KR101740829B1

KR101740829B1 - 아이스플란트 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품

Info

Publication number: KR101740829B1
Application number: KR1020150183496A
Authority: KR
Inventors: 손호용; 김용식; 김미선
Original assignee: 안동대학교 산학협력단; 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2015-12-22
Filing date: 2015-12-22
Publication date: 2017-05-29

Abstract

본 발명은 아이스플란트(Ice plant; Mesembryanthemum crystallinum) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증(thrombosis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 아이스플란트 열수 추출물로부터 유기 용매 분획된 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물, 물 잔류물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 혈액 응고 저해를 통한 혈전증의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것이다. 본 발명의 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 유효성분으로서의 아이스플란트 추출물은 혈전 생성 관련 효소 저해 효과 및 혈액 응고 인자의 저해 효과에 의한 강력한 항혈전 활성을 나타냄과 동시에, 인간 적혈구에 대한 용혈 활성을 전혀 나타내지 않고, 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성 조건 및 혈장 내에서도 혈전 생성 관련 효소 저해 효과 및 혈액 응고 인자 저해 효과의 손실이 나타나지 않으므로, 혈행 개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있을 것으로 기대되며, 상기 유효성분은 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 상시 복용이 가능한 형태로 조제할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 제약 산업 및 식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Description

아이스플란트 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE EXTRACTION OF ICE PLANT AS AN EFFECTIVE COMPONENT FOR PREVENTION OR TREATMENT OF THROMBOSIS AND HEALTH FUNCTIONAL FOOD COMPRISING THE SAME}

본 발명은 아이스플란트(Ice plant; Mesembryanthemum crystallinum) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증(thrombosis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 아이스플란트 열수 추출물로부터 유기 용매 분획된 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물, 물 잔류물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 혈액 응고 저해를 통한 혈전증의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것이다.

인체 구성 성분으로서의 혈액은 산소, 영양분, 노폐물의 운반 기능과 완충 작용, 체온 유지, 삼투압 조절 및 이온 평형 유지, 수분 일정 유지, 액성 조절 작용, 혈압의 유지 및 조절, 생체 방어 등 다양한 중요 기능들을 가지고 있다. 정상적인 혈액 순환은 체내에서의 혈액 응고 반응계와 혈전 용해 반응계가 상호 보완적으로 조절되면서 혈액 순환을 용이하게 하며, 이들 중 혈액 응고 반응계의 기작은 혈관벽에 혈소판이 점착, 응집하여 혈소판 혈전을 형성한 후, 혈액 응고계가 활성화되어 혈소판 응집괴를 중심으로 피브린 혈전이 형성되는 것으로 보고되어 있다.

한편, 피브린 혈전의 생성은 수많은 혈액 응고 인자들의 여러 단계 반응을 거쳐 피브린 응고에 관여하는 트롬빈이 활성화되어, 최종적으로 피브리노겐으로부터 피브린 단량체를 생성하게 하며, 피브린 단량체들은 칼슘에 의해 중합되어, 혈소판과 내피세포에 결합하게 되며 XIII 인자에 의해 교차 결합된 피브린 폴리머를 형성하면서 영구적인 혈전을 생성하게 된다. 또한, 트롬빈은 혈소판, V 인자, VII 인자들을 활성화시켜 혈액 응고 반응을 촉진시키는 등 혈전 생성에 중추적 역할을 하게 된다. 따라서, 트롬빈의 활성 저해물질은 과다한 혈액 응고 이상으로 발생하는 다양한 혈전성 질환에 매우 유용한 예방 및 치료제로 사용될 수 있다. 한편, 내인성 혈전 생성 경로에는 XII 인자, XI 인자, IX 인자, X 인자의 순차적 활성화에 이은 프로트롬빈의 활성화가 최종적으로 트롬빈을 활성화하는 것으로 알려져 혈액 응고 인자의 특이적 저해 역시 중요한 혈전성 질환 치료제의 개발 타겟이 되고 있다. 현재까지, 혈전성 질환의 예방과 치료에 헤파린, 쿠마린, 아스피린, 유로키네이즈 등의 다양한 항응고제, 항혈소판제, 혈전용해제 등이 사용되고 있으나, 이들은 가격이 매우 높을 뿐 아니라, 출혈성 부작용과 위장 장해 및 과민 반응 등으로 그 사용이 한정되고 있는 실정이다.

아이스플란트는 아프리카와 서유럽, 북미, 남미 그리고 호주의 건조 지역에 서식하는 다년생 다육 식물로서 주로 우기에 발아하여 C3형 광합성 식물로 성장하다가 이후 CAM형 광합성 식물로 전환된다. 이러한 전환 시기에 특징적인 epidermal bladder cell을 형성하는 데, 이 bladder cell은 D-pinitol과 베타 카로틴, myo-inositol 및 다량의 미네랄을 포함하여, 마치 잎 표면에 얼음이 맺힌 것처럼 보이게 한다. '아이스플란트'라는 이름은 잎의 얼음 결정처럼 보이는 blader cell 때문에 붙여진 이름이며, 이명으로는 Sea fig, 수정채(水晶菜)로도 불린다. 건강식으로 식용되는 아이스플란트의 잎은 다육 다즙의 조직으로 어긋나는 형태로 되어 있고, 평평한 유선형 모양의 가장 자리가 너울거리는 형태를 띄고 있다. 잎의 엽액(葉腋)에서 꽃 잎자루는 화려하고 하얀색에서 붉은색을 띄는 것이 있으며, 많은 가지와 함께 5개의 실모양의 꽃잎과 3월과 8월 사이에 습기 진 때에 열리는 열매를 가지고 있다. 꽃과 과일에는 oxalate 함량이 높기 때문에 과량 투여시에 잠재적으로 독성을 나타낼 수 있으며(Jacob, RH 등. 1989. Australian Veterinary Journal 66: 91-92), 잎은 천연 당뇨치료제로 알려진 D-pinitol(3-O-Methyl-D-chiro-inositol)을 다량 함유하여 민간에서는 당뇨 치료에 특효로 알려져 있다(Sakae 2009, Plant Prod. Sci. 12: 37-46).

아이스플란트에 관한 학술적 연구는 주로 건조 및 산화적 스트레스에서 나타나는 식물체의 적응 및 변화에 대한 연구(Kirch HH 등, 2000, Plant Physiology 123: 111-124)가 대부분이며, 관련 유전자의 유용 식물의 이식이 활발히 진행되고 있다(Konieczny R. 2011. J. Plant Physiology 168: 722-729). 최근, 국내에서 인공 수경 재배(차미경 등, 2014. Protected Horticulture and Plant Factory 23: 371-375)가 알려지면서 재배가 본격화되고 있는 실정이며, 아이스플란트의 유용 생리 활성으로는 항당뇨(Lee BH 등, 2014, J Sci Food Agric. 94: 2266-2273), 항산화(Bouftira I 등, 2009. Asia J. Chemistry. 21: 549-559), 항염증, 항비만, 기억력 증대 효과(Lee BH 등, 2014, J Sci Food Agric. 94: 2266-2273), 암세포 성장 억제(Lin TH 등, 2013. Int. J. Mol. Sci. 14: 9790-9802), 지질 대사 활성(Drira R 등, 2015. Med Food, Epub aheda of print), pancreatic lipase 저해, α-glucosidase 저해, NO 생성억제 활성(Lee SY 등, 2015. J. Life Sci. 25: 638-645)등이 보고되어 있다.

또한, 아이스플란트와 관련된 특허로는 추출물의 보습력을 이용하는 외용제 특허로, 일본 공개특허 JP 2009-0029734 (2009-02-12) "External preparation for skim" 및 일본 공개특허 JP 2006-0068005 (2006-03-16) "PROTEIN WITH RNP-1 MOTIF HAVING ACTIVITY OF IMPROVING SALT OR HEAT STRESS TOLERANCE AND DNA ENCODING THE SAME PROTEIN"이 알려져 있다. 그러나, 현재까지 혈액 응고 저해를 통한 강력한 항혈전 활성을 나타내면서 독성이 없는 아이스플란트의 활성 추출물에 대한 특허는 알려진 바 없다.

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2009-0029734

A

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2006-0068005

A

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 아이스플란트 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 제공하고자 하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 아이스플란트 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 아이스플란트 추출물은 아이스플란트의 열수 추출물 또는 에탄올 추출물인 것이 바람직하다.

상기 아이스플란트의 열수 추출물은 상기 열수 추출물을 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차 분획하여 수득되는 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물, 물 잔류물 또는 이들의 혼합물인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 아이스플란트 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.

본 발명의 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 유효성분으로서의 아이스플란트 추출물은 혈전 생성 관련 효소 저해 효과 및 혈액 응고 인자의 저해 효과에 의한 강력한 항혈전 활성을 나타냄과 동시에, 인간 적혈구에 대한 용혈 활성을 전혀 나타내지 않고, 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성 조건 및 혈장 내에서도 혈전 생성 관련 효소 저해 효과 및 혈액 응고 인자 저해 효과의 손실이 나타나지 않으므로, 혈행 개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있을 것으로 기대되며, 상기 유효성분은 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 상시 복용이 가능한 형태로 조제할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 제약 산업 및 식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 발명자들은 아이스플란트를 대상으로 항혈전 효능을 검정하기 위하여, 일정 방법으로 아이스플란트 추출물을 조제하고, 상기 추출물과 이의 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 부탄올 분획 후의 물 잔류물을 항혈전 활성 성분으로 회수하였으며, 상기 추출물 및 분획물들은 인간 적혈구에 대해 용혈 활성은 전혀 나타내지 않으면서도, 열 안정성과 산 안정성이 우수한 특징을 가짐을 확인함으로써 상기 추출물 및 분획물들을 혈전증의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품으로 활용하고자 하였다.

구체적으로, 본 발명자들은 민간에서 당뇨 및 혈액 순환 개선 효과가 우수하다고 알려진 아이스플란트를 이용하여 혈전증의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 개발하기 위하여, 아이스플란트를 대상으로 열수 추출물 및 에탄올 추출물을 각각 조제하고, 이들의 항혈전 활성을 인간 트롬빈에 대한 트롬빈 직접 저해(Thrombin Time), 프로트롬빈 저해(Prothrombin Time) 및 활성부분 트롬보플라스틴 타임(activated Partial Thromboplastin Time: aPTT)을 통하여 평가하여, 양호한 항응고 활성이 있음을 확인하였으며, 열수 추출물을 순차적으로 유기용매 분획하여 얻은 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 부탄올 분획 후의 물 잔류물에서 매우 강력한 혈액 응고 인자 저해 활성을 확인하였으며, 상기 추출물 및 활성 분획물들은 인간 적혈구에 대한 용혈활성은 나타내지 않음을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 아이스플란트 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하에서는, 본 발명의 아이스플란트 추출물 및 각 활성 분획물의 제조 방법 및 효능 실험 등을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명의 발명자들은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 아이스플란트로부터 추출물을 조제하는 단계; 아이스플란트 추출물로부터 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올의 순차적 유기용매 분획물 조제 및 이후 얻어지는 물 잔류물의 조제 단계; 상기 추출물 및 분획물의 항혈전 활성 평가 단계 및 에틸아세테이트 분획, 부탄올 분획물 및 부탄올 분획 후의 물 잔류물의 활성물질의 안정성 조사 단계의 실험들을 수행하였다.

본 발명의 조성물에 포함되는 "아이스플란트 추출물"은 2015년 국내에서 재배된 아이스플란트의 성숙된 전초를 채취하여 세척한 후 마쇄하는 단계, 이를 용매로 추출하는 단계 및 상기 추출액을 0.06mm 이하의 여과망을 사용하여 여과하고, 이를 감압농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용매는 물(냉수, 열수), 주정, 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 주정, 프로판올, 부탄올 등), 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매 등을 이용할 수 있으며, 열수, 또는 95% 에탄올 추출이 가장 바람직하다.

바람직한 구체예로서, 본 발명의 아이스플란트 추출물은 아이스플란트를 열수 또는 에탄올로 추출할 수 있다. 또한, 상기 열수 또는 에탄올 추출물은 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올의 유기용매로 순차 또는 각각 분획하여 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 잔류물을 추가적으로 수득할 수도 있다.

본 발명에서는, 아이스플란트의 추출물을 5mg/ml의 농도로 하여 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 측정한 결과, 무첨가구에 비해 증가된 트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 나타내어 양호한 혈전 생성 억제 활성을 확인하였다.

또한, 아이스플란트 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 경우, 농도 의존적으로 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 연장시키면서, 강력한 혈전 생성 억제를 나타내었다. 또한, 부탄올 분획물 및 부탄올 분획 후의 물 잔류물의 경우에는 강력한 혈액 응고인자 저해와 함께, 트롬빈 저해가 나타났으며, 프로트롬빈 저해는 미약하였다.

본 발명의 아이스플란트 추출물 및 이의 활성 분획물들은 감압건조 및 동결건조, 또는 분무건조 등과 같은 통상적인 분말화 과정을 거쳐 분말로 제조될 수 있다. 이들은 혈장 내의 다양한 분해효소에 분해되지 않으며, 100℃의 열처리와 pH 2의 인체 위 내의 pH에서도 활성을 유지한다.

본 발명의 유효성분은 혈전증과 관련된 다양한 질환들의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 상기 질환들은, 예를 들어, 동맥 혈전증으로서, 급성 심근 경색증, 가슴 통증, 호흡 곤란, 의식 소실, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 두통, 운동 이상, 감각 이상, 성격 변화, 시력 저하, 간질 발작, 폐 혈전증, 심부정맥 혈전증, 하지 부종, 통증 및 급성 말초 동맥 폐쇄증 등을 들 수 있고, 정맥 혈전증으로서, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄 등을 들 수 있다.

본 발명의 유효 성분을 포함하는 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.

이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.

바람직한 구체예로서, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.

바람직한 구체예로서, 경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등을 예시할 수 있다. 비수성용제, 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.

본 발명의 유효 성분은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 본 발명의 약학적 조성물에서 유효성분의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏ 당 1 내지 5,000mg, 바람직하게는 100 내지 3,000mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.

본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.

또한, 본 발명의 건강 기능 식품은 혈전증의 예방 또는 개선에 효과적인 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 유효성분을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 유효성분은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100ml를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다.

상기 향미제로는 타우마틴; 레바우디오시드 A 또는 글리시르히진과 같은 스테비아 등의 천연 향미제 및 사카린, 아스파르탐 등의 합성 향미제를 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100ml당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g을 사용한다. 상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 유효성분 100중량부 당 0.01 내지 약 20중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 일 구체예일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1: 아이스플란트 추출물 제조 및 이들의 유용성분 분석

2015년 국내에서 재배된 아이스플란트(수분함량 97±0.7%)를 구입하여, 흐르는 물에 수세하여 이물질을 제거한 후, 에탄올 추출물 및 열수 추출물 제조에 사용하였다. 에탄올 추출물 조제시에는 아이스플란트 시료에 대해 10배의 에탄올을 가하고, 상온에서 2회 반복 추출한 후 추출액을 모아 필터링한 후, 감압 농축하여 분말로 제조하였다. 열수 추출물의 경우에도 동일하게 아이스플란트 시료에 대해 10배의 증류수를 가하고 100℃에서 1시간 가열 추출한 후 방냉하고, 다시 상기 과정을 1회 반복한 후 추출액을 모아 필터링한 후, 감압 농축하여 분말로 제조하였다. 각각의 추출 효율 및 추출물의 성분 분석 결과는 표 1에 나타내었다. 성분 분석으로 총 폴리페놀, 총 플라보노이드, 총 당 및 환원당 함량을 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 추출 검액 400μl에 50μl의 Folin-ciocalteau, 100μl의 Na₂CO₃ 포화용액을 넣고 실온에서 1시간 방치한 후 725nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. 총 플라보노이드 함량은 각각의 시료를 18시간 메탄올 교반 추출하고, 여과한 추출 검액 400μl에 90% diethylene glycol 4ml를 첨가하고 다시 1 N NaOH 40μl를 넣고 37℃에서 1시간 반응 후 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 rutin을 사용하였다. 환원당은 DNS법으로, 총 당은 phenol-sulfuric acid법을 이용하여 정량하였다.

표 1에 나타낸 바와 같이, 아이스플란트는 열수 추출 효율이 에탄올 추출 효율보다 1.5배 높았으며, 추출물의 총 폴리페놀 함량은 유사하였으나, 총 플라보노이드 함량은 에탄올 추출물에서 약 1.9배 높게 나타났다. 반면, 열수 추출물에서 총 당 함량이 에탄올 추출물보다 1.5배 이상 높게 나타났으며, 환원당 함량은 특이하게 에탄올 추출물에서 더욱 높게 나타났다.

실시예 2: 아이스플란트 추출물의 혈액응고 저해활성

실시예 1의 에탄올 추출물 및 열수 추출물의 혈액 응고 저해 활성을 평가하여 그 결과를 표 2에 나타내었다. 이때, 아이스플란트 추출물의 혈액 응고 저해 활성 평가 방법은 기존에 보고된 방법에 준해 평가하였으며(Sohn et al., 2004. Kor. J. Pharmacogn 35. 52-61; Kwon et al., 2004. J. Life Science, 14. 509-513; 류 등 2010. J. Life Science, 20. 922-928), 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티티 타임을 측정하였다. 혈장은 시판 control plasma(MD Pacific Technology Co., Ltd, Huayuan Industrial Area, China)를 사용하였으며 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티티 측정법은 다음과 같은 과정으로 수행되었다.

트롬빈 타임(Thrombin Time)

37℃에서 0.5U 트롬빈(Sigma Co., USA) 50μl와 20 mM CaCl₂ 50μl, 다양한 농도의 시료 추출액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 혈장 100μl를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 32.1초의 응고시간을 나타내었다. 트롬빈 저해 효과는 3회 이상 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 트롬빈 저해 활성은 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값으로 나타내었다.

프로트롬빈 타임( prothrombin time)

표준혈장(MD Pacific Co., China) 70μl와 다양한 농도의 시료액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온 후, 130μl의 PT reagent를 첨가하고 혈장이 응고될 때까지의 시간을 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 18.1초의 응고시간을 나타내었다. 프로트롬빈 저해활성은 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값으로 나타내었다.

aPTT (activated Partial Thromboplastin Time)

혈장 100μl와 다양한 농도의 시료 추출액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온한 후, 50μl의 aPTT reagent(Sigma, ALEXINTM)를 첨가하고 다시 37℃에서 3분간 배양하였다. 이후 50μl CaCl₂(35mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였으며, 이 경우 55.1초의 응고시간을 나타내었다. aPTT의 결과는 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 혈액응고인자 저해활성은 시료 첨가시의 aPTT를 용매 대조구의 aPTT로 나눈 값으로 나타내었다.

표 2에 나타난 바와 같이, 에탄올 및 열수 추출물 모두 5mg/ml 농도에서 양호한 혈액응고 저해활성을 나타내었으며, 특히 트롬빈 타임이 무첨가구에 비해 1.2~1.23배, 에이피티 타임은 1.2~1.32배 연장된 반면, 외인성 혈전 생성과 관련된 프로트롬빈 타임은 오히려 0.68~0.76배를 나타내어, 아이스플란트 추출물은 트롬빈 저해활성 및 혈액응고인자 저해(에이피티 타임)가 우수함을 확인하였다. 이때, 대조구로 사용된 아스피린은 1.5mg/ml 농도에서 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 각각 1.58배, 1.48배 및 1.76배 연장시켰다.

실시예 3: 아이스플란트 추출물의 순차적 유기 용매 분획물의 조제 및 이들의 성분 분석

상기 실시예 1로부터 얻은 아이스플란트 열수 추출물을 대량 조제한 후, 이를 대상으로 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적 유기용매 분획하였으며, 최종적으로 물 잔류물을 회수하였다. 열수 추출의 추출효율과 유기용매 분획 효율, 추출물/분획물의 성분 분석 결과는 표 3에 나타내었다.

표 3에 나타낸 바와 같이, 아이스플란트 열수 추출물은 89.4% 이상이 물 잔류로 이행되었으며, 부탄올 분획물은 9.6%, 에틸아세테이트 분획물은 0.8% 분획수율을 나타내었으며, 헥센 분획은 극미량 회수되었다. 이러한 결과는 100g 아이스플란트로부터 부탄올 분획물은 약 0.143g, 에틸아세테이트 분획물은 약 0.012g 회수할 수 있음을 의미하며, 상기 부탄올 및 에틸아세테이트 분획물은 매우 정제된 것으로 판단된다. 특히 에틸아세테이트의 유기용매 특성을 고려할 때, 기존의 보고된 myo-inositol, pinitol 등은 에틸아세테이트 분획의 항혈전 활성 성분과는 관련이 없는 것으로 판단된다.

한편, 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량 분석 결과 아이스플란트 열수 추출물보다 이의 에틸아세테이트 분획물에서 7.4배의 높은 폴리페놀 함량 및 15.1배의 높은 플라보노이드 함량을 나타내었다. 부탄올 분획물에서는 열수 추출물과 유사한 폴리페놀 함량 및 1.47배의 플라보노이드 함량을 나타내었으며, 분획물의 대부분을 차지하는 물 잔류물은 열수 추출물과 유사한 성분 분석 결과를 나타내었다. 따라서, 아이스플란트 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 다양한 생리활성을 나타내리라 예상되었으며, 실제 분석 결과, 상기 분획물은 강력한 항산화 활성 및 nitrite 소거능을 나타내었다.

실시예 4: 아이스플란트 추출물의 순차적 유기 용매 분획물의 혈액응고저해활성 평가

실시예 1 및 실시예 3에서 얻어진 아이스플란트 열수 추출물 및 이의 분획물의 혈액응고 저해활성을 실시예 2의 방법과 동일하게 평가하였으며, 그 결과를 표 4에 나타내었다.

표 4에 나타낸 바와 같이, 아스피린은 1.5mg/ml 농도에서 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 각각 1.58배, 1.48배 및 1.76배 연장시켜 우수한 항혈전 활성을 나타내었다. 한편, 아이스플란트의 에틸아세테이트 분획은 5mg/ml 농도에서 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임 모두 아스피린보다 강력한 항혈전 활성을 나타내었으며, 부탄올 분획물 및 물 잔류물은 트롬빈 타임 및 에이피티 타임 측정에서 아스피린과 유사한 저해활성을 나타내었다. 그러나, 상기 분획물은 모두 7mg/ml 농도에서 내인성 혈전 생성경로와 관련된 에이피티 타임을 모두, 무첨가구에 비해 15배 이상 연장시켰으며, 특히 에틸아세테이트 분획은 매우 강력한 트롬빈 및 프로트롬빈 저해를 나타내었다. 이러한 혈액응고저해는 농도 의존적으로 나타났다.

한편, 부탄올 분획물 및 물 잔류물의 경우, 프로트롬빈 타임 측정 결과에서 제시한 바와 같이, 프로프롬빈 저해는 매우 미미하여 외인성 혈전 생성 억제는 미약하며, 혈관의 상처없이 혈관내에서 다양한 원인에 의해 생성되는 내인성 혈전 생성 억제에 기여하리라 판단된다. 이러한 결과는, 아이스플란트가 식용으로 이용되고 있음을 감안하면, 아이스플란트 추출물의 조정제물인 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 잔류물은 상업적인 항혈전제로 개발가능하리라 판단되며, 위장 장해 등의 부작용을 나타내는 기존의 항혈전제인 아스피린 등을 대치할 수 있을 것으로 판단된다. 또한, 아이스플란트의 상기 분획물들이 우수한 항산화 활성, 발암억제 활성을 나타내어 혈행개선 및 항혈전 활성에 부가적으로 기여하리라 예상된다.

실시예 5: 아이스플란트 추출물 및 이의 분획물의 인간 적혈구 용혈 활성

아이스플란트는 식품원료로 등록되어 안전성이 확보된 식용식물이다. 아이스플란트 열수 추출물 및 이의 분획물의 급성독성 가능성을 평가하기 위해 인간 적혈구 용혈 활성을 평가하였으며, 그 결과는 표 5에 나타내었다. 이때, 용혈 활성은 기존의 보고(정인창, 손호용, 2014년 ㆍKorean J. Microbiol. Biotechnol. 42: 285-292)에 준해 평가하였으며, 간단하게는 PBS로 3회 수세한 인간 적혈구 100μl를 96-well microplate에 가하고 다양한 농도의 시료용액 100μl를 가한 다음 37℃에서 30분간 반응시켰으며, 이후, 반응액을 10분간 원심분리(1,500rpm)하여 상등액 100μl를 새로운 microtiter plate로 옮긴 후 용혈에 따른 헤모글로빈 유출 정도를 414nm에서 측정하였다. 시료의 용매 대조구로는 DMSO(2%)를 사용하였으며, 적혈구 용혈을 위한 실험 대조구로는 Triton X-100(1mg/ml)를 사용하였다. 용혈 활성은 다음의 수식을 이용하여 계산하였다.

표 5에 나타난 바와 같이, 대조구로 사용된 DMSO와 물은 용혈 활성이 없었으며, triton X-100은 1mg/ml 농도에서 적혈구를 100% 용혈시킴을 확인하였다. 한편, 아이스플란트 열수 추출물 및 이의 분획물들은 0.5mg/ml 농도까지 전혀 적혈구 용혈현상이 나타나지 않아 급성독성 및 적혈구 용혈 활성은 없음을 확인하였다.

실시예 6: 아이스플란트 추출물 및 에틸아세테이트 분획물 , 부탄올 분획물 및 물 잔류물의 혈장, 산 및 열 안정성 평가

상기 실시예 1 및 실시예 3에서 얻은 아이스플란트 열수 추출물, 이의 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 잔류물을 대상으로 항혈전 활성에 대한 혈장 안정성, 열 안정성 및 산 안정성을 확인하였다. 열수 추출물로부터 조제된 활성 분획물은 100℃에서 1시간 열 처리, pH 2(0.01M HCl)에서의 1시간 처리, 혈장에서 1시간 처리시에도 혈액 응고 저해 활성의 심각한 감소가 나타나지 않아 높은 안정성을 나타내었다. 따라서, 아이스플란트 추출물은 내산성, 내열성을 가진 다양한 성분의 항혈전 활성물질을 포함하고 있음을 확인하였다.

Claims

아이스플란트(Mesembryanthemum crystallinum) 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 아이스플란트의 열수 추출물은 상기 열수 추출물을 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차 분획하여 수득되는 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물, 물 잔류물 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
아이스플란트(Mesembryanthemum crystallinum) 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품.