KR102195404B1

KR102195404B1 - 섬바디 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품

Info

Publication number: KR102195404B1
Application number: KR1020190034823A
Authority: KR
Inventors: 손호용; 정진부; 박종이; 이만효
Original assignee: 재단법인 경북바이오산업연구원; 안동대학교 산학협력단
Priority date: 2019-03-27
Filing date: 2019-03-27
Publication date: 2020-12-24
Also published as: KR20200113920A

Abstract

본 발명은 섬바디(Dystaenia takesimana) 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증(thrombosis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 섬바디 잎 추출물을 유효성분으로 하는 혈소판 응집 저해를 통한 혈전증의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것이다. 본 발명의 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 유효성분으로서의 섬바디 잎 추출물은 혈전 생성의 개시 역할을 수행하는 혈소판의 응집 저해 효과에 의한 강력한 항혈전 활성을 나타냄과 동시에, 인간 적혈구에 대한 용혈 활성을 전혀 나타내지 않고, 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성 조건 및 혈장 내에서도 혈소판 응집저해 효과의 손실이 나타나지 않으므로, 혈행 개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있을 것으로 기대되며, 상기 유효성분은 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 상시 복용이 가능한 형태로 조제할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 제약 산업 및 식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Description

섬바디 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE LEAF EXTRACT OF DYSTAENIA TAKESIMANA AS AN EFFECTIVE COMPONENT FOR PREVENTION OR TREATMENT OF THROMBOSIS AND HEALTH FUNCTIONAL FOOD COMPRISING THE SAME}

본 발명은 섬바디(Dystaenia takesimana) 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증(thrombosis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 섬바디 잎 추출물을 유효성분으로 하는 혈소판 응집 저해를 통한 혈전증의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것이다.

인체 구성 성분으로서의 혈액은 산소, 영양분, 노폐물의 운반 기능과 완충 작용, 체온 유지, 삼투압 조절 및 이온 평형 유지, 수분 일정 유지, 액성 조절 작용, 혈압의 유지 및 조절, 생체 방어 등 다양한 중요 기능들을 가지고 있다. 정상적인 혈액 순환은 체내에서의 혈액 응고 반응계와 혈전 용해 반응계가 상호 보완적으로 조절되면서 혈액 순환을 용이하게 하며, 이들 중 혈액 응고 반응계의 기작은 혈관벽에 혈소판이 점착, 응집하여 혈소판 혈전을 형성한 후, 혈액 응고계가 활성화되어 혈소판 응집괴를 중심으로 피브린 혈전이 형성되는 것으로 보고되어 있다.

피브린 혈전의 생성은 수많은 혈액 응고 인자들의 여러 단계 반응을 거쳐 피브린 응고에 관여하는 트롬빈이 활성화되어, 최종적으로 피브리노겐으로부터 피브린 단량체를 생성하게 하며, 피브린 단량체들은 칼슘에 의해 중합되어, 혈소판과 내피세포에 결합하게 되며, XIII 인자에 의해 교차 결합된 피브린 폴리머를 형성하면서 영구적인 혈전을 생성하게 된다. 또한, 트롬빈은 혈소판, V 인자, VII 인자들을 활성화시켜 혈액 응고 반응을 촉진시키는 등 혈전 생성에 중추적 역할을 하게 된다. 따라서, 트롬빈의 활성 저해물질은 과다한 혈액 응고 이상으로 발생하는 다양한 혈전성 질환에 매우 유용한 예방 및 치료제로 사용될 수 있다. 한편, 내인성 혈전 생성 경로에는 XII 인자, XI 인자, IX 인자, X 인자의 순차적 활성화에 이은 프로트롬빈의 활성화가 최종적으로 트롬빈을 활성화하는 것으로 알려져 혈액 응고 인자의 특이적 저해 역시 중요한 혈전성 질환 치료제의 개발 타겟이 되고 있다. 현재까지 혈전성 질환의 예방과 치료에 헤파린, 쿠마린, 아스피린, 유로키네이즈 등의 다양한 항응고제, 항혈소판제, 혈전용해제 등이 사용되고 있으나, 이들은 가격이 매우 높을 뿐 아니라, 출혈성 부작용과 위장 장애 및 과민 반응 등으로 그 사용이 한정되고 있는 실정이다.

한편, 섬바디(Dystaenia takesimana)는 산형과에 속하는 다년생 초본식물로서 울릉도, 금강산 등지에 분포하는 우리나라 특산식물의 하나이며, 울릉도에서는 돼지가 잘 먹는다고 돼지풀이라고 부르기도 한다. 실제 여린 잎은 나물로 식용 가능하며, 한방에서는 해독제로 사용되기도 한다. 한때 잎의 높은 단백질 함량으로 인해 좋은 목초로서 각광을 받은 바도 있으나, 재배상의 문제로 인하여 현재는 생산 및 이용이 제한되고 있다.

섬바디는 키가 2m 정도까지 자라며, 4~5개의 마디가 있고 줄기는 속이 비었고 잎은 어긋난다. 잎자루가 길고 밑부분이 넓어져서 원줄기를 감싸고 있으며, 잎은 3개씩 2회 갈라지고, 위로 올라가면서 점점 작아져서 마침내 3출엽으로 된다. 꽃은 7월에 피고 희며 복합 산형화서로 열매는 8~9월에 익는다.

섬바디와 관련된 연구로는, 지하부 뿌리로부터 umbelliferon, skimmin, isoscopoletin, b-sitosterol, campesterol, stigmasterol 분리(김범해, 1993, 생약학회지 24 : 296-298) 및 furanocoumarin 분리(권용수, 1992, 생약학회지 23: 218-220)가 보고된 바 있으며, Falcarindiol이라는 Listeria monocytogenes에 대한 지용성 항균물질이 확인된 바 있다(오진아, 1999, 한국식품과학회지 31: 984-993). 또한, 섬바디 지상부의 항산화 활성 및 양식넙치 어병세균(Streptococcus iniae)에 대한 항균력도 알려져 있다. 그러나, 현재까지 섬바디에 대한 연구는 매우 미미한 실정이며, 특히 섬바디 추출물의 항혈전 관련 연구는 알려진 바 없다.

또한, 섬바디와 관련된 특허로는, 대한민국 등록특허 제10-1127928호에 [섬바디 추출물을 유효성분으로 함유하는 항아토피용 화장료 조성물]이 알려져 있으며, 공개특허 제10-2013-0016176호에 [어류의 세균성 병원균에 대한 서어나무의 항균 조성물], 제10-2013-0004557호에 [어류의 세균성 병원균에 대한 항균 조성물]이 공개되어 있다. 그러나, 현재까지 섬바디에 대한 항혈전 활성과 관련된 특허는 알려진 바 없다.

KR

10-1127928

B

김범해, 1993, 생약학회지 24: 296-298. 섬바디 지하부 뿌리로부터 umbelliferon, skimmin, isoscopoletin, b-sitosterol, campesterol, stigmasterol 분리 권용수, 1992, 생약학회지 23: 218-220. 섬바디 지하부 뿌리로부터 furanocoumarin 분리 보고

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 섬바디 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 제공하고자 하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 섬바디(Dystaenia takesimana) 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 섬바디(Dystaenia takesimana) 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈소판 응집 저해제를 제공한다.

또한, 본 발명은 섬바디(Dystaenia takesimana) 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.

본 발명의 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 유효성분으로서의 섬바디 잎 추출물은 혈전 생성의 개시 역할을 수행하는 혈소판의 응집 저해 효과에 의한 강력한 항혈전 활성을 나타냄과 동시에, 인간 적혈구에 대한 용혈 활성을 전혀 나타내지 않고, 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성 조건 및 혈장 내에서도 혈소판 응집저해 효과의 손실이 나타나지 않으므로, 혈행 개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있을 것으로 기대되며, 상기 유효성분은 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 상시 복용이 가능한 형태로 조제할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 제약 산업 및 식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 섬바디의 잎, 줄기, 뿌리로부터 수득된 에탄올 추출물의 인간 혈소판 응집저해 활성을 나타낸 것이다: 1: 용매 대조구(DMSO), 2: 아스피린(0.25mg/ml), 3: 아스피린(0.125mg/ml), 4: 섬바디 잎 에탄올 추출물(0.25mg/ml), 5: 섬바디 줄기 에탄올 추출물(0.25mg/ml), 6: 섬바디 뿌리 에탄올 추출물(0.25mg/ml).

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 발명자들은 섬바디를 대상으로 항혈전 효능을 검정하기 위하여, 일정 방법으로 섬바디의 잎, 줄기 및 뿌리 추출물을 조제하여 항혈전 활성을 나타내는 섬바디 잎 추출물을 활성 성분으로 회수하였으며, 상기 추출물은 인간 적혈구에 대해 용혈활성은 전혀 나타내지 않으면서도, 열 안정성과 산 안정성이 우수한 특징을 가짐을 확인함으로서 상기 추출물을 혈전증의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품으로 활용하고자 하였다.

구체적으로, 본 발명자들은 민간에서 혈관 및 순환계, 소화계, 신진대사계, 노화 등 다양한 질환에 효과가 있다고 알려진 섬바디를 이용하여 혈전증의 예방 또는 치료/개선용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 개발하기 위하여, 섬바디의 다양한 부위를 대상으로 에탄올 추출물을 조제하고, 이들의 항혈전 활성을 인간 혈장과 인간 트롬빈에 대한 트롬빈 직접 저해(Thrombin Time: TT), 프로트롬빈 저해(Prothrombin Time: PT) 및 활성부분 트롬보플라스틴 타임(activated Partial Thromboplastin Time: aPTT)을 평가하여, 섬바디 잎 추출물에서 매우 강력한 혈소판 응집저해 활성을 확인하였다. 또한, 상기 추출물은 인간 적혈구에 대한 용혈활성은 나타내지 않음을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 섬바디(Dystaenia takesimana) 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하에서는, 본 발명의 섬바디 추출물의 제조 방법 및 효능 실험 등을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명은 섬바디의 다양한 부위로부터 추출물을 조제하는 단계; 상기 추출물의 항혈전 활성 평가 단계; 및 활성물질의 안정성 조사 단계를 포함한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 "섬바디 잎 추출물"은 섬바디의 잎을 유기용매로 추출하는 단계 및 상기 추출액을 0.06mm 이하의 여과망을 사용하여 여과하고, 이를 감압농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 유기용매는 물(냉수, 열수), 주정, 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 주정, 프로판올, 부탄올 등), 상기 저급알코올과 물과의 혼합용매 등을 이용할 수 있으며, 열수, 또는 95% 에탄올 추출이 가장 바람직하다.

바람직한 구체예로서, 본 발명의 섬바디 잎 추출물은 섬바디 잎을 열수 또는 에탄올로 추출하여 사용할 수 있다. 여기에서, 상기 열수 또는 에탄올 추출물은 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올의 유기용매로 순차 또는 각각 분획하여 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물 및 물 잔류물을 추가적으로 수득할 수도 있다.

본 발명에서는, 섬바디 잎, 줄기 및 뿌리 추출물을 각각 2.5mg/ml의 농도로 하여 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 측정한 결과, 항혈전제로 알려진 아스피린(1.5mg/ml)보다 미약한 항응고 활성을 나타내었으며, 특이한 응집 촉진 효과(혈전 생성 촉진)도 나타나지 않았다.

반면, 섬바디 추출물을 0.25mg/ml의 농도로 하여 혈소판 응집저해를 평가한 결과, 줄기 및 뿌리 추출물에서는 각각 125.1% 및 150.8%의 응집율을 나타내어 응집촉진에 의한 혈전 생성을 증가시킴을 확인한 반면, 잎 추출물의 경우에는 53.3%의 혈소판 응집을 나타내어, 동일농도의 아스피린에 필적하는 우수한 항혈전 효과를 나타내었다. 이러한 결과는 섬바디의 잎 추출물이 정제되지 않은 상태임에도 불구하고 아스피린에 필적하는 강력한 항혈전 활성을 보여준 것으로서 기존의 부작용 우려가 높은 아스피린과 같은 항응고제, 항혈소판제를 대치할 수 있음을 제시한다.

본 발명의 섬바디 잎 추출물은 감압건조 및 동결건조, 또는 분무건조 등과 같은 통상적인 분말화 과정을 거쳐 분말로 제조될 수 있다. 이들은 혈장 내의 다양한 분해효소에 분해되지 않으며, 100℃의 열처리와 pH 2의 인체 위 내의 pH에서도 활성을 유지한다.

본 발명의 유효성분은 혈전증과 관련된 다양한 질환들의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 상기 질환들은, 예를 들어, 동맥 혈전증으로서, 급성 심근 경색증, 가슴 통증, 호흡 곤란, 의식 소실, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 두통, 운동 이상, 감각 이상, 성격 변화, 시력 저하, 간질 발작, 폐 혈전증, 심부정맥 혈전증, 하지 부종, 통증 및 급성 말초 동맥 폐쇄증 등을 들 수 있고, 정맥 혈전증으로서, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄 등을 들 수 있다.

특히, 본 발명의 섬바디 잎 추출물은 구체적인 항혈전 치료의 용도로서 혈소판 응집 저해제로서 사용될 수 있다.

본 발명의 유효 성분을 포함하는 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.

이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.

바람직한 구체예로서, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.

바람직한 구체예로서, 경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등을 예시할 수 있다. 비수성용제, 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.

본 발명의 유효 성분은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 본 발명의 약학적 조성물에서 유효성분의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏ 당 1 내지 5,000mg, 바람직하게는 100 내지 3,000mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.

본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.

또한, 본 발명의 건강 기능 식품은 혈전증의 예방 또는 개선에 효과적인 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 유효성분을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 유효성분은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100ml를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다.

상기 향미제로는 타우마틴, 레바우디오시드 A 또는 글리시르히진과 같은 스테비아 등의 천연 향미제 및 사카린, 아스파르탐 등의 합성 향미제를 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100ml당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g을 사용한다.

상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 유효성분 100중량부 당 0.01 내지 약 20중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 일 구체예일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 섬바디 추출물 제조 및 이들의 유용성분 분석

2018년 울릉도에서 수확한 섬바디를 구입하여 에탄올 추출물 제조에 사용하였다. 구체적으로는, 섬바디의 잎, 줄기, 뿌리를 구분하여, 각각의 시료에 대해 10배의 에탄올(70% 에탄올)을 가하고, 상온에서 2회 반복 추출하고, 추출액을 모아 필터링한 후, 감압 농축하여 분말로 제조하여 에탄올 추출물을 제조하였다.

섬바디 추출물의 성분 분석으로 총 폴리페놀, 총 플라보노이드, 총 당 및 환원당 함량을 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 추출 검액 400μl에 50μl의 Folin-ciocalteau, 100μl의 Na₂CO₃ 포화용액을 넣고 실온에서 1시간 방치한 후 725nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. 총 플라보노이드 함량은 각각의 시료를 18시간 메탄올 교반 추출하고, 여과한 추출 검액 400μl에 90% diethylene glycol 4ml를 첨가하고 다시 1 N NaOH 40μl를 넣고 37℃에서 1시간 반응 후 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 rutin을 사용하였다. 환원당은 DNS법으로, 총 당은 phenol-sulfuric acid법을 이용하여 정량하였다.

[표 1] 섬바디 추출물의 추출효율 및 유용성분 분석

표 1에 나타낸 바와 같이, 섬바디 에탄올 추출효율은 잎 > 뿌리 > 줄기의 순으로 나타났으며, 18.5~25.9%의 수율을 나타내었다.

부위별 추출물의 유용성분 분석 결과, 잎 추출물의 총 폴리페놀 함량은 116.9mg/g으로 매우 높게 나타났으며, 이는 뿌리 추출물(30.6mg/g)의 3.8배, 줄기 추출물(18.1mg/g) 의 6.5배 높은 함량이었다. 또한, 총 플라보노이드 함량 역시, 잎 추출물에서 125.7mg/g으로 가장 높았으며, 뿌리 추출물(27.0mg/g)의 2.15배, 줄기 추출물(11.1mg/g)의 11.3배로 나타났다. 총 당 분석 결과, 특이하게 줄기 추출물에서 가장 높았으며, 다음으로 잎과 뿌리 추출물의 순으로 높았으며, 이러한 패턴은 환원당 함량 분석에서도 동일하게 나타났다.

따라서, 섬바디의 부위별 추출물 중에서는 잎 추출물이 가장 우수한 항산화 활성을 나타나리라 예상되었으며, 실제 분석 결과, 상기 잎 추출물에서 가장 강력한 항산화 활성 및 nitrite 소거능을 나타내었다. 따라서, 섬바디 잎 추출물은 우수한 항산화 활성, 발암억제 활성을 나타내어 혈행개선 및 항혈전 활성에 부가적으로 기여하리라 예상된다.

실시예 2: 섬바디 추출물의 혈액응고 저해활성 평가

실시예 1의 에탄올 추출물의 혈액응고 저해활성을 평가하여 그 결과를 표 2에 나타내었다. 이때, 섬바디 추출물의 혈액응고 저해활성 평가방법은 기존에 보고된 방법에 준해 평가하였으며(Sohn et al., 2004. Kor. J. Pharmacogn 35. 52-61; Kwon et al., 2004. J. Life Science, 14. 509-513; 류 등 2010. J. Life Science, 20. 922-928), 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티 타임을 측정하였다. 혈장은 시판 control plasma(MD Pacific Technology Co., Ltd, Huayuan Industrial Area, China)를 사용하였으며 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티티 측정법은 다음과 같은 과정으로 수행되었다.

트롬빈 타임(Thrombin Time)

37℃에서 0.5U 트롬빈(Sigma Co., USA) 50μl와 20 mM CaCl₂ 50μl, 다양한 농도의 시료 추출액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 혈장 100μl를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 32.1초의 응고시간을 나타내었다. 트롬빈 저해 효과는 3회 이상 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 트롬빈 저해활성은 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값으로 나타내었다.

프로트롬빈 타임(prothrombin time)

표준혈장(MD Pacific Co., China) 70μl와 다양한 농도의 시료액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온 후, 130μl의 PT reagent를 첨가하고 혈장이 응고될 때까지의 시간을 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 18.1초의 응고시간을 나타내었다. 프로트롬빈 저해활성은 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값으로 나타내었다.

aPTT(activated Partial Thromboplastin Time)

혈장 100μl와 다양한 농도의 시료 추출액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온한 후, 50μl의 aPTT reagent(Sigma, ALEXIN^TM)를 첨가하고 다시 37℃에서 3분간 배양하였다. 이후, 50μl CaCl₂(35mM)을 첨가한 후, 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였으며, 이 경우 55.1초의 응고시간을 나타내었다. aPTT의 결과는 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 혈액응고인자 저해활성은 시료 첨가시의 aPTT를 용매 대조구의 aPTT로 나눈 값으로 나타내었다.

[표 2] 섬바디 추출물의 혈액응고 저해활성

그 결과, 섬바디의 잎 및 줄기 추출물은 2.5mg/ml 농도에서 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임 모두에서 무첨가구에 비해 확연한 연장 효과가 나타나지 않았다. 반면, 뿌리 추출물에서는 트롬빈 타임 및 에이피티 타임 연장이 나타났으나, 아스피린(1.5mg/ml)에 비해 약한 항응고 활성이었다.

실시예 3: 섬바디 부위별 추출물의 혈소판 응집저해활성

실시예 1의 섬바디 부위별 추출물의 인간 혈소판 응집저해 활성을 평가하여 그 결과를 표 3 및 도 1에 나타내었다. 혈소판은 다양한 혈구세포와 함께 혈관을 순환하는 원반형의 작은 세포로서, 핵이 없는 대신 혈관손상보호 및 혈소판 응집과 관련된 다양한 물질을 고농도로 포함하는 cytoplasmic granule을 가지고 있으며, 혈관내벽의 손상이 나타나는 경우 응집인자들을 분비하고, 내피세포의 손상으로 노출된 collagen 등과 결합하여 1차 지혈 플러그(primary hemostatic plug)를 형성하여 혈전생성을 개시하는 중요한 세포이다. 따라서, 혈소판 응집저해는 혈전 생성을 방지하는 매우 중요한 활성이다. 혈소판 응집저해 활성은 다음의 방법에 준해 평가하였다.

혈소판 응집 저해활성(Platelet aggregation inhibition activity)

혈소판은 인간 농축혈소판을 사용하였으며, 이를 washing buffer(138mM NaCl, 2.7mM KCl, 12mM NaHCO₃, 0.36mM NaH₂PO₄, 5.5mM Glucose, 1mM EDTA, pH 6.5)로 1회 세척하였다. 이후, suspending buffer(138mM NaCl, 2.7mM KCl, 12mM NaHCO₃, 0.36mM NaH₂PO₄, 5.5mM Glucose, 0.49mM MgCl₂, 0.25% gelatin, pH 7.4)에 재 현탁한 후, 3,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 다시 suspending buffer에 재 현탁하였으며, 이때 혈소판 수는 4x10⁹/ml이 되도록 조정하였다. 이후, 1ml 현탁액에 2.5μl collagen을 가해 5분간 반응시키고, whole-blood aggregometer(Chrono-log, USA)를 사용하여 37℃에서 혈소판 응집을 측정하였다.

[표 3] 섬바디 추출물의 혈소판 응집저해 활성

표 3에 나타낸 바와 같이, 아스피린은 0.25mg/ml 농도에서 32.5%의 응집도를, 0.125mg/ml 농도에서 68.6%의 응집도를 나타내는 등 농도 의존적으로 강력한 혈소판 응집저해를 나타내어 임상에서 항혈전제로 사용되는 근거를 알 수 있었다. 섬바디 잎 추출물은 0.25mg/ml에서 53.3%의 응집도를 나타내어 아스피린보다는 미약하나, 조 추출물인 것으로 고려하면 매우 우수한 응집저해 활성에 해당되는 것으로 해석된다. 한편, 섬바디 줄기 및 뿌리 추출물은 0.25mg/ml에서 125.1 및 150.8%의 응집도를 나타내어 강력한 응집촉진 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 섬바디 잎 추출물은 항혈전제, 특히, 혈소판 응집 저해제로, 줄기 및 뿌리 추출물은 혈소판 응집 촉진제로 이용 가능함을 제시하고 있다.

실시예 4: 섬바디 추출물의 인간 적혈구 용혈 활성

섬바디의 어린 잎은 나물로 식용하며, 돼지가 잘 먹는다고 돼지풀이라고 부르기도 하며, 사료로 이용된 바 있다. 또한, 한방에서 해독제로 사용되어 온 바, 섬바디 추출물은 별도의 급성독성을 유발하지는 않으리라 판단된다. 섬바디 추출물의 급성독성 가능성을 평가하기 위해 인간 적혈구 용혈 활성을 평가하였으며, 그 결과는 표 4에 나타내었다. 이때, 용혈 활성은 기존의 보고(손호용, 2014년, Korean J. Microbiol. Biotechnol. 42: 285-292)에 준해 평가하였으며, 간단하게는 PBS로 3회 수세한 인간 적혈구 100μl를 96-well microplate에 가하고 다양한 농도의 시료용액 100μl를 가한 다음 37℃에서 30분간 반응시켰으며, 이후, 반응액을 10분간 원심분리(1,500rpm)하여 상등액 100μl를 새로운 microtiter plate로 옮긴 후 용혈에 따른 헤모글로빈 유출 정도를 414nm에서 측정하였다. 시료의 용매 대조구로는 DMSO(2%)를 사용하였으며, 적혈구 용혈을 위한 실험 대조구로는 Triton X-100(1mg/ml)를 사용하였다. 용혈 활성은 다음의 수식을 이용하여 계산하였다.

[표 4] 섬바디 추출물의 인간 적혈구 용혈 활성

먼저, 대조구로 사용된 DMSO와 물은 용혈 활성이 없었으며, triton X-100은 1mg/ml 농도에서 적혈구를 100% 용혈시킴을 확인하였다. 또한, 항암제, 항진균제로 사용되고 있는 amphotericin B의 경우 0.025mg/ml 농도에서 50% 이상 적혈구를 용혈시킴을 확인하였다. 본 발명의 섬바디 잎 추출물은 1mg/ml 농도까지 전혀 적혈구 용혈현상이 나타나지 않아 급성독성 및 적혈구 용혈 활성은 없음을 확인하였다.

실시예 5: 섬바디 잎 추출물의 혈장, 산 및 열 안정성 평가

상기 실시예 1에서 얻은 섬바디 잎 추출물을 대상으로 항혈전 활성에 대한 혈장 안정성, 열 안정성 및 산 안정성을 확인하였다. 섬바디 잎 추출물은 100℃에서 1시간 열 처리, pH 2(0.01M HCl)에서의 1시간 처리, 혈장에서 1시간 처리시에도 혈소판 응집저해 활성의 감소가 나타나지 않았다. 따라서, 섬바디 잎 추출물은 내산성, 내열성을 가진 다양한 성분의 혈소판 응집저해 활성물질을 포함하고 있을 것으로 예상되었다.

Claims

섬바디(Dystaenia takesimana) 잎 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
섬바디(Dystaenia takesimana) 잎 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품.