KR102097834B1

KR102097834B1 - 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 개선용 조성물

Info

Publication number: KR102097834B1
Application number: KR1020130130496A
Authority: KR
Inventors: 박용민; 이형주; 이기원; 이범주; 김희정
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2013-10-30
Filing date: 2013-10-30
Publication date: 2020-04-06
Also published as: KR20150049667A

Abstract

본 발명은 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 예방 또는 치료용 약학 조성물과 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 개선용 조성물{Composition for improving atopic skin comprising 7, 8, 4'-trihydroxyisoflavone as active ingredient}

일반적으로 아토피(Atopy)란 그리스어가 어원으로 '비정상적인 반응', '기묘한', '뜻을 알 수 없다'라는 의미로서 어원 그대로 아토피성 피부염이란 다양한 원인이 복잡하게 뒤엉켜 발병하고 완화와 재발을 반복하며, 치료가 어려운 피부질환이다.

아토피는 아토피 소인이 있는 개인에서 피부, 호흡기 점막, 안점막, 장잠막 등에 나타나는 일련의 알레르기 증상을 말하며, 이러한 아토피 소인(알레르기 체질)은 유전되어 가족적으로 나타나며, 아토피 소인에 의한 알레르기 질환으로 알레르기 피부염, 알레르기성 비염, 천식, 알레르기성 결막염, 아토피성 두드러기 등이 있으며, 이들 질환은 단독 또는 여러 질환이 동시에 나타날 수 있다.

아토피 피부염의 주된 증상으로 만성적으로 건조하며 소양감이 심하고 반복적으로 재발되며 삼출을 동반한 홍반성 발진의 아급성 병변, 가죽과 같이 두꺼워지는 만성병변으로 진행되어 혈종, 부종 및 피부 장벽의 파괴로 이어지게 된다.

아토피 피부염 환자에게서는 T 세포로부터 방출되는 사이토카인에 의한 작용이 피부염 발생의 주된 원인으로 보고되었다. 특히 보조 T 세포(CD4+ T 세포)에 의한 억제 T 세포비의 감소가 나타나게 되며 보조 T 세포(Th 세포)은 Th1 세포와 Th2 세포로 나뉘어지는데 이들 간의 균형이 소실되면 면역 반응의 이상이 초래 될 수 있다.

급성형 아토피 피부염 상태에서는 Th2에서 생산되는 IL-4가 우세하게 작용하게 된다. 즉 IL-4 수용체가 IL-4에 노출되면서 Th2 세포로 분화와 성장을 촉진시켜 Th2 세포의 반응이 주를 이루고 IL-4는 Th1 세포로의 분화를 억제하며 B 세포를 자극하여 IgE 생성을 촉진한다. Th1 세포에서 생산되는 IFN-γ은 Th2 세포에서의 작용과는 다르게 만성형 아토피 피부염에 관여한다. 그리고 IFN-γ의 상승은 IL-4와의 작용과는 반대로 IgE의 생산과 T 세포에서 IL-4 수용체의 발현을 억제하는 것으로 알려졌다.

또한 아토피 피부염이 진행되면 피부 병면에서 비만세포가 관찰되고 비만세포는 IgE 수용체에 의해 활성화되며 탈과립과정에서 염증과 관련된 히스타민 및 TNF-α, IL-4, IL-6을 방출하여 염증반응을 촉진시키고 피부에 염증세포가 유입되로록 한다.

현재 사용되고 있는 치료제 중 스테로이드 제제가 가장 효과적으로 알려져 있으나 항염증 치료제로 단기간 사용할 경우 탁월한 효과를 보이지만 장기간 사용하게 되면 피부층이 얇아지는 피부 위측증과 아토피 피부염에 대한 내성이 높아져 재발되는 문제점을 가지고 있다.

따라서 이러한 부작용이 나타나지 않으면서 아토피 피부염을 개선할 수 있는 소재의 개발이 활발히 진행되고 있다.

일예로, 대한민국 특허등록 제431076호에는 백급, 자소, 에키나시아 및 발효대두 추출물을 포함하는 아토피 피부의 치유 개선용 화장료 조성물을 개시하고 있고, 대한민국 특허공개 제2004-0065126호에는 천연의 영지버섯, 유근피, 감초, 백봉령, 백지마 및 백년초 등으로부터 얻은 한방 식물 추출물을 포함하는 아토피 피부의 치유와 예방에 효과를 갖는 한방 화장료 조성물을 개시하고 있다.

대한민국 특허등록 제431076호 대한민국 특허공개 제2004-0065126호

이에, 본 발명자들은 아토피 피부염 개선에 효과적인 조성물을 찾고자 연구 노력한 결과, 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본이 아토피 피부염 완화에 효과적이면서, 아토피로 인해 발생하는 가려움증, 염증 등의 증상, 피부 부종, 혈청 IgE 및 비만 세포수, Th2 관련 사이토카인을 감소시키고, 표피를 통한 수분 손실량 (TEWL: trans epidermal water loss)을 감소시킴을 확인하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명은 상기 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본을 유효성분으로 포함하는 아토피성 피부염의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본을 포함하는 아토피성 피부염의 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

이를 위해 본 발명은,

하기 화학식 1로 표시되는 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다:

또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본을 유효성분으로 함유하는, 아토피 피부염 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본은 아토피 피부염을 유발시킨 아토피 동물 모델 NC/Nga 마우스에서 아토피 피부염 증상을 현저하게 개선하였고, 혈청내 IgE 항체 농도를 감소시켰을 뿐만 아니라, IL-4, IL-5, IL-13의 Th2 관련 사이토카인의 양을 모두 감소시켰다. 또한, 표피를 통한 수분 손실량 (TEWL: trans epidermal water loss)을 감소시킨다. 따라서, 상기 화학식 1의 화합물을 함유하는 본 발명의 약학 조성물은 아토피성 피부염의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 화학식 1의 화합물을 함유하는 본 발명의 화장료 조성물은 아토피성 피부염의 개선용 화장료로서 즉, 항아토피 기능성 화장료로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본을 3주 동안 아토피성 피부염 동물모델인 NC/Nga 마우스에 도포한 후 마우스 피부 외관을 촬영한 사진이다.
도 2는 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본을 3주 동안 아토피성 피부염 동물모델인 NC/Nga 마우스에 도포한 후, 각 군의 마우스에 대한 피부염 지수를 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본을 3주 동안 아토피성 피부염 동물모델인 NC/Nga 마우스에 도포한 후, 각 군의 마우스에 대한 귀두께의 변화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본을 3주 동안 아토피성 피부염 동물모델인 NC/Nga 마우스에 도포한 후, 각 군의 마우스에 대한 혈청 IgE 농도에 변화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본을 3주 동안 아토피성 피부염 동물모델인 NC/Nga 마우스에 도포한 후, 각 군의 마우스에 대한 호산성 백혈구(eosinophil) 염색 사진 및 세포수 변화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본을 3주 동안 아토피성 피부염 동물모델인 NC/Nga 마우스에 도포한 후, 각 군의 마우스에 대한 비만세포(mast cell) 염색 사진 및 세포수 변화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 7은 INF-γ로 자극된 HaCaT 세포에 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본을 처리하였을 때 MDC 및 TARC의 생성 억제 정도를 나타낸 그래프이다.
도 8은 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본을 3주 동안 아토피성 피부염 동물모델인 NC/Nga 마우스에 도포한 후, 각 군의 마우스에 대한 혈청 Th2 사이토카인 IL-4,IL-5 및 IL-13의 수준에 대한 영향을 측정한 결과를 보여준다.
도 9는 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본에 대한 표피를 통한 수분손실량(Trans epidermal water loss)을 보여주는 그래프이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 조성물에 유효 성분으로 함유되는 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본은 하기 화학식 1의 구조를 가진다.

[화학식 1]

상기 화학식 1의 화합물은 아토피 피부염을 유발시킨 아토피 동물 모델 NC/Nga 마우스에서 아토피 피부염 증상을 현저하게 개선하였고, 혈청내 IgE 항체 농도를 감소시켰을 뿐만 아니라, IL-4, IL-5, IL-13의 Th2 관련 사이토카인의 양을 모두 감소시켰다. 또한, 표피를 통한 수분 손실량 (TEWL: trans epidermal water loss)을 감소시킨다.

따라서, 상기 화학식 1의 화합물을 활성성분으로 포함하는 조성물은 아토피 피부염 치료 또는 예방용 약학 조성물 또는 아토피 피부염 개선용 화장료 조성물로 제제화될 수 있다.

약학 조성물로 제제화되는 경우, 본 발명의 조성물은 약제학적 분야에서 공지의 방법에 의해 제제화할 수 있고, 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 등과 혼합하여 통상의 약학적 제제, 예를 들면 액제, 시럽제, 캡슐제, 과립제, 분말, 연고, 에멀젼, 겔, 크림 등으로 제제화할 수 있으며, 이를 여러 경로로 투여할 수 있다. 바람직하기로 용액, 겔, 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 리포좀, 크림, 로션, 연고, 에어로졸, 스프레이, 페이스트 및 패치 등의 경피투여용 제형으로 제제화될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 전체 약학 조성물 중 상기 화학식 1의 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본을 0.001 내지 10 중량%로 함유한다. 이렇게 제조된 약학조성물은 1회당 0.00001㎎/㎏ 내지 400㎎/㎏의 유효함량으로 사용하고, 활성 성분의 실제 투여량은 증상의 중증도, 선택된 투여 경로, 대상의 연령, 성별, 체중 및 건강상태 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다. 투여는 하루에 한 번 내지 수회 나누어 투여할 수 있다.

화장료 조성물로 제제화되는 경우, 상기 화학식 1의 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본의 함량은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%이며, 바람직하게는 0.01 내지 5.0 중량%이다. 최소한의 아토피 피부염 개선 효과를 달성할 수 있도록 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본의 함량은 상기 최소치 이상인 것이 바람직하며, 과량 첨가에 따른 사용감 저하 및 각종 제형에의 적용 가능성을 고려하여 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본의 함량은 상기 최대치 이하인 것이 바람직하다. 이때, 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본의 함량은 제형 또는 화장료 조성물에 함유되는 성분들의 함량에 따라 상기 범위 내에서 적절히 조절하는 것이 바람직하다.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들면 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 젤, 파우더, 보디로션, 보디크림, 보디오일, 보디에센스 등의 화장료로 제형화 될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 더욱 명확히 표현하기 위한 목적으로 기재될 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험예 1: 아토피 실험 동물인 NC/Nga 마우스에서 아토피 피부염 증상에 대한 효과

본 발명의 7,8,4,'-트리하이드록시이소플라본의 아토피성 피부염 개선 효능을 확인하기 위해서 아토피 피부염 동물모델 NC/Nga 마우스에 아토피 유발 시약인 디니트로클로벤젠(DNCB)로 귀와 등 부위에 아토피성 피부염을 유발시킨 후 임상증상을 확인하기 위해 피부상태와 이를 점수화시킨 피부염 지수(dermatitis score)를 확인하였다. 이때 디니트로클로로벤젠을 0.2%의 농도가 되도록 용매(아세톤 : 올리브오일 = 3 : 1 혼합)에 용해하여 제조하였다.

모든 동물군에는 자유로운 식이와 식수를 제공하였다. 실험동물은 총 45마리를 사용하였으며 5군으로 나누어 각 실험군을 9마리씩 배정하였다. DNCB를 도포하지 않으면서 에탄올 190 ㎕를 경구투여한 정상군 9마리, DNCB를 도포하며 에탄올 190 ㎕를 경구투여한 아토피군 9마리, DNCB를 도포하면서 7,8,4,'-트리하이드록시이소플라본을 피부도포(200 nmol, 에탄올)를 병행한 저농도 시료 투여군 9마리, 피부도포(400 nmol, 에탄올)를 병행한 고농도 시료투여군 9마리, 타크로리무스 (용량 100 ㎍) 피부 도포한 타크로리무스 투여군 9마리를 사용하였다.

8주령 암컷 NC/Nga 마우스의 등 부위를 깨끗하게 제모한 후 제모 과정에서 발생할 수 있는 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치하였다. 24시간 후 마우스 마리당 1% DNCB 190 ㎕를 등 부위와 양쪽 귀 뒤쪽에 도포하여 아토피 피부염을 유발하였다. 4일 경과 후, 0.2% DNCB 190 ㎕를 주 3회 1주 동안 동일한 부위에 고르게 도포하여 아토피 피부염이 지속되도록 하였다. 시료는 실험시작부터 매일 도포하였다. 피부염 지수는 1주에 1번 씩 환부를 관찰하여 홍반, 출혈, 가피 등의 육안적 변화를 0~3점으로 평가하여 산출하였다.

실험결과, 7,8,4'-트리하이드록시이소플라본은 아토피성 피부염 유발 상태를 어느 정도 개선시키는 것을 확인 하였다(도 1).

도 2는 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본을 3주 동안 아토피성 피부염 동물모델인 NC/Nga 마우스에 도포한 후, 각 군의 마우스에 대한 피부염 지수를 측정한 결과를 나타낸다.

도 2를 참조하면, 본 발명의 7,8,4'-트리하이드록시이소플라본은 피부염 지수를 개선하였으며 아토피성 피부염 치료제로 사용되고 있는 타크로리무스와 비슷하게 아토피성 피부염 유발 상태를 개선시킴을 확인 하였다.

실험예 2: NC/Nga 마우스에서 귀 부종에 대한 효과

실험의 시작과 함께 마우스 등 피부 조직의 외형적 변화 (홍반, 가려움, 건조피부, 부종, 짓무름 및 태선화)를 관찰하면서 귀 두께 변화를 측정하였다. 귀 두께(ear swelling)는 vernier calipers(Mitutoyo, Japan)를 사용하였다.

부검 후 마우스의 귀 조직을 적출하여 헤마토자일린-에오신(H&E) 법으로 염색을 실시하였고, 광학현미경으로 피부의 두께를 관찰하였다. 마우스의 귀두께는 1주일에 1회씩 3주에 걸쳐 측정하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3은 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본을 3주 동안 아토피성 피부염 동물모델인 NC/Nga 마우스에 도포한 후, 각 군의 마우스에 대한 귀두께의 변화를 측정한 결과를 나타낸다.

도 3에 나타낸 바와 같이, DNCB에 의해 두꺼워진 귀 두께가 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본 도포에 의해 감소함을 확인할 수 있었으며, 타크로리무스와 비슷하게 아토피성 피부염 유발 상태를 개선시킴을 확인 하였다.

실험예 3: 아토피실험 동물인 NC/Nga 마우스에서 혈청 IgE 농도에 대한 효과

실험 종료일에 심장에서 혈액을 주사기로 채혈한 후 3,000rpm, 4℃에서 10분 동안 원심 분리하여 혈청을 분리하였다. 실험에 사용하기 전까지 -75℃ 냉동고에서 보관하였다. NC/Nga 마우스의 혈청에서의 IgE 농도는 ELISA (enzymelinked immunosorbent assay kit (Shibayagi사))를 사용하여 측정하였다. 각 96 웰 플레이트 (well plates)에 마우스에서 취한 혈청 0.2㎕와 희석 버퍼 (dilution buffer) 199.8㎕를 혼합하여 각각의 웰 (well)에 50㎕를 분주하고 실온에서 쉐이커 (shaker)에 올려 2시간 동안 방치한 후 세척 완충 용액 (washing buffer solution)으로 5분씩 3회 세척하였다.

다시 비오틴이 결합된 항-IgE 항체 (Biotin-conjugated anti-IgE antibody)를 넣고 2시간 실온에 방치한 후에 다시 3회 세척하였다. HRP가 결합된 아비딘 (HRP-conjugated avidin) 50㎕를 넣고 실온에서 쉐이커 (shaker)에 올려 1시간 방치한 후 다시 세척하였다. 크로모제닉 서브스트레이트 시약 (Chromogenic substrate reagent(TMB)) 50㎕를 넣고 5분간 방치한 후 50㎕의 정지 용액 (stop solution)을 넣고 ELISA 판독기 (reader)(450nm)에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4를 참조하면, DNCB 처리군에서 증가한 혈청 IgE의 농도는 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본 도포군에서 감소하였다.

실험예 4: 아토피실험 동물인 NC/Nga 마우스에서 면역조직 침윤 억제에 대한 효과

아토피 피부염을 유발한 후 3주 후에 마우스를 희생시키고, 등 피부를 적출하여, 비만 세포(mast cell) 확인을 위해 톨루이딘 블루(toluidine blue)으로 염색하고, 호산성 백혈구(eosinophil) 확인을 위해 콩고 레드(Congo red)로 염색하고, 광학 현미경 하에서 400배 배율에서 관찰하여 표피에서부터 근육 조직 사이 피부에 존재하는 비만세포(mast cell) 또는 호산성 백혈구(eosinophil) 세포수를 계수하였다. 그 결과는 도 5 및 도 6에 나타내었다.

도 5를 참조하면, 림프구 및 단핵구의 침윤을 관찰하였을 때 대조군에서는 수많은 면역 세포들이 보라색으로 염색되어 나타났으나, 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본 도포군에서는 매우 적은 수의 면역 세포만 관찰되었다. 염증 조직 내 비만세포(mast cell)의 침윤을 확인하기 위해, 톨루이딘 블루(toluidine

blue) 염색을 시행한 결과, 아토피 피부염 유발 대조군이 비-유도군 보다 비만세포수가 증가하였으나, 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본 도포군에서는 대조군에 비해 비만세포수가 감소하였다. 실제의 염색 사진에서도 아토피 피부염 유발 대조군에서 많은 수의 비만세포(mast cell)가 관찰된 반면, 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본 도포군에서는 적은 수의 세포가 관찰되었다.

실험예 5: MDC 및 TARC 생성 억제 활성 실험

아토피 피부염을 유발한 후 3주 후에 마우스를 희생시키고, 등 피부를 적출하여 실험에 사용하기 전까지 -75 ℃ 냉동고에서 보관하였다.

사이토카인 측정을 위하여 마우스 등 피부를 작게 조각내어 RIPA lysis buffer 400 ㎕를 넣어준 후 homogenizer를 이용하여 단백질이 충분히 녹아나올 때까지 실시하였다. 얻어진 단백질은 ELISA (enzymelinked immunosorbent assay) kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 측정하였다.

실험 전날 capture antibody를 96 웰 플레이트 (well plates)에 분주하여 실온에서 overnight한다. 세척 완충 용액 (washing buffer solution)으로 5분씩 3회 세척한 후 마우스에서 취한 단백질 50 ㎕를 각각의 웰 (well)에 분주하고 실온에서 2시간 동안 방치한 후 3회 세척하였다.

다시 비오틴이 결합된 항-IgE 항체 (Biotin-conjugated anti-IgE antibody)를 넣고 2시간 실온에 방치한 후에 다시 3회 세척하였다. HRP가 결합된 아비딘 (HRP-conjugated avidin) 50 ㎕를 넣고 실온에서 20분간 방치한 후 다시 세척하였다. 서브스트레이트 시약 (Substrate reagent) A와 B를 1:1로 섞어 50 ㎕를 넣고 20분간 방치한 후 25 ㎕의 정지 용액 (stop solution)을 넣고 ELISA 판독기 (reader)(450nm)에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도를 측정하여 얻어진 싸이토카인 레벨을 Lowry 단백질 정량 값으로 나누어주어 실험 결과 값을 도출하였다.

MDC 및 TARC 생성 억제 활성 실험 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7의 결과, 타크리무스는 MDC를 더 증가시켰으나, 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본은 MDC 및 TARC의 생성 억제 활성을 나타내었다.

실험예 6: Th2 관련 사이토카인 생성 억제효과

다시 비오틴이 결합된 항-IgE 항체 (Biotin-conjugated anti-IgE antibody)를 넣고 2시간 실온에 방치한 후에 다시 3회 세척하였다. HRP가 결합된 아비딘 (HRP-conjugated avidin) 50 ㎕를 넣고 실온에서 20분간 방치한 후 다시 세척하였다. 서브스트레이트 시약 (Substrate reagent) A와 B를 1:1로 섞어 50 ㎕를 넣고 20분간 방치한 후 25 ㎕의 정지 용액 (stop solution)을 넣고 ELISA 판독기 (reader)(450nm)에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도를 측정하여 얻어진 싸이토카인 레벨을 Lowry 단백질 정량 값으로 나누어주어 실험 결과 값을 도출하였다. 그 결과는 도 8에 나타내었다.

도 8을 참조하면, 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본 도포한 군에서 Th2 사이토카인인 IL-4, IL-5 및 IL-13이 감소되었다. 이러한 결과는 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본가 아토피 피부염 병변을 억제하고 이와 관련된 면역 반응을 억제하는데 효과가 있다는 것을 보여주는 것이다.

실험예 7: 경피수분손실량 측정

실험동물의 부검 전 30분간 항온 항습이 유지되는 공간에서 방치한 후 탐침(Tewameter TM300, C+K electronic GmbH. Germany)을 등 부위 피부 표면에 밀착 접촉하여 가볍게 눌러서 나타나는 수치를 기록하였다. 경피수분손실량(TEWL)은 아토피 증상이 심할수록 높은 수치로 나타나며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 각 군의 경표피 손실량을 측정한 결과, 아토피 피부염 대조군인 아토피 피부염군에서 가장 높았고, 정상군 대조군에서 가장 낮았으며, 농도 의존적으로 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본이 표피 수분손실량을 억제함을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명의 제형예로서 피부 외용연고, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스 및 팩을 예시하고 있으나, 본 발명 조성물의 제형은 이에 제한되는 것은 아니다.

제형예 1: 피부 외용연고

하기의 표 1과 같이 피부 외용연고를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본	10
디에틸 세바케이트	8
경납	5
폴리옥시에틸렌올레일에테르 포스페이트	6
벤조산 나트륨	적량
바셀린	잔량
합계	100

제형예 2: 유연화장수 ( 스킨 )

하기의 표 2와 같이 유연화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본	1
글리세린	5
1,3-부틸렌글리콜	3
베타인	1
알란토인	0.1
DL-판테놀	0.3
EDTA-2Na	0.02
소듐 히아루로네이트 파우더	0.05
에탄올	5
옥틸도데세스-16	0.2
폴리옥시에칠렌경화피마자유	0.2
향	적량
방부제	적량
색소	적량
정제수	잔량
합계	100

제형예 3: 영양화장수 (로션)

하기의 표 3과 같이 영양화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
레티노이드 유도체	3
글리세릴 스테아레이트 SE	1.5
세테아릴알콜	1.0
쉐어버터	1.5
폴리솔베이트 60	1.3
솔비탄스테아레이트	0.5
경화식물유	1
광물유	5
스쿠알란	3
사이클로메치콘	2
디메치콘	0.8
초산 토코페롤	0.5
카보머	0.12
글리세린	5
1,3-부틸렌글리콜	3
소듐 히아루로네이트 파우더	0.05
트리에탄올아민	0.12
향	적량
방부제	적량
색소	적량
증류수	잔량
합계	100

제형예 4: 영양크림

하기의 표 4와 같이 영양크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본	3
친유형 모노스테아린산글리세린	2
세테아릴알콜	2
스테아린산	1.5
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄스테아레이트	0.6
하이드로제네이티드 폴리이소부텐	1
스쿠알란	3
광물유	5
사이클로메치콘	5
디메치콘	1
초산토코페롤	0.5
글리세린	5
베타인	3
트리에탄올아민	1
산탄검	0.05
향	적량
방부제	적량
색소	적량
증류수	잔량
합계	100

제형예 5 : 맛사지 크림

하기의 표 5와 같이 맛사지 크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본	3
친유형 모노스테아린산 글리세린	1.5
세테아릴알콜	1.5
스테아린산	1
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄스테아레이트	0.6
이소스테아릴 이소스테레이트	5
스쿠알란	5
광물유	35
디메치콘	0.5
히드록시에틸셀룰로오스	0.12
글리세린	6
1,3-부틸렌글리콜	3
트리에탄올아민	0.3
향	적량
방부제	적량
색소	적량
증류수	잔량
합계	100

제형예 6 : 에센스

하기의 표 6과 같이 에센스를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본	3
글리세린	6
베타인	5
PEG 1500	2
알란토인	0.1
DL-판테놀	0.3
EDTA-2Na	0.02
하이드로제네이티드 레시친	0.6
히드록시에틸 셀룰로오스	0.1
소듐 히아루로네이트 파우더	0.08
카르복시비닐폴리머	0.2
트리에탄올아민	0.2
세라마이드	0.2
옥틸도데칸올	3
스쿠알란	3
폴리소르베이트 60	0.4
글리세릴 스테아레이트 SE	1.5
향	적량
방부제	적량
색소	적량
증류수	잔량
합계	100

제형예 7: 팩

하기의 표 7과 같이 팩을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본	1
폴리비닐알콜	15
셀룰로오스 검	0.15
글리세린	3
PEG 1500	2
베타인	2
DL-판테놀	0.4
알란토인	0.1
트리에탄올아민	0.2
니코틴아미드	0.5
에탄올	6
PEG 40 경화피마자유	0.3
향	적량
방부제	적량
색소	적량
증류수	잔량
합계	100

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본을 유효성분으로 함유하고, 피부투여용 제형을 갖는 아토피 피부염의 치료 또는 예방용 약학적 조성물:
[화학식 1]
제1항에 있어서,
상기 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본의 함량은 전체 약학 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 10 중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 피부투여용 제형이 용액, 겔, 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 리포좀, 크림, 로션, 연고, 에어로졸, 스프레이, 페이스트 및 패치로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본을 유효성분으로 함유하는 아토피 피부염 개선용 화장료 조성물:
[화학식 1]
제5항에 있어서,
상기 7, 8, 4'-트리하이드록시이소플라본의 함량은 전체 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 10 중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제5항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 젤, 파우더, 보디로션, 보디크림, 보디오일, 및 보디에센스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형임을 특징으로 하는 화장료 조성물.