KR101127928B1 - 섬바디 추출물을 유효성분으로 함유하는 항아토피용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항아토피용 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 섬바디 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 항아토피성 화장료 조성물에 관한 것이다. 상기 본 발명에 따른 화장료 조성물은 사이토카인 분비 조절 및 면역 억제를 통해 홍반개선, 가려움증 개선, 건조피부의 진정효과 등을 나타내어 아토피 증상을 효과적으로 개선할 수 있어 아토피 피부염 개선을 위하여 유용하게 이용될 수 있다.

항아토피, 섬바디, 사이토카인

Description

섬바디 추출물을 유효성분으로 함유하는 항아토피용 화장료 조성물{Anti atopic dermatitis containing extracts from extract of Dystaenia takeshimana as active ingredients}

본 발명은 항아토피용 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 섬바디 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 항아토피성 화장료 조성물에 관한 것이다.

아토피(Atopy) 피부염은 유전적 환경적 면역학적인 원인으로 인해 피부 가장 바깥에 있는 피부 보호벽인 각질층에 이상이 생긴 것으로 건조한 기후에서 더욱 심해지는 알레르기 질환이다. 아토피 피부염은 다양한 원인이 복잡하게 뒤엉켜 발병하고 완화와 재발을 반복한다. 아토피 소인에 의한 알레르기 질환으로 알레르기 피부염, 알레르기성비염, 천식, 알레르기성 결막염, 아토피성 두드러기 등이 있으며 이들 질환은 단독 또는 여러 질환이 동시에 나타날 수 있다.

상기의 아토피 피부질환은 정확한 병태생리는 아직까지 완전히 이해되고 있지 않으나 유전적 소인과 함께 면역학적, 비면역학적 기전이 관여하리라고 생각되고 있다. 아토피 피부염의 대부분을 차지하는 외인성 아토피 피부염은 면역 글로불 린 E(IgE)와 연관된 면역기전에 의하여 발생되는데 특정 알레르겐에 대한 속발성 면역 반응보다는 T-세포 이상에 의한 원발성 면역반응이 관여한다는 보고들이 많다. 아토피 피부염 환자에서 세포 매개성 면역기능 장애가 면역 글로불린 E의 증가와 관련이 있음이 밝혀지면서 속발성 면역 반응 외에도 원발성 면역 반응이 아토피 피부염의 병인에 관여한다고 주장하는 보고들이 증가하고 있다(이기영, 최신알레르기 진료, 한국의학사, 서울, 2001, pp23~52).

아토피 피부염 환자에서 세포 매개성 면역 장애는 약 80%까지 발생하는 것으로 알려져 있으며, 바이러스 및 피부 사상균 등에 의한 피부 감염증에 대하여 감수성이 증가되고 접촉 알레르겐에 대한 감수성은 감소되는 경향을 보인다. 과거에는 T-세포 성숙 결핍설, CD8+ 억제 T-세포의 수적 감소 등이 보고된 바 있으나 최근엔 CD4+ T-세포의 역할이 더욱 중요한 것으로 알려지고 있다. 즉, B 세포로부터 면역글로불린 E의 생성을 유도 또는 촉진하는 인터루킨(interleukin) 4, 5와 증폭시키는 인터루킨 6 등을 분비하는 T-세포는 CD4+ T-세포 중 Th2 세포인데 아토피 질환자들의 피부에서 Th1 세포에 비하여 Th2 세포가 높게 존재하는 것이 밝혀졌다. 이러한 사이토카인(cytokine)들은 비만세포, 대식세포, 호염구 등의 면역세포를 자극하여 히스타민(histamine), 루코트리엔(leukotrien), 프로스타글란딘(prostaglandin), 일산화질소(NO) 등의 분비를 촉진하게 되고 이들 염증 매개 물질이 피부의 염증반응을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 아토피 피부질환에서 나타나는 또 다른 특징은 피부 세포의 세포막을 형성하는 지질 중 감마 리놀렌산(γ-linolenic acid)의 결핍이 보고된 점이다. 감마 리놀렌산의 결핍은 필수 지방산의 생합성 경로에서 델타-6-디세추라아제(δ-6-desaturase)의 기능 결손에 의하여 리놀레산(linoleic acid)으로부터 감마 리놀렌산으로의 합성 장애로 인하여 일어나는 현상으로서, 이후 프로스타글란딘 등의 합성을 조절하지 못해 염증 매개 물질의 생성이 높아지게 된다. 또한, 감마 리놀렌산의 결핍으로 피부 지질막의 구조에 이상이 발생하여 과도한 수분 유출 등이 일어남으로써 피부 장벽이 허물어지는 결과를 초래하며 이때 세균 등의 2차 감염이 일어난다.

상기와 같이 현재까지 알려진 아토피 피부염의 병인, 기전, 증상 등을 감안하여 아토피 피부염에 대한 치료제가 개발되고 있으며, 그 결과 천연 또는 합성의 면역억제제, 항히스타민제제, 스테로이드 제제 등 다수가 개발되어 있다. 예를 들면, 면역 억제제로는 싸이클로스포린(Cyclosporin) A, FK506(타크로리무스, Tacrolimus; Wasik 등, Immunopharmacology 20:57-61, 1990)와 SDZ ASM981(피메크로리무스, Pimecrolimus; Grassberger 등, Br. J. Dermatology 141:264-273, 1999)이 각광받고 있다. 반면 기존의 아토피 피부염에 대한 치료제로 사용되는 스테로이드제제와 항히스타민제 등은 증상을 일시적으로 완화해주는 효과는 있으나 외용 또는 경구용 스테로이드 호르몬제의 장기 사용 환자들에 있어서 피부가 엷어지는 현상 및 골다공증의 유발, 어린이의 경우 성장 저해 등 그에 따른 국소 및 전신 부작용으로 인하여 임상적으로 문제가 된다. 따라서 이러한 부작용이 없으며 효능이 우수한 치료제 개발이 요구되고 있다.

이러한 아토피 피부염의 원인은 잘 알려져 있지 않으나 주로 유전적인 요소가 많고 면역계 결핍과 관련되어 있는 것으로 밝혀져 있다. 그 외에 건조한 피부, 정상인에 비해 쉽게 피부가려움증을 느끼는 특성, 세균?바이러스?곰팡이 등에 의한 감염, 정서적 요인, 환경적 요인 등이 서로 복합적으로 작용하여 일어나는 것으로 보인다.

아토피 피부염의 주요증상은 심한 가려움증, 피부건조, 발진, 진물, 부스럼딱지, 비늘 같은 껍질이 있는 피부(인비늘) 등이다. 그 중 무엇보다도 심한 가려움증이 특징이다.

아토피 체질을 근본적으로 고칠 수 없으므로 아토피 피부염은 완치를 목표로 하기보다는 유발 인자를 피하고 적절한 치료를 통해 조절해나가는 질병이라고 할 수 있다. 아토피 피부염에 대한 처방은 스테로이드제, 항히스타민제, 항생제 등과 같은 약물요법이 주로 이루어지고 있다. 스테로이드제(부신피질호르몬제)는 크게 소염작용과 면역억제 작용이 있으며 효과가 우수하지만, 장기간 바르면 피부약화, 전신 호르몬증상, 중독성 등의 부작용이 나타날 수 있다. 항히스타민제는 비만세포에서 히스타민이 유리되지 못하도록 하여 가려운 증상을 경감시키나 임시방편으로 사용하는 것으로 장기간 복용 시 불면, 불안, 식욕감퇴 등의 부작용이 있을 수 있다.

따라서 이러한 아토피를 치료하기 위해서는 항균, 보습, 항염의 효과가 우수하며, 부작용이 없고 비용이 저렴한 물질의 개발 및 그 물질이 함유된 제품을 쉽게 사용할 수 있는 화장료 소재의 개발이 절실히 요구된다.

본 발명자들은 상기와 같은 점들을 감안하여 아토피성 피부염을 치료할 수 있는 천연물에 대해 연구를 수행하던 중 섬바디 추출물이 사이토카인 분비 조절 및 지질다당류에 의해 활성화된 대식세포에서의 염증발생 인자의 활성화 및 발현억제를 나타냄을 확인하여 본 발명의 섬바디 추출물이 아토피 질환에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 피부에 전혀 자극이 없는 천연물인 섬바디(Dystaenia takeshimana) 추출물을 유효성분으로 함유하는 항아토피용 화장료 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여 에탄올로부터 추출된 섬바디(Dystaenia takeshimana) 추출물을 제공한다.

또한, 본 발명은 섬바디(Dystaenia takeshimana) 추출물을 유효성분으로 함유하는 항아토피용 화장료 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 아토피 개선을 위한 항아토피용 섬바디(Dystaenia takeshimana) 추출물을 제공하는 것을 특징으로 하며, 상기 섬바디 추출물은 에탄올 추출물로부터 수득되는 것을 특징으로 한다.

상기 섬바디 추출물은 메탄올, 에탄올, 이소프로필 알콜, 부탄올로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 메탄올 또는 에탄올을 이용하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 에탄올을 이용하는 것이다.

본 발명은 섬바디(Dystaenia takeshimana) 추출물을 유효성분으로 함유하는 항아토피용 화장료 조성물을 제공한다.

구체적인 일예로, 상기 섬바디 추출물은 분쇄하여 분말화한 섬바디 20 내지 50 g에 100% 에탄올 0.2 내지 1.0ℓ을 첨가한 후, 온도조건 60℃ 내지 80℃에서 18 내지 30시간 서서히 교반하면서 추출되며, 상기 추출시간은 추출시 온도 조건에 따라 달라질 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 사이토카인 분비 조절, 지질다당류에 의해 활성화된 대식세포에서의 염증발생 인자의 활성화 및 발현억제를 통하여 아토피 개선 또는 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.

본 발명의 섬바디(Dystaenia takeshimana) 추출물은 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.

상기 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines)은 인터류킨-2, 인터류킨-4, 인터류킨-5, 인터류킨-6, 인터류킨-8 및 종양괴사인자-α(TNF-α)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

섬바디 추출물의 유용성을 확인하기 위하여 염증성 사이토카인 분비 억제능 및 지질다당류에 의해 활성화된 대식세포에서의 염증발생 인자의 활성화 및 발현억제능 측정 실험을 수행하였다.

구체적인 일예로 섬바디 추출물의 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines)의 발현 억제하는 것으로, 사람의 림프구 T 세포(Jurkat T cells) 및 사람의 단핵구 세포(THP-1 cells)에서의 집먼지진드기에 의해 유도된 인터류킨-2, 인터류킨-4, 인터류킨-5, 인터류킨-6, 인터류킨-8 및 종양괴사인자-α(TNF-α)의 분비가 효과적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 섬바디 추출물에 대한 농도 의존적으로 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines)의 분비가 억제되 며 10 ㎍/㎖ 농도일 때가 억제능이 최대가 되는 것을 확인하였다. 이는 본 발명에 따른 섬바디 추출물이 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines) 조절능이 있음을 확인한 것이다.

본 발명의 섬바디(Dystaenia takeshimana) 추출물은 지질다당류(Lipopolysaccharide, LPS)에 의해 활성화된 대식세포(RAW264.7)에서 염증발생 인자의 활성화, 발현, 생성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

구체적인 일예로, 섬바디 추출물의 지질다당류(Lipopolysaccharide, LPS)에 의해 활성화된 대식세포(RAW264.7)에서의 염증발생 인자의 활성화 및 발현 억제를 확인하기 위하여 대식세포에 섬바디 추출물을 처리한 후 지질다당류를 처리하여 인터류킨-1 베타 및 인터류킨-6의 발현을 RT-PCR을 통하여 확인하였다. 그 결과, 지질다당류에 의해 활성화된 대식세포에서의 인터류킨-1 베타 및 인터류킨-6의 발현이 모두 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인하였다. 도 7을 참조한다.

또한, 본 발명의 섬바디(Dystaenia takeshimana) 추출물은 비만세포로부터 알레르기 유발물질의 분비를 억제하는 것을 특징으로 한다.

구체적인 일예로, 섬바디 추출물이 활성화된 비만세포로부터 생산되는 시클로옥시게나제-2 및 인터류킨-4의 발현 억제를 확인하기 위하여 비만세포(HMC-1)에 섬바디 추출물을 처리한 후 PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate) 및 calcium ionophore A23187을 처리하여 시클로옥시게나제-2 및 인터류킨-4의 발현을 RT-PCR을 통하여 확인하였다. 그 결과, 외부 자극에 의해 활성화된 비만세포에서의 시클로옥시게나제-2 및 인터류킨-4의 발현이 모두 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인 하였다. 도 8을 참조한다.

본 발명에 따른 섬바디(Dystaenia takeshimana) 추출물은 조성물의 총 중량에 대해 건조 중량으로 5 내지 30중량%로 함유하는 것이 바람직하며, 10 내지 20중량%인 것이 더욱 바람직하다.

상기 화장료 조성물에 함유되는 섬바디 추출물을 5중량% 미만으로 사용할 경우는 그 효과를 나타내기 어렵고, 30 중량%를 초과하여 사용할 경우는 피부 부작용, 제형의 불안정화 등의 문제를 나타낼 수 있다.

본 발명이 섬바디(Dystaenia takeshimana) 추출물은 과도한 면역반응에 의하여 야기되는 면역세포 매개성 염증 반응의 일종인 아토피피부염 및 여드름 등의 피부 질환에 대한 화장품 등에 치료제 또는 치료보조제로서 유용하게 사용될 수 있으며, 이러한 질환에는 아토피피부염, 알러지 피부염, 습진, 건선, 여드름 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물는 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤 또는 피부 점착타입 화장료의 제형을 갖는 화장료 조성물일 수 있으며, 또한, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피 투여형 제형일 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 섬바디 추출물은 염증성 사이토카인 분비조절, 지질다당류에 의해 활성화된 대식세포에서의 염증발생 인자의 활성화 및 발현억제 등에 작용하여 홍반 감소, 가려움증 소멸작용, 항균작용, 면역 억 제 및 조절 작용 등의 효과를 나타내어 아토피피부염의 개선에 적용함으로써 유용하게 이용할 수 있다.

본 발명을 상세히 기술하기 전에, 특정 구체예의 변형예들이 행해질 수 있으나 첨부된 특허 청구범위의 범주내에 포함되기 때문에, 본 발명은 이하에 기술된 본 발명의 특정한 구체예들에 의해 제한되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 또한, 사용된 용어는 특정 구체예들을 설명하기 위한 것이지 한정하는 것이 아님을 이해하여야 한다. 대신에, 본 발명의 범위는 첨부한 특허청구범위에 의해서 확립될 것이다.

본 명세서와 첨부한 특허청구범위에 사용하는 단수 형태들은 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 복수 형태도 포함하는 것을 알아야 한다. 다르게 정의되지 않는 한, 모든 본 명세서에 사용된 전문 과학 용어들은 본 발명이 속하는 당 업자에게 보편적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.

[ 제조예 ] 섬바디 ( Dystaenia takeshimana ) 에탄올 추출물 제조

채취하여 건조한 섬바디를 분쇄한 후에 추출용매를 혼합하여 추출하였다. 이 때 추출용매로는 여러 가지를 사용할 수 있으나, 산업적으로 널리 이용하는 100% 에탄올을 선택하여 사용하였다. 분쇄한 섬바디에 상기 100% 에탄올을 혼합할 때 시료 30 g 당 추출용매 500 ㎖의 비로 혼합하고 온도조건은 70℃에서 진행하였으며 추출시간은 추출시 온도 조건에 따라 달라질 수 있으나 일반적으로 1일 정도 서서히 교반하면서 추출을 진행하였다. 이후에 추출용액을 회수한 후 감압농축을 하면 서 에탄올 용매를 완전히 제거하였다. 위 공정에서 얻은 최종 섬바디 추출물 10 g 얻었다.

[ 시험예 1] 섬바디 추출물의 사람의 림프구 T 세포에서의 세포독성도 확인

상기 제조예에서 제조한 섬바디 추출물의 세포독성 여부를 확인하기 위하여 사람 사람의 림프구 T 세포(Jurkat T cells)에 무처리구, 섬바디 추출물 1 ㎍/㎖, 섬바디 추출물 10 ㎍/㎖를 처리하여 72시간 후 세포독성도(MTT assay)를 확인하였다.

상기 세포독성도(MTT assay)는 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT 테트라졸리움을 청자색을 띄는 비수용성의 MTT 포마잔(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 검사법이다. MTT formazan의 흡광도는 540 nm의 파장에서 최대가 되며, 이 파장에서 측정된 흡광도는 살아있고 대사가 왕성한 세포의 농도를 반영한다.

사람의 림프구 T 세포(Jurkat T cells)에 대한 시료의 세포독성을 측정하기 위하여 Blois(1958) 방법의 세포독성도(MTT assay)를 이용하였다. 각각 림프구 T 세포를 2 × 10³ cells/well 농도로 96웰 플레이트에 130 ㎕씩 분주하고, 일정농도(1 ㎎/㎖)로 조정한 시료를 웰 플레이트에 14.5 ㎕씩 첨가한 다음 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 인산 생리식염수에 5 ㎎/㎖ 농도로 제조한 MTT 용액을 한 웰 당 14.5 ㎕ 씩 첨가하여 MTT가 생존 암세포의 효 소 작용에 의해 환원되도록 4시간 더 배양하였다. 배양 후 각 웰 당 DMSO 108.5 ㎕를 첨가해 생성된 formazan 결정을 용해시키고 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Blank로서는 각 시료에 세포 대신에 배지만을 넣은 후 동일하게 실험하여 측정하였다.

그 결과 도 1에서도 확인할 수 있듯이, 섬바디 추출물의 세포독성도는 무처리구에 비하여 세포 생존율이 감소하지 않았으며, 이는 본 발명의 처리농도에서 세포에 대한 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.

[시험예 2] 섬바디 추출물의 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokines)의 발현 억제 확인

(1) 인터류킨 -2의 분비억제능

사람의 림프구 T 세포(Jurkat T cells)세포를 0.5% FBS가 든 1640 배지(Life Technologies Inc.)에 2.0 × 10⁶/m로 24 웰 플레이트에 분주한 후 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 16시간 배양하였다. 배양 후 섬바디 추출물(최종 농도 0.1 ㎍/㎖, 1.0 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖)을 처리한 후 1시간 뒤 집먼지진드기 추출액(House dust mite extrract,DP) 1.0 ㎍/㎖를 각각 24시간 동안 처리한 다음, ELISA를 이용하여 상층액에서 인터류킨-2의 양을 측정하였다.

그 결과 도 2에서 확인 할 수 있듯이, 집먼지진드기에 의해 유도된 인터류킨-2의 분비가 효과적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 인터류킨-2의 분비가 억제되며 1.0 ㎍/㎖ 농도일 때가 억제능이 최대가 되는 것을 확인하였다.

(2) 인터류킨-4의 분비억제능

사람의 림프구 T 세포(Jurkat T cells)세포를 0.5% FBS가 든 1640 배지(Life Technologies Inc.)에 2.0 × 10⁶/m로 24 웰 플레이트에 분주한 후 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 16시간 배양하였다. 배양 후 섬바디 추출물(최종 농도 0.1 ㎍/㎖, 1.0 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖)을 처리한 후 1시간 뒤 집먼지진드기 추출액(House dust mite extrract,DP) 1.0 ㎍/㎖를 각각 24시간 동안 처리한 다음, ELISA를 이용하여 상층액에서 인터류킨-4의 양을 측정하였다.

그 결과 도 3에서 확인 할 수 있듯이, 집먼지진드기에 의해 유도된 인터류킨-4의 분비가 효과적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 10 ㎍/㎖ 농도일 때가 억제능이 최대가 되는 것을 확인하였다.

(3) 인터류킨-5의 분비억제능

사람의 림프구 T 세포(Jurkat T cells)세포를 0.5% FBS가 든 1640 배지(Life Technologies Inc.)에 2.0 × 10⁶/m로 24 웰 플레이트에 분주한 후 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 16시간 배양하였다. 배양 후 섬바디 추출물(최종 농도 0.1 ㎍/㎖, 1.0 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖)을 처리한 후 1시간 뒤 집먼지진드기 추출액(House dust mite extrract,DP) 1.0 ㎍/㎖를 각각 24시간 동안 처리한 다음, ELISA를 이용하여 상층액에서 인터류킨-5의 양을 측정하였다.

그 결과 도 4에서 확인 할 수 있듯이, 집먼지진드기에 의해 유도된 인터류킨-5의 분비가 효과적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 농도 의존적으로 인터류킨-5의 분비가 억제되며 10 ㎍/㎖ 농도일 때가 억제능이 최대가 되는 것을 확인하였다.

(4) 인터류킨-8의 분비억제능

사람의 호산구 세포(EoL-1 cells)세포를 0.5% FBS가 든 1640 배지(Life Technologies Inc.)에 2.0 × 10⁶/m로 24 웰 플레이트에 분주한 후 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 16시간 배양하였다. 배양 후 섬바디 추출물(최종 농도 0.1 ㎍/㎖, 1.0 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖)을 처리한 후 1시간 뒤 집먼지진드기 추출액(House dust mite extrract,DP) 1.0 ㎍/㎖를 각각 24시간 동안 처리한 다음, ELISA를 이용하여 상층액에서 인터류킨-8의 양을 측정하였다.

그 결과 도 5에서 확인 할 수 있듯이, 집먼지진드기에 의해 유도된 인터류킨-8의 분비가 효과적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 농도 의존적으로 인터류킨-8의 분비가 억제되며 10 ㎍/㎖ 농도일 때가 억제능이 최대가 되는 것을 확인하였다.

(5) 종양괴사인자-α(TNF-α)의 분비억제능

사람의 림프구 T 세포(Jurkat T cells)세포를 0.5% FBS가 든 1640 배지(Life Technologies Inc.)에 2.0 × 10⁶/m로 24 웰 플레이트에 분주한 후 배양기(37℃, 5% CO₂)에서 16시간 배양하였다. 배양 후 섬바디 추출물(최종 농도 0.1 ㎍/㎖, 1.0 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖)을 처리한 후 1시간 뒤 집먼지진드기 추출액(House dust mite extrract,DP) 1.0 ㎍/㎖를 각각 24 시간동안 처리한 다음, ELISA를 이용하여 상층액에서 종양괴사인자-α의 양을 측정하였다.

그 결과 도 6에서 확인할 수 있듯이, 집먼지진드기에 의해 유도된 종양괴사인자-α의 분비가 효과적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 또한 농도 의존적으로 종양괴사인자-α의 분비가 억제되며 10 ㎍/㎖ 농도일 때가 억제능이 최대가 되는 것을 확인하였다.

[ 시험예 2] 섬바디 추출물의 대식세포( RAW264 .7) 및 비만세포( HMC -1)에 대한 유전자의 발현 억제 확인

(1) 인터류킨 -1 베타의 발현억제

대식세포(RAW264.7)를 10% FBS 가 함유된 DMEM 배지를 이용하여 배양 후 2 × 10⁶/㎖씩 60 mm 디쉬에 분주하였다. 분주된 대식세포는 16시간 경과 후 무혈청 배양액(serum-free media)으로 교체하고 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 약 9시간 동안 배양하였다. 상기 배양에 이용된 배양액을 흡입법을 이용하여 제거한 후 새 무혈청 배양액(serum-free media)을 넣고 섬바디 추출물(최종 농도 0.1 ㎍/㎖, 1.0 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖)을 처리한 1시간 후 지질다당류(Lipopolysaccharide, LPS) 500 ng/㎖ 농도를 처리하여 24 시간동안 처리한 다음 RT-PCR을 이용하여 인터류킨-1 베타의 발현을 확인하였다.

상기 처리된 대식세포의 RNA 2 ㎍를 이용하여 cDNA 합성 후 마우스 IL-1beta 정방향 프라이머 5'-AAGCTCTCACCTCAATGGA-3' 및 역방향 프라이머 5'- TGCTTGAGAGGTGCTGATGT-3'를 이용하여 변성(94℃, 30초), 어닐링(58℃, 20초), 연장(72℃, 1분)을 23회 PCR을 수행하였다.

그 결과 도 7에서도 확인할 수 있듯이, 지질다당류에 의해 활성화된 대식세포(RAW264.7)에서의 인터류킨-1 베타의 발현이 감소되는 것을 확인하였다.

(2) 인터류킨 -6의 발현억제

대식세포(RAW264.7)를 10% FBS 가 함유된 DMEM 배지를 이용하여 배양 후 2 × 10⁶/㎖씩 60 mm 디쉬에 분주하였다. 분주된 대식세포는 16시간 경과 후 무혈청 배양액(serum-free media)으로 교체하고 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 약 9시간 동안 배양하였다. 상기 배양에 이용된 배양액을 흡입법을 이용하여 제거한 후 새 무혈청 배양액(serum-free media)을 넣고 섬바디 추출물(최종 농도 0.1 ㎍/㎖, 1.0 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖)을 처리한 1시간 후 지질다당류(Lipopolysaccharide, LPS) 500 ng/㎖ 농도를 처리하여 24 시간동안 처리한 다음 RT-PCR을 이용하여 인터류킨-6의 발현을 확인하였다.

상기 처리된 대식세포의 RNA 2 ㎍를 이용하여 cDNA 합성 후 마우스 IL-6 정방향 프라이머 5'-ATGAAGTTCCTCTCTGCAAG-3' 및 역방향 프라이머 5'- CACTAGGTTTGCCGAGTAGA -3'를 이용하여 변성(94℃, 30초), 어닐링(58℃, 20초), 연장(72℃, 1분)을 23회 PCR을 수행하였다.

그 결과 도 7에서도 확인 할 수 있듯이, 지질다당류에 의해 활성화된 대식세포(RAW264.7)에서의 인터류킨-6의 발현이 감소되는 것을 확인하였다.

(3) 시클로옥시게나제 -2( cyclooxygenases -2) 발현 억제

사람의 비만세포인 HMC-1 세포를 10% FBS 가 함유된 IMDM배지를 이용하여 배양 후 2 × 10⁶/㎖씩 60 mm 디쉬에 분주하였다. 섬바디 추출물(최종 농도 0.1 ㎍/㎖, 1.0 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖)을 처리한 1시간 후 PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate 5 nM)과 calcium ionophore A23187(25 nM)의 혼합물로 6시간 동안 처리한 다음 RT-PCR을 이용하여 시클로옥시게나제-2의 발현을 확인하였다.

상기 처리된 비만세포 RNA 2 ㎍를 이용하여 cDNA 합성 후 마우스 Cox-2 정방향 프라이머 5'-GGTCTGGTGCCTGGTCTGAT-3' 및 역방향 프라이머 5'- GTCCTTTCAAGGAGAATGGT -3'을 이용하여 변성(94℃, 30초), 어닐링(58℃, 20초), 연장(72℃, 1분)을 24회 PCR을 수행하였다.

그 결과, 도 8에서도 확인할 수 있듯이, PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate) 및 calcium ionophore A23187에 의해 활성화된 비만세포에서의 시클로옥시게나제-2의 발현이 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다.

(4) 인터류킨 -4의 발현억제

사람의 비만세포인 HMC-1 세포를 10% FBS 가 함유된 IMDM배지를 이용하여 배양 후 2 × 10⁶/㎖씩 60 mm 디쉬에 분주하였다. 섬바디 추출물(최종 농도 0.1 ㎍/㎖, 1.0 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖)을 처리한 1시간 후 PMA(Phorbol 12-myristate 13- acetate 5 nM)과 calcium ionophore A23187(25 nM)의 혼합물로 6시간 동안 처리한 다음 RT-PCR을 이용하여 인터류킨-4의 발현을 확인하였다.

상기 처리된 비만세포 RNA 2 ㎍를 이용하여 cDNA 합성 후 마우스 IL-4 정방향 프라이머 5'-CGGCAACTTTGACCACGGACACAAGTGCGATA-3' 및 역방향 프라이머 5'- ACGTACTCTGGTTGGCTTCCTTCACAGGACAG-3'을 이용하여 변성(94℃, 30초), 어닐링(58℃, 20초), 연장(72℃, 1분)을 24회 PCR을 수행하였다.

그 결과, 도 8에서도 확인 할 수 있듯이, PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate) 및 calcium ionophore A23187에 의해 활성화된 비만세포에서의 인터류킨-4의 발현이 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다.

도 1은 본 발명에 따른 섬바디 추출물의 사람의 림프구 T 세포에서의 세포독성도를 확인한 결과이고,

도 2는 본 발명의 섬바디 추출물의 처리 농도에 따른 사람의 림프구 T 세포에서의 인터류킨-2의 분비 억제능을 확인한 결과이고,

도 3은 본 발명의 섬바디 추출물의 처리 농도에 따른 사람의 림프구 T 세포에서의 인터류킨-4의 분비 억제능을 확인한 결과이고,

도 4는 본 발명의 섬바디 추출물의 처리 농도에 따른 사람의 림프구 T 세포에서의 인터류킨-5의 분비 억제능을 확인한 결과이고,

도 5는 본 발명의 섬바디 추출물의 처리 농도에 따른 사람의 단구세포에서의 인터류킨-8의 분비 억제능을 확인한 결과이고,

도 6은 본 발명의 섬바디 추출물의 처리 농도에 따른 사람의 림프구 T 세포에서의 종양괴사인자-α의 분비 억제능을 확인한 결과이고,

도 7은 본 발명의 섬바디 추출물의 처리 농도에 따른 지질다당류에 의해 활성화된 대식세포(RAW264.7)에서 염증발생 인자의 발현 억제능을 확인한 결과이고,

도 8은 본 발명의 섬바디 추출물의 처리 농도에 따른 비만세포로부터 알레르기 유발물질의 분비 억제능을 확인한 결과이다.

Claims (8)

1. 분말화된 섬바디(Dystaenia takeshimana) 20 내지 50 g을 에탄올 0.2 내지 1.0ℓ로 18 내지 30시간 추출하여 수득되는 섬바디 추출물을 조성물의 총 중량에 대해 건조 중량으로 10 내지 20 중량% 함유하는, 화장료 조성물.
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