KR20190053369A

KR20190053369A - 초음파 추출법에 의하여 제조되는 연산호 추출물 및 이를 포함하는 기능성 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20190053369A
Application number: KR1020170149152A
Authority: KR
Inventors: 문영섭; 안용석; 고창익; 양대용
Original assignee: (주)청룡수산
Priority date: 2017-11-10
Filing date: 2017-11-10
Publication date: 2019-05-20
Also published as: KR102060427B1

Abstract

본 발명은 연산호(soft coral) 추출물의 제조 방법, 상기 제조 방법으로부터 수득되는 연산호 추출물 및 이를 포함하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 초음파 추출법에 의한 활성 성분 추출 효율을 증가시키고, 세포 독성을 감소시킬 수 있는 연산호 추출물의 제조 방법, 이로부터 수득되는 연산호 추출물 및 이의 항염증 활성 등을 이용한 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 연산호 추출물은 LPS 처리된 매크로파지에 독성이 없으면서, NO 생성을 효과적으로 억제하는 우수한 효과가 있으므로 염증성 피부 질환 등의 개선 용도로 사용 가능하므로 기능성 화장품 산업상 매우 유용한 발명이다.

Description

초음파 추출법에 의하여 제조되는 연산호 추출물 및 이를 포함하는 기능성 화장료 조성물{SOFT CORAl EXTRACTS MANUFACTURED BY ULTRASONIFICATION METHOD AND FUNCTIONAL COSMETIC COMPOSITION}

본 발명은 연산호(soft coral) 추출물의 제조 방법, 상기 제조 방법으로부터 수득되는 연산호 추출물 및 이를 포함하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 초음파 추출법에 의한 활성 성분 추출 효율을 증가시키고, 세포 독성을 감소시킬 수 있는 연산호 추출물의 제조 방법, 이로부터 수득되는 연산호 추출물 및 이의 항염증 활성 등을 이용한 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

해양은 지구 표면의 70 %를 초과하여 덮고 있는 복잡한 생태계이다. 해양은 식물, 동물 및 미생물을 비롯하여 각종 해양 생물의 풍부하다. 독특한 환경 조건으로 해양 생물은 육상 생물에 비하여 독특한 대사 산물을 합성하는 것을 가능하게 하는 뚜렷한 생리학적 특징을 갖도록 진화되어 왔다. 이들 화합물은 바람직한 생물학적 성질을 나타낼 수 있어, 약학 및 뉴트라슈티컬(nutraceutical) 산업에서 잠재적인 응용 가능성을 갖는다[비특허문헌 1, 2]. 카라기난, 콘드리아미드 C(chondriamide C) 및 카할랄라이드 F(kahalalide F)와 같은 화합물들 중 일부는 현재 약제로서 이용되는 한편, 이들 다수는 여전히 연구 중에 있으며, 임상 전 개발 단계 중에 있다[비특허문헌 3, 4]. 근래 역사에서, 해양 천연 제품의 조사는 그의 잠재적인 생물 기능성(biofunctional properties)으로 인하여 많은 관심을 받아왔으며, 이는 연산호 추출물에 대해서도 계속되기 시작한 것으로 여겨진다.

알리시오나세아(Alcyonacea)로도 알려져 있는 연산호는 경산호(hard coral)에서 발견되는 탄산칼슘 골격을 갖지 않는다. 이들은 물에 떠다니는 먹이를 수득할 수 있는 영양소가 풍부하고 강한 빛으로부터 떨어진 영역에 거주하는 것을 선호한다. 그러나, 이들은 광합성 주산텔라(zooxanthellae)와 공생자로 그들의 대사 산물을 주요 에너지 공급원으로서 이용한다.

알리시오나세아는 단백질, 스테롤, 스테로이드성 글리코사이드, 테르페노이드 및 알칼로이드와 같은 생활성 화합물의 매우 풍부한 공급원이다[비특허문헌 5-10]. 이들 화합물은 항균, 소염 및 항-HIV 제제로서의 잠재적인 용도를 갖는다[비특허문헌 11-13]. 예를 들어, 메이어(Mayer) 등은 카리브해의 연산호인 슈도프테로 고르기아 엘리사베테(Pseudopterogorgia elisabethae)로부터 소염성 화합물인 슈도프테로신(pseudopterosin)의 분리를 보고하였다[비특허문헌 14]. 두번째로, 바드리아(Badria) 등은 연산호 사르코파이톤 글라우쿰(Sarcophyton glaucum)으로부터 분리된 사르코파이톨리드(sarcophytolide)가 신경보호 효과를 갖는다는 것을 보고하였다[비특허문헌 6]. 마지막으로, 쳉(Cheng) 등은 연산호인 시눌라리아 자이로사(Sinularia gyrosa)로부터 다이테르페노이드를 분리하였다[비특허문헌 15].

염증은 감염 또는 세균 및 바이러스와 같은 유해한 자극들에 대한 신체의 보호 반응이다. 이는 산화질소(NO), IL-6, IL-1β 및 TNF-α와 같은 염증 매개체와 사이토카인(cytokine)의 증가된 발현 및 면역 세포를 통하여 매개된다. 생리학적 조건 하에서, 염증은 외래 물질에 대응하기 위하여, 조직 회복 메카니즘을 활성화하기 위한 보호 반응으로서 필수적이다. 그러나, 급성 염증은 종양, 고열증(hyperpyrexia) 및 당뇨병과 같은 각종 질병을 일으킬 수 있다[비특허문헌 16, 17]. 따라서, 급성 및 만성 염증의 발달 통제는 염증 질환의 예방을 위한 효과적인 전략이다.

본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 종래 에탄올 추출법과는 달리 초음파 추출법에 의하여 함염증 활성 성분의 추출 효율을 증가시키면서도 세포 독성은 최소화할 수 있는 신규한 연산호 추출물의 제조 방법과 이로부터 수득되는 연산호 추출물 및 이를 포함하는 항염증 활성 등에 의한 기능성 화장료 조성물을 제공하고자 하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 (1) 채집된 연산호로부터 이물질을 제거하고, 냉동시키는 단계; (2) 냉동된 연산호를 분쇄하는 단계; (3) 분쇄된 연산호에 물을 첨가한 후 초음파 처리하는 단계; 및 (4) 원심분리하여 상등액을 회수하고, 여과시켜 연산호 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 연산호(soft coral) 추출물의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 연산호 추출물의 제조 방법으로부터 수득되는 연산호 추출물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 연산호 추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물을 제공한다.

상기 기능성은 항염증, 피부 미백, 주름 개선 및 보습으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

상기 기능성 화장료 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이, 파우더, 팩트, 립글로즈, 립스틱, 섀도우, 샴푸 및 린스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제형인 것이 바람직하다.

본 발명의 연산호 추출물은 LPS 처리된 매크로파지에 독성이 없으면서, NO 생성을 효과적으로 억제하는 우수한 효과가 있으므로 염증성 피부 질환 등의 개선 용도로 사용 가능하므로 기능성 화장품 산업상 매우 유용한 발명이다.

도 1은 RAW 264.7 매크로파지에서 연산호 추출물(10% 에탄올 첨가 후 초음파 처리)에 의한 NO 생성 저해, 세포 생존율 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 RAW 264.7 매크로파지에서 연산호 추출물(25% 에탄올 첨가 후 초음파 처리)에 의한 NO 생성 저해, 세포 생존율 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 RAW 264.7 매크로파지에서 연산호 추출물(50% 에탄올 첨가 후 초음파 처리)에 의한 NO 생성 저해, 세포 생존율 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 RAW 264.7 매크로파지에서 연산호 추출물(물 첨가 후 초음파 처리)에 의한 NO 생성 저해, 세포 생존율 효과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 발명자들은 제주에서 생육하는 연산호로부터 항염증 활성을 갖는 성분을 분리하기 위한 연구의 일환으로써 초음파 추출법에 의한 신규한 연산호 추출물을 수득하고, 이의 세포 내 항염증 활성을 평가함으로써 초음파 추출법에 의한 연산호 추출물이 매크로파지를 자극하여 기존의 에탄올 추출법에 의한 경우 보다 우수한 항염증 활성을 나타낼뿐만 아니라, 세포 독성도 나타내지 않음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 (1) 채집된 연산호로부터 이물질을 제거하고, 냉동시키는 단계; (2) 냉동된 연산호를 분쇄하는 단계; (3) 분쇄된 연산호에 물을 첨가한 후 초음파 처리하는 단계; 및 (4) 원심분리하여 상등액을 회수하고, 여과시켜 연산호 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 연산호(soft coral) 추출물의 제조 방법을 제공한다.

상기 단계 (1)은 시료의 전처리 단계로서, 채집된 연산호에서 연산호를 제외한 이물질들을 최대한 제거하고, 이를 사용시까지 냉동하는 단계이다.

상기 단계 (2)는 냉동된 연산호를 분쇄시키는 단계로서, 냉동된 연산호를 믹서기에 투입하여 2~3분 동안 분쇄하여 분말상으로 제조하는 단계이다.

상기 단계 (3)은 분쇄된 연산호를 초음파 처리하는 단계로서, 분쇄된 연산호를 물과 혼합하여 초음파 처리한다. 초음파 처리는 물과 혼합된 연산호 분말이 물에 충분히 부유된 상태로 존재하여 초음파에 효과적으로 노출될 수 있는 환경이 조성된 상태에서 수행되어야 하며, 바람직한 구체예로서, 대한민국 등록특허 제10-1246595호에 기재된 분리장치를 이용할 수 있다. 상기 등록특허에 기재 분리장치에 관한 사항은 전체로서 본 명세서에 통합된다. 초음파 처리는 20KHz의 주파수에서 1~5시간 동안 수행되는 것이 바람직하다.

상기 단계 (4)는 초음파 처리물을 원심분리 및 여과하여 연산호 추출물을 수득하는 단계로서, 상기 원심분리는 예를 들어 4,800g, 10분, 4℃의 조건에서 수행될 수 있다. 상기 여과는 마이크로필터를 이용할 수 있다.

상술된 방법에 의하여 활성 성분의 회수율이 높고, 세포 독성이 없는 연산호 추출물을 제조할 수 있으며, 따라서, 본 발명은 상기 연산호 추출물의 제조 방법으로부터 수득되는 연산호 추출물을 제공한다.

본 발명의 연산호 추출물은 항염증 활성이 우수할 뿐만 아니라 세포 독성이 없어 기능성 화장품, 의약품, 기능성 식품, 연구용 시약 등의 용도로 사용할 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 연산호 추출물을 포함하는 기능성 화장료 조성물을 제공한다.

상기 기능성은 피부 염증에 의한 질환, 예를 들어, 여드름, 피부염, 아토피 등의 개선에 도움을 줄 수 있고, 아울러, 피부 미백, 주름 개선 및 보습에도 효과가 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 유효성분은 조성물 총 중량에 대해 0.01 내지 50중량%로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 20중량%, 더욱 바람직하게는 1 내지 10중량%이다. 이러한 함량 범위에서 적절한 제형 안정성을 확보할 수 있으며, 목적하는 항산화 효과를 기대할 수 있다.

본 발명의 상기 조성물은 본 발명의 유효성분 외에도 본 발명의 유효 활성을 저해하지 않는 범위에서 항산화, 피부 노화 방지 및 피부 재생 촉진의 효과를 위한 공지의 천연물 추출물이나 기타 성분을 추가로 포함시켜 이용할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 화장료 조성물에 통상적으로 첨가되는 성분들, 예를 들면, 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제와 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제나 담체를 포함하여 특정 제형으로 성형될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들면, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 팩, 비누, 계면활성제-함유 클린징, 오일 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이, 파우더, 팩트, 립글로즈, 립스틱, 섀도우, 샴푸 및 린스 등의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히, 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대, 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 연산호 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 염증성 질환은 천식, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두퐁, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 관절염, 류머티스성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염, 아토피성 피부염, 습진 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 또는 크림, 로션 등의 피부 외용제 등의 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 또는 피부에 도포하는 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.

이러한 약학 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 바람직한 구체예로서, 본 발명의 약학적 조성물의 유효성분의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 당 1 내지 5,000mg, 바람직하게는 100 내지 3,000mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 피부, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 도포, 경구 또는 비경구 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.

본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 연산호 추출물을 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.

본 발명의 건강 기능 식품은 염증성 질환의 예방 또는 개선에 효과적인 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다.

본 발명의 유효 성분을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 유효성분은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100ml를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다. 상기 향미제로는 타우마틴, 레바우디오시드 A, 글리시르히진, 사카린, 아스파르탐 등을 사용할 수 있다. 상기 향미제의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100ml당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g을 사용한다.

상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 상기 유효성분 100중량부 당 0.01 내지 약 20중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명의 연산호 추출물은 세포, 특히, 매크로파지에서 NO 및 PGE₂ 생성을 억제하는 것으로 확인되었고, 염증 전 사이토카인인 TNF-α 및 IL-1β의 분비를 저해하며, iNOS 및 COX-2 단백질의 발현을 억제하는 것으로 확인되었으므로, 염증성 질환의 치료제 개발을 위한 기초 연구로서 상기 각각의 인자, 사이토카인 및 관련 단백질의 발현을 억제하기 위한 연구 또는 실험용 시약 조성물로서 응용이 가능하다.

따라서, 본 발명은 상기 연산호 추출물을 포함하는 세포의 NO 생성 억제용 시약 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 연산호 추출물을 포함하는 세포의 염증 전 사이토카인 분비 억제용 시약 조성물을 제공한다.

상기 사이토카인은 TNF-α 또는 IL-1β인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 연산호 추출물을 포함하는 세포의 PGE₂ 분비 억제용 시약 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 연산호 추출물을 포함하는 세포 내 iNOS 또는 COX-2 단백질 발현 억제용 시약 조성물을 제공한다.

이하에서는 구체적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 일 구체예를 기재한 것이며, 하기 실시예에 의하여 본 발명의 권리범위가 한정되어 해석되는 것이 아님은 명백하다.

[실시예]

1. 재료 및 방법

1.1. 화학 물질 및 시약

둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 페니실린-스트렙토마이신, 소 태아 혈청(FBS) 및 트립신-EDTA를 깁코-BRL(Gibco-BRL)(미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)로부터 구매하였다. LPS, DMSO 및 본 발명에서 사용된 모든 다른 화학 물질은 분석 등급의 것을 사용하였다.

1.2. 연산호 추출물의 제조

연산호를 대한민국 제주도 해안으로부터 수집하였다. 70 % 에탄올 분무로 표면 소독 후, 샘플을 수도물로 세척하여 임의의 표면 부착물 및 잔해를 제거하였다. 샘플을 냉동시킨 후, 믹서기로 분쇄하여 분말을 형성하였다. 분쇄된 연산호 분말 100중량부에 대하여 10% 에탄올, 25% 에탄올, 50% 에탄올 또는 증류수 1,000중량부를 첨가하고, 연산호 분말이 액체 상에서 부유하는 상태로 순환하는 관을 따라 이동시키면서 20KHz의 주파수로 1~5시간 동안 초음파 처리하였다. 초음파 처리 후 4,800g, 10분, 4℃의 조건 하에서 원심분리하여 상등액을 취하고, 다시 마이크로필터를 사용하여 여과 후 여과액을 연산호 추출물로서 제조하였다. 제조된 연산호 추출물은 분말 연산호와 혼합시킨 액체의 종류, 즉, 10% 에탄올, 25% 에탄올, 50% 에탄올, 증류수에 따라, 그리고, 초음파 처리한 시간, 즉, 1, 2, 3, 4, 5시간에 따라 다음 표 1과 같이 명명하였다.

초음파 처리시 사용 액체 및 초음파 처리 시간별 시료

	1시간	2시간	3시간	4시간	5시간
10% 에탄올	SE10-1	SE10-2	SE10-3	SE10-4	SE10-5
25% 에탄올	SE25-1	SE25-2	SE25-3	SE25-4	SE25-5
50% 에탄올	SE50-1	SE50-2	SE50-3	SE50-4	SE50-5
증류수	SW-1	SW-2	SW-3	SW-4	SW-5

1.3. 세포 배양

RAW 264.7 매크로파지 (1 × 10⁵ 세포/mL)를 37 ℃에서 5 % CO₂를 함유하는 가습된 분위기 내에서 배양하였다. 10 % 열-불활성화된 FBS, 스트렙토마이신 (100 g/mL) 및 페니실린 (100 단위/mL)을 함유하는 DMEM을 배지로 사용하였다.

1.4. NO 생산 및 세포 성장의 측정

김 (Kim) 등에 의해 사용된 방법을 따라 실험을 수행하였다 [비특허문헌 21]. RAW 264.7 매크로파지를 24 시간 동안 24-웰 플레이트에 접종하였다. 연산호 샘플을 각 웰에 첨가하여 넣어 최종 농도 25, 50 및 100 ㎍/mL를 달성하였다. 1 시간 후, LPS (1 ㎍/mL)를 대조구를 제외한 모든 웰에 도입시켰다. 그 후, 추가의 24 시간 후, 각 웰로부터 배양 배지 100 ㎕를 96-웰 플레이트로 옮기고, 100 ㎕ 그리스 (Griess) 시약 (2.5 % 인산 내, 0.1 % 나프틸에틸렌다이아민 다이하이드로클로라이드 및 1 % 설파닐아미드)과 혼합하였다. 10 분 후 마이크로플레이트 판독기 상에서 540 nm의 파장에서 흡광도를 판독하였다. 한편, 100 ㎕의 MTT 용액 (2 mg/mL)을 24-웰 플레이트 내 남아있는 세포들에 첨가하고, 2 시간 동안 인큐베이션시켰다. 결과로서 생성된 MTT의 포르마잔 결정을 그 후 DMSO 내에 용해시키고, 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 540 nm 파장에서 결정하였다.

1.5. 통계 분석

모든 측정은 3 회 반복하였으며, 이들 데이타는 평균±표준 오차(SE)로 나타내었다. 결과는 일원분산분석 (one-way ANOVA)에 의해 분석하였고, 데이타 세트간 차이의 유의성은 스튜던트 (Student) t-검정을 이용하여 결정되었다 (*p < 0.05, ** p < 0.01, ^##대조구에 대하여 p < 0.01).

2. 결 과

2.1. RAW 264.7 매크로파지에서의 LPS-유도된 NO 생성에 대한 연산호 추출물의 저해 효과

NO 생성에 대한 연산호 추출물의 저해 효과를 LPS-유도된 RAW 264.7 매크로파지에서 소염 활성의 측정으로서 측정하였다 (도 1 내지 도 4). 증류수를 사용한 군(SW1 내지 SW5)에서 가장 강한 저해 활성을 나타내었다. 또한, 일반적인 에탄올 추출물의 경우 세포 독성을 나타내지만(결과 미제시), 초음파 처리 시료에서는 세포 독성이 매우 감소됨을 확인할 수 있었다. 특히, 증류수를 사용하여 초음파 처리한 군에서 세포 독성이 가장 약함을 알 수 있었다.

3. 논 의

해양 생물은 항산화성, 소염성 및 항암성을 갖는 다양한 종류의 생활성 성분들을 가진다. 따라서, 이들 생체 기능성 천연 산물을 발견하기 위하여 최근 수 십년 동안 해양 생물군은 광범위하게 조사되어 왔다. 다른 해양 생물들 중, 특히 연산호는 바람직한 생활성 효과를 갖는 독특한 파이토케미칼 (phytochemical)을 함유하는 것으로 알려져 있다. 켈만 (Kelman) 등은 연산호, 파레리트로포디움 펄범 펄범 (Parerythropodium fulvum fulvum)의 항균 활성에 대해 보고한 한편 [비특허문헌 22], 다수의 연구에 연산호로부터 단리된 제 2 대사산물의 소염 활성이 기술되어 있다 [비특허문헌 12 및 23-26]. 본 연구의 촛점은 대한민국 제주도에 서식하는 연산호의 소염 성질에 대한 초기 연구를 실시하고, 상이한 종들 간의 변화를 비교하고자 하는 것이다.

염증은 다수의 질병 (예컨대, 건선, 류마티즘성 관절염 및 염증성 장 질환)을 일으킬 수 있기 때문에, 웰빙 (wellbeing)을 위협하는 심각한 문제이다 [비특허문헌 27]. 매크로파지는 NO, PGE₂, IL-1β 및 TNF-α를 비롯한 각종 염증 매개체를 생산함으로써 염증 및 면역 반응에서 중요한 역할을 한다. 나아가, 앞서 언급된 이들 염증 매개체의 비정상적 생산은 소염 반응의 진행에 대해 중심 축이 된다. 이에 대한 주요 예는 IL-1β가 원인 물질인 것으로 밝혀진 류마티즘성 관절염에서이다 [비특허문헌 28]. 한편, TNF-α는 매크로파지에서 염증 반응 동안 PGE₂, IL-1β 및 세포 부착 분자의 생산을 자극한다 [비특허문헌 29].

LPS는 매크로파지에서 염증 반응을 자극하는 그람-음성 세균의 세포벽 성분이다 [비특허문헌 30]. 이는 PGE₂, IL-1β, IL-6 및 TNF-α의 생산 및 COX-2 및 iNOS의 발현을 포함한다. 따라서, LPS-유도된 RAW 264.7 매크로파지는 연산호 추출물의 소염 활성 연구에 뛰어난 선택이다.

NO, PGE₂, TNF-α, IL-1β 및 IL-6과 같은 염증 매개체의 생산은 상이한 상의 염증을 조절하는데 중요한 역할을 한다. 따라서, 이들 매개체의 저해 또는 그 활성의 억제는 염증의 통제에 유망한 전략이다. 본 발명의 연구 결과는 초음파 처리에 의하여 수득되는 연산호 추출물, 특히, 물을 사용한 경우에서 LPS-자극된 RAW 264.7 매크로파지에서 NO 생산을 현저히 감소시켰음을 입증하였다. 나아가, 이들 추출물은 세포 독성도 거의 없음을 확인하였다. 또한, 웨스턴 블롯 결과는 초음파 처리에 의한 연산호 추출물이 LPS-자극된 RAW 264.7 매크로파지에서 COX-2 및 iNOS의 발현을 저해하는 능력을 분명히 보여주었다. 따라서, LPS-자극된 RAW 264.7 매크로파지에서 이들 추출물의 소염 활성에 대한 메카니즘은 COX-2 및 iNOS 발현의 억제에 기인하는 것으로 보인다.

4. 결 론

본 발명에서 본 발명자들은 초음파 처리에 의하여 조제된 연산호 추출물의 소염 활성을 조사하였다. 특히, 물을 사용하여 초음파 처리한 경우, 에탄올을 사용한 경우보다 더욱 강한 소염 활성을 가졌음이 발견되었다. 결과적으로, 제주도 주변 해변 지역에 서식하는 연산호는 천연 소염 제품의 가능한 공급원이며, 이는 화장품에서 신규 소염 약물 또는 성분을 개발하는데 사용될 수 있을 것이다.

Claims

다음의 단계들을 포함하는 연산호(soft coral) 추출물의 제조 방법:
(1) 채집된 연산호로부터 이물질을 제거하고, 냉동시키는 단계;
(2) 냉동된 연산호를 분쇄하는 단계;
(3) 분쇄된 연산호에 물을 첨가한 후 초음파 처리하는 단계; 및
(4) 원심분리하여 상등액을 회수하고, 여과시켜 연산호 추출물을 수득하는 단계.
제 1항에 기재된 방법으로 제조되는 연산호 추출물.
제 2항에 기재된 연산호 추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 기능성은 항염증, 피부 미백, 주름 개선 및 보습으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 기능성 화장료 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 기능성 화장료 조성물은 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이, 파우더, 팩트, 립글로즈, 립스틱, 섀도우, 샴푸 및 린스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제형인 것을 특징으로 하는 기능성 화장료 조성물.