KR20140128576A - 편백 유래 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원의 분리 방법 및 이를 포함하는 아토피성 피부염 치료용 조성물 - Google Patents

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장영수
윤제정
문명재
김도희
이재의
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재단법인 전남생물산업진흥원
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Abstract

본 발명은 편백 유래 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원(2-hydroxy-4-isopropyl-2,4,6-cycloheptatrien-1-one)의 초임계 분리 방법 및 이를 포함하는 아토피성 피부염 치료용 조성물에 관한 것이다.
상기 편백 유래 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원의 분리 방법은 (a) 편백나무 목질부를 냉풍 건조하는 단계; (b) 상기 건조된 편백나무 목질부를 0.2 내지 2 ㎜의 입자 크기로 분쇄하는 단계; (c) 상기 편백나무 목질부 분쇄물을 30~50℃의 온도 및 100~500bar의 압력 하에서 초임계 이산화탄소로 1차 초임계 추출하는 단계; (d) 상기 편백나무 목질부의 1차 초임계 추출물을 30~50℃의 온도 및 100~500bar의 압력 하에서 초임계 이산화탄소로 2차 초임계 추출하는 단계; 및 (e) 상기 편백나무 목질부의 2차 초임계 추출물로부터 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원을 분리하는 단계를 포함한다.

Description

편백 유래 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원의 분리 방법 및 이를 포함하는 아토피성 피부염 치료용 조성물 {Extraction Method of 2-hydroxy-4-isopropyl-2,4,6-cycloheptatrien-1-one Derived from Hinoki Cypress and Pharmaceutical Composition for Treating Atopic dermatitis Including the same}
본 발명은 편백 유래 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원(2-hydroxy-4-isopropyl-2,4,6-cycloheptatrien-1-one)의 분리 방법 및 이를 포함하는 아토피성 피부염 치료용 조성물에 관한 것이다.
아토피성 피부염(atopic dermatitis)은 유전적, 환경적, 면역학적인 원인으로 피부 가장 바깥에 있는 보호벽인 각질층에 이상이 생긴 것으로 건조한 기후에서 더욱 심해지는 알레르기 질환이다. 아토피성 피부염은 상당히 많은 사람들이 앓고 있는데, 전 인구의 0.5~1%, 어린이의 경우 5~10%가 아토피성 피부염으로 고통을 받고 있으며, 환자의 50%는 두 돌 이내에 치유되나 25%는 청소년기까지 가며, 나머지 25%는 성인이 되어서도 아토피 피부염이 없어지지 않고 계속된다.
아토피성 피부염의 주요증상은 심한 가려움증, 피부건조, 발진, 진물, 부스럼딱지, 비늘 같은 껍질이 있는 피부(인비늘) 등이다.
이러한 아토피성 피부염의 원인은 잘 알려져 있지 않으나 주로 유전적인 요소가 많고 면역 반응과 관련되어 있는 것으로 밝혀져 있으며, 그 외에 건조한 피부, 정상인에 비해 쉽게 피부 가려움증을 느끼는 특성, 세균ㆍ바이러스ㆍ곰팡이 등에 의한 감염, 정서적 요인, 환경적 요인 등이 서로 복합적으로 작용하여 일어나는 것으로 알려졌다.
비만세포(mast cells)는 아토피성 피부염을 유도하는 중요한 원인세포 중의 하나이며, IgE 수용체에 결합되어 있는 IgE 항체가 항원에 의하여 가교(bridge)를 형성하면 다양한 단백질인산화효소(Src-family kinase, Syk 등), phospholipase C, protein kinase C(PKC), 칼슘 신호 등의 작용을 거쳐 과립에 저장되어 있던 히스타민(histamine), β-헥소사미니다제(hexosaminidase), 프로테아제(protease) 등이 방출됨으로써 반응 초기 단계를 매개로 혈관확장, 부종 등을 유발하며, 염증성 싸이토카인인 IL-4, IL-6, TNF-α의 생성을 증가시켜 생체 내의 염증반응을 유도한다.
대식세포의 염증매개물질로는 아라키돈산 연속 대사물(arachidonic acid cascade metabolites)인 프로스타글랜딘(prostaglandin)과 TNF-α와 같은 싸이토카인(cytokines), 산화질소, 활성산소(Reactive Oxygen Species) 등이 알려져 있으며 류마티스관절염, 천식, 아토피 등 염증성 질환에 관여한다.
즉, 인체에 접촉하거나 들어온 두드러기의 원인이 되는 물질을 자연치유력으로 제거하는 과정에서 비만세포(mast cell)에 생긴 항체(IgE)가 다시 그 물질(항원)이 들어오면 과민반응을 일으켜서 히스타민을 생기게 하여 아토피성 피부염의 원인이 된다. 비만세포는 피부, 호흡기, 위장관의 점막, 임파관 주위, 뇌 등 전신의 장기에 널리 분포하며, 다양한 염증 반응 및 알레르기 반응의 원인 세포로 알려져 있다. 또한 비만세포에서 방출된 히스타민은 혈관확장, 장관내 및/또는 기관지 평활근 수축, 선세포의 분비, 항진작용 등을 나태내어 염증 반응 및 즉각형 알레르기 반응을 야기하며, 점액분비 및 국소 단백질 분비와 같은 다양한 생물학적 효과를 매개한다.
아토피성 피부염에 대한 처방은 스테로이드제, 항히스타민제, 항생제 등과 같은 약물요법이 주로 이루어지고 있다. 스테로이드제(부신피질호르몬제)는 크게 소염작용과 면역억제 작용이 있고 효과가 우수하지만, 장기간 바르면 피부약화, 전신 호르몬 증상, 중독성 등의 부작용이 나타날 수 있다.
최근 연구중인 아토피성 피부염의 치료 방향은 면역억제제를 사용하는 것과 새로운 항히스타민제를 사용하는 것이지만, 항히스타민제만으로는 알레르기 반응을 완벽하게 차단하지는 못한다. 이는 알레르기 반응을 야기하는 화학전달물질이 히스타민만은 아니기 때문이다. 비만세포에서 방출되는 화학전달물질에는 히스타민 외에도, 류코트리엔(leukotriene) C4와 류코트리엔 B4 등이 있다. 류코트리엔 C4는 히스타민과 마찬가지로 기관지 평활근을 수축시키고, 류코트리엔 B4는 염증성 백혈구인 호중구와 호산구를 유도하는데 이는 염증을 만성화시켜 주위 세포에 상처를 준다.
따라서 아토피성 피부염에 효과가 있으면서도 부작용이 없는 새로운 아토피성 피부염 치료를 위한 조성물 개발이 요구되고 있다.
한편, 편백(扁柏)은 일본 원산의 상록교목이다. 회목(檜木), 히노끼, 노송나무라고도 한다. 편백은 높이가 30~40m이고, 폭이 1~2m 가량 되며, 나무껍질은 적갈색이고, 작은 바늘 모양의 잎이 가지에 밀생한다. 봄에는 가지 위에 작은 꽃이 피며, 10월에 녹색의 구과가 붉은색으로 익는다. 구과는 지름 1㎝로 7~9개의 방패 모양인 비늘조각으로 되어 있다. 잎과 목재에는 1%의 정유가 포함되어 있으며, 약용으로 이용되고 있다.
특히, 편백은 포름알데히드와 같은 공기중 유해물질을 제거하고, 항균 효과, 면역기능증대 효과는 물론 아토피, 알레르기 예방에도 탁월한 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 이는 편백의 잎이나 목질부에 함유되어 있는 정유 성분으로 인한 것으로 특히, 상기 편백 내에 함유되어 있는 정유 성분 중 휘발성이 크고 항균 활성이 큰 물질을 '피톤치드'라 한다.
본 출원인은 한국공개특허 제2013-0014961호에서, 초임계 추출을 이용하여 편백나무의 잎로부터 에센셜 오일인 사비넨(sabinene), 알파 피넨(α-pinene), 베타 피넨(β-pinene), 미르센(myrcene), 리모넨(limonene), 감마 터피넨(γ-terpinene), (-)-트랜스 카리오필렌((-)-trans caryophyllene), 세드롤(cedrol) 등을 고효율로 추출하는 방법을 개시한 바 있다.
이에, 본 발명자들은 편백나무로부터 아토피성피부염 치료 활성을 가지는 물질을 분리하기 위하여 예의 노력한 결과, 편백나무 목질부를 대상으로 특정 조건에서 초임계 추출 및 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 수행할 경우, 아토피성피부염 치료능을 가지는 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원(2-hydroxy-4-isopropyl-2,4,6-cycloheptatrien-1-one)을 고수율로 분리할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 편백나무로부터 분리된 아토피성피부염 치료능을 가지는 물질을 포함하는 아토피성 피부염 치료용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 편백나무로부터 아토피성피부염 치료능을 가지는 물질을 고수율로 분리하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 편백나무 목질부를 냉풍 건조하는 단계; (b) 상기 건조된 편백나무 목질부를 0.2 내지 2 ㎜의 입자 크기로 분쇄하는 단계; (c) 상기 편백나무 목질부 분쇄물을 30~50℃의 온도 및 100~500bar의 압력 하에서 초임계 이산화탄소로 1차 초임계 추출하는 단계; (d) 상기 편백나무 목질부의 1차 초임계 추출물을 30~50℃의 온도 및 100~500bar의 압력 하에서 초임계 이산화탄소로 2차 초임계 추출하는 단계; 및 (e) 상기 편백나무 목질부의 2차 초임계 추출물로부터 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원을 분리하는 단계를 포함하는 편백 유래 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원의 분리 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 1차 초임계 추출은 40℃의 온도 및 300bar의 압력 하에서 수행하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 2차 초임계 추출은 40℃의 온도 및 250bar의 압력 하에서 수행하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 2차 초임계 추출물로부터 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원을 분리하는 단계는 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 이용한 분리는 n-헥산:에틸아세테이트(75:25) 혼합 용매를 이동상으로 하여 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 편백 유래 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원을 포함하는 아토피성 피부염 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명을 이용할 경우 편백나무의 목질부로부터 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원을 고수율로 분리할 수 있으며, 분리된 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원은 (a) 대식세포에서 산화질소(NO) 생성을 억제하고, IL-6 유전자 발현 및 생성을 억제하고, (b) 비만세포에서 DNP-BSA에 유도되어진 β-헥소사미니다제의 방출을 억제하고, 염증성 싸이토카인인 IL-4 및 TNF-α의 유전자 발현 및 생성을 억제하고, (c) 마우스에서 TPA로 유도된 귀의 부종을 억제하는 활성이 있으므로, 아토피성 피부염 치료 효과가 우수하다.
도 1은 본 발명에 따라 추출된 2차 초임계 추출물의 GC/MS 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따라 분리된 화합물의 대식세포에서의 산화질소 생성 억제능 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따라 분리된 화합물의 대식세포에서의 IL-6 유전자 및 TNF-α 유전자의 발현 저해능을 확인한 RT-PCR 밴드 사진이다.
도 4는 본 발명에 따라 분리된 화합물의 대식세포에서의 IL-6 단백질 및 TNF-α 단백질의 발현 저해능을 확인한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따라 분리된 화합물의 비만세포에서의 β-헥소사미니다제 방출 억제능 평가 결과 및 세포독성 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따라 분리된 화합물의 비만세포에서의 IL-4 유전자 및 TNF-α 유전자의 발현 저해능을 확인한 RT-PCR 밴드 사진이다.
도 7은 도 6의 RT-PCR 밴드의 면적을 GAPDH로 보정하여 %로 환산시킨 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따라 분리된 화합물의 비만세포에서의 IL-4 유전자 및 TNF-α 유전자의 발현 저해능을 확인한 Real-time PCR 결과를 comparative CT (threshold cycles)로 환산한 값의 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따라 분리된 화합물의 비만세포에서의 IL-4 단백질 및 TNF-α 단백질의 발현 저해능을 확인한 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명에 따라 분리된 화합물의 염증유발 반응 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명에서는 편백나무 목질부를 대상으로 특정 조건에서 초임계 추출 및 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 수행할 경우, 아토피성피부염 치료능을 가지는 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원(2-hydroxy-4-isopropyl-2,4,6-cycloheptatrien-1-one)을 고수율로 분리할 수 있다는 것을 확인하고자 하였다.
본 발명에서는, 편백나무 목질부를 대상으로 1차 초임계 추출 및 2차 초임계 추출을 수행한 후, 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원(2-hydroxy-4-isopropyl-2,4,6-cycloheptatrien-1-one)를 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, 정제한 다음 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원(2-hydroxy-4-isopropyl-2,4,6-cycloheptatrien-1-one)의 생리활성 평가를 수행하였다. 그 결과 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원(2-hydroxy-4-isopropyl-2,4,6-cycloheptatrien-1-one)는 (a) 대식세포에서 산화질소(NO) 생성을 억제하고, IL-6 유전자 발현 및 생성을 억제하고, (b) 비만세포에서 DNP-BSA에 유도되어진 β-헥소사미니다제의 방출을 억제하고, 염증성 싸이토카인인 IL-4 및 TNF-α의 유전자 발현 및 생성을 억제하고, (c) 마우스에서 TPA로 유도된 귀의 부종을 억제하는 활성이 있으므로, 아토피성 피부염 치료 효과가 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 편백나무 목질부를 냉풍 건조하는 단계; (b) 상기 건조된 편백나무 목질부를 0.2 내지 2 ㎜의 입자 크기로 분쇄하는 단계; (c) 상기 편백나무 목질부 분쇄물을 30~50℃의 온도 및 100~500bar의 압력 하에서 초임계 이산화탄소로 1차 초임계 추출하는 단계; (d) 상기 편백나무 목질부의 1차 초임계 추출물을 30~50℃의 온도 및 100~500bar의 압력 하에서 초임계 이산화탄소로 2차 초임계 추출하는 단계; 및 (e) 상기 편백나무 목질부의 2차 초임계 추출물로부터 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원을 분리하는 단계를 포함하는 편백 유래 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원의 분리 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 사용하는 용어 '편백나무 또는 편백(hinoki cypress)'은 측백나무과(側柏―科 Cupressaceae)에 속하는 상록비늘잎교목을 의미한다.
본 발명에서는 편백나무중 목질부를 이용한 것을 특징으로 한다. 참고로, 본 출원인은 한국공개특허 제2013-0014961호에서 사용한 편백나무 잎을 대상으로 초임계 추출을 수행하여 사비넨, 피넨, 미르센, 리모넨, 감마-터비넨, 트랜스-카리오필렌 및 세드롤 등을 획득한 바 있다.
상기 편백나무 목질부를 냉풍 건조하는 단계는 편백나무의 추출 효율 증가를 위한 전처리 단계이다. 즉, 냉풍으로 건조를 수행할 경우, 고온에서 쉽게 휘발 가능한 편백나무 내 기능성 성분들의 휘발을 방지할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 '냉풍 건조'는 '열풍 건조'와 대비되는 용어로서, 상온의 냉풍으로 건조시키는 건조방식을 의미한다. 상기 냉풍 건조시 온도는 15 내지 40℃의 온도 범위인 것이 바람직하다.
본 발명에서 상기 냉풍 건조는 수일 동안, 바람직하기로 1 내지 5일 동안 수행할 수 있으며, 편백나무 목질부의 수분 함량에 따라 적절히 조절될 수 있다.
상기 건조된 편백나무 목질부를 0.2~2㎜의 입자 크기로 분쇄하는 단계는 추출 효율 증가를 위한 전처리 단계이다.
상기 분쇄는 0.2~2㎜의 크기의 입자로 분쇄하는 것이 바람직하며, 0.2~0.5㎜ 크기의 입자로 분쇄하는 것이 더욱 바람직하다. 만일 상기 분쇄 시 입자 크기가 상기 범위를 벗어날 경우, 추출 효율이 낮아질 우려가 있다. 특히, 0.2㎜ 미만의 입자 크기에서는 초임계 추출 시 압력 부하로 인하여 추출 효율이 떨어지게 되고, 또한 휘발성 유효 성분이 분쇄 과정 중에 휘발되는 단점이 있다. 한편, 2㎜를 초과하는 큰 입자 크기에서는 입자 속에 포함되어 있는 기능성 성분이 초임계 유체에 의해 외부로 추출되기 어려워 결과적으로 목적하는 유효성분의 추출 효율이 떨어지는 문제점이 있다.
상기 초임계 이산화탄소로 1차 초임계 추출하는 단계는 편백나무 목질부 분쇄물을 30~50℃의 온도 및 100~500bar의 압력 하에서, 바람직하게는 40℃의 온도 및 300bar의 압력 하에서 수행하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 초임계 이산화탄소로 2차 초임계 추출하는 단계는 상기 편백나무 목질부의 1차 초임계 추출물을 30~50℃의 온도 및 100~500bar의 압력 하에서, 바람직하게는 40℃의 온도 및 250bar의 압력 하에서 수행하는 것을 특징으로 한다.
상기 1차 및 2차 초임계 추출단계에서, 상기 범위를 벗어난 온도 또는 압력 조건에서 초임계 추출을 수행할 경우, 목적 화합물인 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원이 추출되지 않거나, 추출되더라도 그 수율이 낮아지는 문제점이 있다.
상기 1차 초임계 추출물은 초임계 유체 추출장비의 특성상 고압으로 추출을 진행하기 때문에 오일과 더불어 지질(wax)까지 추출되므로, 2차 초임계 추출을 통하여 순수한 오일 성분을 추출할 수 있다.
본 발명에 있어서, 초임계 유체는 특별히 한정이 있지는 않으나 이산화탄소가 보다 바람직하다. 이산화탄소는 초임계유체 추출에서 주로 사용되는 용매로, 추출 후 대기압하에서 기화하여 대기중에 방출되므로 잔존용매가 존재하지 않아서 비독성, 비위험성이며, 음식물과 의약품 제조 산업에서 생산물을 오염없이 만드는 데 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 초임계 유체의 유량은 70~80ml/min인 것이 바람직하다. 만일 70ml/min 미만인 경우, 수율은 좋으나 시간 대비 효율이 떨어지고, 80ml/min을 초과할 경우, 적절한 추출이 이루어지지 않아 수율이 낮아질 수 있다.
상기 편백나무 목질부의 2차 초임계 추출물로부터 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원을 분리하는 단계는 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서는 편백나무 목질부의 2차 초임계 추출물은 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 수행하기 전에, 필터링 하거나, 원심분리를 통하여 정제시킨 것을 이용하는 것이 바람직하다.
상기 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 이용한 분리는 n-헥산:에틸아세테이트(75:25) 혼합 용매를 이동상으로 하여 0.5ml/min 용출속도로 수행되는 것을 특징으로 한다. 상기 이동상의 종류나 용매의 혼합비가 다를 경우, 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원의 분리가 어렵거나, 분리 수율이 낮아질 우려가 있다.
본 발명에 있어서, 보다 높은 순도의 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원을 획득하기 위하여, 통상적으로 이용되는 감압증류 및 재결정화법 등을 이용해 더 분리 정제할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 편백 유래 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원을 포함하는 아토피성 피부염 치료용 조성물에 관한 것이다.
상기 편백 유래 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원은 (a) 대식세포에서 산화질소(NO) 생성을 억제하고, IL-6 유전자 발현 및 생성을 억제하고, (b) 비만세포에서 DNP-BSA에 유도되어진 β-헥소사미니다제의 방출을 억제하고, 염증성 싸이토카인인 IL-4 및 TNF-α의 유전자 발현 및 생성을 억제하고, (c) 마우스에서 TPA로 유도된 귀의 부종을 억제하는 활성이 있으므로, 아토피성 피부염 치료에 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 아토피성 피부염 치료용 조성물은 화장료 조성물 또는 약학 조성물로 이용될 수 있다.
상기 아토피성 피부염 치료용 조성물이 화장료 조성물인 경우, 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.
상기 담체는 본 발명의 아토피성 피부염 치료용 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량% 내지 약 99.99 중량%, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 10 중량% 내지 약 99.99 중량 %로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 아토피성 피부염 치료용 조성물이 제조되는 전술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
한편, 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로써, 본 발명에 따른 아토피성 피부염 치료용 조성물은 상기 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원 이외에 식물성 경화유, 바세린, 글리세린, 산화방지제, 부틸렌글리콜, 구연산, 모노스테라인산 폴리옥시에틸렌 소르비탄 등을 포함할 수 있으며, 방부제, 항료, 색소, 정제수 등을 필요에 따라 미량 포함할 수 있다.
특히, 상기 아토피성 피부염 치료용 조성물은 본 발명에 특별히 개시된 제조방법 이외에도, 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조될 수 있다.
화장료 조성물로 제조될 경우, 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.
또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.
본 발명의 아토피성 피부염 치료용 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
또한, 상기 아토피성 피부염 치료용 조성물이 약학적 조성물일 경우, 이미 공지되어 사용되고 있는 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 아토피성 피부염 치료용 조성물은 본 발명의 출원시 공지된 약제학적으로 허용되는 다양한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함하여 제조될 수 있으며, 공지의 방법에 따라 분산제, 현탁제, 유화제, 용액 및 연고 등의 형태로 제조될 수 있다.
구체적으로, 상기 아토피성 피부염 치료용 조성물은 실온에서 약 4,000 내지 약 9,000cps 범위의 점도를 제제에 부여하기 위한 점증제를 함유할 수 있다. 점증제를 첨가하면, 여러가지 온도 범위에서 제형을 유지할 수 있어 안정한 점도를 얻을 수 있고, 동시에 외용으로 피부에 사용한 때의 감촉이 좋아지는 등, 사용성이 개선되는 효과가 있다. 이러한 점증제로는 수크로즈의 알릴 에테르와 C10~30 알킬 아크릴레이트, 아크릴산 및/또는 메타크릴산의 공중합체인 카르보폴 1342가 포함된다. 이외에 사용될 수 있는 다른 점증제로는 하이드록시프로필 메틸셀룰로즈, 하이드록시에틸 셀룰로즈, 카르복시메틸 셀룰로즈 등과 같은 셀룰로즈 유도체가 포함된다. 염(NaCl)의 소량 첨가는 또한 최종 제제의 점도를 조절하는 작용을 한다. 보통 염의 첨가량은 약 0.25 내지 0.6중량%이다. 상기 약학 조성물은 pH를 4 내지 10, 바람직하게는 4.5 내지 8, 더욱 바람직하게는 4.5 내지 7로 유지하기 위해 필요한 경우 산, 염기 및 완충제를 함유한다. 이러한 pH 조정 물질의 성질 및 사용 방식은 본 분야에 잘 알려져 있다.
상기 아토피성 피부염 치료용 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 경피투여용인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 경피투여용의 조성물은 연고, 크림, 파스타제(pastes), 로션, 찰제(liniments), 파스타제(pastes), 외용 액제, 틴크제, 글리세로젤라틴(glycerogelatins), 외용산제, 에어로졸 및 경고제(plasters)로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 갖을 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌에 기술되어 있다(Blaug et al., Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975).
또한, 아토피 피부염에 대한 예방 또는 치료 용량 범위는 중증도 및 제형에 따라 변할 수 있으며, 적용 횟수도 환자의 연령, 체중 및 체질에 따라 변할 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 편백나무 목질부 초임계 추출
1-1: 초임계 추출방법
장성산 편백나무 목질부를 30℃에서 1일 동안 냉풍 건조한 후, 분쇄기를 이용하여 0.2~2mm의 입자 크기로 분쇄함으로써 전처리하였다.
40℃, 300bar 조건에서, 초임계 추출 장치(ISA-SCFE-0050-0100-080-re, 일신오토클레이브, 한국)를 이용하여 편백나무 목질부 분말을 100g의 양으로 주입하고, 240분 동안 초임계 추출을 실시하였다. 초임계 추출 시 유량은 분당 75ml로 하였다.
1차 초임계 추출 완료 후, 초임계 추출 장치의 추출조 압력을 낮춰 초임계 유체 상태를 해제하고 1차 초임계 추출물을 회수하였다.
그 다음, 1차 초임계 추출물을 대상으로 40℃, 250bar 조건에서, 초임계 추출 장치(ISA-SCFE-0050-0100-080-re, 일신오토클레이브, 한국)를 이용하여 240 분 동안 2차 초임계 추출을 실시하여 2차 초임계 추출물을 얻었다. 초임계 추출 시 유량은 75ml/min으로 하였다.
1-2: 초임계 추출물로부터 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원의 분리방법
실시예 1-1에서 추출된 2차 초임계 추출물을 n-hexane(Merck)에 충분히 교반한 후, 원심분리시켜 부유물을 제거하고, 마이크로 필터(0.45 ㎛)로 정제하였다.
다음으로 정제된 2차 초임계 추출물의 성분을 GC/MS(240-MS, Varian)로 분석하였다. 이때, 컬럼은 VF-5ms(30mm×0.25mm×0.25mm), 이동 가스(carrier gas)는 He(1ml/min), 주입(injection) 온도는 250℃, 오븐(oven) 온도는 50~300℃/3℃ 승온, 주입량(injection volumn)은 1㎕, 주입 모드(injection mode)는 split ratio 10:1 조건이었다.
2차 초임계 추출물의 GC/MS 분석결과, 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원(2-hydroxy-4-isopropyl-2,4,6-cycloheptatrien-1-one)가 다량 존재하고 있다는 것을 확인할 수 있었다(도 1 참조).
최종적으로, 정제된 2차 초임계 추출물의 주요성분으로 확인된 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원을 LC/MS(LCMS 2020, Shimadzu)로 분리하였다. 이때, 컬럼은 ODP-50(150mm i.d × 4.6mm), 용매는 n-hexane:EtOAc(75:25), flow rate는 0.5ml/min 이었고, UV 240nm에서 확인하였다.
실험예 1: 대식세포에서의 아토피성 피부염 치료능 확인
1-1: 산화질소(NO) 생성 억제능 평가
아토피성 피부염 (Atopic dermatitis)은 만성적으로 재발하는 염증성 피부질환으로, 대식세포(RAW 264.7 cells)를 이용한 산화질소(NO) 생성 억제 실험을 통한 항염 효과를 평가하였다.
RAW 264.7 cells을 96 well plate에 200ul씩 분주하고 시료와 LPS를 처리하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양 후 상등액 100ul를 취하여 동량의 Griess reagent (1% sulfanilamide, 0.1% naphthylethylenediamine dihydrochloride, 및 2% phosphoric acid)와 혼합하여 상온에서 10분간 방치한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하고, 그 결과를 표 1 및 도 2에 나타내었다.
처리구 Nitric Oxide (nmole/106 cells)
UN ND
LPS 30±2.0
2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원 1ug/ml 20±1.6
3ug/ml 18±1.7
10ug/ml 10±0.94
UN: 음성 대조구, LPS: 양성 대조구
표 1 및 도 2로부터, 양성 대조구인 LPS는 산화질소가 30±2.0(nmole/106 cells) 생성되었고, 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원은 1, 3 및 10ug/ml 농도에서 LPS 대비 각각 33%, 40% 및 67%의 산화질소(NO) 생성 억제능을 나타내는 것을 확인하였다.
1-2: IL-6, TNF-α 유전자 및 단백질 발현 저해능 평가
대식세포는 면역계를 구성하는 세포이며, 항원에 대한 면역작용의 중추적인 역할을 하는 세포로, 활성화된 macrophage는 pro-inflammatory cytokine을 증가시키게 되는데 이러한 pro-inflammatory cytokine에는 iNOS에 의해 만들어지는 NO와 IL-6 및 TNF-α 등이 있다. 따라서, 염증세포 중 하나인 macrophages (RAW 264.7 cell)를 이용하여 시험물질이 염증관련 유전자 발현에 미치는 영향을 평가하였다.
1-2-1: RT-PCR 평가
RAW 264.7 cell은 6 well plate에 3ml 분주하고, 시료를 1시간 전처리 한 다음, RNesay kit(Qiagen, USA)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA 1ug을 100pmoles oligo d(T)16 primer와 reverse transcritase를 이용하여 cDNA를 합성하고, 합성한 cDNA를 이용하여 PCR을 수행하였다. 이때, TNF-α는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머, IL-6는 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머, β-actin은 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머를 이용하였다.
[서열번호 1] : 5'-AGGTTCTGTCCCTTTCACTCACTG-3'
[서열번호 2] : 5'-AGAGAACCTGGGAGTAGACAAGGTA-3'
[서열번호 3] : 5'-TGCTGGTGACAACCACGGCC-3'
[서열번호 4] : 5'-GTACTCCAGAAGACCAGAGG-3'
[서열번호 5] : 5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3'
[서열번호 6] : 5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3'
증폭된 PCR product는 2% agarose gel을 이용하여 확인하고, 도 3에 나타내었다.
도 3으로부터, 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원은 IL-6 유전자 발현을 억제한 것을 확인할 수 있었다.
1-2-2: ELISA 평가
RAW 264.7 cells을 96 well plate에 200ul씩 분주하고, 시료와 LPS를 처리하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양 후 상층액을 회수하였다. 회수된 상층을 이용하여 TNF-α 및 IL-6에 대한 ELISA를 수행하고, 그 결과를 표 2 및 도 4에 나타내었다.
처리구 IL-6
(pg/ml)		 TNF-α
(pg/ml)
UN 151±1 149±2
LPS 4551±130 9282±133
2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원 1ug/ml 3524±292 7685±293
3ug/ml 2568±370 8316±350
10ug/ml 1672±111 12738±285
표 2 및 도 4로부터, 양성 대조구인 LPS는 IL-6의 경우 4551±130(pg/ml), TNF-α의 경우 9282±133(pg/ml) 생성되었고, 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원은 3ug/ml 및 10ug/ml 농도에서 LPS 대비 IL-6 단백질의 발현을 각각 43% 및 63%를 억제하였으나, TNF-α 단백질의 발현은 억제하지 못하는 것을 확인하였다.
실험예 2: 비만세포에서의 아토피성 피부염 치료능 확인
2-1: β-헥소사미니다제 어세이(β-hexosaminidase assay) 및 세포독성 평가
비만세포(mast cell)는 DNP-BSA 수용체와 결합하여 히스타민(histamine) 및 엑시드 하이드롤라제(acid hydrolase)를 분비하여 염증반응을 유도하는데, 엑시드 하이드롤라제(acid hydrolase)인 β-헥소사미니다제(β-hexosaminidase)는 비만세포(mast cell)의 히스타민(histamine)이 저장된 분비과립에 존재하고 있으며, 항원의 자극으로 인한 신호에 의해 세포 밖으로 분비된다. 따라서 histamine과 β-hexosaminidase의 정량은 이들 세포에서 탈과립의 지표이기 때문에 알레르기 억제물질의 생리활성 측정에 사용되고 있다. 따라서, 아토피 피부염 원인세포 중 하나인 Mast cells (RBL-2H3 cell)를 이용하여 IgE를 세포에 감작시킨 다음 항원을 반응시킴으로써 시험물질이 세포의 탈과립에 미치는 영향을 평가하였다.
즉, RBL-2H3 cells을 24 well plate에 500ul를 분주하고 DNP-IgE를 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 다음으로, Siraganian buffer(119mM NaCl, 5mM KCl, 5.6mM Glucose, 0.4mM MgCl2, 25mM PIPES, 40 mM NaOH, 1mM CaCl2, 0.1% BSA, pH 7.2)로 워싱(washing) 후 칼슘 클로라이드(Calcium chloride)가 첨가된 Siraganian buffer를 200ul씩 분주하여 10분간 배양하고, 시료를 30분간 처리한 다음, antigen DNP-BSA를 4시간 처리 후 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액과 동량의 p-NAG(Sigma, USA)를 첨가하고, 1시간동안 반응 후 흡광도 측정하고, 그 결과를 표 3 및 도 5에 나타내었다.
또한, 세포독성을 평가하기 위하여 RBL-2H3 cell을 96 well plate에 200ul 분주하고 시료를 처리하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양 후 XTT solution을 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 2시간 방응 후 490nm에서 흡광도 측정하고, 그 결과를 표 3 및 도 5에 나타내었다.
처리구 β-hexosaminidase release(%) XTT
DNP-BSA 100±5 0991±0.029
2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원 1ug/ml 107±7 0.981±0.020
3ug/ml 86±2 0.952±0.033
10ug/ml 55±3 0.924±0.044
30ug/ml 19±2 0.905±0.019
* DNP-BSA로 방출되는 β-hexosaminidase를 100%로 환산, DNP-BSA에 대한 시료의 농도별 환산값
표 3 및 도 5로부터, 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원은 농도 의존적으로 β-hexosaminidase 방출 억제효과를 나타내고, 세포독성은 없다는 것을 확인할 수 있었다.
2-2: IL-4, TNF-α 유전자 및 단백질 발현 저해능 평가
염증 반응에 관여하는 내재성 면역세포는 대식세포, 비만세포, 호염구 등이 있지만, 특히 알레르기성 염증질환의 유발에 있어 대표적인 세포는 비만세포와 호염구로 알려져 있다. 이들 세포들은 histamine과 같은 염증매개물질을 외부자국에 의하여 분비함으로써 염증유발 및 염증 싸이토카인을 분비하고 포식작용도 수행하는등, 각종 염증질환의 초기단계에서 중요한 역할을 하고 있다. IL-4 및 TNF-α는 주로 급성 염증반응에 관련된 싸이토카인으로 염증 초기반응에 분비된다. 따라서, 아토피 피부염 원인세포 중 하나인 Mast cells(RBL-2H3 cell)를 이용하여 IgE를 세포에 감작시킨 다음 항원을 반응시킴으로써 시험물질이 염증관련 싸이토카인 유전자 발현에 미치는 영향을 평가하였다.
2-2-1: RT-PCR 평가
RBL-2H3 cell을 6 well plate에 2ml를 분주하고 DNP-IgE를 첨가하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양 후 배지를 제거하였다. Siraganian bufferr로 워싱(washing) 후 칼슘 클로라이드(Calcium chloride)가 첨가 된 Siraganian buffer를 1ml씩 분주하여 1시간 배양하고, 시료를 30분간 처리하고 antigen DNP-BSA(Sigma, USA)를 1시간 처리 후 RNesay kit(Qiagen, USA)를 이용하여 RNA를 분리하였다. RNA 1ug을 100pmoles oligo d(T)16 primer와 reverse transcriptase를 이용하여 cDNA를 합성하고, 합성한 cDNA를 이용하여 PCR을 수행하였다.
이때, IL-4는 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머, TNF-α는 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머, GAPDH는 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머를 이용하였다.
[서열번호 7] : 5'-TCTCACCTCCCAACTGCTTCC-3'
[서열번호 8] : 5'-CGTTTCAGGAATCGGATCAGC-3'
[서열번호 9] : 5'-GAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCA-3'
[서열번호 10] : 5'-GGCAATGATGATCCCAAAGTAGACCTGCCCAGACT-3'
[서열번호 11] : 5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3'
[서열번호 12] : 5'-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3'
증폭된 PCR product는 2% agarose gel을 이용하여 확인하고, 도 6에 나타내었다.
도 6으로부터, 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원은 용량에 의존적으로 IL-4 및 TNF-α 유전자 발현을 억제한 것을 확인할 수 있었다.
그리고, RT-PCR의 경우 밴드 각각의 면적을 구한 후 control 유전자인 GAPDH로 보정 하여 %로 환산하여 표 4 및 도 7에 나타내었다.
처리구 IL-4/GAPDH TNF-α/GAPDH
UN ND % ND %
DNP-BSA 69 100 95 100
2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원 1ug/ml 79 114 101 101
3ug/ml 78 112 68 68
10ug/ml 52 75 34 34
30ug/ml 22 32 20 20
* 각각의 band area를 구한 후 GAPDH 면적으로 보정한 후 수치를 %로 환산
표 4 및 도 7로부터, 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원은 10ug/ml 농도에서 IL-4 유전자의 발현을 25%, TNF-α 유전자의 발현을 66% 억제하고, 30ug/ml 농도에서 IL-4 유전자의 발현을 68%, TNF-α 유전자의 발현을 80% 억제한다는 것을 확인할 수 있었다.
2-2-2: Real-time PCR 평가
2-2-1에서 합성한 cDNA와 2XSYBR green Master mix (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 Real-time PCR을 수행하였다. 이때, IL-4는 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머, TNF-α는 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머, GAPDH는 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머를 이용하였다.
Real-time PCR의 결과는 comparative CT (threshold cycles) 방법으로 다음과 같이 계산하고, 그 결과를 표 5 및 도 8에 나타내었다.
△CT (sample) = CT (target gene)- CT(GADPH), △△CT=△CT (treat
sample)-△CT (NA sample) relative expression = 2-△△CT
처리구 IL-4 TNF-α
UN 1±0.11 % 1±0.04 %
DNP-BSA 14.61±1.03 100 18.78±0.51 199
2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원 1ug/ml 16.05±0.82 111 21.33±0.73 114
3ug/ml 14.84±0.11 102 15.26±0.96 80
10ug/ml 11.52±0.53 77 8.92±1.63 45
30ug/ml 4.99±0.17 29 6.5±1.09 31
표 5 및 도 8로부터 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원은 10ug/ml 농도에서 IL-4 유전자의 발현을 23%, TNF-α 유전자의 발현을 55% 억제하고, 30ug/ml 농도에서 IL-4 유전자의 발현을 71%, TNF-α 유전자의 발현을 69% 억제한다는 것을 확인할 수 있었다.
2-2-3: ELISA 평가
RBL-2H3 cells을 24 well plate에 500ul를 분주하고 DNP-IgE를 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. Siraganian buffer로 워싱(washing) 후 칼슘 클로라이드(Calcium chloride)가 첨가 된 Siraganian buffer를 200ul씩 분주하여 10분 배양, 시료를 30분 처리하고 antigen DNP-BSA를 4시간 처리 후 상층액을 회수하였다. 회수된 상층액을 이용하여 IL-4 및 TNF-α 에 대한 ELISA를 수행하고, 그 결과를 표 6 및 도 9에 나타내었다.
처리구 IL-4
(pg/ml)		 TNF-α
(pg/ml)
UN ND % 4±6 %
DNP-BSA 412±9 100 155±14 100
2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원 3ug/ml 382±24 93 151±12 97
10ug/ml 332±15 81 137±1 88
30ug/ml 179±33 43 34±11 20
표 6 및 도 9로부터, 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원은 10ug/ml 농도에서 IL-4 단백질의 발현을 19%, TNF-α 단백질의 발현을 12% 억제하고, 30ug/ml 농도에서 IL-4 단백질의 발현을 57%, TNF-α 단백질의 발현을 80% 억제한다는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3: TPA-induced inflammation
TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate)-induced inflammation은 급성 염증유발 동물모델로, TPA는 마우스에 국소 도포시, 농도 및 시간에 따라 표피 및 진피에 백혈구를 침윤시키고 염증반응을 유발시킨다.
따라서, 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원의 항염 효과를 검증하기 위하여, 시료를 1시간 전처리 후 TPA를 4시간 마우스 귀에 도포하여, 접촉성 피부염을 유도하고, 디지털 게이지로 귀 두께를 측정한 다음, 그 결과를 표 7 및 도 10에 나타내었다. 이때, 대조구로 Hydrocortisone을 사용하였다.
처리구 Increase in ear thichkness(mm) % of vehicle
UN 0.000±0.006 0±6
TPA 0.103±0.020 100±19
2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원 10ug/ml 0.032±0.013 31±12
1% Hydrocortisone 0.014±0.008 14±8
표 7 및 도 10으로부터, 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원은 3ug/ml 농도에서 약 69%의 부종 완화 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Jeonnam Bioindustry Foundation <120> Extraction Method of 2-hydroxy-4-isopropyl-2,4,6-cycloheptatrien-1-one Derived from Hinoki Cypress and Pharmaceutical Composition for Treating Atopic dermatitis Including the same <130> P13061 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 aggttctgtc cctttcactc actg 24 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agagaacctg ggagtagaca aggta 25 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tgctggtgac aaccacggcc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gtactccaga agaccagagg 20 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tggaatcctg tggcatccat gaaac 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 taaaacgcag ctcagtaaca gtccg 25 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tctcacctcc caactgcttc c 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cgtttcagga atcggatcag c 21 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gagtgacaag cctgtagccc atgttgtagc a 31 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ggcaatgatg atcccaaagt agacctgccc agact 35 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tgaaggtcgg agtcaacgga tttggt 26 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 catgtgggcc atgaggtcca ccac 24

Claims (6)

  1. 다음의 단계를 포함하는 편백 유래 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원의 분리 방법:
    (a) 편백나무 목질부를 냉풍 건조하는 단계;
    (b) 상기 건조된 편백나무 목질부를 0.2 내지 2 ㎜의 입자 크기로 분쇄하는 단계;
    (c) 상기 편백나무 목질부 분쇄물을 30~50℃의 온도 및 100~500bar의 압력 하에서 초임계 이산화탄소로 1차 초임계 추출하는 단계;
    (d) 상기 편백나무 목질부의 1차 초임계 추출물을 30~50℃의 온도 및 100~500bar의 압력 하에서 초임계 이산화탄소로 2차 초임계 추출하는 단계; 및
    (e) 상기 편백나무 목질부의 2차 초임계 추출물로부터 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원을 분리하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 1차 초임계 추출은 40℃의 온도 및 300bar의 압력 하에서 수행하는 것을 특징으로 하는 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원의 분리 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 2차 초임계 추출은 40℃의 온도 및 250bar의 압력 하에서 수행하는 것을 특징으로 하는 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원의 분리 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 2차 초임계 추출물로부터 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원을 분리하는 단계는 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하는 것을 특징으로 하는 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원의 분리 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 이용한 분리는 n-헥산:에틸아세테이트(75:25) 혼합 용매를 이동상으로 하여 수행되는 것을 특징으로 하는 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원의 분리 방법.
  6. 편백 유래 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원을 포함하는 아토피성 피부염 치료용 조성물.
KR20130047115A 2013-04-29 2013-04-29 편백 유래 2-하이드록시-4-이소프로필-2,4,6-싸이클로헵타트리엔-1-원의 분리 방법 및 이를 포함하는 아토피성 피부염 치료용 조성물 KR20140128576A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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