试验的特异性。此外，本文所述的发明增强了用于检测LA的所谓“混合试验”(上文讨论的)中的LA信号。
本发明采用了这样一种方法，其中将所选择的抗凝物添加到LA试验中以实现改进的试验灵敏度和特异性，并且提供更可靠的自动混合研究(将基本上不含血小板的正常血浆(NPP)添加到患者血浆样品中并重复凝血试验)，从而解决了用于诊断APS的LA检测中的因子缺乏和因子抑制剂问题。具体而言，根据本文所述的发明，当将不同的抑制剂(包括但不限于凝血酶抑制剂PPACK、水蛭素、水蛭素衍生物(例如重组水蛭素和地西卢定)、水蛭素类似物(例如比伐卢定)、阿加曲班、美拉加群、达比加群、I-2581以及它们的组合)添加到标准磷脂依赖性试验时，来自这些不同抑制剂的协同效应在LA检测和APS的诊断中赋予了工具以优化灵敏度和特异性。必须优化添加的凝血抑制剂的量以提高LA阳性样品的凝血时间比率，同时继续校正缺乏因子或含有因子抑制剂的LA阴性样品，其通过添加到样品中的混合研究血浆来校正。
根据一个方面，本发明是一种用于帮助检测狼疮抗凝物的试剂盒，其用于诊断患者的APS。在本发明的一个实施方案中，试剂盒包括至少一种凝血抑制剂，例如但不限于凝血酶抑制剂，例如但不限于上文详述的凝血酶抑制剂，以及正常血浆(混合的正常血浆或其他正常血浆)。在另一个实施方案中，上述试剂盒进一步包括或旨在与LA试验如APTT试剂(例如，基于APTT的二氧化硅凝血时间(SCT)、基于APTT的血小板中和试验(PNP)、基于APTT的六角相磷脂中和试验，基于APTT的高岭土凝血时间(KCT))一起使用，其具有在0.002(g/l)至0.2(g/l)的范围内、优选0.01(g/l)的低磷脂浓度，并且LA试验具有在0.2(g/l)至5.0(g/l)的范围内、优选1.0(g/l)的高磷脂浓度。
另一方面，本发明是一种用于检测狼疮抗凝物以辅助诊断患者的APS的方法。在本发明方法的一个实施方案中，通过将患者的血浆与下列物质混合以进行凝血筛选凝血试验：一种或多种凝血抑制剂、凝血酶抑制剂(例如上述凝血酶抑制剂或因子Xa抑制剂中的一者或多者)以及具有低磷脂浓度的磷脂依赖性APTT试剂。测定筛选凝血时间。通过将患者的样品与筛选试验中使用的凝血酶抑制剂混合，并且在高浓度磷脂APTT试剂的存在下与磷脂混合，从而对患者的血浆进行凝血确认凝血试验，并测定确认凝血时间。
在可替代的实施方案中，如上所述，(例如)在患者血浆的筛选和确认凝血试验中，在dRVVT试验或稀释凝血酶原时间试验中使用高磷脂和低磷脂替换高磷脂APTT和低磷脂APTT。
在本发明方法的另一个实施方案中，如上所述，(例如)通过将患者的血浆与因子Xa抑制剂(例如但不限于利伐沙班、阿哌沙班、依度沙班、贝曲西班、安他心、蜱抗凝血蛋白(TAP)以及它们的组合)以及具有低磷脂浓度的APTT试剂混合来进行因子Xa筛选凝血试验。测定凝血时间。通过将患者的样品与在患者血浆样品的因子Xa筛选试验中使用的因子Xa抑制剂以及如以上APTT试剂所述的具有高磷脂浓度的APTT试剂进行混合，从而还对患者的血浆进行了确认凝血试验。测定确认凝血时间。
在替代实施方案中，在患者血浆的筛选与确认凝血试验中，使用高磷脂dRVVT和低磷脂dRVVT替换高磷脂APTT和低磷脂APTT。
对于上述各试验，不考虑试验中使用的凝血抑制剂，将测定的患者样品的筛选试验凝血时间与测定的正常贫血小板血浆的筛选试验凝血时间进行比较，并表示为比率(Rs)。此外，将测定的患者样品的确认试验凝血时间与测定的正常贫血小板血浆的确认试验凝血时间进行比较，并表示为比率(Rc)。将标准化比率(NR)表示为Rs/Rc。将NR与由正常健康受试者确定的截止比率进行比较。
在本发明的一个优选实施方案中，截止比率优选来自至少40名正常的健康受试者。如当前LA指南中所建议的那样确定截止值，该值大于正常样品分布的99％或者为正常样品的参数分布的平均值+2SD区间。测试血浆比率大于截止比率表明测试血浆中存在狼疮抗凝物，并且建议在12周后重复测试以确认循环抗磷脂抗体的持续存在。
在本发明的一个优选的实施方案中，示例性截止比率表示为约1.00至约1.20的NR，优选约1.00至约1.15的N，更优选约1.00至约1.10的N。
在本发明的一个优选的实施方案中，由至少40名正常的健康受试者来确定正常的贫血小板血浆的凝血时间。正常的健康受试者的平均凝血时间用于对测试血浆凝血时间进行标准化。
在另一个实施方案中，由正常的健康受试者库来确定正常贫血小板血浆的凝血时间。将所采掘的正常的健康受试者的凝血时间用于对测试血浆凝血时间进行标准化。
示例性研究
D-苯丙氨酰基-L-脯氨酰基-L-精氨酸-氯甲基酮(PPACK)是一种合成肽，其不可逆地结合至凝血酶的催化位点。参照图1至图3，示出了在SCT试验中使用PPACK，其中在测试期间(即，在混合研究设定中)将血浆测试样品与LA阴性血浆样品池以1:1的比例混合。通过混合研究，将存在于正常血浆中的凝血因子添加到疑似患有凝血障碍的测试血浆中。如果校正了凝血异常(凝血时间延长)，则测试血浆缺少凝血因子并且不具有LA。
在LA试验中引入PPACK会造成SCT筛选和SCT确认这两者的凝血时间延长，然而，对于LA阳性样品和LA阴性(贫血小板NPP)样品，PPACK对SCT筛选(低的磷脂浓度)和SCT确认(较高的磷脂浓度)试验的影响显著不同。参照图1，虽然对于LA阴性样品，PPACK对SCT筛选和SCT确认的影响相似，但对于LA阳性样品，PPACK对SCT筛选的影响远大于对SCT确认的影响。因此，参照图2，对于LA阴性样品，在高的PPACK浓度下，筛选/确认比率略微降低(在0nM、100nM和1000nM PPACK时，R分别为0.81、0.83和0.78)，而对于LA阳性样品，筛选/确认比率从没有PPACK时的1.09提高至有1000nM PPACK时的1.82，使得在相同的PPACK浓度下以LA阴性样品进行标准化时，LA阳性样品的标准化比率范围为1.36至2.34(参见图3)。
使用LA阴性样品以不同比例(LA阳性:LA阴性为1:1和1:3)稀释LA阳性样品，以进一步分析PPACK对LA检测的影响。当使用LA阴性样品将LA阳性样品稀释4倍时，在没有PPACK的情况下检测不到LA(NR：1.08)，但在1000nM PPACK的存在下明显变为LA阳性(NR：1.46)，从而突出了本文所述方法的提高的灵敏度。
现在参照图4至图6，PPACK模型证明了凝血酶抑制剂在dRVVT测试中的相同用途，其中在测试(即，在混合研究设定中)期间使测试样品与LA阴性样品以1:1的比例混合并稀释。
在SCT试验和dRVVT试验中使用PPACK表明：即使在混合研究中稀释样品也能够使试验灵敏度实现大幅提高，从而使得在通过添加贫血小板正常血浆以使来自因子缺乏和因子抑制剂的复杂影响最小化时，混合研究在检测LA中更为有用。观察到的LA阴性样品的标准化比率的降低也表明可能略微改善了试验特异性。
当使用dRVVT试验(表1)(无PPACK)对缺乏各种因子(LA阴性、因子V缺乏、因子VIII缺乏、因子VII缺乏、因子VIII/血管性血友病(von Willebrand)因子缺乏、因子IX缺乏、因子X缺乏、因子XI缺乏、因子XII缺乏，以及LA阳性血浆样品)的患者血浆样品(n＝18)进行测试时，两个缺乏因子V的血浆样品和一个缺乏因子X的样品表现出高水平的筛选比率(Rs)。在这三种显示凝血因子缺乏的异常血浆样品中，两种样品未通过dRVVT确认试验。因此，对于这两种失败的血浆样品，不能计算标准化比率(NR)。
表1：通过dRVVT筛选和dRVVT确认试验的患者样品
表2的结果公开了当在混合研究设定(测试血浆样品与NPP比例为1:1)中，在350nMPPACK存在下使用dRVVT测试以上血浆样品(LA阴性、因子V缺乏、因子VIII缺乏、因子VII缺乏、因子VIII/血管性血友病因子缺乏、因子IX缺乏、因子X缺乏、因子XI缺乏、因子XII缺乏，以及LA阳性血浆样品)时，仅有一个因子V缺乏的样品表现出略高的筛选比率(使用PPACK时为1.28，而使用dRVVT筛选时为4.28)。该研究报告了所有血浆样品的标准化比率，并解决了因子缺乏的问题(表2)。
表2：在PPACK存在下，使用1:1的混合研究设定的通过dRVVT筛选和dRVVT确认试验的患者样品
如表2所示，在350nM PPACK存在下，所报告的LA阳性样品的标准化比率不低于来自dRVVT的相应结果(参见表1)，这表明在350nM PPACK存在下，混合研究设定中的方法比dRVVT试验具有更好的灵敏度。
如下所述，虽然PPACK模型证明了对当前LA测试方法的显著改进，但各种凝血酶和因子Xa抑制剂的独特性提供了更丰富的方案，通过使用不同的抑制剂组合物，解决了LA测试的灵敏度和特异性问题。
参照图7，当用于dRVVT试验时，合成凝血酶抑制剂I-2581降低了LA阳性样品和NPP样品两者的dRVVT筛选/确认比率，当与具有提高LA试验灵敏度能力的抑制剂一起使用时，其有可能进一步提高LA试验的特异性。
在另一个实施方案中，参照图8，组合使用水蛭素和阿加曲班(两种直接凝血酶抑制剂)提供了此类组合与LA抗体靶向抗原的异质性相关的能力的另一个实例。水蛭素提高了LA阳性样品和NPP样品两者的dRVVT筛选/确认比率(图8，左图)。如图9所示，虽然在dRVVT测试中使用水蛭素提高了LA阳性样品的标准化比率，但也可能在没有标准化的情况下易于将正常样品错误分类为弱阳性(图8)。对于LA阳性样品，阿加曲班的使用通过降低NPP的筛选/确认比率(图8)而表现出有限的NR增加(图9)。当在混合研究中一起使用水蛭素和阿加曲班时，相比于dRVVT试验的结果(NR：1.64，数据未示出)，提高了LA测试灵敏度(如图9所示，在200ng/ml水蛭素和500ng/ml阿加曲班时，NR：1.66)，同时使正常样品的潜在错误分类最小化(图8)。
在另一方面，本发明是一种用于辅助诊断APS的系统，包括临床分析仪，例如但不限于ACL系列临床分析仪(Instrumentation Laboratory Company，Bedford，MA)，将其配置为：(a)使血浆样品与包含低浓度磷脂和凝血抑制剂的第一磷脂依赖性凝血试验试剂接触足够长的时间，以确定第一凝血时间，(b)使血浆样品与包含高浓度磷脂和凝血抑制剂的第二磷脂依赖性凝血试验试剂接触足够长的时间，以确定第二凝血时间，(c)计算机设备，其具有与所述分析仪单元有效通信的处理器，以及(d)非瞬时机器可读介质，包括可由处理器执行的指令，当该指令执行时，第一凝血时间和第二凝血时间转换成比率，将该比率与截止比率进行比较，并基于与所述截止比率的所述比较结果建立狼疮抗凝物的辅助诊断。
因此，这里描述的发明提供了一种检测LA的新方法。在本发明中，在使用APTT和dRVVT试验的LA检测中，凝血酶抑制剂PPACK的使用起到方法模型的作用。本发明获得了改进的LA试验灵敏度/特异性以及混合研究的更好利用性。各种凝血酶抑制剂和因子Xa抑制剂或此类抑制剂的组合可用于代替PPACK。具体而言，本发明证明了来自不同凝血抑制剂的协同效应可用于优化与LA抗体靶向抗原的异质性相关的LA测试灵敏度和特异性。

Claims (29)

1.一种用于检测患者体内与抗磷脂综合征相关的狼疮抗凝物的方法，包括：
a)在至少一种凝血抑制剂和低磷脂浓度的存在下，在磷脂依赖性凝血试验中检测来自所述患者的血浆样品的凝血时间；
b)在至少一种凝血抑制剂和高磷脂浓度的存在下，在磷脂凝血试验中检测所述血浆样品的凝血时间，所述高磷脂浓度高于步骤a)中的所述低磷脂浓度；
c)确定步骤a)中患者血浆的凝血时间与步骤b)中患者血浆的凝血时间的比率，并将患者的比率与由正常的健康受试者确定的截止比率进行比较。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)的磷脂依赖性凝血试验和步骤b)的磷脂依赖性凝血试验各自还包括正常的混合血浆。
3.根据权利要求1所述的方法，其中磷脂依赖性试验包括活化部分凝血活酶时间(APTT)。
4.根据权利要求1所述的方法，其中磷脂依赖性试验选自由下列物质组成的组：稀释的鲁塞尔氏蝰蛇毒液时间(dRVVT)、基于APTT的血小板中和试验(PNP)、基于APTT的六角相磷脂中和试验、基于APTT的高岭土凝血时间(KCT)、基于APTT的二氧化硅凝血时间(SCT)和稀释的凝血酶原时间(dPT)。
5.根据权利要求1所述的方法，其中至少一种凝血抑制剂包括至少一种凝血酶抑制剂。
6.根据权利要求5所述的方法，还包括选自由下列物质组成的组中的至少一种凝血酶抑制剂：D-苯丙氨酰基-L-脯氨酰基-L-精氨酸-氯甲基酮(PPACK)、I-2581、水蛭素、水蛭素衍生物、重组水蛭素、地西卢定、水蛭素类似物、比伐卢定、阿加曲班、美拉加群、达比加群以及它们的组合。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述凝血抑制剂包括至少一种因子Xa抑制剂，该因子Xa抑制剂选自由利伐沙班、阿哌沙班、依度沙班、贝曲西班、安他心、蜱抗凝血蛋白(TAP)以及它们的组合组成的组。
8.根据权利要求2所述的方法，还包括使用正常的混合血浆稀释所述患者的血浆样品。
9.根据权利要求2所述的方法，还包括使用正常的混合血浆以1:1稀释所述患者的血浆样品。
10.根据权利要求2所述的方法，还包括使用所述正常的混合血浆以1:2、1:3或1:4稀释所述患者的血浆样品。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述低磷脂浓度包括约0.002(g/l)至约0.2(g/l)的范围。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述高磷脂浓度包括约0.2(g/l)至约5.0(g/l)的范围。
13.一种用于检测患者体内与抗磷脂综合征相关的狼疮抗凝物的试剂盒，包括：
a)磷脂依赖性凝血试剂，其包含低磷脂浓度；
b)至少一种凝血抑制剂；以及，
c)所述磷脂依赖性凝血试剂，其包含高磷脂浓度，该高磷脂浓度高于a)中的低磷脂浓度。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，还包括正常的混合血浆。
15.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述磷脂依赖性凝血试剂包含APTT。
16.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述磷脂依赖性凝血试剂选自由下列物质组成的组：dRVVT、基于APTT的血小板中和试验(PNP)、基于APTT的六角相磷脂中和试验、基于APTT的高岭土凝血时间(KCT)、基于APTT的二氧化硅凝血时间(SCT)和稀释的凝血酶原时间(dPT)。
17.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述至少一种凝血抑制剂包括至少一种凝血酶抑制剂。
18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述至少一种凝血酶抑制剂选自由下列物质组成的组：D-苯丙氨酰基-L-脯氨酰基-L-精氨酸-氯甲基酮(PPACK)、I-2581、水蛭素、水蛭素衍生物、重组水蛭素、地西卢定、水蛭素类似物、比伐卢定、阿加曲班、美拉加群、达比加群以及它们的组合。
19.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述至少一种凝血抑制剂包括至少一种因子Xa抑制剂，该因子Xa抑制剂选自由利伐沙班、阿哌沙班、依度沙班、贝曲西班、安他心、蜱抗凝血蛋白(TAP)以及它们的组合组成的组。
20.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述凝血抑制剂和包含所述低磷脂浓度的所述磷脂依赖性凝血试剂装在同一容器中。
21.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述凝血抑制剂和包含所述高磷脂浓度的所述磷脂依赖性凝血试剂装在同一容器中。
22.根据权利要求14所述的试剂盒，其中所述正常的混合血浆与所述凝血抑制剂装在同一容器中。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述凝血抑制剂为凝血酶抑制剂和非凝血酶凝血抑制剂的组合物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中非凝血酶抑制剂包括因子Xa抑制剂。
25.根据权利要求2所述的方法，其中所述凝血抑制剂和所述正常的混合血浆的混合物降低了由血浆中因子缺乏或凝血抑制剂的存在而造成的干扰，并提高了用于检测狼疮抗凝物的方法的特异性和灵敏度。
26.一种用于检测患者体内与抗磷脂综合征相关的狼疮抗凝物的试剂盒，包括：
至少一种凝血抑制剂；以及
正常的混合血浆。
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述截止比率为约1.00至约1.20的比率NR。
28.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述低磷脂浓度包括约0.002(g/l)至约0.2(g/l)的范围。
29.根据权利要求13所述的试剂盒，其中所述高磷脂浓度包括约0.2(g/l)至约5.0(g/l)的范围。
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