KR101760418B1 - 고삼, 감초 및 백선피 추출물을 포함하는 아토피 피부염 완화 또는 개선용 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고삼, 감초 및 백선피 추출물을 포함하는 아토피 완화 또는 개선용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 고삼, 감초 및 백선피 추출물을 포함하는 아토피 완화 또는 개선용 조성물은 고삼(Sophora flavescens, 苦蔘), 감초(Glycyrrhiza uralensis Fischer, 甘草) 및 백선피 추출물(Dictamnus dasycarpus Turcz, 白鮮皮)을 포함하고, 아토피 피부염에 대한 완화 및 개선 효과를 가지는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 고삼, 감초 및 백선피 추출물을 포함하는 아토피 완화 또는 개선용 조성물은 복합한방 제제로 단일 한방재료 사용에 따른 세포독성의 문제를 개선하고, 부작용이 없으면서도 아토피 피부염의 억제 활성으로 항염 효과가 우수하다. 따라서 다양한 아토피 피부염 질환을 완화 및 개선하기 위한 조성물로 활용할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 고삼, 감초 및 백선피 추출물을 포함하는 아토피 완화 또는 개선용 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

Description

고삼, 감초 및 백선피 추출물을 포함하는 아토피 피부염 완화 또는 개선용 조성물 및 그 제조방법{COMPOSITION COMPRISING EXTRACTS OF SOPHORA FLAVESCENS, GLYCYRRHIZA URALENSIS FISCHER AND DICTAMNUS DASYCARPUS TURCZ FOR PREVENTING AND TREATING ATOPIC DERMATITIS AND METHOD OF PREPARERING THE SAME}

본 발명은 고삼, 감초 및 백선피 추출물을 포함하는 아토피 피부염 완화 또는 개선용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 고삼, 감초 및 백선피 추출물을 포함하면서 세포독성이 없고, 아토피 피부염에 대한 개선효과가 우수하여 아모피 피부염을 억제하는 것인 고삼, 감초 및 백선피 추출물을 포함하는 아토피 피부염 완화 또는 개선용 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.

아토피(atopy)는 아토피 피부염(atopic dermatitis)이라는 습진의 형태로 시작하여 호흡기 아토피 질환인 천식 혹은 알레르기 비염으로 진행되는 만성 알레르기성 질환이다(Cho, S. I., Kim, J. H., Chung, B. Y., Ahn, I. S., Kim, H. O., Park, C. W. and Lee, C. H. 2011. Quality of life in children and adolescents with atopic dermatitis. Korean Dematological Association 49, 415-421., Cho, S. I., Kim, J. H., Chung, B. Y., Ahn, I. S., Kim, H. O., Park, C. W. and Lee, C. H. 2011. Quality of life in children and adolescents with atopic dermatitis. Korean Dematological Association 49, 415-421., Furue, M., Saeki, H., Furukawa, F., Hide, M., Ohtsuki, M., Katayama, I., Sasaki, R., Suto, H. and Takehara, K. 2009. Guidelines for management of atopic dermatitis. J Dermatol 36, 563-77)

이러한 병리적 현상의 발병과 진행은 유전적인 요인과 환경적인 요인에 영향을 받고, 다양한 외인성 인자들이 손상된 인체장벽을 통하여 쉽게 침투하여 질병의 개시와 악화에 중요한 영향을 미치는 점을 감안하면 선천면역이 그 특성상 이러한 질환들의 병인에 중요한 역할을 할 것으로 추정된다[Ikoma, A., Rukwied, R., Stander, S., Steinhoff, M., Miyachi, Y., and Schmelz, M. 2003. Neuronal sensitization for histamine-induced itch in lesional skin of patients with atopic dermatitis. Arch Dermatol 139, 1455 ~ 1458., Koblenzer, C. S. 1999. Itching and the atopic skin. J Allergy Clin Immunol 104, S109-S113., 29. Tobin, D., Nabarro, G., Baart de la Faille, H., van Vloten, W. A., van der Putte, S. C. and Schuurman, H. J. 1992. Increased number of immunoreactive nerve fibers in atopic dermatitis. J Allergy Clin Immunol 90, 613-622., 30. Wahlgren, C. F. 1999. Itch and Atopic dermatitis: an overview. J Dermatol 26, 770-779.)

아토피 피부염(Atopic dermatitis)은 대표적인 알레르기성 피부 염증질환을 의미하며, 아토피란 어원상 이상하고 부적절한 반응을 의미한다. 대개 아토피 피부염은 영, 유아기, 특히 생후 2개월 전후에 시작되는데 이 중 약 50%가 생후 2세 이전에 발생하고, 거의 5세 이전에 증상이 나타나는 반면 성인에서 처음 증상이 나타나는 예는 극히 드물다. 대부분 성장과 더불어 증상이 완화되거나 사라지며 유아기 발생 환자의 절반 이상이 2세 전에 호전된다. 상기 아토피 피부염의 증상으로는 주로 가려움증을 호소하며 재발성의 염증성 피부질환이 나타나는데 연령에 따라 반응은 다양하게 나타난다. 최근 아토피 피부염은 전 세계적으로 10% 내지 20%로 추산될 정도로 흔한 질환이다. 의식주 및 생활환경의 변화 등으로 유병률은 계속 증가하고 있으며, 특히 아동기에서 발생빈도가 높고 연령이 증가할수록 유병률은 감소한다. 그러나 연령이 증가하면서 증상은 약화되지만 아토피성 체질은 대부분 평생 동안 지속되므로 환자의 삶의 질에 많은 영향을 미친다. 발병원인은 유전적인 요인 및 환경적 면역학적 요인 등이 복합적으로 작용하여 나타나는 다인자성 질환이다.(L. U. Pizzorno et al., Natural Medicine Instructions for Patients, Churchill Livingstone, 2002).

아토피 피부염은 전형적으로 손의 피부, 두피, 얼굴, 목 부위, 팔꿈치 및/또는 무릎의 주름에서 나타난다. 아토피 피부염이 발병된 피부는 매우 건조하고 가려우며, 염증이 생기고 비늘처럼 벗겨진다.

긁고 문지르면 뚜렷하고 깊게 주름진 두꺼운 피부가 검어지고 굳어지는데, 보통 손목이나 팔꿈치의 앞이나 무릎의 뒤에 나타난다.

아토피 피부염의 급성 병소에서는 혈청 면역글로불린(immunoglobulin) E가 유의하게 증가하고, 인터루킨[interleukin(IL)-4] 같은 T 헬퍼(helper) 2 사이토카인(cytokines) [Th2]를 발현하는 세포수가 증가한다.

아토피 피부염에는 T 림프구, 항원에 특이적인 immunoglobulin E (IgE)를 발현하는 수지상세포(dendritic cell), Th1 세포와 Th2 세포에서 발현하는 cytokine 등의 여러 인자들이 관여한다(Kang, J. S., Lee, K., Han, S. B., Ahn, J. M., Lee, H., Han, M. H., Yoon, Y. D., Yoon, W. K., Park, S. K. and Kim, H. M. 2006. Induction of atopic eczema/dermatitis syndrome-like skin lesions by repeated topical application of a crude extract of Dermatophagoides pteronyssinus in NC/Nga mice. Int Immunopharmacol 6, 1616-1622.). Th1 세포는 interleukin (IL)-2, interferon (IFN)-γ, tumor necrosis factor (TNF) 등을 분비하여 대식세포를 활성화시키며, Th2 세포는 IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 등의 cytokine을 분비하여 IgE 생성을 증가시키고, 비만세포(mast cell)와 호산구(eosinophil) 분화를 유도시킴으로써 과민반응을 유발한다[Kang, J. S., Lee, K., Han, S. B., Ahn, J. M., Lee, H., Han, M. H., Yoon, Y. D., Yoon, W. K., Park, S. K. and Kim, H. M. 2006. Induction of atopic eczema/dermatitis syndrome-like skin lesions by repeated topical application of a crude extract of Dermatophagoides pteronyssinus in NC/Nga mice. Int Immunopharmacol 6, 1616-1622., Metcalfe, D. D., Kaliner, M. and Donlon, M. A. 1981. The mast cell. Crit Rev Immunol 3, 23-74., Miyajima, I., Dombrowicz, D., Martin, T. R., Ravetch, J. V., Kinet, J. P.a and Galli, S. J. 1999. Systemic anaphylaxis in the mouse can be mediated largely through IgG1 and Fc gammaRIII. Assessment of the cardiopulmonary changes, mast cell degranulation, and death associated with active or IgE- or IgG1-dependent passive anaphylaxis. J Clin Invest 99, 901-914.)

정상적인 상태에서는 Th1과 Th2 세포간의 상호작용으로 균형을 이루면서 면역반응을 유지하지만, 아토피성 피부염에서는 Th2가 다량의 염증성 cytokine을 분비시키고 혈중 IgE의 상승을 유발함으로써 염증반응을 더욱 촉진시킨다. 또한, Th2 세포의 반응을 억제하는 역할을 하는 IFN-γ를 생산하는 능력은 저하되고 Th1 세포의 활성을 억제하는 IL-4는 증가하여 Th1 세포의 증식이 억제되어 결국 세포매개성 면역의 저하를 가져오게 된다(Lee, G. S., Jung, H. M., Oh, S. K., Cheong, J. H. and Kang, T. J. 2012. Effects of herbal complex on atoic dermatitis in BALB/c mice. Kor J Pharmacogn 43, 59-65.). 결과적으로 아토피 피부염에서는 Th2 세포에 의한 면역 반응이 우세하게 나타나게 되는데, Th2 세포와 Tc 세포는 granzyme B를 발현하여 피부 염증 반응에 관여하게 된다(Yawalkar, N., Schmid, S., Braathen, L. R. andPichler, W. J. 2001. Perforin and granzyme B may contribute to skin inflammation in atopic dermatitis and psoriasis. Br J Dermatol 144, 1133-1139).

현재까지 아토피 피부염에 대한 치료 대책은 부신피질 호르몬제, 항히스타민제, 항생제 등과 같은 화학적 약물이 많이 이용되고 있으며, 스킨케어는 주로 스테로이드 외용제나 타크로림스 연구가 이용되고 있으나 장기간 이용할 경우 치료약에 대한 저항성, 피부 수축과 일과성 자극감 그리고 그에 따른 증상의 심화 및 재발 등의 부작용이 많이 발생되며 근본적인 치료가 이루어지지 않는 단점이 있다(Allerano, F. M., Wetworth, C. E. and Arana, A. 2007. Risk of lymphoma following exposure to calcineurin inhibitors and topical steroids in patients with atopic dermatitis. JInvest Dermatol 127, 808-816., Furue, M., Terao, H., Moroi, Y., Koga, T., Kubota, Y., Nakayama, J., Furukawa, F., Tanaka, Y., Katauama, I., Kinukawa, N., Nose, Y. and Urabe, K. 2004. Dosage and adverse effects of topical tacrolimus and steroids in daily management of atopic dermatitis. J Dermatol 31, 277-283., Smith, E. W. 1995. Four decades of topical corticosteroid assessment. Curr Probl Dermatol 22, 124-131.)

이에 따라 치료 효과가 높고 부작용이 적은 치료제를 개발하기 위하여 천연물이나 전통 약재의 활용에 관심이 높아지고 있다[Gao, X. K., Fuseda, K., Shibata, T., Tanaka, H., Inagaki, N. and Nagai, H. 2005. Kampo medicines for mite antigen-induced allergic dermatitis in NC/Nga mice. Evid Based Complement Alternat Med 2, 191-199., Koo, J. and Arain, S. 1998. Traditional Chinese medicine for the treatment of dermatologic disorders. Arch Dermatol 134, 1388-1393.)

현재 대기, 수질 등의 환경오염으로 인하여 아토피 피부염은 남녀노소를 가리지 않고 발생 빈도가 증가하고 있어 모든 연령층을 대상으로 하는 질병으로 인식되고 있으나, 부작용이 없는 안전한 치료법이 개발되어 있지 않다.

관련 선행기술을 보면, 선행기술 1(KR 10-2013-0013693 A, 공개일자 2013년02월06일)은 창포 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 개선을 위한 외용 조성물, 구체적으로창포 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 예방 또는 개선용 화장료 조성물 또는 창포 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것으로, 상기 창포 추출물은 탈과립 현상을 억제하고, 사이토카인의 과도한 분비를 억제하며, 비만세포의 활성화를 억제하여 아토피 피부염을 개선 또는 예방할 수 있으며, 특히, 창포 추출물 중 물 즉, 수용매를 이용한 열수 추출물의 경우 다른 추출법이나 다른 용매에 의한 용매 추출법에 비하여 현저하게 우수한 효과를 가진다는 내용이 개시되고 있다.

선행기술 2(KR 10-2013-0012709 A, 공개일자: 2013년02월05일)는 아데노실코발라민을 유효성분으로 함유하는 외용제 조성물을 국소적으로 투여하여 경증 아토피 피부염환자를 치료하는 방법을 제공하는 것으로 상기 조성물은 효과적이며 부작용 없이 경증 아토피 피부염 환자를 치료할 수 있는 내용을 개시하고 있다.

KR 10-2013-0013693 A KR 10-2013-0012709 A

본 발명의 목적은 복합한방 제제로 단일 한방재료 사용에 따른 세포독성의 문제를 개선하고, 부작용이 없으면서도 아토피 피부염에 대한 예방 및 개선 효과가 우수한 고삼, 감초 및 백선피 추출물을 포함하는 아토피 피부염 완화 또는 개선용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 고삼, 감초 및 백선피 추출물을 포함하는 아토피 피부염 완화 또는 개선용 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 고삼, 감초 및 백선피 추출물을 포함하는 아토피 피부염 완화 또는 개선용 조성물은 고삼(Sophora flavescens, 苦蔘), 감초(Glycyrrhiza uralensis Fischer, 甘草) 및 백선피 추출물(Dictamnus dasycarpus Turcz, 白鮮皮)을 포함하고, 아토피 피부염에 대한 완화 및 개선 효과를 가지는 것이다.

상기 고삼, 감초 및 백선피 추출물은 물, 탄소수 1 내지 5의 알코올, 헥산, 메틸렌클로라이드 및 그 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 추출용매로 하여 추출한 것일 수 있다.

상기 고삼, 감초 및 백선피 추출물은 0.00001 내지 1 중량%로 포함되는 것일 수 있다.

상기 고삼, 감초 및 백선피 추출물을 포함하는 아토피 피부염 완화 또는 개선용 조성물은 혈장 내 면역반응 관련 cytokine인 IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-13의 생성을 억제하는 것일 수 있다.

상기 고삼 추출물 및 감초 추출물은 10: 1 내지 1 : 1 중량비로 포함되는 것일 수 있다.

상기 고삼 추출물 및 백선피 추출물은 10: 1 내지 1 : 1 중량비로 포함되는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에 따른 화장료 조성물은 상기 고삼, 감초 및 백선피 추출물을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일실시예에 따른 약학 조성물은 상기 고삼, 감초 및 백선피 추출물을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일실시예에 따른 고삼, 감초 및 백선피 추출물을 포함하는 아토피 피부염 완화 또는 개선용 조성물의 제조방법은 고삼을 물, 탄소수 1 내지 5의 알코올, 헥산, 메틸렌클로라이드 및 그 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 1 : 8 내지 1 : 12 중량비로 혼합하여 추출하는 단계를 포함하는 고삼 추출물 제조단계; 감초를 물, 탄소수 1 내지 5의 알코올, 헥산, 메틸렌클로라이드 및 그 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 1 : 8 내지 1 : 12 중량비로 혼합하여 추출하는 단계를 포함하는 감초 추출물 제조단계; 백선피를 물, 탄소수 1 내지 5의 알코올, 헥산, 메틸렌클로라이드 및 그 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 1 : 8 내지 1 : 12 중량비로 혼합하여 추출하는 단계를 포함하는 백선피 추출물 제조단계 및 상기 고삼 추출물 제조단계에서 얻어진 고삼 추출물, 상기 감초 추출물 제조단계에서 얻어진 감초 추출물 및 상기 백선피 추출물 제조단계에서 얻어진 백선피 추출물을 혼합하는 혼합단계를 포함하고, 아토피 피부염에 대한 완화 및 개선 효과를 가지는 것일 수 있다.

상기 고삼 추출물 제조단계는 고삼을 건조하고 파쇄하는 고삼 건조 및 파쇄단계, 상기 건조단계를 거친 고삼과 탄소수 1 내지 5의 알코올을 1 : 8 내지 1 : 12 중량비로 혼합하여 12 내지 30℃에서 추출하는 고삼 추출단계, 상기 추출단계 거친 추출물에 대하여 상기 추출단계를 2 내지 5회 반복하는 고삼 반복추출단계, 상기 반복추출단계를 거친 추출물을 20 내지 65℃에서 농축하는 고삼 농축 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 감초 추출물 제조단계는 감초를 건조하고 파쇄하는 감초 건조 및 파쇄 건조단계, 상기 건조단계를 거친 감초와 탄소수 1 내지 5의 알코올을 1 : 8 내지 1 : 12 중량비로 혼합하여 12 내지 30℃에서 추출하는 고삼 추출단계, 상기 반복추출단계를 거친 추출물을 15 내지 55℃에서 농축하는 감초 농축 단계를 포함하는 고삼추출물 제조단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 백선피 추출물 제조단계는 백선피를 건조하고 파쇄하는 백선피 건조 및 파쇄단계, 상기 건조단계를 거친 백선피와 탄소수 1 내지 5의 알코올을 1 : 8 내지 1 : 12 중량비로 혼합하여 12 내지 30℃에서 추출하는 백선피 추출단계, 상기 반복추출단계를 거친 추출물을 10 내지 70℃에서 농축하는 백선피 농축 단계를 포함하는 것일 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 고삼, 감초 및 백선피 추출물을 포함하는 아토피 피부염 완화 또는 개선용 조성물은 고삼(Sophora flavescens, 苦蔘), 감초(Glycyrrhiza uralensis Fischer, 甘草) 및 백선피 추출물(Dictamnus dasycarpus Turcz, 白鮮皮)을 포함하고, 아토피 피부염에 대한 완화 및 개선 효과를 가지는 것이다.

상기 고삼은 콩과의 여러해살이풀인 도둑놈의 지팡이(Sophora flavescens)이를 말하며, 상기 도둑놈의 지팡이의 뿌리 부위를 지칭하는 의미로도 사용될 수 있다. 상기 고삼은 하초습열로 인한 이질, 대하, 음부소양증 및 피부가려움증 등에 사용하며 방광열로 인하여 소변을 잘 못보고 통증이 있을 때 사용한다.

상기 감초는 피자식물문 > 쌍떡잎식물강 > 장미목 > 콩과에 속하는 식물을 말하며, 상기 감초는 모든 약의 독성을 조화시켜서 약효가 잘 나타나게 하며 장부의 한열과 사기를 다스리고 모든 혈맥의 소통을 잘 시키며 근육과 뼈를 튼튼히 한다. 특히 약리작용은 해독작용, 간염, 두드러기, 피부염, 습진 등에 효과가 있고, 진해·거담, 근육이완, 이뇨작용 있으며 소화성궤양을 억제하는데 효과가 있다는 것이 알려져 있다.

상기 백선피는 운향과의 백선(Dictamnus dasycarpus Turcz.)의 뿌리껍질을 의미한다. 백선피는 습열로 인한 피부발진, 피부미란, 습진, 풍진, 가려움증, 알레르기성 피부염, 신경성 피부염과 급성간염으로 인한 황달, 습열성 하지마비에 쓰며 해수, 인후건조, 번갈에도 사용할 수 있으며, 약리작용으로 해열작용과 피부진균 억제 작용이 알려져 있다.

최근 과도한 아토피 피부염 반응의 억제를 위한 다양한 한약제의 효능이 보고되고 있으나, 일부 한약제는 항아토피 피부염 효과가 우수하지만 한 종류의 단일 한약제 투여에 따른 세포독성 문제는 여전히 해결되어야 할 과제로 남아 있다. 따라서 이러한 문제 해결을 위하여 최근 몇몇 한약제의 복합 처방전 개발이 큰 관심을 모으고 있으며, 이러한 접근 각 단일 한약제의 우수성을 증대시키면서 세포독성을 현저히 감소시킬 수 있는 장점을 가지고 있다.

본 발명에서도 상기 고삼 추출물, 감초 추출물 및 백선피 추출물을 후보군으로 포함한 한약재 추출물의 후보군으로 선정하여 각각의 개별적인 추출물에 대한 아토피 피부염에 대한 완화 및 개선 효과를 확인하였다. 그러나, 상기 언급한 바와 같이 상기 추출물의 경우에도 아토피 피부염에 대한 완화 및 개선 효과를 위해 상기 각각의 개별적인 추출물을 단독으로 사용하는 경우 상기 단일 추출물의 사용에 따른 세포독성의 문제가 있다는 것을 확인하였다. 따라서 상기 세포독성에 따른 부작용 등의 문제 때문에 상기 개별 추출물을 아토피 피부염에 대한 완화 및 개선용 조성물로 사용하는 데에는 그 사용량이 제한적이므로 실질적으로 아토피 피부염에 대한 효과를 위해 사용할 수 있는 상기 개별 추출물의 함량이 제한적일 수 밖에 없다는 문제가 있었다.

따라서 상기 추출물 중 복합처방으로서, Balb/c mice에 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (DNCB)를 사용하여 아토피 피부염을 유발한 동물모델을 활용하여 고삼 추출물, 감초 추출물 및 백선피 추출물을 혼합하여 사용하는 경우 상기 각각의 개별 추출물을 단독으로 사용하는 경우에 비하여 세포독성을 낮추면서도 아토피 피부염을 억제하는 활성이 높다는 것을 확인하였다.

상기 고삼, 감초 및 백선피 추출물은 물, 탄소수 1 내지 5의 알코올, 헥산, 메틸렌클로라이드 및 그 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 추출용매로 하여 추출한 것일 수 있다.

바람직하게는 상기 추출용매는 탄소수 1 내지 5의 알코올인 것일 수 있다. 상기 탄소수 1 내지 5의 알코올을 사용하는 경우 상기 추출물의 혼합물 즉, 혼합 추출물의 사용에 따른 아토피 피부염 억제 활성을 높이는 유효성분을 수득할 수 있었고, 이 경우 세포독성도 낮출 수 있어 상기 혼합사용에 따른 상승효과를 누릴 수 있다.

더 바람직하게는 상기 추출용매는 에탄올일 수 있고, 보다 더 바람직하게는 에탄올 함량이 20 내지 60중량% 에탄올 및 물 혼합물일 수 있다. 상기에 의하는 경우 아토피 피부염 억제 활성을 높이는 유효성분 수득률이 높아졌으며, 혼합사용에 따른 세포독성 감소효과가 높아질 수 있다.

상기 고삼, 감초 및 백선피 추출물은 0.00001 내지 1 중량%로 포함되는 것일 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 상기 고삼, 감초 및 백선피 추출물의 상호 작용으로 세포독성이 없는 범위 내에서 상기 혼합 추출물의 사용에 따른 아토피 피부염에 대한 완화 및 개선 효과를 높게 유지하게 할 수 있다.

더 바람직하게는 상기 고삼, 감초 및 백선피 추출물은 0.00001 내지 1 중량%로 포함되는 것일 수 있다. 또한, 보다 더 바람직하게는 상기 고삼, 감초 및 백선피 추출물은 0.001 내지 0.05 중량%로 포함되는 것일 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 세포 독성이 거의 없어 부작용이 없고, 상기 추출물의 혼합사용에 따라 아토피 피부염에 대한 완화 및 개선 효과를 높게 유지하게 할 수 있다.

상기 고삼, 감초 및 백선피 추출물을 포함하는 아토피 피부염 완화 또는 개선용 조성물은 대식세포에서 혈장 내 면역반응 관련 cytokine인 IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-13의 생성을 억제하는 것일 수 있다.

상기 고삼, 감초 및 백선피 추출물을 포함하는 아토피 피부염 완화 또는 개선용 조성물은 피부 병변, 귀 두께, 비장 무게, 귀 종창, 비만 세포의 침윤, 혈장 내 IgE, cytokines (IFN-γ, IL-1, -4, -5, -6, -13, -1β 및 TNF-α)의 발현을 유의적으로 억제하여 효과를 가진다. 따라서, 아토피성 피부염과 관련된 T 세포의 cytokine 생산 억제능을 가지고 있으며, 상기 고삼, 감초 및 백선피 추출물을 포함하는 아토피 피부염 완화 또는 개선용 조성물은 아토피성 피부염을 관리하는데 효과적으로 이용될 수 있다.

상기 고삼 추출물 및 감초 추출물은 10: 1 내지 1 : 1 중량비로 포함되는 것일 수 있다.

상기 범위에 의하는 경우 혼합사용에 따른 상승효과로 아토피성 피부염에 대한 억제 활성이 증진되는 것을 확인할 수 있었다.

상기 고삼 추출물 및 백선피 추출물은 10: 1 내지 1 : 1 중량비로 포함되는 것일 수 있다.

상기 범위에 의하는 경우 혼합사용에 따른 상승효과로 아토피성 피부염에 대한 억제 활성이 증진되는 것을 확인할 수 있었다.

바람작하게는 상기 고삼 추출물은 고삼에 바실러스 리체니포르미스(Bacillus lichenifomis) 또는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 중 1종 이상의 미생물을 접종하여 제조된 것일 수 있다. 상기 미생물 접종에 의하는 경우 상기 미생물의 발효에 의하여 아토피성 피부염에 대한 억제 활성이 증대하고, 상기 감초 추출물과 백선피 추출물의 혼합사용에 따른 아토피성 피부염에 대한 억제 활성의 상승 효과가 크게 증대한다. 특히 상기 미생물 접종은 고삼에 접종하여 발효 뒤 이를 추출물로 제조하는 경우에 그 효과가 매우 우수하다.

상기 바실러스 리체니포르미스는 건조된 고삼의 질량 대비 0.0001 내지 0.05%(w/v)로 접종된 것일 수 있다. 0.01%(w/v) 미만으로 접종시키는 경우 발효과정이 진행되지 않거나 발효기간이 너무 길어지는 문제가 있고, 0.05%(w/v)을 초과하여 접종시키는 경우 과발효로 인하여 세포독성이 증가할 수 있는 문제가 있기 때문이다.

바람직하게는 상기 고삼 추출물 100중량부, 상기 고삼 추출물에 대하여 상기 감초 추출물 10 내지 200 중량부 및 상기 백선피 추출물 10 내지 200 중량부를 포함하는 것일 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 혼합사용에 따른 아토피 피부염 억제 활성이 더 높아질 수 있다.

더 바람직하게는 상기 고삼 추출물 100중량부, 상기 고삼 추출물에 대하여 상기 감초 추출물 10 내지 60 중량부 및 상기 백선피 추출물 10 내지 60 중량부를 포함하는 것일 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 혼합사용에 따른 아토피 피부염 억제 활성이 더 높아질 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 상대적으로 적은 양을 사용하여도 혼합사용에 따른 아토피 피부염 억제 활성이 더 높아 세포독성이 적으면서도 아토피 피부염에 대한 완화 및 개선 효과를 높일 수 있다.

보다 더 바람직하게는 상기 고삼 추출물 100중량부, 상기 고삼 추출물에 대하여 상기 감초 추출물 20 내지 40 중량부 및 상기 백선피 추출물 20 내지 40 중량부를 포함하는 것일 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 상기 추출물의 혼합사용에 따른 상승효과가 가장 높아 적은 양의 사용으로 세포독성의 위험이 없으면서도 높은 아토피 피부염의 완화 또는 개선 효과를 가지는 조성물로 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에 따른 화장료 조성물은 상기 고삼, 감초 및 백선피 추출물을 포함하는 것일 수 있다. 상기 화장료 조성물에 포함되는 상기 고삼, 감초 및 백선피 추출물은 화장료로 사용하는데, 허용되는 범위로 사용하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일실시예에 따른 약학 조성물은 상기 고삼, 감초 및 백선피 추출물을 포함하는 것일 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함되는 상기 고삼, 감초 및 백선피 추출물은 약학적으로 허용되는 범위로 사용하는 것일 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 경구투여제 또는 외용제로 사용하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에 따른 식품 조성물은 상기 고삼, 감초 및 백선피 추출물을 포함하는 것일 수 있다. 상기 식품 조성물에 포함되는 상기 고삼, 감초 및 백선피 추출물은 식품으로 사용하는데, 허용되는 범위로 사용하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일실시예에 따른 고삼, 감초 및 백선피 추출물을 포함하는 아토피 피부염 완화 또는 개선용 조성물의 제조방법은 고삼을 물, 탄소수 1 내지 5의 알코올, 헥산, 메틸렌클로라이드 및 그 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 1 : 8 내지 1 : 12 중량비로 혼합하여 추출하는 단계를 포함하는 고삼 추출물 제조단계; 감초를 물, 탄소수 1 내지 5의 알코올, 헥산, 메틸렌클로라이드 및 그 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 1 : 8 내지 1 : 12 중량비로 혼합하여 추출하는 단계를 포함하는 감초 추출물 제조단계; 백선피를 물, 탄소수 1 내지 5의 알코올, 헥산, 메틸렌클로라이드 및 그 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나를 1 : 8 내지 1 : 12 중량비로 혼합하여 추출하는 단계를 포함하는 백선피 추출물 제조단계 및 상기 고삼 추출물 제조단계에서 얻어진 고삼 추출물, 상기 감초 추출물 제조단계에서 얻어진 감초 추출물 및 상기 백선피 추출물 제조단계에서 얻어진 백선피 추출물을 혼합하는 혼합단계를 포함하고, 아토피 피부염에 대한 완화 또는 개선 효과를 가지는 것일 수 있다.

상기 고삼, 감초 및 백선피 추출물은 고삼, 감초 및 백선피를 혼합하여 추출한 것일 수도 있지만 상기와 같이 각각의 개별 추출물로 따로 추출하여 제조하고, 상기 각각의 개별 추출물을 혼합 사용하는 것일 수 있다. 각각의 개별 추출물로 따로 추출하여 제조하고, 상기 각각의 개별 추출물을 혼합하여 사용하는 경우 각각의 추출물의 상호작용으로 세포독성을 낮추고 아토피 피부염 억제 활성의 상승효과가 훨씬 더 높아질 수 있다.

상기 고삼 추출물 제조단계는 고삼을 건조하고 파쇄하는 고삼 건조 및 파쇄단계, 상기 건조단계를 거친 고삼과 탄소수 1 내지 5의 알코올을 1 : 8 내지 1 : 12 중량비로 혼합하여 12 내지 30℃에서 추출하는 고삼 추출단계, 상기 추출단계 거친 추출물에 대하여 상기 추출단계를 2 내지 5회 반복하는 고삼 반복추출단계, 상기 반복추출단계를 거친 추출물을 20 내지 65℃에서 농축하는 고삼 농축 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 고삼 추출물 제조 단계에 의하는 경우 2번의 반복 추출과정에서 세포독성을 낮출 수 있으며 고삼에 함유된 아토피 피부염 억제 활성 증진에 효과가 있는 유효물질의 수득에 유리할 수 있다.

상기 감초 추출물 제조단계는 감초를 건조하고 파쇄하는 감초 건조 및 파쇄 건조단계, 상기 건조단계를 거친 감초와 탄소수 1 내지 5의 알코올을 1 : 8 내지 1 : 12 중량비로 혼합하여 12 내지 30℃에서 추출하는 고삼 추출단계, 상기 반복추출단계를 거친 추출물을 15 내지 55℃에서 농축하는 감초 농축 단계를 포함하는 고삼추출물 제조단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 감초 추출물 제조단계에 의하는 경우 2번의 반복 추출과정에서 세포독성을 낮출 수 있으며 감초에 함유된 아토피 피부염 억제 활성 증진에 효과가 있는 유효물질의 수득에 유리할 수 있다.

상기 백선피 추출물 제조단계는 백선피를 건조하고 파쇄하는 백선피 건조 및 파쇄단계, 상기 건조단계를 거친 백선피와 탄소수 1 내지 5의 알코올을 1 : 8 내지 1 : 12 중량비로 혼합하여 12 내지 30℃에서 추출하는 백선피 추출단계, 상기 반복추출단계를 거친 추출물을 10 내지 70℃에서 농축하는 백선피 농축 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 백선피 추출물 제조단계에 의하는 경우 2번의 반복 추출과정에서 세포독성을 낮출 수 있으며 백선피에 함유된 아토피성 피부염에 대한 억제 활성 증진에 효과가 있는 유효물질의 수득에 유리할 수 있다.

특히 상기 고삼 추출물 제조단계, 감초 추출물 제조단계 및 상기 백선피 추출물 제조 단계는 상기 온도 범위에서 농축하는 경우 아토피성 피부염에 대한 억제 활성이 높게 유지될 수 있다.

또한, 바람직하게는 상기 탄소수 1 내지 5의 알코올은 상기 고삼, 감초 및 백선 중 어느하나와 1 : 9 내지 1 : 11 중량비로 혼합되어 추출되는 것일 수 있다. 상기 범위에 의하는 경우 세포독성 유발 물질의 추출을 최소화시키고, 아토피성 피부염에 대한 억제 활성 물질을 최대화시킬 수 있다.

본 발명에 따른 상기 고삼, 감초 및 백선피 추출물을 포함하는 아토피 피부염 완화 또는 개선용 조성물은 복합한방 제제로 단일 한방재료 사용에 따른 세포독성의 문제를 개선하고, 부작용이 없으면서도 아토피 피부염 억제 활성으로 효과가 우수하다. 따라서 다양한 아토피 피부염을 완화 또는 개선하기 위한 조성물로 활용할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 고삼, 감초 및 백선피 추출물을 포함하는 아토피 피부염 완화 또는 개선용 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

도 1은 고삼 추출물에 대한 세포 독성 실험 결과에 관한 것이다.
도 2는 감초 추출물에 대한 세포 독성 실험 결과에 관한 것이다.
도 3은 백선피 추출물에 대한 세포 독성 실험 결과에 관한 것이다.
도 4는 고삼, 감초 및 백선피 추출물의 혼합물에 대한 세포 독설 실험 결과에 관한 것이다.
도 5는 아토피 피부염 동물 모델에서 아토피 피부염 발현에 관한 것이다.
도 6은 DNCB 용액으로 유발된 아토피 피부염의 증상에 관한 사진이다.
도 7은 시험 마우스의 체중 변화에 관한 것이다.
도 8은 한약재 추출물의 아토피 피부염 억제 효과에 관한 것이다.
도 9는 한약재 추출물의 마우스의 비장 무게 변화에 관한 것이다.
도 10은 한약재 추출물이 아토피 피부염에 미치는 조직 병리학적 영향에 관한 것이다.
도 11은 한약재 추출물이 아토피 피부염에 미치는 조직 병리학적 영향에 관한 것이다.
도 12는 한약재 추출물이 아토피 피부염에 미치는 조직 병리학적 영향에 관한 것이다.
도 13은 한약재 추출물이 아토피 피부염에 미치는 조직 병리학적 영향에 관한 것이다.
도 14는 DNBC에 의해 유발된 마우스의 혈청 내 IgE 농도에 한약재 단일 추출물과 추출혼합물이 미치는 영향에 관한 것이다.
도 15는 면역 반응에 따른 염증 유발 인자들에 대한 cytokine의 변화에 관한 것이다.
도 16은 면역 반응에 따른 염증 유발 인자들에 대한 cytokine의 변화에 관한 것이다.
도 17은 면역 반응에 따른 염증 유발 인자들에 대한 cytokine의 변화에 관한 것이다.
도 18은 면역 반응에 따른 염증 유발 인자들에 대한 cytokine의 변화에 관한 것이다.
도 19는 면역 반응에 따른 염증 유발 인자들에 대한 cytokine의 변화에 관한 것이다.
도 20은 면역 반응에 따른 염증 유발 인자들에 대한 cytokine의 변화에 관한 것이다.
도 21은 면역 반응에 따른 염증 유발 인자들에 대한 cytokine의 변화에 관한 것이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

[제조예: 고삼, 감초 및 백선피 추출물의 제조]

1. 추출물의 제조방법

상기 고삼 추출물 제조 단계에 따라 고삼 추출물을 제조하고, 상기 감초 추출물의 제조단계에 따라 감초 추출물을 제조하였다. 또한 상기 백선피 추출물의 제조단계에 따라 백선피 추출물을 제조하였다.

용매는 에탄올 및 물을 1 : 2 내지 2 : 7로 혼합한 것을 사용하였으며, 상기 용매 1L를 이용하여 추출하였다. 추출시 초음파 기기에 30분씩 총 4번을 반복하여 추출하였다. 상기 농축과정은 rotary evaporator (A-1000, Eyela, Japan)를 이용하였고, DMSO를 이용하여 100 mg/ml의 농도로 stock solution을 만들었다.

고삼 추출물의 수율은 10.35w%, 감초 추출물은 20.65w%, 백선피 추출물은 12.76w%이었다.

2. 실험동물

본 실험에서 사용한 5주령의 Balb/c 암컷 마우스는 쌤타코(주)에서 공급받았으며 1주일간 동물실험실 적응 과정을 거친 후 실험에 사용하였다. 실험동물은 온도 22±2℃, 습도 55±15%, 12시간 주야 12시간 교대로 150∼300 Lux의 환경에서 마우스용 케이지에 8 내지 9마리씩 수용하여 사육하면서 멸균 증류수와 고형사료를 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다.

[시험예 1: 세포독성 실험]

1. 세포배양

본 실시예에 사용된 마우스의 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 American Type Culture Collections (Manassas, VA, USA)에서 분양 받았으며, 세포배양을 위해 10% fetal bovine serum (FBS) 포함하는 Eagle's minimum essential medium (DMEM, Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)을 사용하였다. 세포는 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

2. 세포생존도 측정

각각의 고삼 추출물, 감초 추출물 및 백선피 추출물의 단일 추출물과 상기 고삼 추출물, 감초 추출물 및 백선피 추출물을 일정한 비율로 혼합한 혼합 추출물이 RAW 264.7 대식세포에 미치는 독성 정도를 평가하기 위한 세포 생존도는 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide (MTT, Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA) assay로 분석하였다.

이는 위하여 6 well plate에 RAW 264.7 대식세포를 분주(2×105/well)하고 각 추출물을 농도별(0, 10, 20, 30, 40, 50 μg/ml)로 24시간 동안 처리하였다.

또한, 동일한 방법을 이용하여 추출혼합물을 각 추출물 20 μg/ml과 같은 량으로 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양 후, well당 200 ㎕의 MTT solution (0.5 mg/ml)을 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 2시간 동안 반응시킨 후, microplate reader (Dynatech Laboratories, Chantilly VA, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포생존율을 백분율로 표시하였다.

[시험예1: 세포독성 및 항염 효과 실험결과 및 고찰]

1. RAW 264.7 대식세포의 세포 생존도에 미치는 고삼, 감초, 백선피 추출물 및 추출혼합물의 영향

각 한약재 단일 추출물 및 추출혼합물의 아토피성 피부염에 대한 억제 활성의 평가를 위한 실험조건의 설정을 위하여 각 한약재 추출물을 24시간 동안 다양한 농도로 RAW 264.7 대식세포 처리한 후, MTT assay를 실시하여 세포 생존도 변화를 측정하였다.

그 결과 도 1을 참고하면 상기 고삼 추출물(EESF)은 20 μg/ml까지는 세포 생존도에 거의 영향을 없었으나, 30 μg/ml 농도 이상에서부터 세포 생존율이 농도 의존적으로 억제되었다.

또한, 도 2를 참조하면, 상기 감초 추출물(EEGU)은 10 μg/ml까지는 세포 생존율에 거의 영향을 없었으나, 20 μg/ml 이상에서부터 세포 생존율이 농도 의존적으로 억제되었다.

그리고, 도 3을 참조하면, 상기 백선피 추출물(EEDD)은 10 μg/ml에서부터 세포 생존율이 억제되는 것으로 나타났다.

상기의 결과에 따라 세포 생존도에 거의 영향을 없을 것으로 추정되는 20 μg/ml 농도를 설정하여 4종의 혼합출출물(MHMIX-1, -2, -3 및 -4)을 24시간 동안 RAW 264.7 대식세포에 처리한 결과, 도 4를 참조하면, 4종의 혼합추출물 20 μg/ml에서는 세포생존도에 전혀 영향이 없는 것으로 확인되었다.

이상에 결과에서 단일 한약재 추출물에 비해 추출혼합물이 세포 독성이 현저히 낮은 것이 확인되었다.

[시험예 2: 아토피 피부염 동물 모델과 아토피 억제활성 실험]

1.아토피 피부염 동물모델

아토피 유도를 위한 DNCB는 Sigma-Aldrich Chemical Co (ST. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, 6주령 마우스의 귀 하단에서부터 등 부분을 제모하고 24시간 방치 후 1w%의 DNCB (acetone:oliveolil = 3:1) 용액 200 ul를 제모 부위에 도포하고, 3일 후 2차 도포하였다. 1차 도포 후 7일째부터는, 이틀 간격으로 0.4w% DNCB 용액 200 ul를 실험이 종료될 때까지 동일한 부위에 고르게 도포하여 아토피 피부염이 지속되도록 하였다(하기의 도 5 참조).

2. 약물투여

0.4% DNCB 용액을 3회 도포 후 충분한 아토피 염증반응이 일어났을 때 양성대조군 (dexamethasone, 5 mg/ml), 고삼(이하, 'GS'라 한다), 감초(이하, 'GC'라 한다), 백선피(이하, 'BSP'라 한다) 단일 추출물과 추출혼합물(이하, 'GGB'라 한다)을 하기의 표 1과 같이 제조하고, 이틀 간격으로 300 mg/kg의 농도로 10회 경구투여 후 등 부분과 귀의 염증반응/손상완화 정도를 비교하였다.

Group ID	Treatment	Dosage(mg/kg)
Normal	Distilled Water
DNCB	DNCB+Distilled Water
Dexamethasone	DNCB+Dexamethasone	5
GS	DNCB+Sophoraflavescensextract	300
GC	DNCB+GlycyrrhizauralensisFischerextract	300
BSP	DNCB+DictamnusdasycarpusTurczextract	300
GGB-1	DNCB+GS:GC:BSP = 3:1:1 mixture	300
GGB-2	DNCB+GS:GC:BSP = 2:2:1 mixture	300
GGB-3	DNCB+GS:GC:BSP = 1:3:1 mixture	300
GGB-4	DNCB+GS:GC:BSP = 1:1:1 mixture	300

Normal (n=8); DNCB (n=8); Dexamethasone (n=8); GS, GC, BSP, GGB-1, 2, 3 (n=8); GGB-4 (n=9).

3. 아토피 증상의 관찰 및 체중, 장기 무게의 측정

실험 시작과 함께 Balb/c 마우스 등 피부 조직의 외형적 변화(홍반, 가려움, 건조피부, 부종, 짓무름 및 태선화 등)를 3주동안 관찰하였다. 실험의 시작과 함께 마우스 등 피부 조직의 변화 유무를 관찰하면서 체중과 귀 두께 변화를 측정하였다. 체중은 electric balance (Precisa, Swiss)를 사용하여 측정하였고 귀 두께는 vernier calipers (Mitutoyo, Japan)를 사용하여 삼일 간격으로 측정하였다. 실험 종료일에 마우스를 희생시킨 다음 비장과 간을 적출하여 그 무게를 측정하였다.

4. 혈청 IgE 측정

실험 종료일에 마우스를 희생시킨 후 즉시 주사기를 이용하여 심장에서 혈액을 채취하여 3,000 rpm, 4℃에서 20분 동안 원심 분리하여 혈청을 분리한 후 실험에 사용하기 전까지 -75℃ 냉동고에 보관하였다. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)로 IgE 수준을 확인하기 위한 플라즈마를 분리하는 방법으로, 먼저 ELISA plate에 IgE와 복합체를 형성할 수 있는 capture 항체를 coating buffer (0.1 M Na2CO3, pH 9.5)와 함께 4℃에서 하루 동안 보관한 후, 5% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)으로 상온에서 1시간동안 blocking 과정을 거친 후, 플라즈마 샘플을 20배 희석하여 100 ul의 부피로 2시간동안 실온에 반응시켰다. 그 후 capture 항체에 결합된 IgE를 인지하는 2차 항체를 넣은 다음 기질인 100 ul의 3,3'5,5'-tetramethylbenzidine base (TMB) 용액을 넣고 15분간 반응시킨 후, 50 ul의 stop 용액(1M H3PO4)을 넣어 반응을 종료 시키고 ELISA reader (450 nm)로 측정하였다.

5. 혈청 cytokine 측정

실험동물의 심장으로부터 채취한 혈액을 원심분리 한 후 혈청 IL-4, 5, 6, 13, 1β, IFN-γ 및 TNF-α의 농도를 enzyme immunometric assay kit (Assay Designs Inc., Ann Arbor, MI, USA)를 이용해 측정하였다. 시료를 96 well plate에 PBS로 180배 희석한 capture 항체를 100 ul씩 분주하여 실온에서 overnight 시킨 후, block buffer 300 ul을 분주하여 최소 1시간 실온에서 반응시켰다. 다음 reagent diluent로 희석한 각 샘플과 표준액을 100 ul씩 분주한 후, 실온에서 2시간 반응시켰다. Streptavidin-horseradish peroxidase (HRP, Amdex, Copenhagen, Denmark)을 working dilution으로 희석하여 100 ul씩 각 well에 분주하여 실온에 20분 반응시킨 후, substrate solution을 100 ul씩 분주하고 다시 실온에 20분간 반응시켰다. 각 단계는 0.05% PBS-Twin으로 세척하였으며 마지막으로 발색 후 2 N H2SO4를 50 ul씩 넣고 반응을 정지시켰다. 동일한 과정을 통하여 purified cytokine을 표준으로 하여 ELISA reader (450 nm)로 측정하였다.

6. 조직병리학적 관찰

실험 종료 후 희생시킨 마우스의 등과 귀 조직을 분리하여 10% 중성 포름알데하이드에서 24시간 고정하였다. 적출한 피부조직은 식염수로 수세한 후 OCT compound (Sakura Finetechnical, Tokyo, Japan)로 동결조직절편을 만들어 hematoxylin & eosin (H&E) 염색 및 비만세포를 염색하는 toluidine blue (TB) 염색을 하였다. 염색한 조직은 광학현미경의 ×100 배율 하에서 조직변화 및 비만세포의 침윤 정도를 관찰하였다.

7. 통계처리

실험결과의 모든 분석은 각 그룹의 측정값을 평균 ± SD로 제시하였으며, Student’s t-test로 분석하여 p-value가 0.05 이하일 경우 유의성을 인정하였다.

[시험예 2: 아토피 피부염 동물 모델과 아토피 억제활성 실험결과 및 고찰]

1. 아토피 증상에 대한 한약재 추출물의 효과

DNCB 용액으로 마우스의 등과 귀 피부에 아토피 피부염이 충분히 유발된 후 DNCB 용액을 도포하면서 시료를 경구 투여하여 마우스의 등과 귀 피부에 나타난 아토피 증상을 관찰하여 그 결과를 하기의 도 6에 나타내었다.

하기의 도 6을 참조하면 외상 병변에서, 정상군(normal)의 피부 상태는 깨끗하였고 DNCB 처리군에서는 홍반, 부종, 인설, 가피, 태선화 등의 다양한 아토피 증상이 뚜렷하게 나타났으며 양성대조군인 dexamethasone 처리군과 고삼 추출물 및 추출혼합물 처리군에서는 DNCB군에 비해 아토피 증상이 유의적으로 완화된 것을 육안으로 확인하였고, 특히 추출혼합물 GGB-1 처리군에서 완화효과가 더욱 뚜렷하게 관찰되었다.

2. 체중변화에 대한 한약재 추출물의 효과

실험 시작일부터 종료일까지 마우스의 체중을 3 일에 한 번씩 측정하여 그 결과를 하기의 도 7에 나타내었다. 하기의 도 7을 참고하면 실험을 진행하는 동안 정상군의 체중은 꾸준한 증가를 보였고, DNCB 처리군은 정상군에 비해 현저하게 감소하였으며 이는 아토피 피부염에 의한 스트레스에 의한 결과로 생각되어진다. 반면, 고삼 및 추출혼합물(GGB-1, 2, 3 및 4) 처리군은 DNCB 처리군에 비해 체중감소가 크지 않았고, 체중의 증감폭이 적게 나타났다

3. 귀의 두께 변화에 대한 한약재 추출물의 효과

DNCB에 의해 아토피 피부염이 유발된 Balb/c 마우스에서 한약재 추출물의 아토피성 피부염의 완화 효과를 확인하기 위하여 10회를 걸쳐 한약재 단일 추출물과 추출혼합물을 DNCB와 함께 동시에 처리하여 귀의 두께를 관찰하였다. 귀의 두께는 DNCB 처리군이 정상군에 비해 유의적으로 매우 두꺼워졌지만, 고삼 추출물과 추출혼합물 처리군은 DNCB 처리군에 비하여 유의적으로 얇아짐을 관찰할 수 있었다(하기의 도 8 참조). 각 시료군의 귀 두께를 정상군의 귀 두께와 비교하였을 때, DNCB 처리군의 귀 두께는 2.4배나 두꺼워졌으나, 추출혼합물 GGB-1 처리군은 1.7의 값을 나타내어 양성대조군인 dexamethasone 처리군에 비해 더욱 효과적인 결과를 나타내었다. 또한, GGB-4 처리군과 고삼 추출물 처리군에서도 dexamethasone 처리군과 유사한 값을 나타내어 한약재 단일 추출물인 고삼 추출물과 추출혼합물 GGB-1과 -4가 아토피 피부염 억제에 유의적인 효능이 있을 것으로 추정된다. 특히 추출혼합물 GGB-1은 한약재 단일 추출물의 함량에 비해 각각의 한약재 단일 추출물의 함량이 낮음에도 불구하고 고삼 추출물에 비하여 더 효과적이거나 유사한 결과를 나타내어 한약재 단일 추출물보다 아토피 피부염을 억제하는데 더 효과적인 시료임을 알 수 있었다.

4. 장기 무게의 변화

아토피 피부염의 반응은 면역기관 내 다양한 반응을 유도하며, 이러한 반응은 일차적으로 면역기관의 무게에 영향을 줄 수 있다. 따라서 한약재 추출물이 DNCB에 의해서 유도된 아토피 피부염이 발생한 Balb/c 마우스의 면역장기에 미치는 영향을 관찰하기 위해 비장(spleen)과 한약재 추출물의 독성을 평가하기 위하여 간(liver)의 무게를 측정하였다. 비장은 1차와 2차 림프기관의 특성을 모두 나타내며, 적혈구를 여과하는 red pulp와 체액성 면역과 세포성면역 활성을 나타내는 with pulp로 구성되어 있으며, 면역반응에서 또 다른 중요한 기관이다(Mebius, R. E. and Kraal, G. 2005. Structure and function of the spleen. Nat Rev Immunol 5, 606-616). 또한 비장은 B 세포 발생의 최종단계가 진행되는 곳이며, 동시에 혈액에서 유래된 항원에 반응하는 특화된 기관으로서 기능을 갖는다(Boehem, T. and Bleul, C.C. 2007. The evolutionary history of lymphoid organs. NatImmunol 8, 131-135). DNCB 처리군의 비장무게는 정상군에 비하여 유의적으로 2배 가까이 증가하였다. 그러나 고삼 추출물 처리군과 GGB-1 처리군에서는 DNCB 처리군 보다 급격히 무게가 감소하여 거의 정상군 수준의 무게로 회복되었다(하기의 도9에서 A, B 참조). 또한 한약재의 독성을 평가하기 위하여 측정한 간의 무게는 DNCB 처리군을 제외한 한약재 처리군에서는 유의적인 변화를 볼 수 없었다(하기의 도9에서 C 참조). 이 결과를 통하여 독성이 없는 농도 하에서 고삼 추출물과 추출혼합물 GGB-1이 아토피 피부염에 효과적인 시료임을 알 수 있었다.

5. 조직 병리학적 변화

한약재 추출물이 아토피 피부염에 미치는 조직 병리학적 영향을 관찰하기 위하여 마우스의 귀 조직에 대한 변화를 관찰하였다. DNCB 처리군은 염증반응, 부종, 표피과다형성 등의 아토피성 피부염의 증상이 정상군에 비하여 유의적으로 증가하였다(하기의 도 10 참조). 그러나 고삼 추출물 처리군과 GGB-1 처리군에서는 이러한 증상이 감소되었으며. 특히 GGB-1 처리군에서는 고삼 추출물 처리군과 비교하여 유의적으로 귀 조직의 팽창이 감소되었다(학의 도 11 참조). 또한, 염증반응으로 인한 비만세포의 침윤에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 TB 염색을 시행한 후 염색된 비만세포의 침윤 상태를 관찰하였다. 그 결과, DNCB 처리군은 정상군에 비하여 침윤된 비만세포가 유의적으로 증가하였으며, 한약재 단독 처리군인 고삼 추출물 처리군과 추출혼합물을 처리한 군에서 침윤된 비만세포의 수가 유의적으로 감소하였다(하기의 도 12 참조). 특히, 추출혼합물 GGB-1 처리군은 단일 추출물인 고삼 추출물 처리군에 비하여 유의적으로 비만세포의 침윤이 억제되었다(하기의 도 13 참조).

6. 혈청 내 IgE 농도의 변화

DNBC에 의해 유발된 마우스의 혈청 내 IgE 농도에 한약재 단일 추출물과 추출혼합물이 미치는 영향을 분석하였다. 그 결과, DNCB 처리군은 정상군에 비하여 혈청 내 IgE의 농도가 급격하게 증가하였으나 감초 추출물 처리군을 제외한 한약재 단일 추출물과 추출혼합물 처리군에서 혈정 내의 IgE의 농도가 유의적으로 감소하였다. 특히 고삼 추출물과 추출혼합물 GGB-1 처리군의 혈청 내 IgE의 농도는 양성대조군인 dexamethasone 처리군에 비해 30~40% 낮은 농도를 나타내었다(하기의 도 14 참조). 이러한 결과는 한약재 단일 추출물과 추출혼합물이 혈청 내 IgE 농도를 유의적으로 감소시키는 효과가 있으며, 그중 고삼 추출물과 GGB-1 처리군은 아토피 피부염의 증상을 완화시키는데 기여할 수 있음을 알 수 있었다.

7. 혈청 내 cytokine level의 변화

아토피 피부염은 외부 항원을 가장 먼저 인지하는 IgE가 항원을 인식하고 표피의 랑게르한스 세포(Langerhans' cell)가 항원을 림프구에 전달하여 면역반응을 유도함으로써 병변을 유발하게 된다(Hwang, J. S., Kim, H. Y., Choi, E. J., Goo, J. H., Kweon, D. H. and Chung, D. K.2010. Inhibition of atopic dermatitis by topical application of SNARE complex inhibitor in NC/Nga mice. J skin Barrier Res 12, 9-15). 외부 항원을 삼킨 수지상 세포는 그 항원을 T 세포에 전달하고 T 세포는 다음과 같은 3가지 cytokine들, 즉 IL-4, -12 및 -18에 의해 자극을 받게 되면 Th1 세포는 IFN-γ를, Th2 세포는 IL -4, -5 및 -13을 분비하고, Th0 세포는 Th1 과 Th2 세포가 분비하는 모든 cytokine을 분비한다. Th1 세포는 내인성 인자에 대한 과민 반응용 IgE 항체를 만들며, Th2 세포는 외인성 인자에 대한 과민 반응용 IgE 항체를 생산한다(Ennis, M., Atkinson, G. and Pearce, F.L. 1979. The Effect of alkaline earth cations on the release of histamine from rat peritoneal mast cells treated with compound 48/80 and peptide 401. Br J Pharmac 65, 395-402., Jones, L. A., Chin, L. T., Longo, D. L., and Kruisbeek, A. M. 1990. Peripheral clonal elimination of functional T cells. Science 250, 1726~1729., Kang, J. S., Lee, K., Han, S. B., Ahn, J. M., Lee, H., Han, M. H., Yoon, Y. D., Yoon, W. K., Park, S. K. and Kim, H. M. 2006. Induction of atopic eczema/dermatitis syndrome-like skin lesions by repeated topical application of a crude extract of Dermatophagoides pteronyssinus in NC/Nga mice. Int Immunopharmacol 6, 1616-1622.). 이에 따라 본 연구에서는 마우스의 혈장 내에 IFN-γ, IL-4, -5 및 -13의 면역 관련 cytokine의 생성 정도를 비교하였으며, 면역 반응에 따른 염증 유발 인자들에 대한 cytokine의 변화를 측정하기 위하여 TNF-α, IL-1β, IL-6의 생성 정도를 측정하였다.

혈장 내 면역 반응 관련 cytokine인 IFN-γ, IL-4, -5, -13의 생성량을 측정한 결과 DNCB 처리군은 정상군에 비하여 현저하게 증가되었으며, 한약재 단일 추출물에서 감초 추출물 처리군을 제외한 고삼과 백선피 추출물 처리군과 추출혼합물 처리군에서 DNCB군에 비하여 IFN-γ, IL-4, -5 및 -13의 생성량이 유의적으로 감소되었다(하기의 도 15 내지 18 참조). 그리고 고삼 추출물과 GGB-1 처리군에서 IFN-γ, IL-4, -5 및 -13의 생성이 다른 처리군에 비하여 1.5 ~ 10배 이상의 감소되었으며, 특히 GGB-1 처리군에서 IFN-γ와 IL-13의 발현량이 현저하게 감소되었다(하기의 도 15 및 18 참조). 또한 이들 면역 반응에 따른 염증 반응과 관련된 혈장 내 cytokine인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현 변화를 측정한 결과 면역 반응과 관련된 cytokine과 유사한 경향을 나타내었으며, DNCB 처리군에서 정상군에 비하여 유의적으로 cytokine 생성량이 증가되었다(하기의 도 19 내지 21 참조). 그리고 한약재 단일 추출물인 고삼 추출물과 추출혼합물 GGB-1, -2, -3 및 -4 처리군 모두에서 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현이 DNCB 처리군에 비하여 현저하게 감소되었으며, 특히 고삼 추출물과 GGB-1 처리군에서 유의적인 감소를 확인하였다. 따라서 한약재 추출물이 T 세포의 cytokine 활성을 조절함을 알 수 있었으며, 고삼, 감초, 백선피 추출물의 추출혼합물 GGB-1 처리군이 면역반응과 염증반응에 관여되는 cytokines 발현을 조절함으로써 T 세포 분화를 정상적으로 복구시키는데 영향을 미쳐 아토피성 피부염 증상을 효과적으로 완화시킬 수 있을 것으로 추정된다.

8. 결론

본 연구에서는 고삼, 감초, 백선피 한약제 추출물 및 다양한 비율로 조성된 추출혼합물의 항아토피성 효능을 조사하였으며, 각각의 단일 추출물과 복합추추물에서 항아토피성 조절제로서의 발굴 가능성이 있음을 확인하였다. 특히, 고삼, 감초 및 백선피 추출물이 3:1:1로 혼합된 추출혼합물 GGB-1이 항아토피 관련 기능성 소재 개발에 보다 효과적임을 제안한다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims (10)

1. 고삼(Sophora flavescens, 苦蔘) 추출물 100 중량부;
   상기 고삼 추출물에 대하여
   감초(Glycyrrhiza uralensis Fischer, 甘草) 추출물 20 내지 40 중량부 및
   백선피 추출물(Dictamnus dasycarpus Turcz, 白鮮皮) 20 내지 40중량부로 이루어지고,
   상기 고삼 추출물, 감초 추출물 및 백선피 추출물은 12 내지 30℃에서
   에탄올 및 물이 1 : 2 내지 2 : 7로 혼합된 혼합물을 추출용매로 하여 추출된 것이고,
   아토피 피부염에 대한 완화 및 개선 효과를 가지는 것인
   고삼, 감초 및 백선피 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 완화 또는 개선용 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 제 1항에 따른 고삼, 감초 및 백선피 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 완화 또는 개선용 조성물을 포함하는 화장료 조성물.
8. 제 1항에 따른 고삼, 감초 및 백선피 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 완화 또는 개선용 조성물을 포함하는 약학 조성물.
9. 고삼을 에탄올 및 물이 1 : 2 내지 2 : 7로 혼합된 혼합물을 추출용매로 1 : 8 내지 1 : 12 중량비로 혼합하여 12 내지 30℃에서 추출하는 단계를 포함하는 고삼 추출물 제조단계;
   감초를 에탄올 및 물이 1 : 2 내지 2 : 7로 혼합된 혼합물을 추출용매로 1 : 8 내지 1 : 12 중량비로 혼합하여 12 내지 30℃에서 추출하는 단계를 포함하는 감초 추출물 제조단계;
   백선피를 에탄올 및 물이 1 : 2 내지 2 : 7로 혼합된 혼합물을 추출용매로 1 : 8 내지 1 : 12 중량비로 혼합하여 12 내지 30℃에서 추출하는 단계를 포함하는 백선피 추출물 제조단계 및
   상기 고삼 추출물 제조단계에서 얻어진 고삼 추출물 100 중량부, 상기 고삼 추출물에 대하여 상기 감초 추출물 제조단계에서 얻어진 감초 추출물 20 내지 40 중량부 및 상기 백선피 추출물 제조단계에서 얻어진 백선피 추출물 20 내지 40 중량부를 혼합하는 혼합단계를 포함하고,
   아토피 피부염에 대한 완화 및 개선 효과를 가지는 것인
   고삼, 감초 및 백선피 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 완화 또는 개선용 조성물의 제조방법.
10. 제 9항에 있어서,
    상기 고삼 추출물 제조단계는 고삼을 건조하고 파쇄하는 고삼 건조 및 파쇄단계, 상기 건조단계를 거친 고삼과 에탄올 및 물이 1 : 2 내지 2 : 7로 혼합된 혼합물을 추출용매로 1 : 8 내지 1 : 12 중량비로 혼합하여 12 내지 30℃에서 추출하는 고삼 추출단계, 상기 추출단계 거친 추출물에 대하여 상기 추출단계를 2 내지 5회 반복하는 고삼 반복추출단계, 상기 반복추출단계를 거친 추출물을 20 내지 65℃에서 농축하는 고삼 농축 단계를 포함하는 것이고,
    상기 감초 추출물 제조단계는 감초를 건조하고 파쇄하는 감초 건조 및 파쇄 건조단계, 상기 건조단계를 거친 감초와 에탄올 및 물이 1 : 2 내지 2 : 7로 혼합된 혼합물을 추출용매로 1 : 8 내지 1 : 12 중량비로 혼합하여 12 내지 30℃에서 추출하는 고삼 추출단계, 상기 반복추출단계를 거친 추출물을 15 내지 55℃에서 농축하는 감초 농축 단계를 포함하는 고삼추출물 제조단계를 포함하는 것이고,
    상기 백선피 추출물 제조단계는 백선피를 건조하고 파쇄하는 백선피 건조 및 파쇄단계, 상기 건조단계를 거친 백선피와 에탄올 및 물이 1 : 2 내지 2 : 7로 혼합된 혼합물을 추출용매로 1 : 8 내지 1 : 12 중량비로 혼합하여 12 내지 30℃에서 추출하는 백선피 추출단계, 상기 반복추출단계를 거친 추출물을 10 내지 70℃에서 농축하는 백선피 농축 단계를 포함하는 것인
    고삼, 감초 및 백선피 추출물을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 완화 또는 개선용 조성물의 제조방법.

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