KR102079442B1 - 아토피 피부염 개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents
아토피 피부염 개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 백반, 녹반, 밀타승 및 월석 중에서 선택되는 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 함유하는, 아토피 피부염 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 HMC(Human Mast Cell)-1 세포의 탈과립 및 HMC-1 세포의 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase)의 방출을 억제하고, 대식세포의 산화질소(NO) 발생을 억제함으로써 아토피 피부염의 개선 효과를 나타낸다.
Description
본 발명은 백반, 녹반, 밀타승 및 월석 중에서 선택되는 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
아토피 피부염은 면역기능의 불균형을 주된 원인으로, 환경적, 사회적, 심리적, 유전적 요인 등이 복합적으로 작용하여 증상의 호전과 악화를 반복하는 만성 염증성 피부질환이다. 한의학에서 흔히 태열이라고 하며, 심한 가려움증을 동반하는 홍반, 발진, 진물 형성의 피부장애를 특징으로 한다. 아토피 피부염은 전 세계적으로 계속 증가추세에 있으며, 보통 소아나 유년시절에 발생하지만 성인기에 나타나 지속되기도 한다. 심한 가려움으로 인한 집중력 저하나 수면부족으로 학습능력이나 업무능력이 떨어지고, 어릴 때부터 반복되는 증상의 치료를 위해 환자와 가족이 짊어지는 많은 시간적, 경제적 손실은 물론, 외모에 의한 정신적 고통이 신체적 고통 이상으로 큰 질환이다.
이러한 아토피 피부염은 주로 알레르기를 일으키는 원인 물질인 알레르겐(allergen)에 의해 유도되는데, 인체에 알레르겐이 작용하면, 협조유도세포의 편향된 발달을 비롯한 비만세포(mast cells)의 과도한 활성화 등 면역불균형(immune disorder)에 의한 급성 및 만성 염증반응(acute/chronic inflammatory response)을 일으키는 것으로 알려져 있다. 아토피 피부염은 염증유발과 동시에 심한 가려움증을 동반하면서 피부장벽을 붕괴하여 그 증상을 더욱 악화시키는데 문제가 있다.
비만세포는 아토피 피부염을 비롯한 대부분의 알레르기성 질환에서 급성 및 만성 염증 질환을 일으키는 핵심적으로 참여하는 세포로 알려졌다6-10). 비만세포는 anti-IgE을 비롯한 calcium ionophore(A23187), phobol myristate acetate (PMA)와compound 48/80과 같은 면역학적 및 약리학적 자극원에 의해 활성화된다. 비만세포가 활성화되면, tumor necrosis factor(TNF)-α), interleukin (IL)-1, IL-6과 IL-8 등 염증성 사이토카인(inflammatory cytokines)의 생성뿐만 아니라 히스타민과 같은 가려움 유발물질(pruritogen)을 방출한다. 이와 같이 비만세포 유래 염증성 사이토카인은 염증반응을 더욱 촉진시키는 동시에 히스타민과 같은 가려움 유발물질은 가려움증을 더욱 촉진시켜 피부장벽을 붕괴시키는 원인이 된다.
"원인을 알 수 없는 이상한 질병"이라는 아토피(atopy)의 어원이 의미하듯 아토피 피부염은 서양의학적으로 근본적이고 적절한 치료가 되지 못하고 있는 실정이다. 다만 대중요법으로 사용되고 있는 스테로이드와 같은 비특이적 면역억제제, 항히스타민제 및 항생제의 경우 면역반응을 억제하여 일시적 증상의 완화를 나타내나, 약물치료를 중단할 경우 반동현상으로 인하여 아토피 피부염의 증상이 더욱 심해지는 경우가 많다. 또한 장기간 투여하는 경우 피부가 얇아져 2차 감염을 일으킬 가능성이 있음은 물론, 내성, 당뇨병, 백내장 유발 등 부작용의 우려가 상존한다. 따라서 부작용이 적고, 면역기능을 증강시키며, 항 알레르기 효과와 피부자극 억제 효과를 갖는 천연물질의 발굴은 기존의 비특이적이고 대중적인 약물을 대체할 수 있는 근원적 치료법이 될 수 있기에, 그에대한 개발이 요구되는 실정이다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 부작용을 최소화 하면서 아토피 피부염 억제 효과를 갖는 천연물질을 발굴하기 위해 예의 노력한 결과, 백반, 녹반, 밀타승 및 월석의 추출물이 PMA와 A2318로 자극된 비만세포와 LPS로 자극된 대식세포에서 아토피피부염 억제 효과를 가지는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 백반, 녹반, 밀타승 및 월석 중에서 선택되는 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 함유하는, 아토피 피부염 개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 백반, 녹반, 밀타승 및 월석 중에서 선택되는 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 함유하는, 아토피 피부염 개선용 화장료 조성물이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 조성물은 HMC(Human Mast Cell)-1 세포의 탈과립을 억제할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 조성물은 HMC-1 세포의 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 방출을 억제할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 조성물은 대식세포의 산화질소(NO)의 발생을 억제할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 추출물은 전체 화장료 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01 내지 30 중량% 함유될 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물을 포함하는 아토피 피부염 개선용 피부 외용제가 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 피부 외용제는 용액, 현탁액, 겔, 크림, 유액, 화장수, 팩, 로션, 에센스, 파우더, 비누, 입욕제 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 제형을 가질 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 백반, 녹반, 밀타승 및 월석 중 하나 이상의 추출물을 수득하는 단계; 및 상기 추출물을 0.25% 내지 1%의 농도로 조절하는 단계; 를 포함하고, 상기 추출물은, 물, 주정, 탄소수 1~4의 저급 알코올, 에틸 아세테이트 및 1,3-부틸렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매로 추출하는 것인, 아토피 피부염 개선용 화장료 조성물의 제조방법이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 추출물은 상온침지추출법 또는 초임계추출법에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 백반, 녹반, 밀타승 및 월석 중에서 선택되는 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 함유하는, 아토피 피부염 개선용 식품 조성물이 제공된다.
본 발명의 아토피 개선용 화장료 조성물은 탈과립이 유도된 HMC-1 비만세포에서의 탈과립을 억제하고, 비만세포의 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase)방출을 억제할 수 있으며, 대식세포의 산화질소 분비를 감소시킴으로써 아토피 피부염의 예방, 치료 또는 개선 효과를 나타낸다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 추출물에 따른 HMC-1 비만세포에서의 탈과립 억제 효과를 비교한 것이다(a: 무처리, b: PMA+A23187 처리, c: PMA+A23187+백반 추출물, d: PMA+A23187+녹반 추출물, e: PMA+A23187+밀타승 추출물, f: PMA+A23187+월석 추출물).
도 2는 0.25%, 0.5%, 1% 백반, 녹반, 밀타승 및 월석 추출물의 농도별 베타-헥소사미디다제(β-hexosamididase) 억제 정도를 측정한 것이다.
도 3은 0.25%, 0.5%, 1% 백반, 녹반, 밀타승 및 월석 추출물의 농도별 산화질소(NO) 생성 억제 정도를 측정한 것이다.
도 2는 0.25%, 0.5%, 1% 백반, 녹반, 밀타승 및 월석 추출물의 농도별 베타-헥소사미디다제(β-hexosamididase) 억제 정도를 측정한 것이다.
도 3은 0.25%, 0.5%, 1% 백반, 녹반, 밀타승 및 월석 추출물의 농도별 산화질소(NO) 생성 억제 정도를 측정한 것이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 그러나, 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있어서 특허출원의 권리 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 실시예들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물이 권리 범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 백반, 녹반, 밀타승 및 월석 중에서 선택되는 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 함유하는, 아토피 피부염 개선용 화장료 조성물이 제공된다.
본 발명자들은 상기 네 가지 천연물의 추출물이 비만세포의 탈과립 및 염증반응을 억제함으로써 아토피 피부염 질환을 예방, 치료 또는 개선할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 상기 백반, 녹반, 밀타승 및 월석의 추출물이 아토피 피부염에 대한 개선 효과를 나타내는 것은 이전에 알려진 바 없었으며, 본 발명자들에 의해 처음으로 규명되었다.
본 명세서에서 사용된 용어 ““백반(Alunitum)””은 광물성의 명산석을 가공 처리한 결정체로 만든 약재로, 지혈, 지사, 해열, 해갈에 효능이 있으며, 명반(KAl(SO4)2·12H2O)를 99.9% 이상 함유한다.
본 명세서에서 사용된 용어 ““녹반(Melanterite)””은 단사정계의 능주상의 결정이거나 종유상의 덩어리로, 소종, 정통, 지혈에 효능이 있고 황산제일철(FeSO4·7H2O)을 95% 이상 함유한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “밀타승(Plumbum)”은 납을 용융한 후에 이를 가공하여 만든 것으로, 지혈, 조습, 염창, 진경에 효능이 있으며 납산화물(PbO)을 주성분으로 한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “월석(Borax)”은 천연 붕사광을 정제하거나 붕소광으로부터 만들어 정제한 것으로 생진, 성주, 지주에 효능이 있으며 사붕산나트륨(Na2B4O7·10H2O)을 주성분으로 한다.
백반, 녹반, 밀타승 및 월석 추출물은, 물, 주정, 탄소수 1~4의 저급 알코올, 에틸 아세테이트 및 1,3-부틸렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매, 바람직하게는 물, 에탄올, 메탄올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 수득한 것일 수 있고, 상기 추출물은 상온침지추출법 또는 초임계추출법에 의한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "개선"은 상기 추출물을 포함하는 조성물의 투여로 아토피 피부염의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 화장료 조성물은 HMC(Human Mast Cell)-1 세포의 탈과립을 억제할 수 있고, HMC-1 세포의 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 방출을 억제할 수 있으며, 대식세포의 산화질소(nitric oxide, NO) 발생을 억제할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 비만세포의 탈과립을 감소시켜 히스타민과 염증성 사이토카인인 IL-4의 방출을 억제할 수 있으므로 혈관확장, 알레르기 반응, 기관지 평활근의 수축 작용 등의 유발을 방지하여 아토피 피부염을 개선할 수 있다. 또한, 과립에 저장되어 있다가 탈과립 시 비만세포로부터 히스타민과 함께 유리되는 베타-헥소미니다아제의 방출을 억제하여 가려움 유발을 방지할 수 있으며, 가장 대표적인 염증 유발효소인 iNOS(inducible nitric oxide synthase)의 활성화에 의해 발생하는 산화질소(NO)를 감소시켜 염증반응에 의한 아토피 피부염의 악화를 막을 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 상기 추출물을 전체 화장료 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01 내지 30 중량%, 구체적으로는 0.01 내지 20 중량%, 보다 구체적으로는 0.01 내지 10 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 화장료 조성물은 유효성분으로서 상기 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들어 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 계면활성제, 보습제, 킬레이트제, 보습제 및 향료 등의 첨가제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물을 포함하는 아토피 피부염 개선용 피부 외용제가 제공된다.
또한, 본 발명의 피부 외용제는 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 용액, 현탁액, 겔, 크림, 유액, 화장수, 팩, 로션, 에센스, 파우더, 비누, 입욕제, 스프레이 등의 제형으로 제조될 수 있다.
상기 피부 외용제의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예를 들어, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르를 이용될 수 있다.
상기 피부 외용제의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
상기 피부 외용제의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
또한, 상기 피부 외용제의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로 플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 백반, 녹반, 밀타승 및 월석 중 하나 이상의 추출물을 수득하는 단계; 및 상기 추출물을 0.25% 내지 1%의 농도로 조절하는 단계; 를 포함하고, 상기 추출물은, 물, 주정, 탄소수 1~4의 저급 알코올, 에틸 아세테이트 및 1,3-부틸렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매로 추출하는 것인, 아토피 피부염 개선용 화장료 조성물의 제조방법이 제공된다.
상기 추출물의 농도가 높아질 수록, 베타-헥소미니다제 및 산화질소의 발생이 감소할 수 있으나, 월석 추출물의 농도가 1% 이상인 경우에는 비만세포에 대해 세포독성을 나타낼 수 있으므로, 월석 추출물의 농도는 1% 미만인 것이 바람직하다. 한편, 월석을 제외한 백반, 녹반 및 밀타승 추출물의 농도는 목적에 따라 1% 이상의 농도를 가질 수 있다.
백반, 녹반, 밀타승 및 월석 추출물은, 물, 주정, 탄소수 1~4의 저급 알코올, 에틸 아세테이트 및 1,3-부틸렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매, 바람직하게는 물, 에탄올, 메탄올 또는 이들의 혼합 용매, 보다 바람직하게는 메탄올로 추출하여 수득한 것일 수 있다. 상기 추출물은 상온침지추출법 또는 초임계추출법에 의해 추출된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 백반, 녹반, 밀타승 및 월석 중에서 선택되는 하나 이상의 추출물을 유효성분으로 함유하는, 아토피 피부염 개선용 식품 조성물이 제공된다.
식품 조성물은 일상적으로 섭취하는 것이 가능하므로, 뛰어난 아토피 피부염 개선 효과를 기대할 수 있고, 일반 의약품과 달리 천연물을 원료로 하여 약품의 장기복용 시 발생할 수 있는 부작용이 적은 장점이 있다.
본 발명의 식품 조성물은, 백반, 녹반, 밀타승 및 월석 중에서 선택되는 하나 이상의 추출물을 그대로 이용하거나, 식품학적으로 허용 가능한 추가의 성분을 더 포함할 수 있고, 유효성분의 양은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은, 음료수, 차, 드링크제, 껌, 과자류, 캔디류 등의 식품 소재에 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함할 수 있다.
구체적인 예로, 본 발명의 식품 조성물은 음료 조성물로 사용될 수 있으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 감미료 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당 등의 단당류, 말토스, 수크로오스 등의 이당류, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미료는 타우마틴, 스테비아 추출물 등의 천연 감미료나, 사카린, 아스파탐 등의 합성 감미료를 포함할 수 있다.
이외에도, 음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 또한, 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이들 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 추출물의 제조
백반, 녹반, 밀타승 및 월석을 지름 2cm의 크기로 파쇄한 다음, 각 원료를 5 g씩 100ml의 메탄올 용매에 첨가하고, 3일간 상온에서 정치시켜 추출한 다음, 2% 메탄올로 희석하여 0.25, 0.5, 1% 농도로 준비하였다.
실시예
2: 세포주 배양
인간 유래의 비만세포주인 HMC(Human Mast Cell)-1은 인제대학교(Inje university, Kimhae)로부터 분양받았고, 마우스 유래의 대식세포주인 RAW 264.7은 한국세포주은행(KCLB, Seoul)으로부터 분양 받아 본 실험에 사용하였다. 인간 유래의 비만세포주인 HMC-1을 10% FBS(fetal bovine serum), 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin), 0.1% 2-mercaptoethanol 및 3.024 mg/mL의 NaHCO3가 첨가된 IMDM 배지에 접종하고, 95%의 습도가 유지되는 37℃의 5% CO2 배양기 (MOC-18AIC, SANYO, Osaka, Japan)에서 충분히 배양하였다. 마우스 유래의 대식세포주인 RAW 264.7을 10% FBS(fetal bovine serum), 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 및 3.7 mg/mL의 NaHCO3가 첨가된 DMEM 배지에 접종하고, 95%의 습도가 유지되는 37℃의 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
실시예
3: HMC-1 세포의 형태학적 변화 관찰
탈과립을 유도하기 위한 PMA(Phobol myristate)와 A23187(Calcium Ionophore)는 DMSO에 희석하였고, 염증을 유도하기 위한 LPS는 PBS에 희석하여 준비하였다. PMA와 A23187로 탈과립이 유도된 HMC-1 세포의 형태학적 변화를 관찰하기 위해, 상기 실시예 2에서 배양한 HMC-1 세포를 6-well plate의 각 well에 2 × 105 cells/mL의 농도로 2 mL씩 플레이팅 하고 37℃의 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양된 HMC-1 세포주에 PMA와 A23187을 최종처리 농도가 50 nM와 1 μM이 되도록 처리하고, 37℃의 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하여 단독 처리군으로 하였다. 또한, 배양된 HMC-1 세포를 6-well plate의 각 well에 2 × 105 cells/mL의 농도로 2 mL씩 플레이팅 하고 상기 실시예 1에서 제조된 백반, 녹반, 밀타승 및 월석 추출물을 1%의 농도로 처리하여 1시간 배양한 후, 최종처리 농도 50 nM의 PMA와 1 μM의 A23187을 처리하고 37℃의 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다.
배양된 세포의 형태학적 변화는 위상차 현미경 (Nikon, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였고, 200배의 배율로 사진을 촬영하여 도 1에 나타내었다. 도 1의 a 내지 f는 다음과 같다: a: 무처리, b: PMA+A23187 처리, c: PMA+A23187+백반 추출물, d: PMA+A23187+녹반 추출물, e: PMA+A23187+밀타승 추출물, f: PMA+A23187+월석 추출물.
도 1을 참고하면, PMA와 A23187 단독 처리군은 세포윤곽이 불분명하고 세포질 내 과립이 세포 표면으로 표출되어 흩어지는 형태학적 변화를 나타내는 반면(도 1의 b), 백반, 녹반, 밀타승, 월석 추출물을 처리한 경우, PMA와 A23187에 의해 탈과립이 유도되었던 세포의 형태학적 변화가 회복되어 세포 윤곽이 뚜렷해지고, 세포 원래의 형태를 유지하는 것을 확인할 수 있다(도 1의 c ~ f). 이를 통해, 상기 실시예 1의 추출물을 처리하는 경우 HMC-1 세포의 탈과립이 억제되는 것을 알 수 있다.
실시예
4:
탈과립
억제 효과 검증
베타-헥소사미니다아제의 억제 정도를 측정하기 위해 β-hexosaminidase release assay를 실시하였다. 상기 실시예 2에서 배양된 HMC-1을 extracellular buffer로 2번 washing하여 24-well plate에 1 × 106 cells/mL의 농도로 500 μL씩 분주한 다음, 상기 실시예 1의 추출물을 0.25%, 0.5%, 1% 농도별로 처리하고 1시간 배양하였다. 다음으로, PMA 50 nM과 A23187 1 μM을 처리하고 24시간 배양한 후, ice bath에서 10분간 방치하여 반응을 정지시켰으며, suspension하여 micro tube (Eppendorf AG, Hamburg, Germany)로 옮겼다. 옮긴 세포를 8000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 배양 상등액 20 μL를 96-well plate로 옮겼다. 여기에 substrate buffer 100 μL를 첨가하고 37℃ 암반응에서 1시간 배양하였다. 그 후, stop solution 100 μL를 첨가하여 반응을 정지시키고, ELISA reader (Model 680, BioRad, USA)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정한 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2를 참고하면, PMA, A23187 무처리 대조군과 비교할 때, PMA 50 nM 및 A23187 1 μM 처리군은 베타-헥소미니다아제 발생량이 2배 증가하였으며, 0.25, 0.5, 1% 농도의 백반, 녹반, 밀타승, 월석 추출물 처리군에서는 농도가 높아짐에 따라 베타-헥소미니다아제 발생량이 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인할 수 있다.
실시예
5: NO 억제 효과 검증
RAW 264.7 세포에서 백반, 녹반, 밀타승, 월석의 NO 억제 정도를 측정하기 위해 NO production assay를 실시하였다. 상기 실시예 2에서 배양된 RAW 264.7을 96-well plate에 2 × 105 cells/mL로 100 μL 분주하여 37℃의 5% CO2 incubator에서 48시간 동안 배양하였다. 상기 실시예 1의 추출물을 0.25%, 0.5%, 1% 농도별로 처리하여 30분 동안 배양하고, 최종처리 농도 1 μg/mL의 LPS를 처리하여 24시간 동안 배양하였다. NO의 양을 측정하기 위해 배양 상등액 50 μL를 96-well plate에 분주하고 griess reagent를 50 μL씩 분주 후 상온에서 10분간 반응시킨 다음, ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3을 참고하면, LPS 무처리 대조군에 비해 LPS 처리군은 NO 발생량이 2배 이상 증가하였으며, 0.25, 0.5, 1% 농도의 백반, 녹반, 밀타승, 월석 추출물 처리군에서는 농도가 높아짐에 따라 NO 발생량이 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인할 수 있다.
실시예
6: 세포 독성 실험
6-1: HMC-1 세포
HMC-1 세포에 미치는 백반, 녹반, 밀타승, 월석의 자체독성 여부를 측정하기 위해 WST (water soluble tetrazolium) reduction assay를 실시하였다. 상기 실시예 2에서 배양된 HMC-1 세포를 96-well plate의 각 well에 2 × 105 cells/mL의 농도로 100 μL씩 플레이팅 한 다음 상기 실시예 1의 추출물을 0.25%, 0.5%, 1% 농도별로 처리하여 37℃의 5% CO2 incubator에서 24시간 동안 배양 하였다. EZ-Cytox WST assay reagent (Daeil Lab Service Co., LTD, Seoul, Korea)을 10 μL 첨가하고 3시간 동안 반응시킨 후에 ELISA reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 무처리군을 100%로 하였을 때 상대적인 세포생존율을 측정하여 하기 표 1에 나타내었다.
| PMACI | Survival (%) | ||||
| (%) | 백반 | 녹반 | 밀타승 | 월석 | |
| None | - | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 0.25 | + | 99.1±4.000 | 98.0±12.890 | 91.5±1.475 | 88.0±2.897 |
| 0.5 | + | 100.4±1.374 | 119.7±21.863 | 91.3±1.140 | 79.2±0.409 |
| 1 | + | 100.5±4.100 | 186.1±24.802 | 93.6±1.569 | 73.1±0.179 |
표 1을 참고하면, 백반과 밀타승은 모든 농도에서 독성이 나타나지 않았고, 녹반은 색이 진하여 값을 측정하기 어려웠으며, 월석은 농도가 높아짐에 따라 독성이 나타나는 것을 알 수 있었다.
6-2. RAW 264.7 세포
RAW 264.7 세포에 미치는 백반, 녹반, 밀타승, 월석의 자체독성 여부를 측정하기 위해 MTT reduction assay를 실시하였다. RAW 264.7 세포를 96-well plate의 각 well에 1 × 105 cells/mL의 농도로 100 μL씩 플레이팅 하고 37℃의 5% CO2 incubator에서 48시간 동안 배양하였다. 상기 실시예 1의 추출물을 0.25%, 0.5%, 1% 농도별로 처리하여 24시간 동안 배양한 후, 각 well에 PBS 완충액으로 녹인 MTT solution (5 mg/mL; Sigma-Aldrich)을 10 μL씩 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. 배지를 완전히 제거하고, 각 well에 100 μL씩 DMSO를 첨가하여 형성된 비수용성의 formazan을 완전히 용해한 후, ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 무처리군을 100%로 하였을 때 상대적인 세포생존율을 측정하여 하기 표 2에 나타내었다.
| PMACI | Survival (%) | ||||
| (%) | 백반 | 녹반 | 밀타승 | 월석 | |
| None | - | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 0.25 | + | 104.8±1.764 | 107.0±10.135 | 96.4±7.127 | 102.3±3.959 |
| 0.5 | + | 110.1±3.588 | 120.8±2.748 | 97.3±6.968 | 103.4±4.784 |
| 1 | + | 116.8±4.761 | 123.9±7.399 | 93.8±8.133 | 106.4±3.624 |
표 2를 참고하면, 백반, 녹반, 밀타승, 월석은 모든 농도에서 독성이 나타나지 않는다는 것을 알 수 있다.
이를 통해, 백반, 녹반, 밀타승 및 월석은 자체독성이 적고, 상기 실시예 3 내지 실시예 6의 결과가 세포사에 의해 나타난 탈과립 및 염증반응의 억제가 아닌 백반, 녹반, 밀타승 및 월석 추출물 자체에 의한 것임을 알 수 있다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.
Claims (13)
- 백반, 녹반, 밀타승 및 월석 추출물을 유효성분으로 함유하는, 아토피 피부염 개선용 화장료 조성물로서,
HMC(Human Mast Cell)-1 세포의 탈과립을 억제하고, HMC-1 세포의 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 방출을 억제하며, 대식세포의 산화질소(NO) 발생을 억제하는, 아토피 피부염 개선용 화장료 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 추출물은 전체 화장료 조성물의 총 중량을 기준으로 0.01 내지 30 중량% 함유되는, 아토피 피부염 개선용 화장료 조성물.
- 삭제
- 제1항 또는 제5항의 조성물을 포함하는, 아토피 피부염 개선용 피부 외용제.
- 제7항에 있어서,
상기 피부 외용제는, 용액, 현탁액, 겔, 크림, 유액, 화장수, 팩, 로션, 에센스, 파우더, 비누, 입욕제 및 스프레이로 이루어진 군에서 선택되는 제형을 가지는, 아토피 피부염 개선용 피부 외용제.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 백반, 녹반, 밀타승 및 월석 추출물을 유효성분으로 함유하는, 아토피 피부염 개선용 식품 조성물로서,
HMC(Human Mast Cell)-1 세포의 탈과립을 억제하고, HMC-1 세포의 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 방출을 억제하며, 대식세포의 산화질소(NO) 발생을 억제하는, 아토피 피부염 개선용 식품 조성물.
- 삭제
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