KR20120083625A

KR20120083625A - 방풍통성산의 유산균 발효물을 함유하는 알레르기성 접촉피부염개선제

Info

Publication number: KR20120083625A
Application number: KR1020110004846A
Authority: KR
Inventors: 김현수; 강동희; 육영민; 김길수; 김대익; 임애경
Original assignee: 김현수; 육영민; 강동희
Priority date: 2011-01-18
Filing date: 2011-01-18
Publication date: 2012-07-26

Abstract

본 발명은 활석, 감초, 석고, 황금, 길경, 방풍, 천궁, 당귀, 적작약, 대황, 마향, 박하, 연교, 망초, 형개, 백출, 치자를 조합한 방풍통성산에 Lactobacillus 균주 배양물을 접종하여 발효시킨 추출물을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 접촉피부염 개선제를 제공한다.

Description

방풍통성산의 유산균 발효물을 함유하는 알레르기성 접촉피부염개선제{An improvementary agent for allergenic skin desease comprising of Lactobacillus sp. fermened Bangpoongtongsungsan}

본 발명은 한방 조성물 방풍통성산에 유산균인 Lactobacillus 균주를 접종 발효하여 제조되는 알레르기성 접촉피부염 개선용 약학조성물에 관한 것이다.

일반적으로 알러지성 접촉성 피부염은 T 림프구와 대식세포 등에 의하여 발생되는 세포성 면역과민반응을 말하며, 알러지원(allergen)과 접촉 시 수시간에서 72시간 사이에 비교적 늦게 염증반응이 시작되기 때문에 지연형 과민반응(delayed type hypersensitiyly)이라고 불린다.

이 같은 접촉성 피부염은 allergen에 의한 습진성 피부질환으로, 피부염을 일으키는 allergen은 대부분 화학물질로 불안정한 항원인 hapten이라 불리는데, hapten이 표피에서 완전한 항원이 되고 Langerhan 세포표면과 접촉하면서 사이토카인을 방출시킨다. 이들 사이토카인에 특이적인 염증의 유발 및 세포독성 등의 작용으로 피부내의 국소면역반응으로 나타난다. 현재 알러지성 접촉성 피부염의 치료 및 개선제로 항 histamin제, 부신피질호르몬제 및 면역억제제 등이 사용되고 있으나, 일시적인 효과 및 장기간 사용 시 체액 및 전해질의 균형 장애, 고혈당증, 당뇨, 결핵의 이환성 증가, 간장 및 신장 독성 등이 발현되는 한계와 문제점이 알려져 있다.

한편, 알러지성 접촉성 피부염의 면역학적 특징은 T 세포의 활성으로 항원 특이적 세포독성 T 림프구의 활성과 항원 특이적 반응이 일어나는 점이다. 그리고, 알러지성 접촉성 피부염의 유발에는 IL-1, IL-2, IL-3, IFN-γ 등과 같은 사이토카인이 관여하여 각질형성세포의 성장을 자극함으로써 상피 과형성(epidermal hyperplasia), 랑게르한스 세포 증가, 각질형성세포의 증가 등이 촉진된다.

방풍통성산은 활석, 감초, 석고, 황금, 길경, 방풍, 천궁, 당귀, 적작약, 대황, 마황, 박하, 연교, 망초, 형개, 백출, 치자를 조합한 한방 조성물로 한의학 및 민간요법에서 다양한 기능이 공지된 한방제이다.

본 발명은 상기와 같은 공지된 지식과 정보를 기초로 다양한 생리활성기능을 가지고 있는 한방 조성물인 방풍통성산에 Lactobacillus sp . 균주를 2단계로 접종하고 복합발효시켜 얻은 조성물의 신규한 용도에 관한 것으로 알레르기성 접촉피부염 개선용 신규한 약학조성물을 제공하는 데 그 목적이 있다.

본 발명의 상기 목적은 Picryl Chloride(PiCi)로 알러지성 접촉성 피부염을 인위적으로 유발시킨 후 한방 조성물 방풍통성산의 복합유산균 발효조성물을 피부에 도포하여 항알러지 효능을 검증함으로써 달성하였다.

본 발명 방풍통성산의 Lactobacillus 균주 복합발효 조성물은 피부이상이 없고 면역관련 피부염에서 특이적으로 나타나는 1gE생성, IL-4 및 INF-γ의 현저한 억제효과가 있으며, 비만세포가 감소되어 히스타민의 유리억제효과가 있으므로 접촉 피부염 개선에 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 본 발명 신규한 방풍통성산의 유산균 복합발효 추출물을 사용한 실험구와 대조구의 피부 병변의 외관을 보인 사진도이다.
도 2는 본 발명 PiCi 감작 후 6주간의 피부조직의 병리조직학적 변화를 보인 사진도이다.
도 3은 본 발명 PiCi 감작 후 6주 후의 실험군의 혈청의 변화를 보인 그림이다.

＜ 실시예 1＞ 실험동물 및 사육조건

본 발명에서는 6주령의 수컷 BALB/c 마우스 35두를 코아텍(주)에서 구입하여, 7일간 적응시킨 다음 실험에 사용하였다. 실험동물실의 환경은 표준적인 사육조건으로서 온도는 23±3℃, 습도는 40-60%, 명암 주기는 12시간으로 유지되며, 실험동물전용 사료(퓨리나 코리아, 오산)와 음수 (여과살균정제수)는 제한 없이 공급하였다. 본 발명의 모든 동물실험은 대구바이오산업지원센터 동물실험윤리위원회의 승인 하에 수행되었다.

＜ 실시예 2＞ 본 발명 방풍통성산의 유산균 발효 추출물의 제조

본 발명에 따른 방풍통성산 공시재료는 활석 6.37g, 감초 4.5g, 석고, 황금, 길경 각각 2.62g, 방풍, 천궁, 당귀, 적작약, 대황, 마황, 박하, 연교, 망초 각각 1.68g, 형개, 백출, 치자 각각 1.31g 및 생강 5g을 선택하고 이들 한약재를 조합하여 9 mg/mL(0.9%, w/v) 비율로 증류수를 가하여 압력식 추출기로 100℃에서 3시간동안 추출 후 1~5℃ 가장 바람직하게는 4℃에서 2000~5000×g, 가장 바람직하게는 4,000×g으로 10분간 원심분리하여 침전물을 제거한 후 pH를 4~7 가장 바람직하게는 6.3으로 조정한 다음 121℃에서 15분간 멸균하였다. 유산균의 생육을 증대시키기 위하여 설탕(brown sugar)을 상기 한방 조성물에 대하여 5%(w/v)의 양으로 첨가한다. 상기 추출물에 미리 MRS배지에서 계대배양한 하기 Lactobaillus sp .균주 배양액 stock(각 1×10⁸ CFU/mL)을 2단계로 접종, 복합발효시키되, 가장 바람직하게는 Lactobacillus brevis KCTC 3498, Lactobacillus delbrueckii subsp . bulgaricus KCTC 3112, Lactobacillus helveticus KCTC 3545 각각 0.1~0.3%(v/v)씩 접종한 후 30~45℃에서 발효시키고, 상기 접종일로부터 4일째에 다시 pH가 낮은 데서 발효가 왕성한 Lactobacillus fermentum KCTC 3112 및 Lactobacillus plantarum KCTC 3108 을 각각 0.1~0.3%(v/v)씩 접종하여 3일간 더 발효시켜 pH 3.0~4.0 가장 바람직하게는 pH 3.51에서 중지시켰다. 이것을 본 발명 도포물질 원료로 사용한다. 상기 본 발명 도포액은 고농도로서는 방풍통성산의 유산균 복합 발효조성물의 원액(HC)을 직접 도포 사용하고, 저농도는 기본로션(에탄올, 프로필렌글리콜과 증류수를 각각 30:50:20의 비율로 혼합한 것)에 상기 방풍통성산의 유산균 복합 발효조성물의 원액을 50% 비율로 혼합한 희석액(LC)을 도포 사용하였다.

본 발명에서 방풍통성산을 직접 사용하는 경우는 본 발명의 효과를 전혀 달성할 수 없었으므로 대조구 실험에서도 제외하였고 실험결과도 제시하지 않았다. 또, 방풍통성산에 유산균 생육촉진을 위해 첨가하는 설탕(Brown sugar)의 첨가량은 1~10%(w/v)가 5%이하에서는 본 발명의 효과를 달성할 수 없고, 10%이상에서는 유산균의 증식이 오히려 지연(Lag)되어 바람직하지 않았다.

본 발명에 따른 한약재 방풍통성산 추출 조성물에 Lactobacillus sp .균주를 접종하여 얻은 복합 발효의 항산화, 여드름균에 대한 항균활성, 세포독성 기타 β헥소사미니다아제 억제효과를 위한 in vitro 실험을 개시한 바 있으나, 본 발명은 알러지성 접촉성 피부염 개선제로서의 용도를 규명하기 위한 in vivo 실험을 하기와 같이 실시하고 그 결과를 도 1 내지 도 3에 나타냈다.

＜ 실험예 1＞ 알러지성 접촉성 피부염의 유발 및 병변의 육안적 소견

1-Chloro-2,4,6-trinitrobenzene (Picryl Chloride; PiCi, Katayama Chemical Industries, Osaka, Japan)는 에탄올로 재결정시킨 후 사용하였다. BALB/c 마우스는 제모 과정에서 발생할 수 있는 피부의 미세 상처가 치유되도록 약물처치 24시간 전에 등쪽과 배쪽의 털을 넓게 제모하고 ethanol/acetone혼합물(4:1)에 용해시킨 5% PiCi용액 100μL를 배쪽의 경피에 도포하여 감작시켰다. 감작 후 5일 후에 등쪽피부에 olive oil에 용해시킨 1% PiCi용액 100μL를 도포하여 피부염을 유발시켰다. 그 후 1주일 간격으로 등쪽피부에 0.5% PiCi용액 100μL를 반복적으로 5회 더 도포하여 피부염을 지속적으로 유발시켰다.

실험군은 5개의 군(군단 7두씩 배치)으로 분류하였는데, 제 1실험군은 아무런 처치를 실시하지 않은 정상 대조군이고, 제 2실험군은 PiCi를 감작시키고 일정하게 경피로 반복 처치하여 알러지성 접촉성 피부염을 유발시킨 양성 대조군이며, 제 3실험군은 PiCi로 피부염을 유발시키면서 0.1% Tacrolimus 연고를 피부도포한 치료대조군, 제 4실험군과 5실험군은 PiCi로 피부염을 유발시키면서 방풍통성산 발효추출물을 저농도(50%)와 고농도(100%) 원액으로 1일 2회 12시간 간격으로 경피에 도포하는 실험군으로 설정하였다. 양성대조군 및 치료대조군은 본 발명 방풍통성산의 유산균 복합 발효조성물의 투여와 동일한 용량 및 처치빈도의 동일한 방법으로 처치하였다.

본 실험군의 피부의 육안적 형상은 도 1에 보인 바와 같다. 정상군에서는 육안적으로 보이는 피부염이나 피부이상이 관찰되지 않았으며, PiCi에 감작된 모든 마우스는 PiCi자극 후 1주째부터 PiCi를 직접 도포한 등부위에 삼출물, 미란 또는 표재성 궤양의 출현과 함께 다양한 피부염과 유사한 피부병변이 발생하였다. 피부 병변의 형태는 홍반, 부종, 미란, 피부건조 등도 관찰되었다. 이러한 피부염의 증상은 PiCi의 반복적인 도포로 4주째에서는 매우 심하였고 6주째에는 자연적인 증상이 경감되었다. 그러나 Tacrolimus 연고를 도포한 치료대조군를 도포한 실험군은 뚜렷하게 피부병변이 억제되었고 6주째에는 거의 정상군에 가깝게 회복되었다. 그리고 본 발명 방풍통성산의 유산균 복합 발효조성물 도포하면서 피부염을 유발시킨 실험군도 연고를 도포한 치료대조군과 동일한 양상으로 4주째부터 현저하게 피부염의 증상이 완화되었고 농도의존적인 경향은 뚜렷하지 않았지만 PiCi 대조군에 비하여 외관상 피부염으로 인한 탈모증상도 개선되었음을 육안적으로 확인할 수 있었다. 모발증식은 아무런 처치를 하지 않은 정상군에 비해서 나머지 모든 실험군에 활성화되는 양상을 나타내었고, 치료대조군과 본 발명 방풍통성산의 유산균 복합 발효조성물 고농도 도포군에서의 모발증식이 뚜렷하게 관찰되었다.

＜ 실험예 2＞ 피부 조직 병리 검사

본 발명에 따른 실험의 종료시점에 모든 마우스를 ethyl ether로 흡입마취를 시킨 후 육안관찰을 위해 사진촬영을 하고 안와정맥총에서 채혈을 하여 희생시키고 즉시 피부조직시료를 등 주변의 피부염 부위를 중심으로 1.5× 1.5cm의 넓이로 채취하여 10% neutralized buffered formalin 용액에 고정한 후 파라핀에 포매(embedding)하여 조직염색 전까지 실온에 보관하였다. 4μm 두께로 절편을 만들고 Haematoxylin-eosin 염색법을 이용하여 조직을 염색하여 광학현미경 상에서 100배의 배율로 피부의 전반적인 상태를 관찰하였고 조직중의 비만세포(mast cell)는 toluidine blue로 염색하여 관찰하였다.

6주간의 도포 후 실험군의 등쪽 피부의 조직병리학적 변화는 도 2에 나타내었다. Hematoxylin & Eosin염색을 실시하여 정상군은 표피, 진피 및 기저선이 일정하게 관찰되면서 염증성 변화가 없는 정상적인 모습을 나타내었고, PiCi로 피부염을 유발한 PiCi처치 실험군은 표피가 진피쪽으로 두껍게 내려가 현저하게 확장되어 비후화를 보이는 피부병변을 나타내었는데, 이러한 상황으로 발진이 많이 진행된 것을 확인할 수 있었으며 과각화증, 발적, 표피의 비후화, 염증성 세포의 침윤 등이 관찰되었다. 이러한 양상으로 PiCi 감작 및 자극에 의하여 급성피부염과 만성피부염의 소견을 모두 나타내었다. 치료대조군에서는 연고의 도포에 따라 유의하게 저하된 염증소견을 보였다.

본 발명 방풍통성산의 유산균 복합 발효조성물 처치부위의 피부는 전반적으로 표피의 두께 및 부종이 현저히 줄었고 염증세포의 침윤도 현저하게 감소되어 피부염의 병변이 뚜렷하게 완화되었다. 이러한 피부염의 개선효과는 농도의존적으로 나타났다.

Toluidine blue염색을 실시하여 정상군에 비하여 PiCi 처치군은 표피를 중심으로 비만세포의 출현증가가 관찰되었고 치료대조군 및 본 발명 방풍통성산의 유산균 복합 발효조성물 도포군에서는 전체적으로 비만세포의 출현이 감소되어 있어 histamine의 유리가 감소되고 있음을 추정할 수 있었다.

＜ 실험예 3＞ 혈청내 IgE , IL -1β, IL -4, IL -10, IL -12, INF -γ, TNF -α의 측정

본 발명에 따른 실험종료 후 ether 마취 하에서 NC/Nga 마우스의 안와정맥얼기로부터 채취한 혈액을 3,000rpm으로 10분간 원심분리하여 혈청을 분리한 후 분석 시까지 -80℃에 보관하였다. 혈청내 IgE, IL-1β, IL-4, IL-10, IL-12, INF-γ, TNF-α의 농도를 ELISA 방법(Koma biotech, Seoul, KOREA)을 이용하여 측정하였다.

모든 데이터 분석은 Statistical Analysis System(SAS, Ver. 8.01)을 이용하여 기술적인 통계치를 산출하였다. 결과는 평균(mean)과 표준오차(standard error, SE)로 표시하였다. 실험군의 평균간의 유의성을 Duncan's multiple range test로 p < 0.05 수준에서 검정하였다.

PiCi 감작 후 6주의 실험군의 혈청내 IgE, IL-1β, IL-4, IL-10, IL-12, INF-γ, TNF-α의 농도 변화는 도 3에 나타내었다. IgE, IL-4, INF-γ의 혈청내 농도는 PiCi처치로 급격하게 증가하였고 치료대조군과 본 발명 방풍통성산의 유산균 복합 발효조성물을 도포한 실험군에서는 양성대조군에 비하여 유의하게 감소되었다. 혈청내 IL-10의 농도는 정상군에 비하여 PiCi로 유발된 피부염 동물에서 증가하였고 치료대조군에서는 유의하게 감소되었고 본 발명 방풍통성산의 유산균 복합 발효조성물을 도포한 실험군에서는 경미하게 감소되는 경향을 나타내었다. IL-1β 및 IL-12의 혈청내 농도는 PiCi도포로 정상군에 비하여 증가되었으나 치료대조군 및 본 발명 방풍통성산의 유산균 복합 발효조성물 도포군에서 유의한 변화를 관찰할 수 없었다. 혈청내 INF-γ의 농도는 PiCi 도포로 급격하게 증가되었고 치료대조군 및 본 발명 방풍통성산의 유산균 복합 발효조성물 도포군에서 유의하게 감소되었는데, 감소 정도가 3개의 실험군 모두 유사한 농도를 나타내었다. TNF-α의 혈청 내 농도는 PiCi도포로 급격하게 증가되었고 치료대조군은 양성대조군과 거의 유사하였으나 본 발명 방풍통성산의 유산균 복합 발효조성물 처치군은 농도의존적으로 감소되어 고농도 도포군에서는 유의한 감소를 나타내었다. 이러한 결과는 면역관련 피부염에서 특이적으로 나타나는 IgE의 생성 및 Th2 사이토카인으로 알려진 IL-4와 Th1 사이토카인인 IFN-γ의 증가는 본 발명 방풍통성산의 유산균 복합 발효조성물의 도포 농도에 비례하여 뚜렷한 억제효과가 있었다.

이상 설명하고 도시한 바와 같이 본 발명 방풍통성산 유산균 복합 발효조성물은 접촉피부염 개선제로서 뛰어난 효과가 있으므로 생물의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

활석 6.37g, 감초 4.5g, 석고, 황금, 길경 각 2.62g, 방풍, 천궁, 당귀, 적작약, 대황, 마황, 박하, 연교, 망초 각 1.68g, 형개, 백출, 치자 각 1.31g, 생강 5g에 0.9%(w/v)의 증류수를 가하여 100℃에서 3시간 추출하고 1~5℃에서 2000~5000×g으로 10분간 원심분리하여 침전물을 제거한 후 pH 4~7로 조정하고 121℃에서 15분간 멸균한 다음 설탕을 상기 한약재 추출물에 대하여 5%(w/v)의 양으로 첨가한 후 통상의 MRS배지에서 미리 계대배양한 Lactobacillus 균주 배양액 stock(각 1×10⁸ CFU/mL)을 0.1~1%(v/v)씩을 접종하여 30~45℃에서 발효시킴에 있어서, Lactobacillus brevis KCTC 3498, Lactobacillus delbrueckii subsp . bulgaricus KCTC 3112, Lactobacillus helveticus KCTC 3545 각 0.1~0.3%(v/v)씩을 접종하여 30~45℃에서 발효시키고, 상기 접종일로부터 4일째에 다시 pH가 낮은 상태에서 발효가 왕성한 Lactobacillus fermentum KCTC 3112 및 Lactobacillus plantarum KCTC 3108 을 각 0.1~0.3%(v/v)씩을 접종하여 3일간 더 발효시켜 pH 3.0~4.0으로 복합발효시킴을 특징으로 하는 방풍통성산의 유산균 발효조성물을 포함하는 접촉피부염 개선용 약학 조성물의 제조방법.
제 1항의 방법으로 제조된 것이 특징인 pH 3.0~4.0 범위의 방풍통성산의 유산균 발효조성물.
제 2항의 방풍통성산의 유산균 발효조성물을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 접촉피부염 개선제.