KR20170005609A

KR20170005609A - 시나픽산을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품

Info

Publication number: KR20170005609A
Application number: KR1020150095863A
Authority: KR
Inventors: 손호용; 신우창; 김미선; 이수민
Original assignee: 안동대학교 산학협력단; 주식회사 국순당
Priority date: 2015-07-06
Filing date: 2015-07-06
Publication date: 2017-01-16
Also published as: KR101799803B1

Abstract

본 발명은 혈액에 대한 항응고 활성과 혈소판 응집 저해 활성을 나타내는 시나픽산(sinapic acid)을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것이다. 본 발명의 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 유효성분으로서의 다양한 식물체로부터 얻어지는 시나픽산은 혈액응고에 관련된 트롬빈, 프로트롬빈, 다수의 혈액응고인자를 강력히 저해하며, 또한 인간 혈소판 응집저해를 강력히 억제하여 혈전 생성을 효율적으로 억제할 수 있는 효과가 있으며, 인간 적혈구 용혈활성 없이, 혈행개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

시나픽산을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE SINAPIC ACID AS AN EFFECTIVE COMPONENT FOR PREVENTION OR TREATMENT OF DISEASES RELATED TO THROMBOSIS AND HEALTH FUNCTIONAL FOOD COMPRISING THE SAME}

본 발명은 혈액에 대한 항응고 활성과 혈소판 응집 저해 활성을 나타내는 시나픽산(sinapic acid)을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것이다.

인체 구성성분으로 혈액은 산소, 영양분, 노폐물의 운반 기능과 완충작용, 체온유지, 삼투압 조절 및 이온 평형유지, 수분 일정유지, 액성 조절작용, 혈압의 유지 및 조절, 생체방어 등 다양한 중요 기능들을 가지고 있다. 따라서, 혈액 및 혈액 순환은 인간의 생존에 필수사항이며, 혈관의 손상시에는 재빨리 혈전을 생성하여 혈액손실을 방지해야 한다. 그러나, 혈관 내의 과다한 혈전 생성은 혈액 순환을 방해하며, 심한 경우 혈관을 막아 심혈관계 및 뇌 조직의 심각한 손상을 나타내어 혈전증(thrombosis)을 야기한다. 이러한 혈전증은 1) 혈관내피세포의 이상, 2) 혈액응고인자(XII 인자, XI 인자, IX 인자, X 인자 등) 및 혈액응고효소(트롬빈, 프로트롬빈 효소)의 과다한 응고 활성, 3) 혈소판 응집 및 4) 생성된 혈전의 용해 시스템의 비정상적 작용이 그 원인으로 알려져 있다. 이러한 원인들은 개별적, 또는 복합적으로 작용하여 혈관 내 과도한 혈전생성을 야기하며, 혈전성 질환의 예방과 치료를 위해, 현재 1) 혈액응고인자의 활성을 저해하여 혈전 생성을 억제하는 헤파린, 쿠마린 등의 다양한 항응고제, 2) 혈소판 응집을 저해하여 혈전 생성을 억제하는 아스피린과 같은 항혈소판제, 3) 이미 생성된 혈전을 녹여 혈전생성을 억제하는 유로키네이즈와 같은 혈전용해제 등이 사용되고 있다. 그러나, 이들은 가격이 매우 높을 뿐 아니라 출혈성 부작용과 위장장해 및 과민반응 등으로 그 사용이 한정되고 있는 실정이다.

한편, 시나픽산은 3,5-Dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid, 4-Hydroxy-3,5-dimethoxy-cinnamic acid 또는 sinapinic acid로 불리며, phenylpropanoid 계의 hydroxycinnamic acid의 일종이다. 통상 복분자, 사과, 자두, 체리, 블루베리 등의 베리류의 과일 및 쌀, 귀리, 메밀 등의 곡류에서 일반적으로 존재하며, 특히, 과일 및 곡류로부터 제조되는 와인, 식초와 같은 발효식품에서 고농도로 발견된다(Sedej et al., 2012. J. Food Sci. 77, C954-C959; Mitani et al., 2013. Biosci Biotechnol, Biochem 77: 1623-1627). 시나픽산은 강력한 항산화 활성이 보고되어 있으며, 최근에는 고혈당 치료효과, 우울증 및 기억상실증 치료효과, 신경세포 보호효과, 항염증 활성, 혈관내피세포의 이상 예방효과, 항세균 효과(Ni'ciforovi'c N, and Abramovic H. 2014. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 13: 34-51) 등이 알려지고 있다. 그러나, 현재까지 혈액응고 활성 및 혈소판 응집저해에 따른 항혈전 활성은 보고된 바 없다.

시나픽산과 관련된 국내특허로는 “시나픽산 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 탈모방지 및 발모촉진용 조성물”이 10-1387081 (2014-04-14)에 등록되어 있으며, “페닐프로파노이드계 화합물을 포함하는 항불안 및 기억력개선 효과를 나타내는 조성물”이 10-0740566 (2007-07-11)에 등록되어 있다. 또한, “시나핀산을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학조성물”이 10-2012-0084504 (2012-07-30)에 공개되어 있다.

시나픽산과 관련된 국제특허로는 가축사료 첨가제로서의 시나픽산이 WO2005/0096836 (2005-10-20)에 공개되어 있으며, 항산화제인 시나픽산을 대량생산할 수 있는 방법이 JP 2000-256260 (2000-09-19)에, hydroxystilbenes-sinapic acid 반응산물 및 flavonol-sinapic acid 반응산물이 심혈관계 질환의 예방 치료의 사용 가능함이 JP 2014-0125464 (2014-07-07), JP 2014-0148472 (2014-08-21) 및 JP 2014-0162774 (2014-09-08)에 공개되어 있으며, stilbenes-sinapic acid 열 중합산물이 항비만제로 사용가능함이 JP 2014-0088355 (2014-05-15)에, sinapic acid를 이용한 화장품 조성물이 EP 2009-2117499 (2009-11-18)에 공개되어 있다. 또한, sinapic acid를 주성분으로 하는 brain function improver가 JP 1995-0179338 (1995-07-18)에, 서방형 폴리머로서 “functionalized sinapic acid and methyl sinapate”가 US 2012-8318973 (2012-11-27)에 등록되어 있다. 그러나, 현재까지 시나픽산과 관련된 항혈전 조성물 및 건강기능식품은 알려진 바 없다.

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2014-0125464

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2014-0148472

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본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 다양한 과일, 곡류 및 이들의 발효식품에서 발견되는 시나픽산이 강력한 항혈전 활성을 나타남을 확인하여, 시나픽산을 포함하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 물질을 포함하는 건강 기능 식품을 제공하고자 하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 다음의 구조식으로 표시되는 시나픽산(cinapic acid) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:

또한, 본 발명은 다음의 구조식으로 표시되는 시나픽산(cinapic acid) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈액 응고 저해용 조성물을 제공한다:

또한, 본 발명은 다음의 구조식으로 표시되는 시나픽산(cinapic acid) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈소판 응집 저해용 조성물을 제공한다:

또한, 본 발명은 다음의 구조식으로 표시되는 시나픽산(cinapic acid) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다:

본 발명의 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 유효성분으로서의 다양한 식물체로부터 얻어지는 시나픽산은 혈액응고에 관련된 트롬빈, 프로트롬빈, 다수의 혈액응고인자를 강력히 저해하며, 또한 인간 혈소판 응집저해를 강력히 억제하여 혈전 생성을 효율적으로 억제할 수 있는 효과가 있으며, 인간 적혈구 용혈활성 없이, 혈행개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 복분자 주박 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획으로부터 분리한 다양한 활성물질의 인간 혈소판 응집 저해 활성 평가도(Aggregometer)를 나타낸 것이다. 좌측으로부터 A: 디엠에스오(용매대조구), B: 아스피린 (0.5 mg/ml), C: 아스피린 (0.25 mg/ml), D: p-Coumaric acid (0.25 mg/ml), E: Caffeic acid (0.25 mg/ml), F: Sinapic acid (0.25 mg/ml) G: Ferulic acid (0.25 mg/ml), H: Syringic acid (0.25 mg/ml) 및 I : Vanillic acid (0.25 mg/ml)를 각각 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 복분자 주박의 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획으로부터 얻어진 시나픽산을 함유하는 혈액응고 관련 효소/혈액 응고인자 저해활성 및 인간 혈소판 응집저해 활성을 갖는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 건강 기능 식품에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명의 발명자들은 일정 방법으로 수득한 복분자 주박 추출물로부터 항혈전 활성 물질들을 회수하였고, 단리된 활성 물질들의 구조를 확인한 결과, ferulic acid, p-coumaric acid, caffeic acid, vanillic acid, syringic acid 및 sinapic acid 임을 확인하였으며, 이중 sinapic acid를 제외한 다른 물질들은 이미 다양한 식물체에서 분리되어 혈소판 응집저해능, 혈전생성 억제능이 보고되어 있어, 현재까지 혈액응고저해 활성 및 혈소판 응집저해활성이 알려지지 않은 sinapic acid를 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품으로 활용하고자 하였다. 상기의 sinapic acid는 다양한 과일류, 곡류 및 이들의 발효식품류로부터 회수가 용이하며, 강력한 혈액응고 저해활성 및 혈소판 응집저해활성이 이미 알려진 caffeic acid, p-coumaric acid, ferulic acid, syringic acid와 유사한 강력한 항혈전 활성을 나타내어, 신규의 항혈전제로서 사용 가능하다.

구체적으로, 본 발명자들은 복분자 주박으로부터 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 개발하기 위하여, 복분자 주박의 에탄올 추출물을 조제하고, 이를 순차적 유기용매 분획하여 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 잔류물 등을 수득하고, 이의 총폴리페놀, 총플라보노이드 등의 유용성분을 분석하고, 이를 각각 인간 혈장과 인간 트롬빈에 대한 트롬빈 직접저해(Thrombin Time), 프로트롬빈 저해(Prothrombin Time), 활성부분 트롬보플라스틴 타임(activated Partial Thromboplastin Time: aPTT) 및 혈소판 응집저해능을 평가하였다. 그 결과, 복분자 주박의 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획에서 현재 사용되고 있는 의약품인 아스피린(혈소판 응집저해제)보다 우수한 혈소판 응집저해 효과와 강력한 혈액응고 저해활성을 확인하였다. 이후, 에틸아세테이트 분획으로부터 반복된 silica-gel chromatography와 GC-Mass 분석을 통해 구조식 1의 ferulic acid(trans-4-Hydroxy-3-methoxycinnamic acid), 구조식 2의 p-coumaric acid(trans-4-hydroxycinnamic acid), 구조식 3의 caffeic acid(3,4-dihydroxycinnamic acid), 구조식 4의 vanillic acid(4-Hydroxy-3-methoxybenzoic acid), 구조식 5의 syringic acid(3,5-Dimethoxy-4-Hydroxybenzoic acid) 및 구조식 6의 sinapic acid(3,5-Dimethoxy-4-Hydroxycinnamic acid)를 확인하였으며, 특히, 각각에 대한 혈액응고 저해활성 및 혈소판 응집저해 활성을 평가한 결과, 구궂구조식 6의 sinapic acid를 신규의 항혈전 물질로 확인하였다.

(구조식 1)

(구조식 2)

(구조식 3)

(구조식 4)

(구조식 5)

(구조식 6)

따라서, 본 발명은 다음의 구조식으로 표시되는 시나픽산(cinapic acid) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:

본 발명의 sinapic acid는 혈전성 질환과 관련된 다양한 질환들의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 상기 질환들은, 예를 들어, 동맥 혈전증으로서, 급성 심근 경색증, 가슴 통증, 호흡 곤란, 의식 소실, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 두통, 운동 이상, 감각 이상, 성격 변화, 시력 저하, 간질 발작, 폐 혈전증, 심부정맥 혈전증, 하지 부종, 통증 및 급성 말초 동맥 폐쇄증 등을 들 수 있고, 정맥 혈전증으로서, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄 등을 들 수 있다.

본 발명의 sinapic acid를 포함하는 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.

이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.

바람직한 구체예로서, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.

바람직한 구체예로서, 경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등을 예시할 수 있다. 비수성용제, 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.

본 발명의 sinapic acid는 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

바람직한 구체예로서, sinapic acid의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏ 당 1 내지 1,000mg, 바람직하게는 100 내지 500mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 시나픽산은 하기 구체적인 실시예에서 충분히 설명되지만, 트롬빈과 프로트롬빈과 같은 혈액응고효소를 저해할 뿐만 아니라, 혈액응고와 관련되는 혈액응고인자를 효과적으로 저해하는 것으로 확인되었다.

따라서, 본 발명은 다음의 구조식으로 표시되는 시나픽산(cinapic acid) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈액 응고 저해용 조성물을 제공한다:

또한, 본 발명의 시나픽산은 하기 구체적인 실시예에서 충분히 설명되지만, 혈소판 응집을 효과적으로 저해하는 우수한 특징을 갖는다.

따라서, 본 발명은 다음의 구조식으로 표시되는 시나픽산(cinapic acid) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈소판 응집 저해용 조성물을 제공한다:

본 발명의 건강 기능 식품은 혈전성 질환의 예방 또는 개선에 효과적인 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 sinapic acid를 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 sinapic acid는 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 1.5중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100ml를 기준으로 0.02 내지 1.0g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다.

상기 향미제로는 타우마틴 및 레바우디오시드 A 또는 글리시르히진과 같은 스테비아 등의 천연 향미제 및 사카린, 아스파르탐 등의 합성 향미제를 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100ml 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g을 사용한다. 상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 sinapic acid는 100중량부 당 0.01 내지 약 5중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 하나의 구체예일뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1: 복분자 주박으로부터 에탄올 추출물 및 유기용매 분획물의 조제

㈜국순당에서 제조된 복분자주의 부산물로 얻어진 복분자 주박(수분함량 51%) 20 kg에 10배 부피의 에탄올을 가하고, 상온에서 2일간 3회 반복 추출하였다. 추출물은 감압 농축하여 분말로 제조하고 사용 전까지 저온 밀봉 보관하였다. 분획물 조제를 위해서는, 추출물을 증류수에 현탁한 후, 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적 분획하였으며, 최종적으로 물 잔류물을 얻었다. 추출물의 수득율은 1.52%이었으며, 분획물의 수득율은 표 1에 나타낸 바와 같이 헥센 분획물이 0.24%, 에틸아세테이트 분획물이 2.54%, 부탄올 분획물이 46.66%, 물 잔류물이 54.29%로 복분자 주박의 추출물은 대부분이 수용성 물질임을 확인하였다.

조제된 추출물 및 분획물들의 총 플라보노이드(total flavonoid), 총 폴리페놀(total polyphenol), 총당 및 환원당 함량을 측정하였다. 총 플라보노이드 함량 측정은 각각의 시료를 18시간 메탄올 교반 추출하고, 여과한 추출 검액 400μl에 90% diethylene glycol 4ml를 첨가하고 다시 1N NaOH 40μl를 넣고 37℃에서 1시간 반응 후 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 rutin을 사용하였다. 총 폴리페놀 함량은 추출 검액 400μl에 50μl의 Folin-ciocalteau, 100μl의 Na₂CO₃ 포화용액을 넣고 실온에서 1시간 방치한 후 725nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. 환원당은 DNS법으로, 총당은 phenol-sulfuric acid법을 이용하여 정량하였다. 그 결과는 다음 표 1에 나타내 바와 같이 에틸아세테이트 분획에서 각각 413 mg/g 및 15.73 mg/g의 매우 높은 함량의 폴리페놀 및 플라보노이드 성분을 확인하였다.

[표 1] 복분자 주박의 에탄올 추출물 및 분획물의 수율 및 이들의 성분 분석

실시예 2: 복분자 주박 에탄올 추출물 및 분획물의 혈액응고 저해활성 평가

실시예 1 의 복분자 주박 추출물 및 유기용매 분획물에 대한 항혈전 활성을 조사하였다. 항혈전 활성평가 중 혈액응고저해를 먼저 평가하였으며, 혈액응고 효소저해는 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임을 측정하여, 내인성 혈전생성기작인 혈액응고인자 저해활성은 에이피티 타임으로 측정하였다 [Sohn et al., 2004. Kor . J. Pharmacogn 35. 52-61; Kwon et al., 2004. J. Life Science, 14. 509-513; 류 등 2010. J. Life Science, 20. 922-928].

트롬빈 타임(Thrombin Time)

37℃에서 0.5U 트롬빈(Sigma Co., USA) 50μl와 20mM CaCl₂ 50μl, 다양한 농도의 시료 추출액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 혈장(control plasma, Thermo Fisher Scinentific Inc, MA, USA) 100μl를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 28.5초의 응고시간을 나타내었으며, 결과는 3회 이상 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 최종적으로는 시료 첨가시 응고시간/용매 대조구의 응고시간의 비로 나타내었다.

프로트롬빈 타임( prothrombin time)

표준혈장(MD Pacific Co., China) 70μl와 다양한 농도의 시료액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온 후, 130μl의 PT reagent를 첨가하고 혈장(control plasma, Thermo Fisher Scinentific Inc, MA, USA)이 응고될 때까지의 시간을 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 16.7초의 응고시간을 나타내었으며, 결과는 3회 이상 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 최종적으로는 시료 첨가시 응고시간/용매 대조구의 응고시간의 비로 나타내었다.

aPTT (activated Partial Thromboplastin Time)

혈장 (control plasma, Thermo Fisher Scinentific Inc, MA, USA) 100μl와 다양한 농도의 시료액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온한 후, 50μl의 aPTT reagent(Sigma, ALEXIN^TM, USA)를 첨가하고 다시 37℃에서 3분간 배양하였다. 이후 50μl CaCl₂(35mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였으며, 이 경우 52.2초의 응고시간을 나타내었고, 결과는 3회 이상 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 최종적으로는 시료 첨가시 응고시간/용매 대조구의 응고시간의 비로 나타내었다.

복분자 주박의 에탄올 추출물 및 분획물의 혈액응고 저해활성 측정 결과는 표 2에 나타내었다. 대조구로 사용된 아스피린(상품명: 프로텍트)은 5mg/ml 농도에서 무첨가구에 비해 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티 타임 모두 용매 대조구에 비해 15배 이상 연장된 응고시간을 나타내어 우수한 항혈전 효과를 나타내었다. 그러나, 복분자의 에탄올 추출물 및 헥센 분획물, 물 잔류물에서는 유의할 만한 혈액응고효소 및 혈액응고인자 저해 활성은 인정되지 않았으며, 에틸아세테이트 분획에서는 5mg/ml 농도에서 무첨가구에 비해 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티 타임 모두 용매 대조구에 비해 15배 이상 연장된 응고시간을 나타내었고, 부탄올 분획물(5mg/ml)에서는 에이피티 타임에서만 용매 대조구에 비해 15배 이상 연장된 응고시간을 나타내어 내인성 혈액응고 저해가 우수함을 확인하였다.

[표 2] 복분자 주박 에탄올 추출물 및 이의 분획물의 혈액 응고효소 및 혈액 응고인자 저해활성

실시예 3: 복분자 주박 에탄올 추출물 및 분획물의 인간 혈소판 응집 저해효과

복분자 주박 추출물 및 분획물의 항혈전 활성 평가의 일환으로 인간 혈소판에 대한 응집저해활성을 평가하였다. 혈소판 응집저해 활성은 다음의 방법에 준해 평가하였다.

혈소판 응집저해 활성(Platelet aggregation inhibition activity)

혈소판은 건강한 인간의 전혈로부터 3.2% sodium citrate 용액과 1:9의 비율로 혼합한 후, 1,100rpm에서 10분간 원심분리하여 상층의 PRP(platelet rich plasma)를 취하고, 이를 washing buffer(138mM NaCl, 2.7mM KCl, 12mM NaHCO₃, 0.36mM NaH₂PO₄, 5.5mM Glucose, 1mM EDTA, pH 6.5)로 1회 세척하였다. 이후, suspending buffer(138mM NaCl, 2.7mM KCl, 12mM NaHCO₃, 0.36mM NaH₂PO₄, 5.5mM Glucose, 0.49mM MgCl₂, 025% gelatin, pH 7.4)에 재 현탁한 후, 3,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 다시 suspending buffer에 재현탁 하였으며, 이때 혈소판 수는 4x10⁹/ml 되도록 조정하였다. 이후 1ml 현탁액에 2.5μl collagen을 가해 5분간 반응시키고, whole-blood aggregometer(Chrono-log, USA)를 사용하여 37℃에서 혈소판 응집을 측정하였다.

표 3에 나타낸 바와 같이, 아스피린은 우수한 인간 혈소판 응집저해 활성을 나타내었으며, 농도의존적인 응집저해 활성을 확인하였다. 복분자 주박 추출물(0.25 mg/ml)의 경우 예상과는 달리 오히려 혈소판 응집을 촉진시켜 용매 대조구에 비해 202%의 응집율을 나타내었으며, 헥센 분획은 혈소판 응집에 거의 영향을 미치지 않았다. 한편, 에틸아세테이트 분획의 경우 0.25 mg/ml농도에서 75.4%의 응집율을 나타내어, 동일농도의 아스피린보다는 미약하였으나 우수한 저해활성을 나타내었다. 부탄올 분획과 물 잔류물은 무첨가구에 비해 각각 혈소판 응집율이 54.6% 및 39.3%로 나타나, 임상의 항혈소판제인 아스피린보다 강력한 혈소판 응집활성이 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 민간에서 혈행개선에 도움이 된다고 알려진 복분자 뿐만 아니라 복분자 주박으로부터 얻어진 활성 분획은, 부작용이 심한 아스피린의 대치할 수 있는 항혈전제로 개발 가능함을 제시하고 있다.

[표 3] 복분자 주박 에탄올 추출물 및 이의 분획물의 인간 혈소판 응집저해 활성

실시예 4: 복분자 주박 에탄올 추출물의 에틸아세테이트로부터 활성물질의 분리 및 분리물질의 혈액응고효소/ 혈액응고인자 저해 활성 및 인간 혈소판 응집 저해효과 평가

상기 실시예 2 및 실시예 3의 결과를 바탕으로, 혈액 응고저해활성과 혈소판 응집저해 활성이 모두 우수한 에틸아세테이트 분획을 대상으로 활성물질을 단리하였다. 실시예 3의 에틸아세테이트 분획의 활성물질은 기존의 보고된 방법으로 성분을 분리하였다[Hwang 등, 2012. Biorganic Medicinal Chemistry Lett. 22: 706-708]. 즉, 에틸아세테이트 분획을 실리카겔에 로딩하고 크로마토그래피를 실시하였으며, 1차적으로 메틸렌클로라이드:메탄올을 농도구배하여 흘러내렸으며, 회수된 4개 분획들은 다시 메틸렌클로라이드:아세톤을 농도구배하여 흘러내렸다. 이후 얻어진 분획들은 기존의 보고와 같이 다시 RP-18 및 ODS 컬럼 크로마토그래피로 재분리하였다. 분리물질들은 GC-Mass 분석을 통해 ferulic acid, p-coumaric acid, caffeic acid, vanillic acid, syringic acid 및 sinapic acid 로 확인되었다.

상기 6종의 물질들을 대상으로 실시예 2와 동일한 방법으로 혈액응고 효소 및 혈액응고인자에 대한 저해활성을 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 측정하여 평가한 결과, 6종 분리물질들은 5 mg/ml 농도에서 용매 대조구에 비해 15배 이상 연장된 혈액응고시간을 나타내어, 강력한 혈액응고 저해활성을 나타내는 것으로 확인되었다(표 4). 이 중 ferulic acid (Xu et al, 1981, Zhongguo Yao Li Xue Bao. 2: 35-37), p-coumaric acid zhou et al., 2014, Pharmazie. 69: 615-620), caffeic acid (Luceri et al., 2007, Br J Nutr. 97: 458-463), vanillic acid (Dhananjaya, 2006, Toxicon. 48: 411-421) 및 syringic acid (Yuan et al., 2011, Chinese journal of new drugs 20: 1801?1804)는 기존의 항혈전 활성이 보고되어 있으나 sinapic acid의 경우 혈액응고 저해활성을 포함한 항혈전 활성이 보고된 바는 없다.

[표 4] 복분자 주박 추출물의 에틸아세테이트 분획으로부터 분리된 활성물질의 혈액 응고효소 및 혈액 응고인자 저해활성

또한, 상기 6종의 물질들을 대상으로 실시예 3과 동일한 방법으로 혈소판 응집 저해활성을 평가한 결과, p-coumaric acid, caffeic acid, sinapic acid는 각각 IC₅₀ (실험조건에서 혈소판 응집을 50% 저해하는 데 소요되는 농도)이 211 μg/ml, 256 μg/ml 및 232 μg/ml로 나타나, 항혈전제로 사용되고 있는 아스피린의 IC₅₀ (415 μg/ml )보다 매우 낮아 강력한 항혈전 활성을 나타내었다.

또한, 이미 혈소판 응집저해활성이 보고된 syringic acid (Yuan et al., 2011, Chinese journal of new drugs 20: 1801-1804), vanillic acid (Dhananjaya, 2006, Toxicon. 48: 411-421), ferulic acid (Xu et al, 1981, Zhongguo Yao Li Xue Bao. 2 : 35-37)의 경우, 상기의 p-coumaric acid, caffeic acid, sinapic acid보다는 상대적으로 약한 혈소판응집저해 활성을 나타내었으나, syringic acid, vanillic acid, ferulic acid는 0.25 mg/ml 농도에서, 동일농도의 아스피린과 유사한 혈소판 응집저해를 나타내었다(도 1). 그러나, 본 발명의 sinapic acid는 아스피린보다 강력한 혈소판 저해활성을 나타내며, 현재까지 이에 대한 보고는 없다. 따라서, sinapic acid를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물 및 건강 기능 식품은 혈전성 질환의 예방 또는 치료용으로 적합하다고 판단되며, sinapic acid가 강력한 항산화 활성과 함께 치매예방, 심혈관 질환 예방, 우울증 치료 및 신경세포 보호효과가 잘 알려져 있으므로, 상기의 조성물 및 건강 기능 식품은 부가적인 건강상의 이익을 제공할 수 있다.

[표 5] 복분자 주박 추출물의 에틸아세테이트 분획으로부터 분리한 활성물질의 인간 혈소판 응집 저해 활성

실시예 5: 복분자 주박 추출물의 에틸아세테이트 분획물로부터 단리한 활성물질의 인간 적혈구 용혈 활성

실시예 4에서 분리된 활성물질의 급성독성 가능성을 평가하기 위해 인간 적혈구 용혈활성을 평가하였으며, 그 결과는 표 6에 나타내었다. 이때 용혈활성은 기존의 보고(정인창, 손호용, 2014년. Korean J. Microbiol. Biotechnol. 42: 285-292)에 준해 평가하였으며, 간단하게는 PBS로 3회 수세한 인간 적혈구 100 μl를 96-well microplate에 가하고 다양한 농도의 시료용액 100 μl를 가한 다음 37℃에서 30분간 반응시켰으며, 이후, 반응액을 10분간 원심분리(1,500 rpm)하여 상등액 100 μl를 새로운 microtiter plate로 옮긴 후 용혈에 따른 헤모글로빈 유출 정도를 414 nm에서 측정하였다. 시료의 용매 대조구로는 DMSO (2%)를 사용하였으며, 적혈구 용혈을 위한 실험 대조구로는 Triton X-100 (1 mg/ml)를 사용하였다. 용혈활성은 다음의 수식을 이용하여 계산하였다.

평가 결과, 대조구로 사용된 DMSO와 물은 용혈활성이 없었으며, Triton X-100은 1 mg/ml 농도에서 적혈구를 100% 용혈시킴을 확인하였다. 그러나, sinapic acid를 포함한 분리된 활성물질은 모두 적혈구 용혈활성이 나타나지 않았다.

[표 6] 복분자 주박 추출물의 에틸아세테이트 분획으로부터 분리한 활성물질의 인간 적혈구 용혈활성

Claims

다음의 구조식으로 표시되는 시나픽산(cinapic acid) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
다음의 구조식으로 표시되는 시나픽산(cinapic acid) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈액 응고 저해용 조성물:
다음의 구조식으로 표시되는 시나픽산(cinapic acid) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈소판 응집 저해용 조성물:
다음의 구조식으로 표시되는 시나픽산(cinapic acid) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품: