KR102150988B1 - 홍삼농축분말을 포함하는 아토피 피부염 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 아토피 피부염 치료용 조성물에 관한 것으로, 홍삼농축분말을 포함하고, 아토피 피부염으로 손상된 피부의 홍반, 출혈, 건조, 흉터, 짓무름, 태선화 및 각화 증상을 개선하며, 비만세포의 침윤을 억제하고, 수분함유량을 증가시키는 효과를 갖는다.

Description

홍삼농축분말을 포함하는 아토피 피부염 치료용 조성물{COMPOSITION FOR TREATING ATOPIC DERMATITIS CONTAINING RED GINSENG CONCENTRATED POWDER}

본 발명은 아토피 피부염 치료용 조성물에 관한 것으로 홍삼농축분말을 포함하는 아토피 피부염 치료용 조성물에 관한 것이다.

아토피(atopy)는 1925년 코카(Coca)가 선천적으로 음식물과 흡입성 물질에 대한 알레르기 반응의 결과로 피부염이나 천식 및 고초열이 나타나는 경향을 아토피라고 기술한 이후부터 쓰이게 된 피부질환이다.

아토피성 질환에는 아토피 피부염 이외에 천식, 알레르기성 비염 및 알레르기성 결막염 등이 있다.

대체적으로 아토피 피부염은 영유아기, 특히 생후 2개월 전후에 시작되는데, 이 중 약 50%가 생후 2세 이전에 발생하여 증상이 나타난다.

대부분 성장과 더불어 증상이 완화되거나 사라지며 영유아기때 아토피 피부염이 발생한 환자의 절반 이상이 2세 전에 호전된다.

현재 일반인의 0.7%, 5세 이하 소아의 3~5%가 아토피 피부염을 앓고 있으며, 대기오염 증가, 주거환경의 변화로 인한 항원에 대한 노출 증가, 모유 수유의 감소 및 소아기 감염 질환의 감소 등의 환경적 요인으로 인하여 매년 그 숫자가 급격하게 증가하고 있다.

아토피 피부염은 심한 가려움을 동반한 홍반성 구진과 인설로 시작하여 심해지면 수포 및 장액성 삼출액과 가피를 보이는 급성 증상으로 진행한다.

가장 특징적인 증상인 소양증(가려움증)은 그 정도가 매우 심해서 피가 날 정도로 긁게 되며, 더 지속되면 피부가 두꺼워지고 주름이 뚜렷해지는 태선화 현상이 나타난다.

대부분의 임상 양상은 긁거나 문지른 결과에 의해 발생하며, 밤에는 소양증이 더욱 심해져 수면장애를 일으킨다.

아토피 피부염의 정확한 병태생리는 아직까지 완전히 밝혀지지 않았지만 유전적, 면역학적 및 비면역학적 기전이 관여하고 있을 것으로 추정되고 있다.

아토피 피부염의 대부분을 차지하는 외인성 아토피 피부염은 면역글로불린 E(immunoglobulin E, IgE)와 연관된 면역기전에 의하여 발생되는데, 특정 알레르겐(allergen)에 대한 속발성 면역 반응보다는 T-세포 이상에 의한 원발성 면역반응이 관여한다는 보고들이 많다.

또한, 아토피 피부염 환자에서 세포 매개성 면역기능 장애가 면역글로불린 E의 증가와 관련이 있음이 밝혀지면서 속발성 면역 반응 외에도 원발성 면역 반응이 아토피 피부염의 병인에 관여한다고 주장하는 보고들이 증가하고 있다(비특허문헌 1).

현재까지 알려진 아토피 피부염의 병태생리학적 기전과 증상 등을 감안하여 아토피 피부염에 대한 치료제가 개발되고 있으며, 그 결과 천연 또는 합성의 면역억제제, 항히스타민제제 및 스테로이드 제제 등 다수가 개발되어 있다.

대표적으로, 면역 억제제로는 사이클로스포린(cyclosporin) A, FK506(타크로리무스) 및 SDZ ASM981(피메크로리무스) 등이 사용되고 있다.

그러나, 현재까지 개발된 아토피 피부염에 대한 치료제로 스테로이드제와 항히스타민제 등을 사용하고 있지만 이러한 치료제들은 증상을 일시적으로 완화해주는 효과는 있으나 장기간 투약하게 되면 피부가 엷어지는 현상, 골다공증의 유발 및 어린이의 경우 성장 저해 등의 부작용으로 인하여 임상적으로 문제가 될 수 있다.

심한 경우에는 호르몬에 의한 전신 부작용이 나타날 수 있고, 치료제를 중지하면 증상이 악화되는 스테로이드제에 대한 내성을 나타낼 수도 있다.

따라서, 아토피 피부염 치료에 뛰어난 효과를 가지면서도 부작용은 적은 천연물을 이용한 새로운 아토피 피부염 치료제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

상기 천연물을 이용한 아토피 피부염 치료제에 관한 선행문헌을 살펴보면, 대한민국 등록특허공보 제10-1605057호를 참고할 수 있다.

상기 선행문헌은 “진세노사이드 Rd가 강화된 발효 인삼 또는 홍삼 추출물을 포함하는 아토피 피부염 개선용 조성물”에 관한 것으로, 인삼 또는 홍삼의 주근 및 세근의 혼합 추출액에 펙티나제 효소를 첨가하여 발효시킨 것을 특징으로 한다.

또 다른 선행문헌인 대한민국 등록특허공보 제10-1345226호는 “신규한 패니바실러스 속 엠비티213 균주, 이를 이용한 발효 인삼 및 이를 이용한 발효 인삼 추출물을 함유하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물”에 관한 것이다.

이는 특정한 미생물(패니바실러스 속 엠비티213 균주)을 사용하는 것을 특징으로 한다.

상기 선행문헌들은 천연물인 인삼 또는 홍삼을 사용한 아토피 피부염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로 기존의 스테로이드제 뛰어난 효과를 가지면서도 부작용이 적은 장점이 있으나, 제조과정에 있어서 특정한 미생물이나 효소를 사용하여 발효시켜야 하는 번거로움이 있다.

대한민국 등록특허공보 제10-1605057호(2016.03.15.) 대한민국 등록특허공보 제10-1345226호(2013.12.19.)

최신알레르기 진료, 2001, 이기영, 한국의학사, pp23~52.

본 발명은, 아토피 피부염 치료용 조성물로 홍삼농축분말을 포함하는 아토피 피부염 치료용 조성물을 제공하는 것을 해결하고자 하는 과제로 삼는다.

상기한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 홍삼농축분말을 포함하는 아토피 피부염 치료용 조성물을 과제 해결을 위한 수단으로 제공한다.

상기 홍삼농축분말의 1회 투여 용량은 마우스 경구 투여시 100~800 mg/kg인 것을 특징으로 한다.

상기 홍삼농축분말은 아토피 피부염으로 손상된 피부의 홍반, 출혈, 건조, 흉터, 짓무름, 태선화 및 각화 증상을 개선하며, 비만세포의 침윤을 억제하고, 수분함유량을 증가시키는 것을 특징으로 한다.

상기 홍삼농축분말은 피부조직 내 필라그린(filaggrin) 농도를 증가시키고, 세라미다아제(ceramidase) 농도를 감소시키며, 혈액 내 호산구(eosinophil) 및 면역글로불린 E(immunoglobulin E) 농도를 감소시키는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 홍삼농축분말은 TNF-α(tumor necrosis factor-alpha), IL-4(interleukin-4), IL-6(interleukin-6), TSLP(thymic stromal lymphopoietin) 및 TARC(thymus and activation regulated chemokine) 유전자 발현을 억제하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 홍삼농축분말을 포함하는 아토피 피부염 치료용 조성물은 아토피 피부염으로 손상된 피부의 홍반, 출혈, 건조, 흉터, 짓무름, 태선화 및 각화 증상을 개선하며, 비만세포의 침윤을 억제하고, 수분함유량을 증가시키는 효과를 갖는다.

또한, 피부조직 내 필라그린 농도를 증가시키고, 세라미다아제 농도를 감소시키며, 혈액 내 호산구 및 면역글로불린 E 농도를 감소시키고, TNF-α, IL-4, IL-6, TSLP 및 TARC 유전자 발현을 억제하는 효과를 갖는다.

도 1은 홍삼농축분말을 다양한 농도로 처리하였을 때의 HaCaT 세포의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 2(a)는 홍삼농축분말이 HaCaT 세포의 MDC와 TARC 발현에 미치는 효과를 나타낸 것이고, (b)는 MDC의 mRNA 발현양을 나타낸 그래프이며, (c)는 TARC의 mRNA 발현양을 나타낸 그래프이다.
도 3(a)는 홍삼농축분말이 Jurkat 세포의 TNF-α, IL-4 및 IL-6 발현에 미치는 효과를 나타낸 것이고, (b)는 TNF-α의 mRNA 발현양을 나타낸 그래프이며, (c)는 IL-4의 mRNA 발현양을 나타낸 그래프이고, (d)는 IL-6의 mRNA 발현양을 나타낸 그래프이다.
도 4는 DNCB를 처리하여 아토피 피부염이 유발된 BALB/c 마우스에 홍삼농축분말을 경구 투여한 일정을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 5는 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스의 체중에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스의 피부 임상증상에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 6주간 홍삼농축분말을 경구 투여한 BALB/c 마우스의 피부를 촬영한 사진이다.
도 8(a)는 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스의 혈액 내 호산구 농도에 미치는 효과를 나타낸 그래프이며, (b)는 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스의 혈액 내 면역글로불린 E 농도에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 9(a)는 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스 피부조직의 TNF-α, IL-4 및 IL-6 유전자 발현에 미치는 효과를 나타낸 것이며, (b)는 BALB/c 마우스 피부조직의 TNF-α 유전자 발현정도를 나타낸 그래프이고, (c)는 BALB/c 마우스 피부조직의 IL-4 유전자 발현정도를 나타낸 그래프이며, (d)는 BALB/c 마우스 피부조직의 IL-6 유전자 발현정도를 나타낸 그래프이다.
도 10(a)는 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스 피부조직의 TSLP 유전자 발현에 미치는 효과를 나타낸 것이며, (b)는 BALB/c 마우스 피부조직의 TSLP 유전자 발현정도를 나타낸 그래프이고, (c)는 BALB/c 마우스 피부조직의 TARC 농도를 나타낸 그래프이다.
도 11(a)는 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스 피부조직 변화에 미치는 효과를 나타낸 광학현미경 사진이며, (b)는 계수된 비만세포의 수를 나타낸 그래프이다.
도 12는 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스 피부 표면 pH 변화에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.
도 13(a)는 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스 피부조직 내 필라그린에 미치는 효과를 나타낸 것이고, (b)는 필라그린의 생성정도를 나타낸 그래프이며, (c)는 세라미다아제의 생성정도를 나타낸 그래프이다.
도 14(a)는 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스 피부 표피에 미치는 효과를 나타낸 광학현미경 사진이며, (b)는 표피 두께를 측정하여 나타낸 그래프이다.

본 명세서 및 청구 범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

따라서 본 명세서에 기재된 실험예, 실시예 및 도면에 기술된 사항은 본 발명의 가장 바람직한 일 예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

제조예 1. 홍삼농축분말의 제조

1) 홍삼농축분말 제조

전라북도 진안군에서 6년근 인삼(Panax ginseng C. A. Meyer) 으로 만든 홍삼을 구입하여 증류수에 세착한 후 건조하였다. 건조한 홍삼 100g에 물 1L를 가하고 80℃, 8시간 추출하였으며, 2, 3차추출은 100g당 600ml의 증류수를 첨가하여 80℃, 8시간 동안 반복 추출하여 홍삼추출액을 얻었다. 홍삼추출액은 70mesh housing filteration으로 여과한 후, 스팀농축조에 투입 하여 60℃에서 감압농축하였다. 홍삼농축액은 당도 65브릭스(brix)가 될 때까지 농축하였으며 ginsenoside Rg1+Rb1+Rg3=6.39mg/g을 함유하는 홍삼농축액을 제조하였다. 제조된 홍삼농축액은 65℃ 분무건조(spray dryer)에서 inlet 180℃, outlet 90℃ 조건에서 건조하였으며, 말토덱스트린(maltodextrin)을 고형분 기준 40% 첨가 후 가공하였다. 이때 ginsenoside Rg1+Rb1+Rg3의 합은 6.42mg/g이 함량이 되도록 제조하였다. 제조된 홍삼농축분말은 -80℃에서 보관하였다.

실험예 1. 홍삼농축분말이 인간 HaCaT 세포의 생존율에 미치는 영향 평가

홍삼농축분말이 인간 각질형성세포(HaCaT)의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위해 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide(MTT) 분석을 수행하였다.

본 실험에 사용한 인간 피부각질세포주(HaCaT)는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, ATCC)에서 구입하였다.

HaCaT 세포를 10% 소태아 혈청(가열하여 불활성화시킴), 스트렙토마이신(100 μg/mL) 및 페니실린(100 unit/mL)이 함유된 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute, RPMI) 1640 배지를 사용하여, 배양기에서 5% 이산화탄소 및 37℃를 유지하며 배양하였다.

배양된 HaCaT 세포를 6 웰 플레이트(well-plate)에 각각 1x10⁶ cells/mL이 되도록 세포를 접종하고 홍삼농축분말을 31.25, 62.5, 125, 250, 500 및1000 ug/mL의 농도로 각각 처리한 뒤 24시간동안 배양하였다.

배양된 세포에 MTT 0.5 mg/mL를 처리한 뒤 37℃에서 3시간동안 배양하였다.

배양이 끝난 뒤, 배지를 제거하고 포르마잔(formazan) 침전물을 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 용해시켰다.

포르마잔 생성물의 흡광도를 마이크로플레이트 리더 (microplate reader)를 사용하여 540 nm 파장에서 측정하였다.

아무것도 처리되지 않은 HaCaT 세포를 대조군, 홍삼농축분말을 다양한 농도로 처리한 HaCaT 세포를 실험군으로 하였다.

도 1은 홍삼농축분말을 다양한 농도로 처리하였을 때의 HaCaT 세포의 생존율을 나타낸 그래프이다.

그 결과, 홍삼농축분말은 1000 ug/mL까지 세포 독성이 나타나지 않았다.

실험예 2. 홍삼농축분말이 HaCaT 세포의 MDC와 TARC 발현에 미치는 영향 평가

세포가 인터페론 감마(interferon gamma, IFN-γ)와 종양괴사인자 알파(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)와 같은 염증 유발 인자에 의해 염증이 유발되면 대식세포유래 케모카인(macrophage derived chemokine, MDC) 유전자와 흉선활성화조절 케모카인(thymus and activation regulated chemokine, TARC) 유전자의 발현량이 증가하게 된다.

이에 따라, MDC 및 TARC 유전자의 발명정도를 분석하여 아토피 피부염의 염증정도를 판단할 수 있다.

홍삼농축분말이 HaCaT 세포의 MDC와 TARC 유전자 발현에 미치는 영향을 평가하기 위해 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse tranion polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하였다.

HaCaT 세포를 6 웰 플레이트에 1x10⁶ cells/mL로 접종한 후 37℃의 5% 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양하였다.

배양된 세포에 홍삼농축분말을 250, 500 및 1000 ug/mL 농도로 처리하고 24시간 동안 배양하였다.

배양된 세포를 수확(harvest)한 후 RNA 추출 kit를 사용하여 RNA를 분리 후 분광광도계(spectrophotometer)로 RNA를 정량하였다.

정량된 RNA를 cDNA kit를 사용하여 cDNA를 합성한 후, 합성된 cDNA를 프라이머(primer)로 PCR 반응시켜 MDC 및 TARC의 mRNA 발현양을 측정하였다.

내부 표준(internal standard)으로는 글리세르알데히드 3-인산염 탈수소효소(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)를 사용하였다.

아무것도 처리하지 않은 HaCaT 세포를 정상군, IFN-γ와 TNF-α를 각각 10 ng/mL 처리한 HaCaT 세포를 음성대조군, IFN-γ와 TNF-α를 각각 10 ng/mL 처리한 뒤 아토피 피부염 치료제인 덱사메타손(dexamethasone) 100 uM을 처리한 HaCaT 세포를 양성대조군, IFN-γ와 TNF-α를 각각 10 ng/mL 처리한 뒤 홍삼농축분말을 각각 농도별로 처리한 HaCaT 세포를 실험군으로 하였다.

도 2(a)는 홍삼농축분말이 HaCaT 세포의 MDC와 TARC 발현에 미치는 효과를 나타낸 것이고, (b)는 MDC의 mRNA 발현양을 나타낸 그래프이며, (c)는 TARC의 mRNA 발현양을 나타낸 그래프이다.

그 결과, 덱사메타손을 처리한 양성대조군과 비교하였을 때, 홍삼농축분말을 처리한 실험군은 MDC와 TARC 유전자의 발현량이 농도 의존적으로 감소하였다.

따라서, 홍삼농축분말은 아토피 피부염의 염증반응을 억제하는 효과를 갖는 것을 확인하였다.

실험예 3. 홍삼농축분말이 HaCaT 세포의 TNF-α, IL-4 및 IL-6 발현에 미치는 영향 평가

아토피 피부염에는 T 세포(T cell)와 사이토카인(cytokine)이 활성화되며, T 세포가 항체 형성에 관여하고, 아토피 피부염 병변에 보조 T 세포가 주로 침윤된다.

보조 T 세포는 기능에 따라 보조 T 세포 1(helper T cell 1, Th1)와 보조 T 세포 2(helper T cell 2, Th2)로 구분할 수 있는데, 지연기 아토피 피부염에는 Th1가 우세하게 나타나며, 급성기 아토피 피부염에서는 Th2가 우세하게 나타난다.

Th1 세포는 TNF-α를 생산하여 대식세포를 활성화시켜 지연형 면역과민반응을 유발하며, Th2 세포는 IL-4 및 IL-6를 활성화시켜 급성형 면역과민반응을 유발한다.

이에 따라, TNF-α, IL-4 및 IL-6의 발현을 분석하여 아토피 피부염의 면역과민반응 정도를 판단할 수 있다.

홍삼농축분말이 Jurkat 세포의 TNF-α, IL-4 및 IL-6 유전자 발현에 미치는 영향을 평가하기 위해 RT-PCR을 수행하였다.

본 실험에 사용한인간 T 림프구 세포주(Jurkat)는 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank, KCLB)에서 구입하였다.

Jurkat 세포를 10% 소태아 혈청(가열하여 불활성화시킴), 스트렙토마이신(100 μg/mL), 페니실린(100 unit/mL) 및 L-글루타민(2 mM)을 포함하는 RPMI640 배지 사용하여, 배양기에서 5% 이산화탄소 및 37℃를 유지하며 배양하였다.

Jurkat 세포를 6 웰 플레이트에 각각 1x10⁶ cells/mL이 되도록 세포를 접종한 후 37℃의 5% 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양하였다.

그런 다음, 배양된 Jurkat 세포에 홍삼농축분말을 250, 500 및 1000 ug/mL 농도로 처리하고 24시간 동안 배양하였다.

배양된 Jurkat 세포를 수확한 후 실험예 2와 동일한 방법으로 RNA를 추출하였으며, cDNA를 합성하였고, mRNA 발현양을 측정하였다.

내부 표준으로는 GAPDH를 사용하였다.

아무것도 처리하지 않은 Jurkat 세포를 정상군, 포볼 12-미리스테이트 13-아세트산(phorbol 12'-myristate 13'-acetate, PMA) 10 ng/ml과 이오노마이신(ionomycin) 0.5 uM을 처리한 Jurkat 세포를 음성대조군, PMA 10 ng/ml와 ionomycin 0.5 uM을 처리한 뒤 아토피 피부염 치료제인 덱사메타손(dexamethasone) 100 uM을 처리한 Jurkat 세포를 양성대조군, PMA 10 ng/ml와 이오노마이신 0.5 uM을 처리한 뒤 홍삼농축분말을 각각 농도별로 처리한 HaCaT 세포를 실험군으로 하였다.

PMA와 이오노마이신은 T 세포가 활성화 되도록 신호적 자극을 주는 물질로 실제 항원에 의한 T 세포의 활성기작과 같은 역할을 하여 면역반응이 일어나는 것 같은 환경을 만들어 준다.

도 3(a)는 홍삼농축분말이 Jurkat 세포의 TNF-α, IL-4 및 IL-6 발현에 미치는 효과를 나타낸 것이고, (b)는 TNF-α의 mRNA 발현양을 나타낸 그래프이며, (c)는 IL-4의 mRNA 발현양을 나타낸 그래프이고, (d)는 IL-6의 mRNA 발현양을 나타낸 그래프이다.

그 결과, 덱사메타손을 처리한 양성대조군과 비교하였을 때, 홍삼농축분말을 처리한 실험군은 TNF-α, IL-4 및 IL-6 유전자의 발현량이 농도 의존적으로 감소하였다.

따라서, 홍삼농축분말은 아토피 피부염의 면역과민반응을 억제하는 효과를 갖는 것을 확인하였다.

실험예 4. 아토피 피부염 억제 효능 연구를 위한 동물실험

홍삼농축분말의 아토피 피부염 억제 효능 연구를 위한 동물실험을 수행하기 위해, 홍삼농축분말을 사용하였으며 6주령 된 BALB/c 마우스를 이용하였다.

정상군과 음성대조군에는 아세톤과 올리브오일을 3:1로 혼합하여 제조한 면역교란물질로 1.5% 2,4-디니트로클로로벤젠(2,4-dinitrochlorobenzen, DNCB)을 처리하였으며, 실험군에는 1.5% DNCB를 처리한 뒤 홍삼농축분말(100, 200, 400 및 800 mg/kg)을 각각 농도별로 경구 투여하고, 양성대조군에는 DNCB를 처리한 뒤 덱사메타손(1.0 mg/kg)을 경구 투여하여 총 7개 군으로 나누어 각 군당 10마리씩 총 70마리를 실험에 사용하였다(표 1).

아토피 피부염 억제 효능 연구를 위한 동물실험군

군	1.5% DNCB 처리	처리량	마우스 수
정상군	-	-	10
음성대조군	+	-	10
실험군 1 (100 MPK)	+	홍삼농축분말 100 mg/kg	10
실험군 2 (200 MPK)	+	홍삼농축분말 200 mg/kg	10
실험군 3 (400 MPK)	+	홍삼농축분말 400 mg/kg	10
실험군 4 (800 MPK)	+	홍삼농축분말 800 mg/kg	10
양성대조군	+	덱사메타손 1.0mg/kg	10

BALB/c 마우스의 등을 귀 하단부에서부터 꼬리 상단부까지 전체를 제모한 뒤 24시간 방치하였으며, BALB/c 마우스의 제모 부위에 1.5% DNCB 200 ul를 1차 처리한 뒤 4일 후에 2차 처리하여 아토피 피부염을 유발하였다.

1차 처리 후 7일째부터 1주일에 3회씩 6주간 0.5% DNCB 150 ul를 재차 처리하였으며, 1차 처리 후 7일째부터 1주일에 6회씩 하루 1회 홍삼농축분말을 BALB/c 마우스에 경구 투여하였다.

도 4는 DNCB를 처리하여 아토피 피부염이 유발된 BALB/c 마우스에 홍삼농축분말을 경구 투여한 일정을 도식화하여 나타낸 것이다.

실험예 5. 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스의 체중에 미치는 영향 평가

아토피 피부염이 유발된 BALB/c 마우스에 홍삼농축분말을 6주간 반복적으로 경구 투여하였을 때 BALB/c 마우스의 체중에 미치는 영향을 비교하였다.

도 5는 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스의 체중에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.

그 결과, 정상군 및 양성대조군과 비교하였을 때, 실험군의 유의적인 무게 변화는 관찰되지 않았다.

실험예 6. 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스의 피부 임상증상에 미치는 영향 평가

홍삼농축분말이 BALB/c 마우스의 피부 임상증상에 미치는 영향을 알아보기 위해, BALB/c 마우스에 DNCB를 1차 처리한 뒤 1주 후 부터 주 1회 마우스의 피부를 촬영하여 임상증상의 변화를 관찰하였다.

홍반(erythema), 출혈(hemorrhage), 건조(dryness), 흉터(scarring), 태선화(lichenification) 및 짓무름(erosion)의 6가지 임상증상을 각각 0(정상)~10(심각)등급으로 나누어 측정하였다(표 2).

BALB/c 마우스의 아토피 피부염 등급

Group	1 week	2 week	3 week	4 week	5 week	6 week
정상군	0	0	0	0	0	0
음성대조군	5.7±0.2	7.3±0.5	8.5±1.2	8.4±1.6	7.9±1.6	8.5±1.7
실험군 1 (100 MPK)	5.5±0.7	6.0±0.7	6.4±0.7	5.8±1.0	6.2±1.1	6.5±0.8
실험군 2 (200 MPK)	5.5±0.6	5.7±0.4	6.3±0.5	6.2±1.8	6.5±0.5	6.8±1.0
실험군 3 (400 MPK)	5.0±0.6	5.5±0.4	6.2±0.5	5.7±0.7	6.2±0.9	6.4±0.5
실험군 4 (800 MPK)	5.1±0.5	5.3±0.6	5.8±0.3	5.3±1.1	5.9±0.5	5.8±0.4
양성대조군	5.0±0.5	4.9±0.6	5.5±1.1	5.7±0.3	5.5±1.3	5.4±1.1

도 6은 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스의 피부 임상증상에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.

도 7은 6주간 홍삼농축분말을 경구 투여한 BALB/c 마우스의 피부를 촬영한 사진이다.

그 결과, 음성대조군과 비교하였을 때, 실험군 1 내지 4 모두에서 음성대조군에 비해 피부 임상증상이 완화되었으며, 특히 실험군 4에서 피부 임상증상 완화효과가 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.

실험예 7. 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스의 혈액 내 호산구 및 IgE의 농도변화에 미치는 영향 평가

아토피 피부염이 유발된 경우, Th2 세포에서 생산되는 사이토카인에 의해 면역글로불린 E 합성이 증가되고 호산구(eosinophil)의 분화를 유도하여 면역과민반응이 유발된다.

이에 따라, 면역글로불린 E와 호산구의 농도변화를 분석하여 아토피 피부염의 면역과민반응 정도를 판단할 수 있다.

홍삼농축분말이 BALB/c 마우스의 혈액 내 호산구 및 면역글로불린 E의 농도변화에 미치는 영향을 알아보기 위해, 마우스에서 혈액을 채취하여 아래와 같이 실험하였다.

DNCB를 처리하여 아토피 피부염이 유발된 BALB/c 마우스에 홍삼농축분말을 6주 동안 경구 투여한 후, 마우스의 혈액을 채취해 혈액분석기(complete blood count, CBC)를 이용하여 혈액 내 호산구 농도를 측정하였으며, 이후 혈장을 분리하여 효소면역측정 키트(enzyme-linked immunosorbent assay kit, ELISA kit)를 이용하여 혈액 내 IgE 농도를 측정하였다.

도 8(a)는 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스의 혈액 내 호산구 농도에 미치는 효과를 나타낸 그래프이며, (b)는 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스의 혈액 내 면역글로불린 E 농도에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.

그 결과, 정상군과 비교하였을 때, 음성대조군에서 호산구 및 IgE의 농도가 증가하였으며 홍삼농축분말을 투여한 실험군에서는 호산구 및 IgE의 농도가 감소하였다.

특히 실험군 4에서 호산구 및 IgE 농도 감소효과가 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.

실험예 8. 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스 피부조직의 TNF-α, IL-4 및 IL-6 유전자 발현에 미치는 영향 평가

홍삼농축분말을 6주간 반복적으로 경구 투여한 BALB/c 마우스의 피부조직을 적출하여 TNF-α, IL-4 및 IL-6 유전자 발현에 미치는 영향을 평가하기 위해 RT-PCR을 수행하였다.

적출한 피부조직을 실험예 2와 동일한 방법으로 RNA를 추출하였으며, cDNA를 합성하였고, mRNA 발현양을 측정하였다.

내부 표준으로는 GAPDH를 사용하였다.

도 9(a)는 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스 피부조직의 TNF-α, IL-4 및 IL-6 유전자 발현에 미치는 효과를 나타낸 것이며, (b)는 BALB/c 마우스 피부조직의 TNF-α 유전자 발현정도를 나타낸 그래프이고, (c)는 BALB/c 마우스 피부조직의 IL-4 유전자 발현정도를 나타낸 그래프이며, (d)는 BALB/c 마우스 피부조직의 IL-6 유전자 발현정도를 나타낸 그래프이다.

그 결과, 정상군 및 음성대조군과 비교하였을 때, 실험군에서 Th1 계열의 사이토카인인 TNF-α와 Th2 계열의 사이토카인인 IL-4 및 IL-6 유전자 발현량이 대체적으로 감소하였으며, 특히 실험군 3 내지 4에서 TNF-α, IL-4 및 IL-6 유전자 발현량이 뚜렷하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 9. 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스 피부조직의 TSLP 유전자 발현 및 TARC 농도에 미치는 영향 평가

흉선 기질성 림포포이에틴(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)과 TARC는 각질형성세포에서 분비되는 사이토카인으로, Th2 면역반응을 유도하여 피부를 면역과민상태로 이르게 하며 이로 인하여 아토피 피부염을 일으키는 주요인자로 알려져 있다.

홍삼농축분말을 6주간 반복적으로 경구 투여한 BALB/c 마우스의 피부조직을 적출하여 TSLP 유전자 발현에 미치는 영향을 평가하기 위해 RT-PCR을 수행하였으며, TARC 농도에 미치는 영향을 평가하기 위해 ELISA를 수행하였다.

적출한 피부조직을 실험예 2와 동일한 방법으로 RNA를 추출하였으며, cDNA를 합성하였고, TSLP mRNA 발현양을 측정하였다.

내부 표준으로는 GAPDH를 사용하였다.

또한, 적출한 피부조직을 실험예 7과 동일한 방법으로 효소면역측정 키트를 이용하여 피부조직 내 TARC 농도를 측정하였다.

도 10(a)는 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스 피부조직의 TSLP 유전자 발현에 미치는 효과를 나타낸 것이며, (b)는 BALB/c 마우스 피부조직의 TSLP 유전자 발현정도를 나타낸 그래프이고, (c)는 BALB/c 마우스 피부조직의 TARC 농도를 나타낸 그래프이다.

그 결과, 정상군 및 음성대조군과 비교하였을 때, 실험군에서 TSLP 유전자 발현 및 TARC 농도가 대체적으로 감소하였으며, 특히 실험군 3 내지 4에서 TSLP 유전자 발현 및 TARC 농도가 뚜렷하게 감소하는 것을 확인하였다.

실험예 10. 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스 피부조직 변화에 미치는 영향 평가

피부에서 비만세포가 활성화되면 혈관투과성이 높아져 부종을 일으키고, 비만세포에서 분비된 히스타민에 의해 홍반과 소양증 증상을 동반하게 된다.

홍삼농축분말이 BALB/c 마우스의 피부조직 변화에 미치는 영향을 평가하기 위해, 톨루이딘 블루 O 염색(toluidine blue O staining)법으로 비만세포를 염색한 뒤 비만세포의 수를 계수하였다.

홍삼농축분말을 6주간 반복적으로 경구 투여한 BALB/c 마우스의 피부조직을 적출하여 10% 포르말린(formalin) 용액으로 3일 동안 고정시켰다.

고정이 완료된 피부조직을 회전형 박절기(microtome, Thermo Electron Corporation)를 사용하여 4~5 um로 박절 후 슬라이드글라스(slide glass)에 부착하여 사용하였다.

슬라이드글라스에 부착된 피부조직을 톨루이딘 블루 O를 사용하여 2일 동안 염색한 뒤, 광학현미경을 사용하여 100배율에서 관찰하였다.

도 11(a)는 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스 피부조직 변화에 미치는 효과를 나타낸 광학현미경 사진이며, (b)는 계수된 비만세포의 수를 나타낸 그래프이다.

그 결과, 정상군 및 음성대조군과 비교하였을 때, 실험군에서 농도 의존적으로 피부조직 내로 침윤된 비만세포의 수가 유의성 있게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 11. 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스 피부 표면 pH 변화에 미치는 영향 평가

피부의 정상 pH는 4.5~6 사이의 약산성으로 면역과민반응 상태가 되면 피부 표면의 pH가 높아지고, 각질세포의 탈락이 촉진되며, Th2 계열의 사이토카인이 생성되어 알레르기 반응이 일어나게 된다.

홍삼농축분말이 BALB/c 마우스의 피부 표면 pH에 미치는 영향을 알아보기 위해, pH를 측정하여 피부 상태를 확인하였다(표 3).

BALB/c 마우스 피부 표면 pH 변화

Group	1 week	2 week	3 week	4 week	5 week	6 week
정상군	5.57±0.15	5.37±0.14	5.37±0.24	5.46±0.18	5.54±0.17	5.74±0.17
음성 대조군	6.70±0.24	6.67±0.22	6.68±0.19	6.59±0.24	6.54±0.23	6.75±0.16
실험군 1 (100 MPK)	6.60±0.25	6.52±0.18	6.50±0.17	6.51±0.21	6.45±0.23	6.48±0.19
실험군 2 (200 MPK)	6.48±0.16	6.46±0.32	6.35±0.13	6.37±0.18	6.39±0.15	6.41±0.16
실험군 3 (400 MPK)	6.42±0.08	6.31±0.16	6.39±0.12	6.40±0.21	6.41±0.12	6.42±0.14
실험군 4 (800 MPK)	6.30±0.11	6.27±0.06	6.30±0.07	6.34±0.12	6.35±0.10	6.35±0.09
양성 대조군	6.32±0.12	6.31±0.10	6.27±0.16	6.28±0.27	6.31±0.21	6.24±0.16

도 12는 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스 피부 표면 pH 변화에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.

그 결과, 정상군의 피부 표면 pH는 6주동안 5.57±0.15에서 5.74±0.17의 약산성을 유지하였으며, 음성대조군의 피부 표면 pH는 6.70±0.24에서 6.75±0.16로 측정되어 정상군보다 pH가 증가하였다.

반면, 양성대조군의 피부 표면 pH와 비교하였을 때, 실험군의 피부 표면 pH는 농도 의존적 감소하였다.

특히, 6주차에 측정한 실험군 4의 피부 표면 pH는 6.35±0.09로 음성대조군에 비해 상대적으로 pH가 감소하였다.

실험예 12. 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스 피부 수분에 미치는 영향 평가

피부장벽은 면역과민반응 상태가 되면 염증과 알레르기 반응으로 인하여 손상을 받게된다.

손상된 피부장벽은 투과성이 높아져 피부 내 수분이 외부로 손실되어 수분함유량이 감소된다.

홍삼농축분말이 BALB/c 마우스 피부 수분에 미치는 영향을 알아보기 위하여, BALB/c 마우스의 피부 표면의 경피수분손실도(transepidermal water loss, TEWL)와 수분함유량을 측정하여 피부상태를 확인하였다.

BALB/c 마우스 피부 표면의 경피수분손실도

Group	1 week	2 week	3 week	4 week	5 week	6 week
정상군	2.12 ±0.29	2.08 ±0.19	2.14 ±0.30	2.18 ±0.33	2.16 ±0.11	2.20 ±0.78
음성 대조군	35.54 ±2.48	39.96 ±3.75	42.78 ±6.67	41.02 ±7.86	40.67 ±9.57	42.93 ±5.92
실험군 1 (100 MPK)	33.16 ±2.97	37.76 ±6.16	36.84 ±6.01	36.93 ±8.12	35.11 ±8.75	37.99 ±5.72
실험군 2 (200 MPK)	32.88 ±3.01	35.88 ±3.01	37.73 ±12.65	34.49 ±13.10	32.07 ±3.96	33.16 ±6.43
실험군 3 (400 MPK)	33.10 ±4.64	36.14 ±12.90	35.11 ±4.66	34.64 ±5.62	35.65 ±6.86	34.15 ±7.31
실험군 4 (800 MPK)	32.84 ±4.34	33.66 ±5.38	33.73 ±2.86	32.76 ±4.06	34.41 ±10.71	32.19 ±4.16
양성 대조군	30.18 ±3.07	31.11 ±3.78	30.89 ±4.67	32.49 ±4.78	32.12 ±5.12	31.48 ±4.93

BALB/c 마우스 피부 내 수분함유량

Group	1 week	2 week	3 week	4 week	5 week	6 week
정상군	91.20 ±4.49	90.80 ±2.28	92.40 ±4.51	90.20 ±4.15	91.40 ±2.30	90.20 ±3.25
음성 대조군	35.30 ±9.19	33.00 ±9.68	32.00 ±7.78	34.10 ±9.73	31.30 ±9.19	32.50 ±7.78
실험군 1 (100 MPK)	33.50 ±7.58	32.10 ±5.30	34.20 ±6.16	33.30 ±8.89	35.50 ±7.58	35.20 ±6.16
실험군 2 (200 MPK)	37.33 ±9.64	34.60 ±11.45	36.60 ±6.66	39.40 ±13.10	38.33 ±9.64	39.60 ±6.66
실험군 3 (400 MPK)	36.22 ±8.78	35.30 ±8.40	38.60 ±9.85	37.40 ±11.29	40.22 ±8.78	38.60 ±9.85
실험군 4 (800 MPK)	39.44 ±6.84	39.50 ±5.19	42.00 ±9.54	40.90 ±10.60	41.44 ±7.84	41.00 ±9.54
양성 대조군	41.78 ±5.96	40.78 ±10.45	42.63 ±9.63	39.51 ±10.36	41.87 ±10.23	42.12 ±8.63

그 결과, 정상군의 경피수분손실도는 6주동안 2.12±0.29에서 2.20±0.78로 수분손실도가 낮은 반면, 음성대조군의 경피수분손실도는 6주동안 35.54±2.48에서 42.93±5.92로 증가하였다.

또한, 정상군의 수분함유량은 6주동안 91.20±4.49에서 90.20±3.25로 높은 수분함유량을 유지한 반면, 음성대조군의 수분함유량은 6주동안 35.30±9.19에서 32.50±7.78로 감소하였다.

음성대조군과 비교하였을 때, 실험군 4의 경피수분손실도는 6주동안 32.84±4.34에서 32.19±4.16의 낮은 수준을 유지하였으며, 실험군 4의 수분함유량은 6주동안 39.44±6.84에서 41.00±9.54로 증가하였다.

따라서, 홍삼농축분말은 아토피 피부염으로 인해 손상된 피부의 수분 손실을 억제하고 수분함유량을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 13. 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스 피부조직 내 필라그린 및 세라마이드에 미치는 영향 평가

필라그린(filaggrin)은 피부 각질세포막에서 케라틴 필라멘트(keratin filament)를 형성해주는 단백질로, 피부장벽을 단단하게 고정시켜주는 벽돌역할을 한다.

또한, 세라마이드(ceramide)는 피부 각질세포 사이의 지질막을 형성해주는 물질로, 필라그린과 함께 피부장벽의 구조 형성을 도와주는 시멘트역할을 한다.

하지만 피부에 염증반응이 유도되어 Th2 계열 사이토카인이 생성되면 필라그린의 발현이 억제되고 세라마이드의 분해가 촉진되어 피부장벽에 손상을 유발함으로 피부 각화현상, 건선 및 태선화 증상이 발생된다.

홍삼농축분말이 BALB/c 마우스의 피부조직 내 필라그린과 세라마이드에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 6주간의 투여가 끝난 마우스의 피부조직을 적출하여 웨스턴 블랏(western-blot)과 ELISA를 수행하였다.

세라마이드는 지질로 구성되어 있어 실험 시 분해될 수 있으므로 세라마이드 분해효소인 세라미다아제(ceramidase)를 ELISA로 간접측정하였다.

BALB/c 마우스의 피부조직을 용해완충용액(20 mM Tris-HCl(pH 7.4), 1 mM EDTA, 140 mM NaCl, 1% 트리톤 X-100, 2.5 mM Na₂HPO₄, 1 mM β-글리세롤포스페이트, 1 mM Na₃VO₄, 1 μg/ml 류펩틴 및 1 mM PMSF)으로 용해시켜 단백질을 추출하였다.

추출한 단백질은 브래드포드(bradford)법으로 정량하여 10% 소듐 도데실설파이트 폴리아크릴아미드 겔(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel, SDS-PAGE)로 전기영동하여 분리하였다.

전기영동 후 겔 내 단백질을 니트로섬유소막(nitrocellulose membrane)에 전이시킨 뒤, 막을 5% (w/v) 탈지유(non-fat dry milk)가 포함된 인산염완충식염수 에 1시간 동안 담궈 비특이적인 결합을 방지하는 블로킹(blocking)을 수행하였다.

발현정도를 확인하려는 단백질과 결합하는 1차 항체 및 2차 항체를 처리 하였으며 enhanced chemiluminescence(Amersham Corp) 시스템을 사용하여 단백질의 양을 측정하였다.

도 13(a)는 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스 피부조직 내 필라그린에 미치는 효과를 나타낸 것이고, (b)는 필라그린의 생성정도를 나타낸 그래프이며, (c)는 세라미다아제의 생성정도를 나타낸 그래프이다.

그 결과, 정상군 및 음성대조군과 비교하였을 때, 필라그린은 실험군 4에서 뚜렷하게 증가하였으며 세라미다아제는 실험군 1을 제외한 실험군 2 내지 4에서 감소하였다.

실험예 14. 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스 피부 표피에 미치는 영향 평가

피부조직은 표피, 진피 및 피하지방으로 구성되어 있으며 이 중 표피에 피부장벽이 존재하여 피부를 자극으로부터 보호한다.

하지만, 아토피 피부염이 발생되면 면역과민반응으로 인해 피부장벽에 손상을 유발하여 피부 각화와 태선화 증상이 발생된다.

홍삼농축분말이 BALB/c 마우스 피부 표피에 미치는 영향을 알아보기 위해, BALB/c 마우스의 피부조직을 적출하여 헤마토실린-에오신 염색(hematoxylin-eosin staining)을 한 뒤 광학현미경으로 관찰하였다.

도 14(a)는 홍삼농축분말이 BALB/c 마우스 피부 표피에 미치는 효과를 나타낸 광학현미경 사진이며, (b)는 표피 두께를 측정하여 나타낸 그래프이다.

그 결과, 정상군과 비교하였을 때, 음성대조군에서 피부의 각화와 태선화가 진행되어 표피가 두꺼워진 것을 확인할 수 있으며 피하지방층 안쪽으로 각화세포가 침윤되어 피하층의 구조가 무너진 것을 확인할 수 있었다.

이러한 증상은 실험군에서 농도 의존적으로 감소되었으며 특히 실험군 3 내지 4에서 표피가 매끄러워졌으며, 표피, 진피 및 피하지방층의 경계가 명확히 구별되어 피부조직의 구조 손상이 억제되었고, 표피두께가 유의적으로 감소하였다.

실험예에 따른 결과를 종합해보면, 홍삼농축분말은 아토피 피부염으로 손상된 피부의 홍반, 출혈, 건조, 흉터, 짓무름, 태선화 및 각화 증상을 개선하며, 비만세포의 침윤을 억제하고, 수분함유량을 증가시켰다.

또한, 피부조직 내 필라그린 농도를 증가시키고, 세라미다아제 농도를 감소시키며, 혈액 내 호산구 및 면역글로불린 E 농도를 감소시키고, TNF-α, IL-4, IL-6, TSLP 및 TARC 유전자 발현을 억제하였다.

Claims (5)

1. 홍삼농축분말을 포함하는 아토피 피부염 치료용 약학 조성물에 있어서,
   상기 홍삼농축분말은, 세척하여 건조시킨 홍삼 1g당 물 10㎖를 가하여 80℃의 온도로 8시간 동안 1차 추출하고, 1g당 6ml의 증류수를 첨가하여 80℃의 온도로 8시간 동안 2차 및 3차에 걸쳐 반복 추출함으로써 제조되고,
   상기 홍삼농축분말의 진세노사이드 Rg1+Rb1+Rg3는 6.42mg/g이며,
   상기 홍삼농축분말의 1회 투여 용량은 마우스 경구 투여시 800 mg/kg인 것을 특징으로 하는, 아토피 피부염 치료용 약학 조성물.
   
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